JPH06181757A - ウサギ由来のモノクローナル抗体を生産する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 齧歯目骨髄腫細胞と非形質転換ウサギパート
ナー細胞の融合産物である安定な異種間融合パートナー
および該異種間融合パートナーをウサギ抗体産生細胞と
融合して予定の抗原に対する抗体を産生する細胞系を単
離することからなるウサギモノクローナル抗体の製造
法。 【効果】 本発明の細胞系および方法によって、従来の
マウスまたはラットでは抗体を発生させることが困難で
あった抗原に対するモノクローナル抗体を容易に得るこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は概してモノクローナル抗体の分野
に属し、より具体的にはウサギモノクローナル抗体を生
産する方法およびそれを生産するために使用する細胞に
関する。

【０００２】モノクローナル抗体は、典型的には抗体産
生細胞を不死化した細胞と融合させて、すべての細胞が
同じ抗原エピトープに指向する抗体を生産する均一な細
胞集団を作出することによって生産される。マウスおよ
びラットは抗体産生細胞の従来からの供給源である。雑
種の融合産物と呼ばれる、抗体産生細胞と不死融合パー
トナーとの融合によって作出される細胞雑種(ハイブリ
ッド)は、免疫化抗原と反応する分泌された抗体の質と
量について選択され、試験される。これらのハイブリッ
ドはインビトロまたはインビボ(腹水として)で抗体の大
量生産のために拡張される。モノクローナル抗体を開発
するために現在使用されている手法については、Waldma
n,T.,Science 252:1657-1662(1991)およびHarlowら,Ant
ibodies：ALaboratory Manual.,コールド・スプリング・
ハーバー,1988,ニューヨークの総説を参照のこと。

【０００３】モノクローナル抗体は診断的検定にとって
ポリクローナル抗体より好ましい。モノクローナル抗体
は限定された特異性を有する抗体の均一な集団である。
この抗体は首尾一貫した結果を伴って繰り返して使用す
ることができる。モノクローナル集団は均一であるか
ら、免疫検定において対応するポリクローナル集団より
予測可能な反応パターンを有する傾向がある。さらにポ
リクローナル抗体とは対照的に、一貫した質のモノクロ
ーナル抗体を長期間にわたって生産することができる。
モノクローナル抗体はその特異性ゆえに、酵素結合イム
ノソルベント検定法(ＥＬＩＳＡ)、放射線免疫検定法
(ＲＩＡ)、ウェスタンブロットあるいは免疫組織化学的
検定法などの免疫検定法にとって好ましい種類の抗体で
ある。

【０００４】ラットとマウスはモノクローナル抗体の生
産にとって代表的な供給源であるが、いくらかの抗原は
マウスおよびラット中で高親和性抗体の発生を、診断的
検定法において有用であるほどには、十分に刺激しな
い。この種類の抗原の例には主として炭水化物部分が含
まれる。アミノ酸エピトープは炭水化物よりも免疫原性
である傾向を示すが、齧歯目中で高親和性抗体を刺激し
ないアミノ酸エピトープもある。したがって、モノクロ
ーナル抗体のもう１つの便利な供給源は当該技術分野に
とって多大な利益をもたらすであろう。

【０００５】ウサギはポリクローナル抗体の優れた供給
源である。様々な免疫原を用いたウサギにおける抗原刺
激は一貫して高力価のウサギポリクローナル抗体を生成
させる。さらにウサギは一般的で便利な実験動物でもあ
る。齧歯目が炭水化物部分に対する高親和性抗体を生産
しにくいのに対して、ウサギは外来炭水化物決定基に対
してより一貫して陽性に反応する。ウサギとマウスの間
の親和性の相違は、これらの生物が進化論的にかけ離れ
ており、それゆえに同じ抗原に対して異なる応答をし得
るという事実に原因を帰することができよう。したがっ
てウサギは、マウス中では反応性に乏しいヒトのエピト
ープに対してより強力な抗体応答をよりよく生成させ得
るのである。炭水化物決定基は癌の診断と感染症にとっ
て重要なマーカーであり、それゆえに、これらの抗原に
対する高親和性抗体がますます必要とされている。

【０００６】ウサギとマウスの間で抗原性応答が異なる
ことに加えて、ウサギ中で生産された抗体は診断的検定
法にとってさらなる利点をも持っている。例えばある人
々は内因的レベルの抗ネズミ抗体(ＨＡＭＡ)を持ってい
る。２つのネズミ抗体を使用する標準的なＥＬＩＳＡ検
定法では、この抗体が２つのネズミ抗体を架橋して、偽
陽性信号を発生させる。偽陽性を減じることは免疫検定
法の開発において重要な目標である。したがって、診断
的検定法において偽陽性を減じる機構は健康管理者にと
って重要である。内因性のヒト抗ウサギ抗体はまれであ
る。さらに、ヒトの抗マウス抗体はネズミ抗体の治療的
使用をも複雑にし得る。例えば、ネズミモノクローナル
-モノクローナル形式を使用する診断的検定法ではネズ
ミのモノクローナル抗体で画像化もしくは治療される個
人中で癌に関連する抗原を検出する能力が損なわれ得
る。ウサギ-ウサギ二重モノクローナル形式またはウサ
ギモノクローナル-ネズミモノクローナル形式はマウス-
マウスモノクローナル形式にとっての必要条件を不必要
にするであろう。

【０００７】免疫検定法においてモノクローナル抗体は
一般的にポリクローナル抗体よりも好ましいのである
が、ウサギモノクローナル抗体を一貫した量または質で
生産するために使用できる効率的な方法は存在しない。
ウサギ骨髄腫やウサギに由来する適当な不死化融合パー
トナーは存在しない。ウサギモノクローナル抗体を生産
するための他の方法にはＳＶ４０(シミアンウイルス４
０)またはＥＢＶ(エプスタイン-バー・ウイルス)を用い
るウサギにおけるＢ細胞形質転換と癌遺伝子トランスフ
ェクションが含まれる。これらの方法はすべて困難であ
ることがわかっており、その結果には一貫性がない(Col
linsら,Proc.Natl.Acad.Sci.71:260-262,1974およびStr
osbergら,米国特許第４８５９５９５号(１９８９年８月
２２日発効)を参照のこと)。ウサギに由来する骨髄腫細
胞系が存在しないので、標準的なモノクローナル抗体技
術は有用でない。したがってウサギのモノクローナル抗
体を生産するための再現性のある方法は現在のところ存
在しない。

【０００８】幾つかの研究機関でヘテロハイブリッドの
作出が考察されている。ある種から単離されて別の種に
由来する不死化細胞と融合された抗体分泌細胞は種間ま
たはヘテロハイブリドーマを与える。本明細書ではヘテ
ロハイブリッド融合という用語を異種間融合と同意義に
使用する。Raybouldらは、ウサギモノクローナル抗体を
分泌するウサギ-マウス・ハイブリドーマを作出する方
法を開示している(Raybouldら,Science 240:1788-1790,
1988およびRaybouldら,米国特許第４９７７０８１号(１
９９０年１２月１１日発効))。マウスの骨髄腫細胞をウ
サギの脾細胞と融合することによってウサギのモノクロ
ーナル抗体が生産された。融合産物をウサギ血清の存在
下で生育させた場合に限って安定な抗体産生が得られ
た。Raybouldらは、ウサギモノクローナル抗体の生産に
とってウサギ血清の使用が必須であるという彼らの結論
を示している。

【０００９】ウサギ血清の存在下で生産されたウサギモ
ノクローナル抗体は血清中に存在する内因性のウサギ抗
体によって汚染されている。ウサギ血清はネズミハイブ
リドーマまたはヘテロハイブリドーマによって生産され
るマイクログラム量のＩｇＧと比較して１０〜３０ｍｇ
／ｍｌの免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)を含有している。モ
ノクローナル抗体調製物中に存在する非特異的ウサギ免
疫グロブリンは、融合産物からの抗体産生を検出するた
めに設計された検定法のバックグラウンドの反応性を増
大させ、その感度を減少させる。診断的検定法用のモノ
クローナル抗体を製造するためには、血清中に存在する
非特異的なウサギ免疫グロブリンからモノクローナル抗
体を精製する必要がある。これらの技術は困難であり、
労働集約的であり、生産コストを増大させる。

【００１０】Raybouldらによって開示された方法など、
種間ハイブリドーマから生産される抗体は不安定な傾向
がある。異常な染色体数ゆえに、分離が常に同一の染色
体対を娘細胞に与えるとは限らず、これらの染色体が失
われることもある。細胞の複製と抗体の産生を維持する
ためには、機能的な再配列した免疫グロブリン重鎖およ
び軽鎖遺伝子を含有する染色体と薬剤耐性を可能にする
染色体の両方が必要である。本発明の詳細な説明に開示
するように(表２および３を参照のこと)、Raybouldの種
間融合物は経時的に不安定であり、抗体の生産に失敗し
た。

【００１１】モノクローナル抗体の商業的使用は、特定
のクローンから生産される抗体の安定性と品質に依存す
る。安定性と品質に加えて、そのクローンから生産され
る抗体の濃度が、商業的に有用な量の抗体を得るに足る
ほど(好ましくは２５μｇ／ｍｌ以上)高くなくてはなら
ない。通常、最も高いレベルの抗体産生は、抗体を腹水
として生産した時に得られる。大量の抗体を得るために
は腹水生産が最もコストがかからず効率的な方法であ
る。通常、ネズミのハイブリドーマは密接に関連したネ
ズミ宿主中で腹水として生産される。ヘテロハイブリド
ーマはネズミ以外の動物に由来する抗体を分泌する。免
疫反応能を有するマウスはヘテロハイブリドーマを異物
であると認識するか、もしくは抗体に対する免疫応答を
発生させるであろう。したがって、ウサギモノクローナ
ル抗体を腹水として生産する方法は当該技術分野におい
て有意義な進歩であろう。

【００１２】ヌードマウス中でウサギ重鎖-ネズミ軽鎖
キメラ抗体を腹水として生産することができるというい
くつかの証拠はあるが、ウサギ軽鎖とウサギ重鎖からな
る抗体を生産するためにマウスを利用することはこれま
でに開示されていない(Dreherら,J.Immunology 130:442
-447,1983)。さらにこれらのキメラクローンもRaybould
らが開示したものも、経時的に安定ではなかった。した
がって、商業的な診断的検定法に有用な抗体量を生産す
ることはできなかった。Wareらはラット×マウスハイブ
リドーマが重度合併型免疫不全(ＳＣＩＤ)マウス中で生
育できることを明らかにした(J.Immunological Methods
85:353-361,1985；この文献は参考文献として本明細書
の一部を構成する)。異種間融合物についての抗体生産
はこれまで組織培養中での抗体生産に限定されていた。
ＳＣＩＤマウスにおける高レベルのヘテロハイブリドー
マ・ウサギ抗体生産はこれまでに立証されていない。

【００１３】ウサギモノクローナル抗体を一貫して生産
する可能性は開示されていない。さらにウサギ血清の非
存在下でウサギモノクローナル抗体を再現可能に生産す
る方法と、抗体産生細胞を腹水腫瘍として生育させる方
法は、当該技術分野において有意義な進歩であろう。そ
うすればウサギモノクローナル抗体を用いることによっ
て、炭水化物に対する抗体を生産する際に伴う困難の幾
分かを克服することができるであろう。

【００１４】本発明は、齧歯目骨髄腫細胞と非形質転換
(形質転換されていない)ウサギ細胞の間の細胞融合の産
物からなる安定な異種間融合パートナーを開示する。本
発明の好ましい態様において、この安定な融合パートナ
ーは検出不可能なレベルの抗体を生産する。齧歯目骨髄
腫細胞は好ましくはマウス由来であり、本発明の特に好
ましい態様ではそのマウス由来の齧歯目骨髄腫細胞がＳ
Ｐ２／０細胞系である。本発明のもう１つの特に好まし
い態様では、安定な融合パートナーがＳＰ２／０細胞と
牛ソマトトロピン感作ウサギ脾細胞の間の細胞融合によ
って誘導される。この融合パートナーはヒポキサンチン
-アミノプテリン-チミン感受性であり、ヒポキサンチン
-グアニン-ホスホリボシル・トランスフェラーゼ欠損性
である。この安定な融合パートナーの天然に存在する変
種や突然変異種も本発明の範囲に包含される。本発明の
もう１つの特に好ましい態様では、安定な融合パートナ
ーが、ブダペスト条約に基づいてアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション(メリーランド州ロックビル)
に培養番号１１０８６として寄託されている細胞系から
なる。

【００１５】本発明のもう１つの好ましい態様には、ウ
サギモノクローナル抗体を分泌する安定な細胞系が包含
される。この安定な細胞系は、齧歯目骨髄腫細胞と非形
質転換ウサギ細胞の融合物からなる安定な異種間融合パ
ートナーと、予定の抗原で感作されていてその抗原に対
する抗体を生産するウサギ脾細胞の融合の産物からな
る。この安定な細胞系は、それ自身は検出可能な量の抗
体を分泌しない安定な異種間融合パートナーを用いた融
合の産物であることが好ましい。さらにこの安定な細胞
系は、安定な異種間融合パートナーがマウス由来の齧歯
目骨髄腫細胞を用いた融合の産物であるような融合の産
物であることが好ましい。またこの細胞系はＳＰ２／０
ネズミ骨髄腫細胞系を用いた融合の産物であることがよ
り好ましく、またウサギ脾細胞が炭水化物抗原で感作さ
れており、これらの脾細胞がその抗原に対する抗体を生
産することがより好ましい。好ましい態様では、安定な
異種間融合パートナーがアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションに細胞培養番号１１０８６として寄託
されている細胞系である。特に好ましい態様では、ウサ
ギ脾細胞がＮ-アセチル-Ｄ-グルコサミンで感作されて
いて、その炭水化物抗原に対する抗体を生産する。

【００１６】さらなる好ましい態様として、ウサギモノ
クローナル抗体を生産する方法であって、非形質転換ウ
サギパートナー細胞を齧歯目骨髄腫細胞と融合して異種
間融合パートナーを作出し、検出不可能なレベルの抗体
を生産する安定な融合パートナーを選択し、その安定な
融合パートナーをウサギ抗体産生細胞と融合し、その融
合段階から得られる抗体産生細胞系であって予定の抗原
に対する抗体を産生する抗体産生細胞系を単離するとい
う段階からなる方法を提供する。ある態様では、その選
択段階がさらに薬剤耐性の安定な融合パートナーを作成
することからなり、その単離段階がさらにその抗体産生
細胞をその薬剤中で生育させることからなる。齧歯目骨
髄腫細胞がマウス由来であり、ウサギ抗体産生細胞が予
定の抗原によって免疫化されたウサギから得られること
が好ましい。この方法の好ましい態様では、安定な融合
パートナーがアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションに培養番号１１０８６として寄託されている細胞
系である。

【００１７】ウサギモノクローナル抗体を生産するもう
１つの好ましい方法では、ＳＰ２／０細胞と牛ソマトト
ロピン感作ウサギ脾細胞の間の融合に由来する安定な融
合パートナーがヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジ
ン感受性であり、ヒポキサンチン-グアニン-ホスホリボ
シル・トランスフェラーゼ欠損性である。この方法は、
安定な融合パートナーをウサギ抗体産生細胞と融合し、
その融合産物を単離し、その融合産物を生育し、その融
合産物から抗体を集めることからなる。ある態様では、
その生育段階がインビボで起こる。このインビボ生育段
階は腹水を生産することからなることが好ましく、その
生育段階は成熟したＴおよびＢリンパ球が欠損したマウ
スに融合産物を導入することからなることがより好まし
い。

【００１８】本明細書に開示する方法を用いれば、安定
な生産的異種間融合パートナーの使用によってウサギモ
ノクローナル抗体を生産することが可能になる。異種間
融合パートナーという用語は、脾細胞と融合することが
できる不死細胞系を得るための２またはそれ以上の細胞
の種間融合を述べるために使用される。ウサギモノクロ
ーナル抗体の再現性ある生産には、部分的にウサギ細胞
に由来する安定な異種間融合パートナー細胞系が必要で
ある。

【００１９】ウサギモノクローナル抗体の再現性ある生
産は当該技術分野で開示されたことがない。２つ以上の
細胞の融合が関与する異種間融合パートナーの使用はい
くつかの系について開示されているが、ウサギについて
は開示されていない。具体的にはOestbergら(米国特許
第４６３４６６４号(１９８７年１月６日発効))とTenga
ら(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 80:7308-7312,1983)が、
ヒトモノクローナル抗体を生産するための異種間融合パ
ートナーの使用を開示している。異種間融合パートナー
は牛と羊のモノクローナル抗体の生産についても記述さ
れているが、腹水生産は開示も記述もされていない(Ken
nedyら,J.Gen.Virol.69:3023-3032,1988およびFlynnら,
J.Immunol.Methods 121:237-246,1989)。

【００２０】ヒトおよび大きい哺乳動物系での成功はウ
サギにおける成功を予言するものではない。骨髄腫細胞
の宿主パートナー細胞との融合は、有用な異種間融合パ
ートナーの作出の成功をひとりでに保証するものではな
い。有用な異種間融合パートナーは経時的な細胞安定性
を示すことが好ましく、少なくとも２４時間の倍加時間
を伴って複製することが好ましい。さらにこれらの細胞
は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン
(ＨＡＴ)に対して感受性であることが好ましい。融合パ
ートナーは少なくとも１つの宿主種特異的染色体を含有
することがより好ましい。この方法によって得られる融
合パートナーのすべてが融合パートナーとして等価にふ
さわしいわけではないことは理解されるが、融合にとっ
て充分にふさわしい安定な融合パートナーの試験および
単離法が詳述されている。本明細書に開示する適切な融
合パートナーの選択は、再現性のある一貫したモノクロ
ーナル抗体の生産を容易にする。したがって、ウサギモ
ノクローナル抗体の製造にとって有用で適当な異種間融
合パートナーを選択するための方法、その融合パートナ
ーを試験するための方法、および高品質で有用な量のウ
サギモノクローナル抗体を生産するために以降の融合に
おいてその融合パートナーを使用する方法が開示されて
いる。さらに、本発明に概略を記す方法を用いて得られ
る異種間融合パートナーの具体例はアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(メリーランド州ロックビ
ル：ＡＴＣＣ)にＣＲＬ１１０８６として寄託されてい
る。

【００２１】適当な融合パートナーの作出と同定は、異
種間融合から得られるモノクローナル抗体の生産にとっ
て必須である。マウスまたはラット骨髄腫(または他の
齧歯目不死化細胞)の、異なる種から得られる脾細胞ま
たは他の細胞との異種間融合は、しばしば遺伝的に不安
定な細胞を作出する。培養中のさらなる細胞継代に伴っ
て細胞から染色体が欠失する。したがって、マウス骨髄
腫の、別の免疫化した動物に由来する脾細胞との融合産
物は最初は抗体を分泌し得る。時間と共に染色体の欠失
が抗体発現の欠失をもたらすであろう。Raybouldらが開
示しているように、種特異的血清や追加の添加物などの
培地成分がこれらの細胞系を維持するために必要とされ
ることもあろう。したがって、骨髄腫細胞と異なる種に
由来する脾細胞の異種間融合物の多くについては、抗体
生産が経時的に安定ではない。

【００２２】本発明の好ましい態様として、齧歯目骨髄
腫細胞を非形質転換ウサギパートナー細胞と融合するこ
とによって、安定な異種間融合パートナーを作出する。
本発明を実施する際にラットもしくはマウスの骨髄腫細
胞を使用し得ることは本発明の範囲に包含される。骨髄
腫細胞は不死化された血漿細胞であり、当該技術分野で
使用される骨髄腫細胞は多様に存在する。マウス骨髄腫
細胞系ＳＰ２／０などのいくつかはネズミ細胞系Ｐ３と
ネズミ脾細胞の融合産物である。他の骨髄腫細胞は軽鎖
抗体タンパク質を分泌もしくは生産する。脾細胞との融
合にふさわしいことが当該技術分野で知られているマウ
スの不死化細胞系はいくつか存在する。本発明で使用す
ることができる考え得るマウス骨髄腫細胞系にはＭＯＰ
Ｃ２１やＰ３Ｘ６３ＡＧ８(ＡＴＣＣ番号Ｔ１Ｂ９)など
のＩｇＧ分泌マウス骨髄腫細胞や、より好ましくはＳＰ
２／０(ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １５８１)、ＮＳ-１(ＡＴ
ＣＣ番号ＴＩＢ１８)、Ｐ３.Ｘ６３ＡＧ８.６５３(ＡＴ
ＣＣ番号ＣＲＬ １５８０)、Ｆ０，Ｓ１９４／５.ＸＸ
Ｏ.ＢＵ-１(ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １５８０)およびＦＯ
Ｘ-ＮＹ(ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １７３２)などの非抗体分
泌細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではな
い。これらの細胞系はＡＴＣＣ(メリーランド州ロック
ビル)から入手することができる。ＳＰ２／０は当該技
術分野でよく特徴付けられており、抗体軽鎖または重鎖
タンパク質を分泌しないので、下記の実施例では不死化
細胞としてこの細胞系を使用した。ＳＰ２／０細胞系統
の歴史と他の骨髄腫との関係についてはHarlowらのAnti
bodies：A Laboratory Manual,145頁を参照のこと。

【００２３】有用な不死化融合パートナーの作出に、少
なくとも１つのウサギ染色体から不死化された細胞染色
体上に転座された少なくとも１つのウサギ染色体または
遺伝子が要求されることは、本発明の範囲内で予期され
ることである。したがって、不死化融合パートナーの候
補には、ヒト、マウス、ヤギなどかなり多数の種に由来
する不死化細胞誘導体が含まれ得る。次いで、この不死
化融合パートナーをウサギ抗体産生細胞に融合する。し
かし、ウサギ抗体の生産にとっては、ウサギ免疫グロブ
リンの発現を可能にするウサギ染色体の必須部分の染色
体転座で充分であると考えられる。したがって、ウサギ
染色体の同定それ自体は融合パートナーの選択にとって
正確な予言者ではない。

【００２４】融合に用いられる非形質転換パートナー細
胞は、ウサギに由来するＢ細胞系統の成長調節された細
胞である。本発明の好ましい態様では、この細胞はウサ
ギ脾細胞である。実施例１は、牛ソマトトロピンで免疫
化したウサギから得たウサギ脾細胞との融合の産物であ
る異種間融合パートナーの作出を詳述するものである。
牛ソマトトロピンは免疫原の具体例である。したがっ
て、別の免疫原を使用することによって、融合パートナ
ーを作出するために使用するウサギ供給源中での免疫応
答を得ることができるということも予期される。さら
に、融合パートナーを得るためにマウス骨髄腫細胞との
融合で用いられる脾細胞が免疫化されたウサギに由来す
る必要がないことも本発明の範囲内で予期される。とい
うのは、免疫化は適当な異種間パートナーの同定にとっ
て必要条件ではないからである。

【００２５】不死化細胞と非形質転換ウサギパートナー
細胞の間の細胞融合は当該技術分野で既知のいくつかの
方法を用いて行うことができる。融合を促進する化学物
質は一般にフソーゲン(fusogen)と呼ばれている。これ
らの薬剤は極めて親水的で、膜接触を容易にする。細胞
融合の１つの方法として、ポリエチレングリコールを用
いて細胞を融合させる。細胞融合の方法の好ましい態様
として、実施例５および「安定な融合パートナーのウサ
ギ脾細胞との融合」と題した章に記述する方法に準じ
る。代表的融合パートナーであるＯＭＢ-０３７を作出
するために使用する方法の特定の例を実施例１に記載す
る。

【００２６】細胞融合を容易にするために同様に使用さ
れ得る他の方法には電気融合が含まれる。この方法では
細胞を特殊な緩衝液中に置き、細胞膜の電位を変化させ
細胞融合の可能性を増大させる予め決定された放電にさ
らす。本発明での使用が予期される他の細胞融合法は架
橋融合法(bridged-fusion method)などである。架橋融
合法の一例として、抗原をビオチニル化し、骨髄腫をア
ビジニル化する。細胞を共に加えると、抗原反応性Ｂ細
胞-抗原-ビオチン-アビジン-骨髄腫橋が形成される。こ
れは抗原反応性細胞の不死化細胞との特異的な融合を可
能にする。この方法では細胞融合を容易にするために化
学的手段または電気的手段を追加的に使用してもよい。

【００２７】実施例１の異種間融合について概略を記し
た互換性の培地中で融合産物を生育させる。実施例１に
記載の如く、融合の後、細胞をヒポキサンチン、アミノ
プテリンおよびチミジン(ＨＡＴ)感受性について選択す
る。この融合産物は抗体を生産しないことが好ましい。
非形質転換ウサギ細胞がウサギ脾細胞(特に免疫化した
ウサギから得られるウサギ脾細胞)に由来する場合に
は、その細胞上清を、軽抗体鎖もしくは重抗体鎖の生産
を含む抗体生産について調べる必要がある。ＨＡＴ耐性
であって抗体を分泌しない融合産物を選択する一方法と
して、ＨＡＴに対して感受性であって８-アザグアニン
耐性である融合産物から得られる上清を、当該技術分野
でよく知られている標準的なＥＬＩＳＡを用いてＩｇＧ
の存在について試験する。抗体タンパク質を可視化する
ために、セルロースアセテートまたはポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を用いて上清をさらに電気泳動する。最
後に、融合産物から得られる細胞溶解液をＩｇＧ特異的
ｍＲＮＡについて試験する。ＩｇＧ生産について陰性と
試験された細胞を融合パートナーとしての効能について
試験する。

【００２８】異種間融合にとって有用な候補は、好まし
くは少なくとも２４時間に１回倍加し、抗体タンパク質
を生産せず、しかも８-アザグアニン耐性になり得る融
合産物である。８-アザグアニン耐性の候補融合パート
ナーを作成する方法を実施例３に記載する。８-アザグ
アニン耐性に代わるものとして、細胞を５ＢＵｄＲ(５-
ブロモデオキシウリジン)耐性にすることもできる。こ
のような方法は、Antibodies：A Laboratory Manual(Ha
rlowら,上述)を含むモノクローナル抗体生産の一般的な
実験書に記述されている。融合産物を選択するのに適し
た他の選択可能な薬剤は当該技術分野で公知である。他
の選択系のあらましについてはKlein,J.(1982),Immunol
ogy：The science of Self-Nonself Discrimination(ジ
ェイ・ウィリー・アンド・サンズ,ニューヨーク)を参照の
こと。

【００２９】ウサギモノクローナル抗体の生産に適した
安定な融合パートナーの開発および選択の例として、実
施例１に記載の免疫化手法を用いて牛ソマトトロピンで
免疫化したウサギから得た脾細胞であって、マウス骨髄
腫細胞系ＳＰ２／０に融合した脾細胞から融合パートナ
ーＯＭＢ-０３７を選択した。

【００３０】得られた融合パートナーを抗体分泌および
成長特性について試験し、また核型分類によって調べ
た。その融合パートナーを以降のウサギ脾細胞融合で試
験し、ウサギモノクローナル抗体の生産について調べ
た。融合パートナー細胞系ＯＭＢ-０３７の染色体展開
の写真の模式図を図１に示す。ウサギ染色体を矢印で同
定する。マウスは次端部動原体型の染色体４４個をもっ
ているが、ウサギ細胞は中部動原体型の染色体４０個を
もっている。もともとこの細胞系は６〜８個のウサギ染
色体を含有しており、この染色体数は９カ月の連続的培
養の間一定であった。約１年の培養後この細胞系は１つ
のウサギ染色体を含有していた。この経時的な染色体の
喪失にもかかわらず、この細胞は融合パートナーとして
効率よく機能し、この異種間融合パートナーを抗体産生
細胞と融合させることによって作出したモノクローナル
抗体産生細胞は培養中で１年にわたって安定であった。
一定の融合効率を保証するために、まず異種間融合パー
トナーを拡張し、凍結した。新しい凍結物を６カ月ごと
に用いた。適当な異種間融合パートナーを長期間使用す
るための手法を実施例２に記載する。ＯＭＢ-０３７の
核型が経時的にわずかに変化するにもかかわらず、６カ
月ごとに融解した新しいバッチは一貫した融合を確実に
した。

【００３１】ウサギモノクローナル抗体を生産するため
に、安定な融合パートナーをウサギ抗体を産生する細胞
に融合した。潜在的にはウサギ抗体を産生するあらゆる
細胞を、異種間融合パートナーとの融合に使用すること
ができる。当該技術分野でよく知られている方法を用い
て、選択した抗原でウサギを免疫化することによってウ
サギ抗体産生細胞を得た。ウサギ免疫化の方法の概略に
ついてはHarlowらの文献(上述,92〜114頁)を参照のこ
と。

【００３２】一般に、免疫原が免疫原性であるためには
２つの規準を満たさなくてはならない。第１に免疫原は
抗体結合のための部位を保持しなければならず、第２に
免疫原はクラスＩＩ／Ｔ細胞相互作用のための部位を保
持しなければならない。したがってほとんどの外来タン
パク質はこれらの規準を満たし、免疫性である。タンパ
ク質に結合した炭水化物基もしくは炭水化物単独による
ウサギの免疫化を用いて免疫応答を開始させることがで
きる。一般に、タンパク質に結合した炭水化物でウサギ
を免疫化することによって、よりよい免疫原性応答が得
られる。ウサギモノクローナル抗体の生産を容易にする
という融合パートナーの能力、より具体的には、炭水化
物部分に対するモノクローナル抗体を生産するという融
合パートナーの能力の実例として、代表的融合パートナ
ーＯＭＢ-０３７を、ペプシン消化したＡ群ストレプト
コッカス(ＧＡＳ)で免疫化したウサギから得た脾細胞と
融合した。

【００３３】以下に概略を記す実施例４では、ペプシン
消化したＡ群ストレプトコッカス・ピロゲンス(Strepto
coccus pyrogens)(細胞壁除去したもの)を用いて免疫応
答を開始させた。Ａ群ストレプトコッカス特異的エピト
ープ(Ｎ-アセチルグルコサミン)の精製した調製物は使
用しなかった。その理由は、Ｎ-アセチルグルコサミン
(ＮＡＧ)の画分が濃縮された亜硝酸抽出物が、免疫化し
た動物をおそらく麻痺させるであろうと思われるからで
ある。このエピトープに対する高親和性モノクローナル
抗体をマウス中で発生させることが困難であることは当
該技術分野でよく知られている。

【００３４】ポリペプチドによる免疫化の方法は当該技
術分野で充分に報告されている。一般的に、抗原をフロ
イントなどのアジュバントと組み合わせて導入すること
によってまず動物を免疫化する(Harlowら,上述)。さら
に他のアジュバントも当該技術分野で記述されている。
続いて、不完全フロイントアジュバントまたは別のアジ
ュバントと共同させて、あるいは単独で、アジュバント
なしで、抗原の追加免疫注射を行う。通常、動物に最初
の注射を行い、免疫グロブリン応答が発生して分泌され
た抗体が浄化されたその２ないし４週間後に、ＩｇＧ応
答を発生させるために追加免疫注射を行う。

【００３５】炭水化物に対して免疫化する方法は様々で
ある。炭水化物免疫化に適した一方法、具体的にはＡ群
ストレプトコッカスに適した一方法を実施例４に記載す
るが、この方法はOsterlandらの方法(J.Exp.Med.123:59
9-614,1966；この文献は参考文献として本明細書の一部
を構成する)を適合させたものである。この免疫化手法
でウサギを３週間試験した。通常はこの時間枠内で充分
な力価に到達した。そうでない場合には、許容できる力
価が測定されるまで、最大の抗原投与量で、隔週ごとに
抗原の追加免疫をウサギに静脈内投与(ＩＶ)した。有用
な抗体力価を得るために、実施例４に記載する手法の変
法や他の免疫化手法を追加して使用することもできよ
う。

【００３６】さらに、ウサギ細胞をインビトロで免疫化
し得ることも本発明の範囲内で予期される。培養中のヒ
トリンパ球を免疫化する手法を利用することができる。
インビトロ免疫化技術の概略についてはJamesら,J.Immu
nol.Methods 100:5-40,1987(この文献は参考文献として
本明細書の一部を構成する)を参照のこと。

【００３７】上述の方法もしくは当該技術分野で公知の
他の方法に従って、ウサギを抗原で免疫化する。課題の
抗原に対して適当な抗体力価(好ましくは同じウサギか
ら得た免疫前の血清より２〜３倍高い範囲内)を含有す
るウサギを選択して使用する。下記実施例４では、融合
の３日前に、選択したウサギをＡ群ストレプトコッカス
(ＧＡＳ)で最後に追加免疫した。

【００３８】細胞融合のためにウサギ脾細胞の単細胞懸
濁液を作成および調製する方法は文献中に容易に認めら
れる。本発明で使用した方法はマウスの脾細胞を作成す
るために使用される方法と類似するものである。簡単に
述べると、ウサギを犠牲にし、その脾臓を物理的に細か
く裂き、リン酸緩衝化食塩水やＨＢ-ＧＲＯ培地(イルビ
ン・サイエンティフィク，カリフォルニア州サンタ・ア
ナ)などの適当な培地に再懸濁した。当該技術分野公知
の方法を用いて細胞濃度を決定し、その濃度を２.５×
１０⁶細胞／ｍｌに調節した。マクロファージなどのリ
ソソーム濃縮細胞を殺すためにｌｅｕ-ｌｅｕ-ｏｍｅペ
プチド(Ｌ-ロイシン-Ｌ-ロイシンメチルエステル；ベー
リンガー・マンハイム，インディアナ州インディアナポ
リス)を加えた。この細胞を遠心沈降させ、融合パート
ナーと混合した。

【００３９】ハイブリドーマを作出するために細胞融合
を容易にする方法は当該技術分野で数多く知られてい
る。ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)は標準的な融合媒
介剤である。融合パートナー細胞に対する脾細胞の細胞
比はそれぞれ特定の融合条件について最適化されるであ
ろう。融合パートナーに対する細胞比は慣用的には２：
１から１０：１まで変化する。さらにＰＥＧの至適濃度
もＰＥＧの分子量に応じて変化するであろう。下記の実
施例５では３５％ＰＥＧ１５００を選択したが、例えば
５０％ＰＥＧ４０００といった他の分子量ＰＥＧの他の
濃度も細胞融合を容易にするために代替的に使用するこ
とができよう。

【００４０】融合効率を最大化することは、とりわけ炭
水化物のように免疫応答を容易に発生させないエピトー
プにとっては重要なことである。融合パートナーと培養
培地は本融合において良好な融合効率を得る際に最も重
要な変数の２つである。ウサギ抗体産生細胞が検出され
なくなる危険性を減じるために、融合効率は１００％
(換言すれば、細胞を含有する組織細胞ウェルすべての
生育)に近づくべきである。Raybouldらの米国特許第４
９７７０８１号は、マウスの不死化細胞とウサギの脾細
胞をウサギ血清の存在下で融合させることによるウサギ
モノクローナル抗体の生産を教示している。さらにRayb
ouldらは、ウサギモノクローナル抗体の生産には正常な
ウサギの血清が必要であることを示している。

【００４１】Raybouldのウサギモノクローナル抗体法を
他の融合の組み合わせおよび条件と比較した。融合パー
トナーの最適な組み合わせと培地を決定するための研究
として、本発明を用いて得た融合パートナーＯＭＢ-０
３７をネズミ骨髄腫融合パートナーＳＰ２／０およびＰ
３．６５３と比較した。ウサギ血清補足培地(ＲＳ)、馬
血清(ＨＳ)、牛胎児血清(ＦＣＳ)および脾臓調整培地
(ＳＣＭ)を融合パートナーと組み合わせて比較した。脾
臓調整培地は、スピナー培養として１×１０⁶細胞／ｍ
ｌの濃度で接種し、標準的な培地(ＨＢ-ＧＲＯ)中で４
８時間培養した正常な脾細胞から上清として収集した。
培養を２０％の最終濃度で使用した。

【００４２】ウサギ脾細胞を免疫化していない動物から
得た点を除いて実施例５に記述の如く融合を行った。試
験した様々な培養条件を図２の水平軸に記載する。Rayb
ouldの組み合わせを矢印で示す。図２に例示されるよう
に、融合パートナーＯＭＢ-０３７を用いることによっ
て最高の融合効率が得られた。Raybouldとは対照的に、
最適な融合効率はウサギ血清の存在に依存しなかった。
各試料について、接種したウェル数に対する生存可能な
ハイブリッドを含有するウェル数として結果を表す。各
試料群について最低２８８ウェルを使用した。融合産物
の大きさとウェル中での細胞成長の存在によって融合産
物をウェル中で同定した。これらの方法はウサギモノク
ローナル抗体を生産するために選択された細胞融合にお
ける融合効率を試験する方法の具体例である。

【００４３】ＯＭＢ-０３７を用いた以降の融合では、
実施例５に概略を記した如く、成長補足物として牛胎児
血清(ＦＣＳ)を用いた。ウサギ血清はハイブリドーマの
同定工程を複雑にすることがわかった。その理由はウサ
ギ血清中に存在する抗体が検定の特異性を減じたからで
ある。

【００４４】融合が完結したら、抗体産生細胞を含有す
るウェルを約２〜３週間生育させ、陽性クローンを選択
し、さらなる分析のためにサブクローン化する。興味あ
る特定のクローンを選択する方法はハイブリドーマ技術
の分野でよく知られている。方法と選択技術の概略につ
いては一般にNakamuraら,Immunochemical Assays andBi
osensor Technology for the 1990s(米国微生物学会,19
92,ワシントンD.C.)を参照のこと。実施例５に記述の如
く、１８日後にハイブリドーマ上清を特異的な抗体生産
についてスクリーニングする。ハイブリッドを含有する
ウェルはこの特定の抗原のために設計した３レベルの試
験を経た。検定法開発の当業者が様々な抗原について同
様に適当な検定法を開発し得るであろうことは予期され
る。３段階の試験のそれぞれにおいて陽性であった選択
クローンを連続的な培養として保持し、それらのモノク
ローン性を確実にするために少なくとも１回はサブクロ
ーン化した。

【００４５】一連の３つの連続的試験を用いてＧＡＳ特
異的抗体を発現するクローンを検出した。これらのＥＬ
ＩＳＡ形式は、ポリクローナル血清、ハイブリドーマ上
清および腹水液中のＡ群ストレプトコッカス特異的抗体
の存在を検出するために開発された。この３つの検定法
すべてを実施例６に詳述する。第１の試験はペプシン消
化したＡ群ストレプトコッカスに対する抗体の存在を検
出した。第１のスクリーニングの結果を下記の表１に記
載する。第２のスクリーニングでは、第１の試験に合格
したクローンから生産される抗体を２形態の抗原を用い
て再試験した。ペプシン消化した細胞抽出物を第１のス
クリーニングと同様に使用し、さらにＡ群ストレプトコ
ッカスの亜硝酸抽出物(ＮＡＥ)を用いて抗体を試験し
た。Ａ群ストレプトコッカスの亜硝酸抽出物を調製する
方法を実施例６に記述する。この亜硝酸抽出物はエピト
ープ付与基特異性を含む細胞由来の炭水化物の濃縮物で
あり、陽性クローンがＡ群ストレプトコッカスに対して
特異的な抗体を生産していることの推定的証拠である。
陽性ウェルを拡張し、Ａ群ストレプトコッカスに対する
特異的な抗体によって認識されるエピトープであるＮ-
アセチル-Ｄ-グルコサミンによる阻害によって群特異的
であることを確認した。スクリーニングは数週間にわた
って行われることが好ましく、これはクローン安定性の
第１の指標である。第３の試験では、第２の試験で同定
された陽性クローンから得られる抗体をさらにＮ-アセ
チルグルコサミンを用いる阻害検定法によって試験し
て、抗体特異性がＧＡＳ炭水化物エピトープに指向して
いることを確認した。ＳＡ１Ｇと同定した１融合物から
得られる結果を下記の表１に記載する。

【００４６】これらのＥＬＩＳＡに代わるものとして、
興味のウサギモノクローナル抗体をコートし、次いでそ
の抗原、さらに定量を容易にするのに適したラベルを含
有する抗原特異的モノクローナル抗体が続くサンドイッ
チＥＬＩＳＡを用いて、試料をさらに試験することがで
きる。

【表１】 融合の要約 第１スクリーニング 再試験 最終試験 抗原 ペプシン ペプシン及びＮＡＥ Ｎ-アセチル-Ｄ-グル コサミンによる阻害 目的 検出 確認 特異性 結果 １２２／２８４４ ３０／１２２ ９／３０ (SA1G) (４％) (２５％) （３０％）

【００４７】ウサギモノクローナル抗体産生細胞系が有
用であるためには、それが安定でなければならない。異
種間融合の産物はしばしば不安定である。ＯＭＢとＦＣ
Ｓを用いて実施例５に概略を記したように行った融合物
ＳＡ１Ｇについて、実施例６と表１の第３欄に概略を記
したスクリーニング試験から同定された９クローンのう
ちの１クローンをＳＡ１Ｇ７-５１６と同定した。この
クローンをサブクローニングのために選択した。サブク
ローニングの成功はそのクローンが安定で均一であるこ
とを確実にするので、サブクローニングは商業化が可能
な抗体の開発にとっては重要なことである。したがっ
て、本発明の方法を用いて同定される抗原特異的ウサギ
抗体産生クローンのほとんどはサブクローニングされる
であろう。

【００４８】サブクローニング法の実例として、融合の
４カ月後にクローンＳＡ１Ｇ７-５１６を限界希釈(１／
３ 細胞／ウェル)によってサブクローン化した。細胞を
６つの９６穴プレートに分配し、５５個のサブクローン
を抗体特異性についてスクリーニングした。これら５５
個のサブクローンのうち、１５クローン(２７％)が陽性
であった。他のクローンが異なる百分率の陽性サブクロ
ーンを生み出すであろうことは予期される。異種間融合
は、ネズミ×ネズミまたはラット×ラットが関与する同
種内または同系間融合と比較して、いくらか低い陽性サ
ブクローン率を有するであろうと予想される。

【００４９】これらのクローンを長期間安定性について
追跡調査した。安定性は商業的な検定法の開発によって
好ましいことである。ＳＡ１Ｇ７-５１６.５という１サ
ブクローンを、ペプシン消化したＡ群ストレプトコッカ
スに対する反応性について定期的に試験しながら長期間
安定性について追跡調査した(方法については実施例６
を参照のこと)。このクローンは本方法によって作成さ
れた他のものと同様に培養中で１２カ月にわたって安定
であり、ＧＡＳ特異的抗体を生産し続けた。

【００５０】図３はクローンＳＡ１Ｇ７-５１６.５の安
定性を陽性対照と比較して例示するものである。陽性対
照は各試験日について一定の濃度に希釈した市販のウサ
ギポリクローナル抗Ａ群ストレプトコッカス血清であ
る。この陽性対照は検定法の一貫性の尺度として機能す
る。クローンＳＡ１Ｇ７-５１６.５を培養中で９カ月維
持し、実施例６に記述の方法の１つなどの抗原特異的検
定法で定期的にウサギＩｇＧ分泌について試験した。ペ
プシン消化したＡ群ストレプトコッカスをプレート上に
コートした。ヤギ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ複合体を用い、オルト-フェニルアミンジアミン
(ＯＰＤ，シグマ，ミズーリ州セントルイス)を基質とし
て、培養上清を検出した。図３に記載の結果をＯＤ₄₉₀
でＥＬＩＳＡプレート読取り装置から読み取った。光学
密度の増大は抗体量の増大に対応する。図３は陽性対照
と比較して、クローンＳＡ１Ｇが経時的に安定であるこ
とを示している。

【００５１】当該技術分野で利用できる他の方法と比較
してウサギモノクローナル抗体を作成する方法の有用性
のさらなる尺度として、Raybouldらが牛胎児血清適合細
胞として作成し寄託した代表的クローンＡＴＣＣ ＨＢ
９６９６の安定性と抗体産出量を比較した。実験の詳細
は実施例７に記述する。ＨＢ ９６９６を１０％牛胎児
血清を補足したダルベッコ最小必須培地(ＤＭＥＭ)中で
Raybouldの指示に従って生育させた。表２は本発明の方
法によって導かれたクローンとＡＴＣＣクローンＨＢ
９６９６との比較を表している。表２の結果は、ＮＡＥ
もしくはペプシン消化したＡ群ストレプトコッカスの抗
原特異的ＥＬＩＳＡを用いて作成された。ウサギＡ群ス
トレプトコッカスポリクローナル抗体とクローンＳＡ１
Ｆ ７-２０５、７-４７９、７-４９０および７-５７２
に由来するウサギモノクローナル抗体をＨＢ ９６９６
から得られる抗体と同様に比較した。ＳＡ１Ｇクローン
と同様に、ＳＡ１ＦクローンもＳＡ１Ｇについて開示し
た方法と同じ方法を用いてウサギ脾細胞をＯＭＢ-０３
７と融合することによってもたらされた(実施例５を参
照のこと)。

【００５２】表３は上記培養によって生産されるウサギ
免疫グロブリンの量を定量するための検定の結果を示
す。ＥＬＩＳＡによってＩｇＧ濃度を決定するために、
１.６〜１０００ｎｇ／ｍｌにわたるＡ群ストレプトコ
ッカスポリクローナル抗体を用いた。少なくとも一回は
同様に凍結され融解されたＳＡ１Ｇクローンと比較し
て、ＡＴＣＣ ＨＢ ９６９６はＡＴＣＣによって提供さ
れた生育条件を用いて検出可能な抗体を生産することが
できなかった。

【表２】 ＲＭＨ-Ｂ５２の評価 Ａｇ特異的検定 ＮＡＥ(ＯＤ＠４９０ｎｍ) Ｐｅｐ(ＯＤ＠４９０ｎｍ) ＮＳＢ ０.０ ０.０ 陽性(10μg／ml) ３.９±０.０５ ２.９±０.１ 陰性 ０.０ ０.０ 本発明のクローン： ＳＡ１Ｆ ７-２０５ ２.９ ０.７ ＳＡ１Ｆ ７-４７９ ２.６ １.２ ＳＡ１Ｆ ７-４９０ ２.８ ０.７ ＳＡ１Ｆ ７-５７２ ２.６ １.２ ＡＴＣＣクローン: ＲＭＨ-Ｂ５２ ０.０±０.０ ０.０±０.０

【表３】 ウサギ免疫グロブリン検定 標 準 ＯＤ＠４９０ｎｍ 陽 性 １０００ｎｇ／ｍｌ ３.１±０.２３ ２００ｎｇ／ｍｌ ２.９±０.２６ ４０ｎｇ／ｍｌ １.４±０.０４ ８ｎｇ／ｍｌ ０.４±０.０ １.６ｎｇ／ｍｌ ０.１±０.０ 陰 性 ０ｎｇ／ｍｌ ０.０±０.０ ＲＭＨ-Ｂ５２ 培養上清 ０.０±０.０

【００５３】インビトロまたはインビボで抗体を大量に
生産することはできる。しかし腹水としての抗体のイン
ビボ生産はインビトロ拡張よりも迅速に高い濃度の抗体
を生産する。ほとんどの異種間融合物は腹水中で充分に
生育しない。その理由の一部はマウスを宿主とする腹水
成長が融合産物を異物として認識することにある。クロ
ーンの表面上に発現した決定基も同様に異物と見なされ
るので、腹水生産の効率は体液性免疫応答および細胞性
免疫応答によって損なわれる。

【００５４】異種間抗体生産に伴う免疫応答を回避する
ために、ヌードマウスもしくは重度合併型免疫不全マウ
ス(ＳＣＩＤ)中でクローンを腹水として生育した。免疫
不全マウスを取り扱う技術は当該技術分野で公知である
から、ここではそれらの警告を繰り返さない。

【００５５】異種間融合パートナーから得られる安定な
ハイブリドーマクローンはヌードマウスまたは重度合併
型免疫不全マウス中に注射されることが好ましい(実施
例８を参照のこと)。腹水生産の方法も当該技術分野で
はよく知られている(Harlowら,上述,を参照のこと)。簡
単に述べると、クローンを生育培地(１０％ＦＣＳを含
むＨＢ-ＧＲＯ)中に調製し、クローンを注射する５日前
に不完全フロイントアジュバントで感作しておいたヌー
ドマウスまたはＳＣＩＤマウス中に注射した。

【００５６】腹水の試料をウサギ由来およびマウス由来
の抗体の存在について試験し、興味の特定の抗原に対す
る抗体特異性について調べる。クローンをマウスに注射
した２〜３週間後に腹腔の腹水液を集め、試料をセルロ
ールアセテートゲル上に充填して抗体タンパク質の存在
について検査する。セルロールアセテートゲル電気泳動
は電荷に基づいて分子を分離する。図４はクローンＳＡ
１Ｇ７-５１６.５を用いた粗製腹水の一部を含有するセ
ルロールアセテートゲルの写真の模式図である。この模
式図はＳＡ１Ｇ細胞がヌードマウスおよびＳＣＩＤマウ
スの両方で抗体を腹水として生産することを示してい
る。矢印はヌードマウスおよびＳＣＩＤマウスの両方か
ら得たウサギ試料中の免疫グロブリンの存在を示す。右
に移動して次のバンドはトランスフェリンであり、この
模式図の右端にある重いバンドはアルブミンである。こ
れらのクローンから得られる腹水を実施例６の方法を用
いるＥＬＩＳＡによってさらに試験して、Ａ群ストレプ
トコッカスに対するウサギ抗体の特異性を確認した。

【００５７】腹水中の抗体含量とウサギモノクローナル
抗体の存在を、実施例６に記述する３つの検定法を用い
て確認した。第１の検定ではペプシン消化したＧＡＳ
(１ＯＤ＝Ａ₆₆₀の１：４００の濃度)をプレート上にコ
ートした。腹水を加え、西洋ワサビペルオキシダーゼ
(ＨＲＰ)に結合したヤギ抗ウサギ抗体(フィッシャー・
バイオテック,ペンシルバニア州ピッツバーグ；１：１
０００に希釈した０.４ｍｇ／ｍｌの貯蔵液を用いた)で
プローブした。ヌードマウスとＳＣＩＤマウス両方の腹
水の力価を、ＯＭＢ-０３７を対照として用いた腹水生
産と比較した。その結果はＳＡ１Ｇ調製物が大量のウサ
ギ抗体を含有することを示した。この検定の結果を図５
に記載する。

【００５８】マウス免疫グロブリンのための検定法を用
いて、混入したネズミ免疫グロブリンの存在と腹水宿主
としてのＳＣＩＤマウスの有用性をヌードマウスと比較
して決定した。このＥＬＩＳＡではヤギ抗ネズミＩｇＧ
(フィッシャー・バイオテック,ペンシルバニア州ピッツ
バーグ：１ｍｇ／ｍｌ，２５０ｎｇ／ウェル)をコーテ
ィング抗体として使用した。腹水試料を加え、マウス由
来の抗体をＨＲＰでラベルした第２ヤギ抗ネズミ抗体
(フィッシャー・バイオテック；０.４ｍｇ／ｍｌ，２０
ｎｇ／ウェル)を用いて検出した。結果を図６に記載す
る。共にヌードマウスから得た試料ＯＭＢ-０３７およ
びＳＡ１Ｇは大量のネズミ免疫グロブリンを含有してい
た。逆に、ＳＣＩＤマウスから得たＳＡ１Ｇ腹水は極め
て少量のネズミ免疫グロブリンしか含有していなかっ
た。

【００５９】ネズミ×ネズミ融合のハイブリッドから得
た腹水はハイブリッド細胞からの抗体と腹水を生産する
宿主からの抗体を共に含有する。このことは異種間ハイ
ブリッドを注射した場合にも当てはまり、ネズミ抗体は
ウサギ抗体と共に精製されるであろうから、これらのマ
ウス抗体は精製の問題を提起し得る。ＴおよびＢ細胞成
熟が遮断されているＳＣＩＤマウスの使用はネズミ免疫
グロブリンのバックグラウンドを減少させることがわか
った(図７を参照のこと)。したがって、本発明の方法に
よって生産されるウサギモノクローナル抗体が、好まし
くはＳＣＩＤマウス中で腹水として都合よく生育するこ
とによって、商業的な量と品質の抗体を与えることは、
本発明の範囲内で予期されることである。

【００６０】腹水によって生産されるウサギ抗体の特異
性を、抗原特異的な免疫グロブリンについての捕捉検定
によって決定した。ペプシン消化したＡ群ストレプトコ
ッカスまたはＮＡＥ抽出した炭水化物を用いてＥＬＩＳ
Ａプレートをコートした。腹水の一部を加え、反応性の
抗体をＨＲＰでラベルしたヤギ抗ウサギＩｇＧで検出し
た。これらの比較の結果を図７に記載する。ＯＭＢ-０
３７クローンを用いた腹水は特定の抗原に対して反応し
なかったが、ＳＡ１Ｇクローンはヌードマウス中もしく
はＳＣＩＤマウス中で生育して抗原特異的な抗体を生産
した。

【００６１】診断的検定における一貫した反応性には精
製したモノクローナル抗体が要求される。免疫グロブリ
ンを含む混入タンパク質は非特異的な反応を増大させる
ことによって免疫検定の感度のレベルを低下させる。多
くの応用にとってカラム精製は必ずしも必要ではない
が、モノクローナル抗体の反復可能な一貫した性能には
一般に精製が必要とされる。抗体を精製する様々な方法
は当業者には公知であるから、以下に概略を記す抗体精
製法の提案を、本発明の範囲を限定するものと見なして
はならない。

【００６２】抗体を含有する腹水を飽和硫酸アンモニウ
ムで浄化し、リポタンパク質を硫酸デキストラン沈殿に
よって除去した。ウサギ抗体をＱセファロースカラム
(ファルマシア,ニュージャージー州ピスカタウェイ)も
しくはＮ-アセチルグルコサミンアガロース免疫アフィ
ニティーカラム上で分離することによって精製した。カ
ラムクロマトグラフィーを用いて抗体を分離し精製する
方法は当該技術分野で公知である。ウサギモノクローナ
ル抗体の精製に適合させ得るカラムクロマトグラフィー
の基本的な方法にはClezardinらとTasakaらの方法(それ
ぞれJ.Chromatogr.319:67-77 1985とActa Histochem.Cy
tochem 17:283-286,1984；これらの文献は参考文献とし
て本明細書の一部を構成する)が含まれる。カラムから
様々な画分を溶出させて、ＥＬＩＳＡによって試験す
る。ウサギ免疫グロブリンを含有する単一ピークを図５
との関連で説明した方法を用いて試験し、図７に関連し
て説明した方法を用いてＡ群抗ストレプトコッカス活性
を確認した。ウサギモノクローナル抗体精製法の具体例
を実施例９に記載する。

【００６３】抗体のＫ_aを当該技術分野公知の技術を用
いて決定した(Lindmoら,J.Immunol.Methods 72:77-89,1
984を参照のこと)。簡単に述べると、ウサギポリクロー
ナル抗ＧＡＳ抗体(イムセル,メイン州ポートランド)で
予備コートしたポリスチレンビーズ上に抗原(ここでは
ＮＡＥ抽出物)を固定化することによって固相検定法を
用いてＫ_aを決定した。抗体をポリスチレンビーズに結
合させる方法は製造者から入手することができ、当該技
術分野でよく知られている。ポリクローナル抗体をＡ群
ストレプトコッカスから得られるＮＡＥで飽和させた。
Ｉ¹²⁸-ラベル化および非ラベル化ＳＡ１Ｇモノクローナ
ル抗体をビーズに結合した一定量の抗原に対して滴定し
た。スカッチャード分析を用いてＫ_aを計算した。この
実験で、クローンＳＡ１Ｇ７-５１６.５から生産される
抗体を２.７４±０.６４×１０⁹であると決定した。Ｋ_a
プロットを図８に記載する。

【００６４】本発明の方法を用いて生産されるウサギモ
ノクローナル抗体をネズミのポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体に代わる抗体として使用することがで
き、また、免疫学の分野で知られているかなりの数の用
途に使用することができる。したがって本発明の方法に
よって生産されるウサギモノクローナル抗体を、蛍光検
定法で、あるいは抗原を精製するための捕捉分子とし
て、あるいは放射線免疫検定法、酵素結合イムノソルベ
ント検定法、ウエスタンブロットなどの診断的検定法
で、あるいは免疫クロマトグラフィー検定法で使用する
ことができる。診断的検定法の開発に適した応用として
の本発明のウサギモノクローナル抗体の使用例について
は、実施例６に開示する検定法を参照のこと。

【００６５】本発明のウサギモノクローナル抗体を組み
込むことができる他の装置または１段階免疫検定法には
コンサイス・デバイス(Concise^R Device；ハイブリテッ
ク,ラジョラ)、欧州特許出願第２１７４０３号(１９８
７年４月８日公開)に記述されているアボット・ラボラ
トリーズ(イリノイ州ノース・シカゴ)のテストパック(T
estPack^R)デバイス、または類似の試験装置が含まれ
る。本発明のウサギモノクローナル抗体を使用するよう
に適合させることができる多孔性膜を含有する他の装置
にはBauerら,米国特許第３８１１８４０号(１９７４年
５月２１日発効)、Brown,IIIら,米国特許第４９１６０
５６号(１９９０年４月１０日発効)、Coleら,米国特許
第４４０７９４３号(１９８３年１０月４日発効)、Cole
ら,米国特許第４２４６３３９号(１９８１年１月２０日
発効)、Intengan,米国特許第４４０３０１号(１９８４
年４月３日発効)、Jolley,米国特許第４７０４２５５号
(１９８７年１１月３日発効)、Katzら,米国特許第４４
９６６５４号(１９８５年１月２９日発効)およびTomら,
米国特許第４３６６２４１号(１９８２年１２月２８日
発効)の装置が含まれる(これらはすべて参考文献として
本明細書の一部を構成する)。

【００６６】本発明のウサギモノクローナル抗体を、例
えばWengら,米国特許第４７４０４６８号(１９８８年４
月２６日発効；本明細書の一部を構成する)やYueら,公
開された欧州出願第１８６１００号(１９８６年７月２
日公開)に記述されているようなクロマトグラフィー法
に使用することができる。

【００６７】検定法開発の当業者なら、他の抗原または
抗体に対するウサギモノクローナル抗体を使用するため
に、これらの検定法に適当な改変を容易に加え得るであ
ろう。ウサギモノクローナル抗体を画像化試薬や治療的
モダリティーのための標的分子として治療的に応用する
こともできる。

【００６８】本発明のウサギモノクローナル抗体の特に
有用な応用として、本抗体を固相免疫検定装置で使用す
ることが予期される。そのような装置には、Valkirsら,
米国特許第４６３２９０１号と同第４７２７０１９号
(それぞれ１９８６年１２月２０日と１９８８年２月２
３日発効；これらは参考文献として本明細書の一部を構
成する)に記述されている非クロマトグラフィー的ＩＣ
ＯＮ^Rなどの装置が含まれる。ＩＣＯＮ^RはValkirsらの
文献に記述されている装置に対するハイブリテック・イ
ンコーポレイテッド(カリフォルニア州サン・ディエゴ)
の商標である。これらの検定法では、第１抗体または抗
原を多孔性膜やフィルターなどの多孔性要素に結合もし
くは固定する。多孔性膜は、ガラス繊維、ミクロ繊維お
よび天然材料または合成材料を含む様々な濾過またはク
ロマトグラフィー材料のいずれかでできた柔軟な基盤ま
たは硬直な基盤からなり得る。液体はその多孔性膜中に
流入して容易に通過することができなくてはならない。
またこの膜は好ましくは少なくとも０.１μであって好
ましくは２０μを越えない孔径をもっているべきであ
る。多孔性膜は単独で、もしくはより精巧な装置の一部
として使用することができる。

【００６９】多孔性膜に適用された試験試料液は膜を通
って流れ、その上の抗体または抗原と接触する。試験試
料液中に存在する試験分析物は多孔性要素上の第１抗体
によって結合される。

【００７０】試料液の適用後、好ましくは抗体の溶液を
含有する第２溶液を加える。この第２抗体は好ましくは
第１抗体または抗原の結合を妨害しないエピトープで試
験分析物を結合する。もう１つの好ましい態様として、
試験試料をまず加工して分析物検出を容易にし、試験試
料を多孔性要素に適用する前に第２抗体と混合する。検
出抗体溶液中に存在する抗体は、比色法的分析のための
酵素、放射性ヌクレオチド、蛍光ラベル、有色ラテック
ス粒子などの検出標識でラベルされていることが好まし
い。必要であれば、多孔性要素上の試験分析物に結合し
たラベルされた標識を可視化するために追加の工程を加
える。試料液中の分析物の存在は多孔性要素の表面上の
陽性信号として検出される。

【００７１】当該技術分野におけるこのような検定法の
応用はよく知られており、AndersonらとValkirsによる
刊行物(それぞれClin.Chem.32(9):1692-1695,1986とLab
oratory Medicine 19:564-567,1988；両文献は参考文献
として本明細書の一部を構成する)に詳述されている。
実施例１０では本発明のウサギモノクローナル抗体がＡ
群ストレプトコッカス特異的抗原を認識している。ウサ
ギモノクローナル抗体を使用するこれらの検定法が、ヒ
ト・コリオゴナドトロピン(ＨＣＧ)、ルトロピン(ＬＨ)
またはＨＩＶ-１などに対する抗体を検出するための検
定法を含む数多くの抗原または抗体検出法のために開発
されるであろうことは予期される。

【００７２】固相免疫検定法はいくつかの異なる配置で
利用することができる。好ましい配置では、その検定形
式がAndersonらの形式に従い、Andersonらと同様に内部
参照を含む。この検定形式では固相免疫検定のためのＩ
ＣＯＮ^R検定法において、本発明のウサギモノクローナ
ル抗体を第１抗体(捕捉抗体)または検出抗体として使用
する。もう１つの好ましい態様では、固相免疫検定法で
抗原の捕捉と検出に使用される両抗体がウサギモノクロ
ーナル抗体である。

【００７３】実施例１０にはＡ群ストレプトコッカス感
染を同定するためのＩＣＯＮ^R法の使用が詳述されてい
る。

【００７４】表４は、捕捉抗体と検出抗体の両方にウサ
ギモノクローナル抗体を用いたＡ群ストレプトコッカス
のためのＩＣＯＮ^R形式検定法を例示するものである。
細菌と酵母の試料を、その細菌が綿棒で集めた喉の標本
から単離された場合には類似の方法を用いて、実施例１
０に開示するように加工した。細菌を試験試料液として
多孔性要素に適用した。表４中の＋／−は左欄に挙げた
生物に対するウサギモノクローナル抗体反応性の存在ま
たは不在を示している。これらの結果はこれらのウサギ
モノクローナル抗体がＡ群ストレプトコッカス特異的で
あることを示している。Ａ群ストレプトコッカス抗原Ｎ
-アセチルグルコサミンに対する抗体のいくつかの調製
物がストレプトコッカス・アウレウス上に存在する抗原
性決定基にも結合し得ることは当業者に理解されるであ
ろう。ストレプトコッカス・アウレウスは再懸濁した綿
棒で集めた喉の標本などの試料液中に存在し得るので、
Ａ群ストレプトコッカスを検出するための検定はストレ
プトコッカス・アウレウスをも認識する抗体を検定に使
用した場合には、いくらかのレベルの偽陽性を有するで
あろう。ストレプトコッカス・アウレウス抽出物をも認
識する抗体を用いた検定から得られた結果は別の方法に
よって確認するべきである。都合のよいことに、本発明
のウサギモノクローナル抗体は、上述のように従来はＡ
群ストレプトコッカスの免疫検定法に関与していたスト
レプトコッカス・アウレウスを結合しなかった。したが
って、Ａ群ストレプトコッカスに対して生成させた本発
明のウサギモノクローナル抗体の使用は、第２の試験法
によって陽性結果を確認する必要性を排除する。

【表４】 ストレプトコッカスＡ固相免疫検定(モノ／モノ)特異性試験 １．ストレプトコッカスＤ群，ＣＤＣ ＳＳ７５４ − ２．ストレプトコッカスＡ群，非べータ(臨床的単離物) ＋ ３．スタフィロコッカス・サプロフィチルス，ＡＴＣＣ １５３０５ − ４．ストレプトコッカスＢ群ＩＩ，ＳＳ ６１９ − ５．エシュリシア・コリ，ＡＴＣＣ ２５９２３ − ６．ストレプトコッカスＤ群，ＡＴＣＣ １９４３４ − ７．ストレプトコッカスＧ群，ＳＳ ８６８ − ８．ストレプトコッカスＣ群，ＳＳ １８８ − ９．ストレプトコッカスＢ群Ｉｂ，ＳＳ ６１８ − １０．ストレプトコッカスＢ群，ＳＳ ７００ − １１．ストレプトコッカスＡ群，ＡＴＣＣ １９６１５ ＋ １２．ストレプトコッカスＢ群ＩＩＩ，ＳＳ ４６２ − １３．スタフィロコッカスＡ群，コーワンＩ ＣＤＣ − １４．クレブシエラ・ノウモニアエ，ＡＴＣＣ ２３３５７ − １５．ストレプトコッカスＣ群，ＳＳ １８９ − １６．キャンディダ・アルビカンス，ＨＭＣＣ ０６３ − １７．ストレプトコッカスＡ群，ＳＳ ７２１ ＋ １８．ストレプトコッカスＡ群，ＳＳ ４１０ ＋１９．ストレプトコッカスＢ群Ｉａ，ＳＳ ６１５ −

【００７５】Ａ群ストレプトコッカスに関する現行の検
定法では検出抗体と捕捉抗体の両方にウサギポリクロー
ナル抗体を使用する。図９は異なるウサギ抗体形式検定
法を比較するための研究の結果を表している。下記の表
５に記載するように、Ａ群ストレプトコッカスを２×１
０^８コロニー形成単位(ＣＦＵ)／ｍｌから１.５６×１
０⁶ＣＦＵ／ｍｌまで希釈した。検出または捕捉抗体と
してウサギモノクローナル抗体およびウサギポリクロー
ナル抗体の様々な組み合わせを用いて、この懸濁液２０
μｌをＩＣＯＮ^R形式検定法(実施例１０を参照、もしく
はハイブリテック,インコーポレイテッド(カリフォルニ
ア州サン・ディエゴ)から市販されている)で加工した。
これら特定の４つのＩＣＯＮ^R形式検定法を、ウサギポ
リクローナル抗体を検出抗体として用いウサギポリクロ
ーナル抗体を捕捉抗体として(ポリ／ポリ)、あるいはウ
サギモノクローナル抗体を検出抗体として用いウサギポ
リクローナル抗体を捕捉抗体として(モノ／ポリ)、ある
いはウサギモノクローナル抗体を検出抗体として用いウ
サギモノクローナル抗体を捕捉抗体として(モノ／モ
ノ)、あるいはウサギポリクローナル抗体を検出抗体と
して用いウサギモノクローナル抗体を捕捉抗体として
(ポリ／モノ)調製した。

【００７６】図９において、較正物質尺度上の数値の増
大は細菌濃度の増大に対応している。免疫検定に関する
信号の反射率(Ｒ)をモデル１５００プラス反射率計(マ
クベス，ニューヨーク州ニューベルグ)を用いて決定
し、データを１００−％Ｒとして表した。その結果は、
捕捉抗体と検出抗体のすべての組み合わせが固相免疫検
定法にとって十分に適当であることを示した。したがっ
て本発明の方法によって生産されるウサギモノクローナ
ル抗体は、Ａ群ストレプトコッカス固相免疫検定法にお
いてウサギポリクローナル抗体の代わりに使用すること
ができる。免疫検定法開発の当業者が同様に、ウサギポ
リクローナル抗体とウサギモノクローナル抗体の間の比
較およびウサギモノクローナル抗体とマウスモノクロー
ナル抗体の間の比較を行って、特定の検定法におけるそ
の効能と利便性に基づいて所望の抗体集団を選択できる
であろうことは予期される。

【表５】ウサギポリクローナル抗体とウサギモノクロー
ナル抗体を比較する ＩＣＯＮ^R形式検定法 較正物質数 細菌濃度 細菌濃度 ＣＦＵ／ｍｌ ＣＦＵ／検定 １ １.５６×１０⁶ ３.１２×１０⁴ ２ ３.１３×１０⁶ ６.２６×１０⁴ ３ ６.２５×１０⁶ １.２５×１０⁵ ５ ２.５０×１０⁷ ５.００×１０⁵ ８ ２.００×１０⁸ ４.００×１０⁶

【００７７】本発明の特定の態様を詳細に議論し、本発
明の範囲で考え得る変動について言及した。同様に本発
明を成功裏に行うことを可能にするであろう様々な代替
技術や手法が当業者には利用可能である。

【００７８】実施例１ 融合パートナーＯＭＢ−０３７の生成 融合パートナーを生成させるために、ウサギを、下記の
免疫化プロトコールを用いてウシソマトトロピン（ＢＳ
Ｔ）で免疫した。融合の３日前に、ウサギに、ＢＳＴ５
０μｇを静注（ＩＶ）ブースター投与した。融合の１日
前に、マウスネズミ由来マクロファージ支持細胞を採集
し、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ，熱不活化５６
℃、３０分間）＋１ｘＨＡＴ中、１０，０００細胞／ウ
エルでプレート（平板）した。脾臓から３００ｘ１０⁶
細胞を得た。細胞を２分し、２つの別個の融合を行っ
た。５：１の比率の脾細胞とＳＰ２／Ｏ細胞とを４３％
ＰＥＧ中で融合させた。細胞を１５％ウサギ血清、１ｘ
ＨＡＴ中、１０⁵細胞／ウエルで支持細胞上にプレート
した。融合から２週間後、培地を除去し、１０％ＦＣ
Ｓ，１ｘＨＴで置換した。融合Ｎｏ１ではほぼ１０％の
ウエルが成長を示し、融合Ｎｏ２ではほぼ５０％のウエ
ルが成長を示した。炭酸バッファー中ＢＳＴで被覆した
（２５０ng／ウエル）ウエルを用い、プレートをＥＬＩ
ＳＡでスクリーニングした。全て、抗−ＢＳＴＡｂには
陰性であった。ＨＡＴ感受性突然変異体を見つけるため
に、細胞を２０μｇ／mｌの８−アザグアニン中で培養
した（実施例３に記載の方法）。１つのＨＡＴ感受性ラ
インを、実施例６に記載のごとく、捕捉検定（capture
assay）により、ウサギＩｇＧの存在に関して試験し
た。ＩｇＧ ８０ng／mｌの上清まで、Ａｂは検出され
なかった。この時点で実施例２に記載の方法によって細
胞を凍結した。

【００７９】実施例２ 融合パートナーの長期保存および使用 対数期に増殖した細胞を遠心（３００ｘｇ，１０分間）
し、凍結培地（ＭＥＭ＋３０％ウマ血清＋１０％ＤＭＳ
Ｏ）に再懸濁した。細胞を細胞密度５Ｘ１０⁶細胞／１m
ｌバイアル（ＮＵＮＣ，Vangard International, New J
ersey)で凍結した。細胞を速度調節凍結室（コントロー
ルド・レート・フリージング・チャンバー）（１度／
分）（Cryomed, Inc., New Baltimore, MI)で凍結し、
液体窒素中に保存した。バイアルを液体窒素保存から、
３７℃の水浴により解凍した。細胞をＨＢ−ＧＲＯ培地
（Irvine Scientific, Santa Ana, California)および
１０％ウマ血清１mｌで希釈し、ＨＢ−ＧＲＯ＋１０％
ＨＳ１０mｌを含有する１５mｌ容のコニカル管に移し
た。細胞を遠心し、培養のために２ｘ１０⁵細胞／mｌで
プレートした。

【００８０】実施例３ ８−アザグアニン耐性およびＨ
ＡＴ感受性の確立 対数期に増殖した細胞１.２ｘ１０⁷を遠心（３００ｘ
ｇ，１０分間）し、２０ng／mｌの８−アザグアニン（C
albiochem, La Jolla, California)を補充したＨＢ−Ｇ
ＲＯ＋１０％ウマ血清１２mｌに再懸濁した。細胞を２
４ウエルのプレートに２mｌ／ウエルでプレートした。
コロニーが出現するまで、細胞に８−アザグアニンを補
充したＨＢ−ＧＲＯ培地を３日毎に与えた。密集成長し
たコロニーを、２部分に分割した。これを５サイクル繰
り返した。ウエルの１／２をＨＡＴ（Sigma, １００ｘ:
１０ｍＭヒポキサンチン、０.０４ｍＭアミノプテリ
ン、１.６ｍＭチミジン）を含有する培地で置換した。
細胞の死はＨＡＴ感受性を示し、対応する、ＨＡＴに暴
露しなかったウエルを融合のために拡張した。

【００８１】実施例４ 炭水化物に対するウサギモノク
ローナル抗体のための例示免疫化プロトコール 以下の免疫化プロトコールでは、ニュージーランド白兎
（Siminek, Vista, California)をペプシン消化Ａ群ス
トレプトコッカス変種Ａ４８６で免疫化するのに用い
た。ペプシン消化ストレプトコッカス・ピオジェンズ
（Streptococcus pyogens)（ＡＴＣＣ１９６１５）を、
細胞をトッド−ヒュイットブロス（Todd-Hewitt Brot
h）内で３７℃において培養することで調製した。細胞
を７０℃で１.５時間処理し、熱死させた。細菌を０.８
５％ＮａＣｌ中１mg／mlペプシン（ｐＨ２.８）に再懸
濁し、３７℃で２時間インキュベーションした。細胞消
化物をＰＢＳ（りん酸緩衝化食塩水）で３回洗浄した。
消化物をＡ₆₆₀＝０.３８−０.４０まで希釈した。免疫
化プロトコールは以下の通りである。

【表６】 日：１ ３ ５ ０.５mｌ／日ＩＶ ８ ９ １１ １.００mｌ／日ＩＶ １２ １５ １６ １.００mｌ／日ＩＶ １８ １９ ２９ １.００mｌ／日ＩＶ ２２日目にウサギを放血させ、３２日目に脾臓を摘出し
た。ウサギ血清をペプシン消化Ａ群ストレプトコッカス
・ピオジェンズ（Group A Streptococcus pyogens：Ｇ
ＡＳ）を用い、実施例６に記載のごとくにしてＥＬＩＳ
Ａで試験した。

【００８２】実施例５ ウサギ抗体産生細胞と例示融合
パートナーＯＭＢ−０３７との融合 ウサギ脾細胞の単一の細胞懸濁液を実施例４記載の免疫
化プロトコールを用いてＡ群ストレプトコッカスで免疫
したウサギから得た。脾細胞密度をＰＢＳ中、２.５ｘ
１０⁶／mｌに調節した。マクロファージのようなリソソ
ームに富む細胞を殺すために、leu-leu-omeペプチドを
２５０μＭ／ｌで加えた。混合物を室温で１５分間イン
キュベーションした。細胞を遠沈させ、ペレットを融合
パートナーであるＯＭＢ−０３７と、ＯＭＢ−０３７細
胞あたり４脾細胞の比率で混合した。融合は３５％ＰＥ
Ｇ１５００（Aldrich, Milwaukee, Wisconsin)１mｌを
細胞ペレット／ＯＭＢ−０３７混合物に、１．５分間、
ゆっくり加えた後、徐々に血清不含培地、次いで、血清
含有培地で希釈することで行われた。融合混合物を、実
施例３に開示したように、１５％ウシ胎仔血清およびＨ
ＡＴを含有するＨＢ−ＧＲＯ１５０mｌ中で細胞密度８
ｘ１０⁵細胞／mｌにし、２．０×１０⁵細胞／ウエルで
９６ウエルプレートに分散させた。細胞を５−１０％Ｃ
Ｏ₂雰囲気下、３７℃でインキュベーションした。融合
後、培養物をハイブリドーマの成長に関して検査した。
ハイブリドーマの成長を評価するための１次基準とし
て、より大きい細胞の存在、および細胞複製の証拠を用
いた。培地含有ＨＡＴを細胞に、５、８および１３日目
に与えた。１８日以後、ハイブリドーマ上清を、特異的
抗体の製造に関してスクリーニングした。以後の分析に
用いた、１つの融合実験の生成物は、ＳＡ１Ｇと命名さ
れた。

【００８３】実施例６ 抗体産生のための試験融合 Ａ群ストレプトコッカス（ＧＡＳ）に対するウサギモノ
クローナル抗体を評価するために３つの試験を用いた。 １）Ａ群ストレプトコッカス（ＧＡＳ）抗体に対するＥ
ＬＩＳＡ：特異的抗体の存在を試験するために２つの形
態の抗原を用いた。第１標品には、ペプシン消化ストレ
プトコッカス・ピオジェネス(Streptococcus pyogenes)
細胞を用いた。ペプシン消化細胞の調製方法は実施例２
に記載されている。Ａ群ストレプトコッカス炭水化物の
亜硝酸抽出標品は、ストレプトコッカス・ピオジェネス
を１ＭＨＣｌおよび６Ｍ ＮａＮＯ₂中でインキュベー
ションして得た。反応の停止のために１Ｍりん酸カリウ
ムを加えた。溶解液を遠心し上清を採取し、０.２μｍ
フィルターでろ過し、濃縮し、ＰＢＳに対して透析し
た。亜硝酸抽出物（ＮＡＥ）を１．６mg／mlの濃度に希
釈した。ペプシン消化標品または亜硝酸抽出物のいずれ
かを用いてFalcon９６ウエル検定プレートを被覆した。
プレートを被覆するために、ストックペプシン−消化Ｇ
ＡＳまたはストックＮＡＥの炭酸バッファー（ｐＨ９．
５）中１：４００希釈液５０μｌの抗原を各ウエルに入
れた。プレートを３７℃で一夜インキュベーションし
た。遊離の吸収部位を０．１％Tween含有りん酸緩衝化
食塩水（ＰＢＳ／Tween）中、２％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）で飽和した。各被検試料５０μｌをプレート
に加え、３７℃で１時間インキュベーションした。ＰＢ
Ｓ／Tweenで３回洗浄して非結合物質を除去した。西洋
ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ
抗体５０μｌを加え、さらに１時間インキュベーション
した。洗浄後、基質ｏ−フェニレンジアミン・二塩酸塩
（ＯＰＤ）１００μｌを加え、室温で１５分間インキュ
ベーションした。ストレプトコッカスＡに対する抗体の
存在は４９０ｎｍにおける吸収の増大で証明された。

【００８４】２）ＩｇＧに対するサンドイッチＥＬＩＳ
Ａ試験：Falcon Probind 検定プレートをりん酸ナトリ
ウムバッファー(ｐＨ７．０）中、ヤギ抗ウサギＩｇＧ
により５０μｌ／ウエルで被覆した。被検試料を加え、
以後の工程として上記の検定を行った。細胞培養上清お
よび腹水の両者に対する抗体生成の種を確認するため
に、マウスＩｇＧを検出するための同様のサンドイッチ
検定を用いた。ウサギおよびマウスＩｇＧ検定のいずれ
においても交差反応性は認められなかった。 ３）Ａ群ストレプトコッカス抗原に対する阻害ＥＬＩＳ
Ａ：工程は、等容量の２０％Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンと被検試料とを３７℃で１時間、一緒にインキュ
ベーションした外は、上記１）のＡ群ストレプトコッカ
ス検定と同様である。得られた４９０ｎｍにおける吸収
の減少はＡ群ストレプトコッカス特異的炭水化物エピト
ープに対する抗体の存在を示唆している。３段階の試験
の後、所望のハイブリドーマを、モノクローン性を確か
にするために、少なくとも１度、連続的に培地に担持さ
せサブクローニングした。あらゆるサブクローニングは
モノクローン性を確かにするために、ウエルあたり１／
３の細胞を用い、限界希釈法で行った。

【００８５】実施例７ ウサギモノクローナル抗体産生
クローンＨＢ９６９６とウサギモノクローナル抗体産生
クローンＳＡ１Ｇ７の比較 Ａ群ストレプトコッカス（ＧＡＳ）の亜硝酸抽出物（ク
ローンＨＢ９６９６の製造に用いた抗原）、またはペプ
シン消化Ａ群ストレプトコッカスのいずれかでＥＬＩＳ
Ａプレートを被覆した。ウエルあたりのＮＡＥ産物の濃
度は１２５ngであった。１０％ウシ胎仔血清を補充した
ＤＭＥＭ培地内で密集成長した細胞の上清をウエルに加
えた。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレ
ートを洗浄し、結合した抗体をヤギ抗ウサギＨＲＰ結合
体で検出した。陽性対照として、ウサギＡ群ストレプト
コッカス精製ポリクローナル抗体と、ＯＭＢ−０３７を
用いて生成した融合プロトコールからの幾つかのクロー
ンとを加えた。結果を表２に示した。ＨＢ９６９６はＡ
群ストレプトコッカスに特異的な抗体を生成しなかった
し、細胞はウサギ血清の存在下でさえ、培養物中で安定
でなかった。ＨＢ９６９６が抗体を作成しているか否か
を決定するために、初期スクリーン定量ＥＬＩＳＡ（こ
こでは、免疫グロブリン濃度の測定に用いる標準曲線
（ＧＡＳポリクローナル）の範囲は１．６−１０００ng
の範囲である）を調製した。結果を表３に示した。ＨＢ
９６９６は検出可能な抗体を生成しなかった。クローン
は本来的に不安定であるか、特に凍結／解凍工程の影響
を受け易かった。両方の性質は、商業規模の量の抗体の
製造におけるこれら融合パートナーおよび抗体産生細胞
の使用に大いに反するものである。

【００８６】実施例８ 腹水としての異種間抗体産生クローンの培養 増殖培地で安定なハイブリドーマクローンを調製し、ヌ
ードまたはＳＣＩＤマウス（接種５日前に不完全フロイ
ンドのアジュバント、０.５mｌ／マウスで感作）に注射
した（マウスあたり２ｘ１０⁶細胞）。２−３週間後、
腹水を採取し、急いで、酢酸セルロースゲル上で抗体の
存在を調べた。抗体を含有する腹水はさらに、Ａ群スト
レプトコッカスに対するウサギ抗体の検出のために、実
施例６記載のＥＬＩＳＡを用いて試験した。 腹水の特性化：ヌードおよびＳＣＩＤの両マウスからの
腹水を抗原特異的検定（ＧＡＳ抗原被覆ダウン（dow
n））にかけたところ、両供給源は良好な抗Ａ群ストレ
プトコッカス活性を有するようであった（図７）。抗体
の起源（宿主対融合パートナー）を決定するために、ウ
サギ免疫グロブリン（図５）およびマウス免疫グロブリ
ン（図６）を検出するための検定を行った。マウスおよ
びウサギ種特異的検定において、捕捉抗体（ヤギ抗ウサ
ギまたはヤギ抗マウス）でプレートを被覆し、腹水中の
適当な抗体種を捕えた。捕捉した抗体をＨＲＰと結合し
たヤギ抗種抗体を用いて検出した。結果は、ヌードおよ
びＳＣＩＤマウスの両方からの腹水が高含有量のウサギ
抗体を含むことを示した（図５）。逆に、ヌードマウス
からの腹水のみが高含有量の宿主抗体を含んでいた（図
６）。これらの結果はまた、異種間融合パートナーＯＭ
Ｂ−０３７が抗体を産生しなかったことを示すものであ
る。我々の手元にはあるのは、腹水から、精製抗体を少
なくとも１mg／ml産生するヘテロハイブリッド、ＳＡ１
Ｇ７−５１６．５である。マウスあたり製造される腹水
の全量は様々で、１−６mｌ／マウスの範囲である。

【００８７】実施例９ ウサギモノクローナル抗体精製 ヌードまたはＳＣＩＤマウス内で増殖したウサギｘマウ
スｘウサギの異種ハイブリッドからの腹水を飽和硫酸ア
ンモニウムを用いる１回の塩析を用いてタンパク質を浄
化した。リポタンパクはデキストランサルフェート沈殿
で除去しウサギ免疫グロブリンを２つの異なる方法のい
ずれかで精製した。第１の方法では、ウサギ免疫グロブ
リンをイオン交換クロマトグラフィーで精製した。浄化
した腹水のバッファーを、Amicon Centriprep-30 カラ
ム(Amicon, Beverly, Massachusetts)中、充てん／洗浄
バッファー（２０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０）で交換
し、Ｑ Sepharose Fast Flowカラム(ＦＦＱ； Pharmac
ia)に充てんし、２０ｍＭトリス、０.５Ｍ ＮaＣl、ｐ
Ｈ８．０のグラディエントバッファーで溶離した。適当
な画分を試験のために分取した。第２の方法では、浄化
した腹水をＮ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）−アガ
ロースカラム（Sigma, St. Louise, Missouri）を用い
るイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精
製した。充てんしたカラムをりん酸緩衝化食塩水(ＰＢ
Ｓ）で洗浄し、１０％Ｎ−アセチルグルコサミン（Sigm
a）でウサギ抗Ａ群ストレプトコッカスを溶離した。適
当な画分を試験のために分取した。全試料を図４および
図５に関して記載したようにして、種の同定（ウサギま
たはマウス）のために試験した。抗原特異性はＥＬＩＳ
Ａ（実施例６および表１に関連の記載参照）で確認し
た。ウサギ抗体フラクションを分取し、残るあらゆるマ
ウス免疫グロブリンをヒツジ抗マウス免疫グロブリン−
被覆ポリスチレンビーズを用いて除去した。

【００８８】実施例１０ ウサギモノクローナル抗体お
よびウサギポリクローナル抗体の固相イムノアッセイで
の使用 検出抗体の調製：この実施例では、ウサギモノクローナ
ル抗体ＳＡ１Ｇ７−５１６．５を固相イムノアッセイ
(固相免疫検定)におけるＡ群ストレプトコッカスに対す
る検出抗体として用いた。モノクローナル調整物１０mg
をアルカリホスファターゼ１０mgで標識した。アルカリ
ホスファターゼのモノクローナル抗体への結合は、免疫
学の分野で周知の方法に従って行った。抗体およびアル
カリホスファターゼ（ＡＰ）の両方をＰＢＳ中で透析
し、０．４５μｍフィルターでろ過した。抗体およびＡ
Ｐの濃度を分光光度計により、Ａ_280nmで測定した。抗
体溶液を重量によりＰＢＳで５mg／mｌに希釈した。こ
の工程はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体
のいずれにも用いることができ、また多数の抗原を認識
する抗体にも同様の方法が用いることができると考えら
れる。ＡＰをヘテロ２機能性試薬スクシンイミジル４−
（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート（ＳＭＣＣ， Pierce, Rockford, Illinoi
s)に、初期モル比としてＡＰ：ＳＭＣＣ１０：１で結合
させた。ＳＭＣＣを濃度１０mg／mlで乾燥アセトニトリ
ルに懸濁した。ＳＭＣＣおよびＡＰをアルゴン雰囲気下
で混合し、室温で３０分間インキュベーションした。混
合物をセファデックスＧ−２５カラムに適用し、アルゴ
ンガスで飽和し、結合酵素を除去した。結合ＡＰ（ＳＭ
ＣＣ−ＡＰ）の濃度を分光光度計によりＡ₂₈₀で測定し
た。ウサギモノクローナル抗体をヘテロ２機能性試薬Ｎ
−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オナート（ＳＰＤＰ，Pierce)に結合させた。ＳＰＤＰ
も乾燥アセトニトリルに懸濁した。ＳＰＤＰの濃度をＡ
₂₆₀で測定した。ＳＰＤＰをモノクローナル抗体と、モ
ル比２０：１で混合し、アルゴン雰囲気下、室温で３０
分間インキュベーションした。抗体−ＳＰＤＰ混合物
に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）０.１０mｌをＤＴＴ
の終濃度１ｍＭになるように加えた。室温で３０分間イ
ンキュベーションしたのち、セファデックスＧ−２５カ
ラム上で、結合した抗体を非標識抗体および遊離のＳＰ
ＤＰから分離した。結合抗体の濃度はＡ₂₈₀で測定し
た。

【００８９】ＳＭＣＣ-ＡＰとＳＰＤＰ-抗体を個別にＰ
ＢＳを用いて重量で１.５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。等
体積のＳＭＣＣ-ＡＰとＳＰＤＰ-抗体を混合し、アルゴ
ン下で脱酸素化した。抗体と酵素の溶液を混合し、室温
で９０分間撹拌した。Ｎ-エチルマレイミド(N-ethlmale
imide；ＮＥＭ，ピアス)の１２５ｍｇ／ｍｌ溶液を反応
液中の最終濃度が０.０１ＮＥＭ／ｍｌ反応溶液になる
ように用いることによって、反応しなかったＳＰＤＰ基
を遮断した。反応しなかったＳＭＣＣ基を等体積の０.
２０Ｍ ２-メルカプトエタノールを用いて遮断した。セ
ントリコア(Centricor)３０カラム(アミコン)を用い
て、２℃〜８℃でＡＰ-ウサギモノクローナル抗体複合
体を２５ｍｇ／ｍｌより高くならないように濃縮した。
この複合体化した抗体をＰＢＳ中で透析し、カラムクロ
マトグラフィーによって精製した。ピーク分画を貯蔵
し、複合体化した抗体を２０ｍＡに希釈した(ここに１
ｍＡはＡ₂₈₀＝０.００１に等価である)。

【００９０】捕捉抗体の調製：Ａ群ストレプトコッカス
に対するウサギモノクローナル抗体またはウサギポリク
ローナル抗体をラテックスビーズ上に捕捉抗体としてコ
ートした。０.３６ｍｌのコーティング溶液を調製する
ために、７.６５ｍｇ／ｍｌ抗体貯蔵液０.０１２ｍｌを
コーティング緩衝液(０.９％ＮａＣｌ中の５０ｍＭエタ
ノールアミン，ｐＨ１０.０)０.３０９ｍｌおよびラテ
ックス０.０３６ｍｌと混合し、４５℃で終夜インキュ
ベートした。その混合物にバックコーティング緩衝液
(ＰＢＳ中の０.３％牛血清アルブミン)０.３０９ｍｌを
加え、室温で２時間インキュベートした。ラベルされた
ラテックスを遠心沈降させ、ＰＢＳ０.５ｍｌに再懸濁
し、安定化緩衝液(ＰＢＳ中の１０％ショ糖、２％無脂
肪乾燥ミルク)を加えることによって最終体積を１０ｍ
ｌにした。

【００９１】固相イムノアッセイ：Ａ群ストレプトコッ
カスに対するイムノアッセイのために、０.３０％ラテ
ックス固体溶液としてのＡ群ストレプトコッカス抗体-
ラテックス溶液３μｌを米国特許第４７２７０１９号な
どに記載されている多孔性要素上にスポットした。この
実験ではＰＯＲＥＸ^R(ポレックス・テクノロジーズ,ジ
ョージア州アトランタ)フィルターにＡ群ストレプトコ
ッカス溶液を陽性対照および陰性対照と共にスポットし
た。等体積の、ラテックスに結合してストレプトコッカ
スの亜硝酸抽出物で予備インキュベートしたストレプト
コッカス特異的抗体を第２の位置に陽性対照としてスポ
ットした。精製したストレプトコッカス陰性ウサギポリ
クローナル抗体を多孔性膜の第３の位置に陰性対照とし
てスポットした。

【００９２】実施例６に開示した方法を用いてＡ群スト
レプトコッカス亜硝酸抽出物または他の生物からの抽出
物を調製し、リン酸カリウムで中和した。４×１０⁶Ｃ
ＦＵ／ｍｌに相当する溶液２０μｌを、アルカリホスフ
ァターゼに結合させた抗体１滴に加えた。この試料を
０.２μｍフィルターに通して濾過し、その全試料を多
孔性要素に適用した。液体が多孔性要素を通過したら、
その表面を洗浄溶液(ＰＢＳ中の１％トリトンＸ-１０
０、０.００２％ニトロブルー・テトラゾリウム(wt／vo
l)およびアジ化ナトリウム)で洗浄した。ＰＢＳ中のＡ
Ｐ基質インドキシルホスフェート(Ｔｒｉｓ６.６６ｇ、
２-アミノ-２-メチル-１-プロパノールの９０％溶液０.
９５６ｍｌ、ＮａＣｌ １ｇ、アジ化ナトリウム０.１
ｇ、インドキシルホスフェート０.２９０ｇおよび濃塩
酸０.４１１ｍｌ)の添加によって結合試料の検出を決定
した。陽性対照位置の紫色の点染は正しい技術を用いた
ことと、上記試薬が機能的であることを示した。陰性対
照位置の紫色の点染は試料がヒトの抗ウサギ抗体を含有
しないことを示した。ラッテクス結合抗Ａ群ストレプト
コッカス位置の紫色の点染は試験試料中のＡ群ストレプ
トコッカスの存在を示した。

【００９３】本発明の特定の態様を詳細に記述したが、
これらの態様が単なる具体例にすぎず、本発明の真の範
囲は前記特許請求の範囲の欄で規定されている通りであ
ることは明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 具体例としての融合パートナー細胞系ＯＭＢ
-０３７から得られる中期染色体の染色体展開の写真の
模式図である。矢印はウサギ染色体を示す。次端部動原
体型染色体はネズミのものである。

【図２】 ウサギモノクローナル抗体生産の融合効率を
最適化するための研究の結果を表すグラフである。培養
条件を水平軸上にとっている。Ｐ３.６５３、ＳＰ２／
０およびＯＭＢ-０３７融合パートナーを異なる血清、
即ち、ウサギ血清(ＲＳ)、馬血清(ＨＳ)、牛胎児(ＦＣ
Ｓ)および脾細胞調整培地(ＳＣＭ)と共に試験した。各
群について生存可能なハイブリッドを伴うウェルの数を
ハイブリッドを入れたウェルの合計数で割った値として
融合効率(％)を表す。

【図３】 ヘテロハイブリッドＳＡ１Ｇ７-５１６.５の
安定性を１０μｇ／ｍｌの濃度の市販の調製されたウサ
ギ抗Ａ群ストレプトコッカスポリクローナル抗体と比較
して決定するためのＥＬＩＳＡの結果を表すグラフであ
る。ＮＳＢ(非特異的結合)は組織培養上清中の抗体の非
特異的接着によるバックグラウンドを表す。

【図４】 粗製腹水の一部を含有するセルロースアセト
ートゲルの写真の模式図である。レーン１と２はヘテロ
ハイブリドーマＳＡ１Ｇ７-５１６.５から得た粗製腹水
の一部を含有する。レーン３は融合パートナーＯＭＢ-
０３７から得たものを表す。

【図５】 ヘテロハイブリドーマＳＡ１Ｇ７-５１６.５
から得られる腹水液中のウサギ免疫グロブリンの存在に
ついて融合パートナーＯＭＢ-０３７と比較して試験す
るためのＥＬＩＳＡの結果を表すグラフである。(Ｎ)と
(Ｓ)はそれぞれヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス中で
生産された免疫グロブリンを意味する。

【図６】 ヘテロハイブリドーマＳＡ１Ｇ７-５１６.５
から得られる腹水液中のマウス免疫グロブリンの存在に
ついて融合パートナーＯＭＢ-０３７と比較して試験す
るためのＥＬＩＳＡの結果を表すグラフである。(Ｎ)と
(Ｓ)はそれぞれヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス中で
生産された免疫グロブリンを意味する。

【図７】 Ａ群ストレプトコッカスを認識するウサギ抗
体の存在について融合パートナーＯＭＢ-０３７と比較
して試験するためのＥＬＩＳＡの結果を表すグラフであ
る。(Ｎ)と(Ｓ)はそれぞれヌードマウスまたはＳＣＩＤ
マウス中で生産された免疫グロブリンを意味する。

【図８】 ヘテロハイブリドーマＳＡ１Ｇ７-５１６.５
から産出される抗体に関するＫ_aプロットのグラフであ
る。

【図９】 モノクローナルまたはポリクローナルウサギ
抗体調製物の４種の異なる組み合わせを用いて、異なる
濃度の細菌溶解液の反射率を比較するグラフである。

【手続補正書】

【提出日】平成５年１１月５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/577 Ａ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 5/26 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 591065505 ハイブリテック・インコーポレイテッド ＨＹＢＲＩＴＥＣＨ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡ ＴＥＤ アメリカ合衆国カリフォルニア州サン・デ ィエゴ、トレヤナ・ロード11095番 (72)発明者 リュ−シャ・リウ アメリカ合衆国92130カリフォルニア州サ ン・ディエゴ、コーベット・コート12801 番 (72)発明者 ジョゼフ・ビンセント・マネッタ アメリカ合衆国46256インディアナ州イン ディアナポリス、ノース・リチャード・ス トリート8134番 (72)発明者 ロバート・トーマス・マッコーマック アメリカ合衆国92131カリフォルニア州サ ン・ディエゴ、イーストグレン・ストリー ト12085番 (72)発明者 ジョン・リチャード・スポーツマン アメリカ合衆国94306カリフォルニア州パ ロ・アルト、アマランタ・コート4154番

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 齧歯目骨髄腫細胞と形質転換されていな
   いウサギ細胞の間の細胞融合の産物からなり、実質上検
   出不可能なレベルの抗体を産生する安定な異種間融合パ
   ートナー。
2. 【請求項２】 該齧歯目骨髄腫細胞がＳＰ２／０系であ
   ることを特徴とする融合パートナーからなる請求項１の
   安定な異種間融合パートナー。
3. 【請求項３】 ａ）ＳＰ２／０細胞と牛ソマトトロピン
   感作ウサギ脾細胞の間の融合に由来し、ｂ）ヒポキサン
   チン-アミノプテリン-チミジン感受性であり、ｃ）ヒポ
   キサンチン-グアニン-ホスホリボシル・トランスフェラ
   ーゼ欠損性である融合パートナーもしくは天然に存在す
   るその変種または突然変異種からなる請求項２の安定な
   異種間融合パートナー。
4. 【請求項４】 ＡＴＣＣに培養番号１１０８６として寄
   託されている細胞系もしくは天然に存在するその変種ま
   たは突然変異種からなる請求項３の安定な融合パートナ
   ー。
5. 【請求項５】 ウサギモノクローナル抗体を分泌する安
   定な細胞系であって、ａ）齧歯目骨髄腫細胞と形質転換
   されていないウサギ細胞の融合産物からなり、それ自体
   は実質上検出可能な量の抗体を分泌しない安定な異種間
   融合パートナーと、ｂ）予め決定された抗原で感作され
   ていて、その抗原に対する抗体を産生するウサギ脾細
   胞、の融合の産物からなる細胞系。
6. 【請求項６】 安定な異種間融合パートナーがマウス由
   来の齧歯目骨髄腫細胞を用いた融合の産物であることを
   特徴とする融合の産物である請求項５の細胞系。
7. 【請求項７】 安定な異種間融合パートナーがさらにＳ
   Ｐ２／０ネズミ骨髄腫細胞系を用いた融合の産物である
   ことを特徴とする融合の産物である請求項６の細胞系。
8. 【請求項８】 ウサギ脾細胞が炭水化物抗原で感作され
   ていて、その抗原に対する抗体を生産することを特徴と
   する請求項７の細胞系。
9. 【請求項９】 安定な異種間融合パートナーがＡＴＣＣ
   に細胞培養番号１１０８６として寄託されている細胞系
   であることを特徴とする請求項８の細胞系。
10. 【請求項１０】 ウサギ脾細胞がＮ-アセチル-Ｄ-グル
    コサミンで感作されていて、その炭水化物抗原に対する
    抗体を生産することを特徴とする細胞系からなる請求項
    ９の細胞系。
11. 【請求項１１】 ウサギモノクローナル抗体を生産する
    方法であって、次の段階からなる方法： ａ）形質転換されていないウサギパートナー細胞を齧歯
    目骨髄腫細胞と融合して異種間融合パートナーを作出
    し、 ｂ）実質上検出不可能なレベルの抗体を産生する安定な
    異種間融合パートナーであって、その融合パートナーが
    ウサギ細胞と齧歯目骨髄腫細胞の間の融合の産物である
    安定な異種間融合パートナーを選択し、 ｃ）該安定な融合パートナーをウサギ抗体産生細胞と融
    合し、 ｄ）予め決定した抗原に対する抗体を生産する、段階
    (ｃ)から得た抗体産生細胞系を単離する。
12. 【請求項１２】 該選択段階がさらに薬剤耐性の安定な
    融合パートナーを作出することからなり、該単離段階が
    さらに該薬剤中で該抗体産生細胞を生育させることから
    なる請求項１１の方法。
13. 【請求項１３】 該齧歯目骨髄腫細胞がマウス由来であ
    ることを特徴とする請求項１２の方法。
14. 【請求項１４】 該ウサギ抗体産生細胞が該予め決定し
    た抗原で免疫化されたウサギから得られることを特徴と
    する請求項１３の方法。
15. 【請求項１５】 該安定な融合パートナーがＡＴＣＣに
    培養番号１１０８６として寄託されている細胞系である
    ことを特徴とする請求項１４の方法。
16. 【請求項１６】 さらに抗体産生細胞をインビボで成長
    させる段階を含む請求項１５の方法。
17. 【請求項１７】 該成長段階が腹水を生成させることか
    らなる請求項１６の方法。
18. 【請求項１８】 該成長段階が成熟ＴおよびＢリンパ球
    が欠損したマウス中に該融合産物を導入することからな
    る請求項１７の方法。
19. 【請求項１９】 請求項１１の方法によって生産される
    ウサギモノクローナル抗体。
20. 【請求項２０】 請求項１９のウサギモノクローナル抗
    体を含む免疫検定法。
21. 【請求項２１】 ウサギモノクローナル抗体を産生する
    細胞系を作出する方法であって、次の段階からなる方
    法： ａ）形質転換されていないウサギパートナー細胞を齧歯
    目骨髄腫細胞と融合して異種間融合パートナーを作出
    し、 ｂ）実質上検出不可能なレベルの抗体を産生する安定な
    異種間融合パートナーであって、その融合パートナーが
    ウサギ細胞と齧歯目骨髄腫細胞の間の融合の産物である
    安定な異種間融合パートナーを選択し、 ｃ）該安定な融合パートナーをウサギ抗体産生細胞と融
    合する。