JPS6244175A - マウスインタ−ロイキン−２に特異的なモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−マ - Google Patents
マウスインタ−ロイキン−２に特異的なモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−マInfo
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- JPS6244175A JPS6244175A JP61102959A JP10295986A JPS6244175A JP S6244175 A JPS6244175 A JP S6244175A JP 61102959 A JP61102959 A JP 61102959A JP 10295986 A JP10295986 A JP 10295986A JP S6244175 A JPS6244175 A JP S6244175A
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- interleukin
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
- C07K16/246—IL-2
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は基本的にはマウスインターロイキン−２（本明
細書では゛工Ｌ−２−＝と略す）と反応性の免疫グロブ
リンを分泌することができるノ・イブリド−マ細胞系の
作製に関し、より詳細にはマウス工Ｌ−２に対して特異
的であるが、その他のいくつかの哺乳動物種（例えばラ
ットまたはヒト）由来の天然ＩＬ−２に対しては極めて
低い交差反応性を示すモノクローナル抗体の産生に関す
る。
細書では゛工Ｌ−２−＝と略す）と反応性の免疫グロブ
リンを分泌することができるノ・イブリド−マ細胞系の
作製に関し、より詳細にはマウス工Ｌ−２に対して特異
的であるが、その他のいくつかの哺乳動物種（例えばラ
ットまたはヒト）由来の天然ＩＬ−２に対しては極めて
低い交差反応性を示すモノクローナル抗体の産生に関す
る。
従来の技術
°゛モノクローナル抗１体°′という用語は一般にクロ
ーン化された細胞系によって産生される一定の特異性を
もつ実質的に均一の免疫グロブリン集団を意味する。免
疫学者たちはこのような免疫グロブリンを産生ずる：数
多くの形質細胞腫を単離したが、予め定められた抗原特
異性をもつ均一抗体を分泌する細胞系の作製が実行可能
となったのはコーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタ
イ７ （Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の独創的な研究が初めてで
あった〔コーラ−１Ｇ。
ーン化された細胞系によって産生される一定の特異性を
もつ実質的に均一の免疫グロブリン集団を意味する。免
疫学者たちはこのような免疫グロブリンを産生ずる：数
多くの形質細胞腫を単離したが、予め定められた抗原特
異性をもつ均一抗体を分泌する細胞系の作製が実行可能
となったのはコーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタ
イ７ （Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の独創的な研究が初めてで
あった〔コーラ−１Ｇ。
およびミルスタイン、Ｃ６のネイチャー（Ｎａｔｕｒθ
）２５６：４９５〜４９７（１９７５）を参照〕。
）２５６：４９５〜４９７（１９７５）を参照〕。
簡単に述べれば、コーラ−とミルスタインの独創的研究
は、センダイウィルスを利用してマウス骨髄腫細胞系の
ＨＡＴ （ピポキサンチン、アミノプテリンおよびチ
ミジン）−感受性変異細胞とヒツジの赤血球細胞に対し
て免疫化したマウス由来の脾臓細胞とを融合させた。こ
の細胞をＨＡＴ培地で約１週間培養すると７・イブリッ
ド細胞（骨髄腫細胞と脾臓細胞との融合体）のみが生き
残った・・・骨髄腫細胞はそれらのＨＡＴ感受性のため
に死滅し、残りの正常脾臓細胞は一般に培養下で生存で
きない。ハイブリドーマとして知られるこれらのハイブ
リッド細胞なＨＡＴ培地で生き残るために必要な正常細
胞からのＨＧＰＲＴ （ヒポキサンチングアニンホスホ
リボシルトランスフェラーゼ）サルベージ機構（再利用
機構）を有し、しかも骨髄腫融合パートナ−の不滅性（
すなわち増殖性）を保持していた。さらに、個々の細胞
クローンに分離した場合、若干の・・イブリビーマはヒ
ツジの赤血球細胞に対して特異的な均一抗体を大量に分
泌することが発見された。こうして、簡単で有効なモノ
クローナル抗体の産生方法が実現された。
は、センダイウィルスを利用してマウス骨髄腫細胞系の
ＨＡＴ （ピポキサンチン、アミノプテリンおよびチ
ミジン）−感受性変異細胞とヒツジの赤血球細胞に対し
て免疫化したマウス由来の脾臓細胞とを融合させた。こ
の細胞をＨＡＴ培地で約１週間培養すると７・イブリッ
ド細胞（骨髄腫細胞と脾臓細胞との融合体）のみが生き
残った・・・骨髄腫細胞はそれらのＨＡＴ感受性のため
に死滅し、残りの正常脾臓細胞は一般に培養下で生存で
きない。ハイブリドーマとして知られるこれらのハイブ
リッド細胞なＨＡＴ培地で生き残るために必要な正常細
胞からのＨＧＰＲＴ （ヒポキサンチングアニンホスホ
リボシルトランスフェラーゼ）サルベージ機構（再利用
機構）を有し、しかも骨髄腫融合パートナ−の不滅性（
すなわち増殖性）を保持していた。さらに、個々の細胞
クローンに分離した場合、若干の・・イブリビーマはヒ
ツジの赤血球細胞に対して特異的な均一抗体を大量に分
泌することが発見された。こうして、簡単で有効なモノ
クローナル抗体の産生方法が実現された。
その後、ウィルス融合に代わるものとして、一層簡単で
安全な４１Ｊ工チレングリコール融合処理が使用され〔
リンガ−ティー（ｌＲｉｎｇｅｒｔｙ、Ｎ、 ）および
サベージ（Ｓａｖａｇθ、Ｒｏ）の細胞・・イブリッド
（Ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄｓ）、アカデミツクプレス、
ニューヨーク（１９７６）を参照〕、それは今や第一の
融合方法となっている〔ガルフレ（Ｇａ〕、ｆｒｅ 、
Ｇ、 ）およびミ／ｌ、、Ｘタイ７ （Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ、Ｃ，）のＭｅｔｈ。
安全な４１Ｊ工チレングリコール融合処理が使用され〔
リンガ−ティー（ｌＲｉｎｇｅｒｔｙ、Ｎ、 ）および
サベージ（Ｓａｖａｇθ、Ｒｏ）の細胞・・イブリッド
（Ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄｓ）、アカデミツクプレス、
ニューヨーク（１９７６）を参照〕、それは今や第一の
融合方法となっている〔ガルフレ（Ｇａ〕、ｆｒｅ 、
Ｇ、 ）およびミ／ｌ、、Ｘタイ７ （Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ、Ｃ，）のＭｅｔｈ。
Ｅｎｚｙｍｅ、 ７３：３〜４６（１９８１）を参照〕
。その他の点では、コーラ−とミルスタインの技術が本
質的に変わることなくそのまま使用される。
。その他の点では、コーラ−とミルスタインの技術が本
質的に変わることなくそのまま使用される。
この技術は科学界において迅速にかつ普遍的に受は入れ
られ、そして種々の特異性をもつモノクローナル抗体を
産生ずるいろいろな種類のハイブリド−マが作られた。
られ、そして種々の特異性をもつモノクローナル抗体を
産生ずるいろいろな種類のハイブリド−マが作られた。
実際に、抗原、融合パートナ−細胞およびその後の培養
条件の選択を含めたハイプリド−マ作製のだめの計画は
限りがない。
条件の選択を含めたハイプリド−マ作製のだめの計画は
限りがない。
〔一般にはゴールデインク（Ｇｏｌｄｉｎｇ、 Ｊ 、
）−のモノクローナル抗体：原理と実際、アカデミツ
クプレス、ニューヨーク（１９８３）を参照されたい。
）−のモノクローナル抗体：原理と実際、アカデミツ
クプレス、ニューヨーク（１９８３）を参照されたい。
−〕しかしながら、正確な範囲の結合特性をもつ〔例え
ばタン・ぐり質は種（ｓｐｅｃｉｅθ）の間で構造的に
非常に類似するが、ある咄乳動物種のタンパク質に対し
て特異的であるが、他の種に由来する相同タン・ξり質
に対して特異的でない〕モノクローナル抗体を分泌し得
るハイブリド−マの作製は非常に困難な問題をかかえた
ままであり、往々にしてそれは偶然に解決されるにすぎ
ない。
ばタン・ぐり質は種（ｓｐｅｃｉｅθ）の間で構造的に
非常に類似するが、ある咄乳動物種のタンパク質に対し
て特異的であるが、他の種に由来する相同タン・ξり質
に対して特異的でない〕モノクローナル抗体を分泌し得
るハイブリド−マの作製は非常に困難な問題をかかえた
ままであり、往々にしてそれは偶然に解決されるにすぎ
ない。
モノクローナル抗体は非常に数多くの方法、例えば免疫
検定法、免疫組織化学的染色法、免疫吸着剤として、お
よび細胞選別法において有用性を見出されている。さら
にモノクローナル抗体がタン・ξり質（または細胞に対
して測定可能な活性を有する他の分子）に対して特異的
である場合、それは実験条件下の細胞系に対するその分
子の抗体−媒介除去の影響を調べることにより、その分
子の機能を確かめるために使用できる。
検定法、免疫組織化学的染色法、免疫吸着剤として、お
よび細胞選別法において有用性を見出されている。さら
にモノクローナル抗体がタン・ξり質（または細胞に対
して測定可能な活性を有する他の分子）に対して特異的
である場合、それは実験条件下の細胞系に対するその分
子の抗体−媒介除去の影響を調べることにより、その分
子の機能を確かめるために使用できる。
組換えＤＮＡ技術の出現と共に、モノクローナル抗体は
免疫化学プロッティング法、いわゆる゛ウェスターン法
″における補助試薬としての有用性を加えた。この抗体
はゲル上で電気泳動されたホルモンのような外来性タン
パク質の産生を検出するために用いられる。
免疫化学プロッティング法、いわゆる゛ウェスターン法
″における補助試薬としての有用性を加えた。この抗体
はゲル上で電気泳動されたホルモンのような外来性タン
パク質の産生を検出するために用いられる。
最近、相当の注意を引いているホルモンの１つに、元来
Ｔ細胞増殖因子として知られるインターロイキン−２（
工Ｌ−２）がある。このリンフ才力インは１０年以上前
に発見され〔スミス（Ｓｍ１ｔｈ。
Ｔ細胞増殖因子として知られるインターロイキン−２（
工Ｌ−２）がある。このリンフ才力インは１０年以上前
に発見され〔スミス（Ｓｍ１ｔｈ。
Ｋ、） ノＩｍｍｕｎｏ１．Ｒｅｖ、 ５１ ：３３７
〜３５７（１９８０）を参照１、その主な機能はほとん
ど疑いなくＴ細胞資（哺乳動物の免疫応答において決定
的な役割を果たす細胞）の増殖の刺激および維持である
。実際に、増殖性Ｔ細胞からＩＬ−２を除去すると、そ
れらは数時間のうちに死滅する〔ラセッティ（Ｒｕｓｃ
ｅｔｔｉ 、Ｆ、）らｔｙ） Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、
１２３：２９２８〜２９３１（１９７７）を参照〕。こ
うして何人かの免疫学者は工Ｌ−２が全免疫応答の中心
を占めると考えている。■Ｌ−２活性の詳細な記事につ
いては、例えばファジー（Ｆ＋ａｒｒａｒ、 Ｊ、 ）
らの工ｍｍｕｎｏ１． Ｒｅｖ。
〜３５７（１９８０）を参照１、その主な機能はほとん
ど疑いなくＴ細胞資（哺乳動物の免疫応答において決定
的な役割を果たす細胞）の増殖の刺激および維持である
。実際に、増殖性Ｔ細胞からＩＬ−２を除去すると、そ
れらは数時間のうちに死滅する〔ラセッティ（Ｒｕｓｃ
ｅｔｔｉ 、Ｆ、）らｔｙ） Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、
１２３：２９２８〜２９３１（１９７７）を参照〕。こ
うして何人かの免疫学者は工Ｌ−２が全免疫応答の中心
を占めると考えている。■Ｌ−２活性の詳細な記事につ
いては、例えばファジー（Ｆ＋ａｒｒａｒ、 Ｊ、 ）
らの工ｍｍｕｎｏ１． Ｒｅｖ。
６３：１２９−１６６（１９８２）を参照されたい。
驚くべきことではないが、研究者たちは免疫応答におけ
る工Ｌ−２の役割を、例えば工Ｌ２の検定および精製の
より優れた方法を開発することにより、一層深く理解す
るためにモノクローナル抗体技術を使用した。例えば、
少なくとも３つの欧州特許出願（８２３０２２３１゜４
，８３１０８４４４．７．および８３１１２５３２．３
）が工Ｌ−２と結合しうるモノクローナル抗体に関して
発行されており、そして少なくとも１つの商品源が存在
する〔ＤＭＳ−１゜マサチューセッツ州ホストン、ゲン
ザイム・コーポレー ジョン（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ）ｌ。
る工Ｌ−２の役割を、例えば工Ｌ２の検定および精製の
より優れた方法を開発することにより、一層深く理解す
るためにモノクローナル抗体技術を使用した。例えば、
少なくとも３つの欧州特許出願（８２３０２２３１゜４
，８３１０８４４４．７．および８３１１２５３２．３
）が工Ｌ−２と結合しうるモノクローナル抗体に関して
発行されており、そして少なくとも１つの商品源が存在
する〔ＤＭＳ−１゜マサチューセッツ州ホストン、ゲン
ザイム・コーポレー ジョン（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ）ｌ。
これらのモノクローナル抗体のそれぞれは、報告によれ
ば、ヒ） 工Ｌ−２に対して有意な結合親和性を示し、
いくつかのものはさらにマウスおよび／またはラツ）
工Ｌ−２との交差反応性を示す。ヒト１Ｌ−２に対する
親和性が多くの目的にとって非常に重要であるが、ヒト
またはラットエＬ−２に存在シナいマウスエＬ−２のエ
ピトープ（抗原部位）を認識するモノクローナル抗体を
提供することは有用であるだろう。このことはヒ） Ｉ
Ｌ−２の存在精製および二部位免疫検定法が一層実行可
能となるだろう。さらに、これは外因性ＩＬ−２（例え
ばヒトまたはラット）を加えつつ内因性ＩＬ−２（例え
ばマウス）の実験的抑制を可能にし、哺乳動物の免疫応
答における工Ｌ−２の役割に関する免疫学者の知識を広
めるであろう。
ば、ヒ） 工Ｌ−２に対して有意な結合親和性を示し、
いくつかのものはさらにマウスおよび／またはラツ）
工Ｌ−２との交差反応性を示す。ヒト１Ｌ−２に対する
親和性が多くの目的にとって非常に重要であるが、ヒト
またはラットエＬ−２に存在シナいマウスエＬ−２のエ
ピトープ（抗原部位）を認識するモノクローナル抗体を
提供することは有用であるだろう。このことはヒ） Ｉ
Ｌ−２の存在精製および二部位免疫検定法が一層実行可
能となるだろう。さらに、これは外因性ＩＬ−２（例え
ばヒトまたはラット）を加えつつ内因性ＩＬ−２（例え
ばマウス）の実験的抑制を可能にし、哺乳動物の免疫応
答における工Ｌ−２の役割に関する免疫学者の知識を広
めるであろう。
従って、マウスエＬ−２に特異的であるが、ヒトまたは
ラツ）■Ｌ−２とは有意に交差反応しないモノクローナ
ル抗体を産生しうる・・イプリド−マに対する必要性が
存在する。本発明はこの必要性をみたすものである。
ラツ）■Ｌ−２とは有意に交差反応しないモノクローナ
ル抗体を産生しうる・・イプリド−マに対する必要性が
存在する。本発明はこの必要性をみたすものである。
発明の構成
本発明は、マウスインターロイキン−２（工Ｌ−２）に
特異的であるが他の哺乳動物種（例えばヒトやラット）
由来の天然工Ｌ−２と有意に交差反応しないモノクロー
ナル抗体を産生ずるノ・イブリッド細胞系を提供する。
特異的であるが他の哺乳動物種（例えばヒトやラット）
由来の天然工Ｌ−２と有意に交差反応しないモノクロー
ナル抗体を産生ずるノ・イブリッド細胞系を提供する。
ラットエｇＧ２ａサブクラスの抗体を分泌する１つの・
・イプリド−マは３４Ｂ６と命名され、この試料はアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１２３（
１１パークローントゝライブ、ロックビル、メリーラン
トゝ州２０８５２゜’Ｕ Ｓ Ａ ）に寄託番号ＨＢ−
８７９４として寄託された。
・イプリド−マは３４Ｂ６と命名され、この試料はアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１２３（
１１パークローントゝライブ、ロックビル、メリーラン
トゝ州２０８５２゜’Ｕ Ｓ Ａ ）に寄託番号ＨＢ−
８７９４として寄託された。
本発明方法によれば、マウスエＬ−２に特異的なモノク
ローナル抗体は：抗マウスエＬ−２抗体産生細胞と融合
パートナ−細胞とを融合してノ・イブリド９−マを作り
；そのノ・イブリド−マを増殖させ；そしてそのバイブ
リド９−マによって産生される抗体（この抗体は他の哺
乳動物種の天然工Ｌ−２とは実質的に交差反応しない）
を採取する；ことによりつくられる。抗体産生細胞はマ
ウスエＬ−２またはその断片（ヒトおよびラツ）工Ｌ−
２に対してマウスエＬ−２に特異なアミノ酸配列から成
る断片）で免疫感作された動物（好ましくはラット）の
脾臓細胞またはリンパ節細胞よシ得ることができる。
ローナル抗体は：抗マウスエＬ−２抗体産生細胞と融合
パートナ−細胞とを融合してノ・イブリド９−マを作り
；そのノ・イブリド−マを増殖させ；そしてそのバイブ
リド９−マによって産生される抗体（この抗体は他の哺
乳動物種の天然工Ｌ−２とは実質的に交差反応しない）
を採取する；ことによりつくられる。抗体産生細胞はマ
ウスエＬ−２またはその断片（ヒトおよびラツ）工Ｌ−
２に対してマウスエＬ−２に特異なアミノ酸配列から成
る断片）で免疫感作された動物（好ましくはラット）の
脾臓細胞またはリンパ節細胞よシ得ることができる。
ハイブリド−マはｉｎ ｖｉｔｒｏ （例えば組織培養
）またはｉｎ ＶｉＶＯ（例えばマウスの腹腔）で培養
される。融合パートナ−は抗体産生細胞と異なる種に由
来するものであってもよい。例えば抗体産生細胞がラッ
トの３９７２球である場合、その融合パートナ−はマウ
スの骨髄腫細胞であシうる。
）またはｉｎ ＶｉＶＯ（例えばマウスの腹腔）で培養
される。融合パートナ−は抗体産生細胞と異なる種に由
来するものであってもよい。例えば抗体産生細胞がラッ
トの３９７２球である場合、その融合パートナ−はマウ
スの骨髄腫細胞であシうる。
よシ詳細には、本発明の好適な実施態様は非グリコシル
化または自然グリコモル化マウスエＬ−２と結合するが
、ヒトまたはラット由来の天然ＩＬ−２と有意に結合し
ないモノクローナル抗体を産生じ得るバイブリド９−マ
である。このバイブリドゞ−マは次の諸工程：マウスエ
Ｌ−２を産生ずる細胞系からの上清を用いてラットを免
疫化し；そのラットから３９７７９球を取り出し；その
３９７２球と骨髄腫型の細胞系（例えば、特にマウスま
たはラット由来の適当な骨髄腫細胞系もしくは第一のハ
イブリッド細胞系）とを融合して（第二の）細胞ハイブ
リッドを作シ；個々の細胞ハイブリット９を限界希釈法
によシ選択およびクローニングして、マウスＩＬ−２に
特異的な抗体を産生ずる細胞ハイブリッドをスフＩ）−
ユングおよび単離し；そしてラットおよびヒト天然工Ｌ
−２に対する交差反応性について検定して上記の・・イ
プリド−マを同定する：ことから成る方法によって製造
することができる。
化または自然グリコモル化マウスエＬ−２と結合するが
、ヒトまたはラット由来の天然ＩＬ−２と有意に結合し
ないモノクローナル抗体を産生じ得るバイブリド９−マ
である。このバイブリドゞ−マは次の諸工程：マウスエ
Ｌ−２を産生ずる細胞系からの上清を用いてラットを免
疫化し；そのラットから３９７７９球を取り出し；その
３９７２球と骨髄腫型の細胞系（例えば、特にマウスま
たはラット由来の適当な骨髄腫細胞系もしくは第一のハ
イブリッド細胞系）とを融合して（第二の）細胞ハイブ
リッドを作シ；個々の細胞ハイブリット９を限界希釈法
によシ選択およびクローニングして、マウスＩＬ−２に
特異的な抗体を産生ずる細胞ハイブリッドをスフＩ）−
ユングおよび単離し；そしてラットおよびヒト天然工Ｌ
−２に対する交差反応性について検定して上記の・・イ
プリド−マを同定する：ことから成る方法によって製造
することができる。
本発明をより良く理解するために、その好適な実施態様
を添付の図面に関連させて説明するであろう。ここで、 第１図は成熟マウスエＬ−２活性をコート９するｃＤＮ
ＡりＱ−ン（外層膜プロティン−Ａシグナルにプチドに
融合される）を保有するプラスミド。
を添付の図面に関連させて説明するであろう。ここで、 第１図は成熟マウスエＬ−２活性をコート９するｃＤＮ
ＡりＱ−ン（外層膜プロティン−Ａシグナルにプチドに
融合される）を保有するプラスミド。
ｐｏｍｐＡ２ ｍＩＬ−２を示し；そして第２図は本発
明のモノクローナル抗体、ならびに工Ｌ−２０ＤＮＡ挿
入物を含む（＋）および含まない（−）第１図記載のプ
ラスミドを組み入れた細菌培養からの上清を利用するウ
ェスターン法を示す。
明のモノクローナル抗体、ならびに工Ｌ−２０ＤＮＡ挿
入物を含む（＋）および含まない（−）第１図記載のプ
ラスミドを組み入れた細菌培養からの上清を利用するウ
ェスターン法を示す。
本発明によれば、マウスエＬ−２に特異的であるがラッ
トまたはヒト由来の工Ｌ−２と有意に反応しないモノク
ローナル抗体を分泌するハイブリド−マが提供される。
トまたはヒト由来の工Ｌ−２と有意に反応しないモノク
ローナル抗体を分泌するハイブリド−マが提供される。
このハイブリド−マは以下に述べるように抗原として未
精製上清を使用し；且っ一般にポリエチレングリコール
を融合剤として使用するコーラ−およびミルスタインの
方法に従うことによシ作られる。
精製上清を使用し；且っ一般にポリエチレングリコール
を融合剤として使用するコーラ−およびミルスタインの
方法に従うことによシ作られる。
Ａ、免疫感作
マウスエＬ−２用の好適な抗原はマウスＴ細胞系からの
上清であり〔ファジー（Ｆ ａｒｒａｒ 、 Ｊ、 ）
らのＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ１２５：２５５５〜２５５８（
１９８０）参照〕、また他の源から精製されたマウスエ
Ｌ−２も適している〔グラネリーピパーノ（Ｇｒａｎｅ
ｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ 。
上清であり〔ファジー（Ｆ ａｒｒａｒ 、 Ｊ、 ）
らのＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ１２５：２５５５〜２５５８（
１９８０）参照〕、また他の源から精製されたマウスエ
Ｌ−２も適している〔グラネリーピパーノ（Ｇｒａｎｅ
ｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ 。
Ａ、）らのＪ、ＥｘｐｏＭｅｄ、１５４：４２２〜４３
０（１９８１）参照〕。いったんＩＬ−２が精製される
と、臭化シアン処理または酵素的切断（例えば滅プシン
、トリプシンなど）のようなよく知られた方法を使って
その断片を作ることができる。また、１９８５年１０月
３日付の欧州特許出願８５３０７０９４．４（１９８６
年４月９日に第（１１７７３５７号として発行された）
はマウスエＬ−２活性を示すポリイプチビをコードする
ｃＤＮＡクローンのクローニングおよび発現を開示して
おり、この特許出願（参照によりここに引用される）は
マウスエＬ−２を外因性宿主（細菌、酵母およびサル細
胞を含む）内で生産する方法を提供し、その上清は適当
な抗原源である。ヒトＩＬ−２をコードするｃＤＮＡク
ローン〔谷口（Ｔａｎ、ｉｇｕｃｈｉ、Ｔ、 ）らのネ
イチャー３０２）３０５〜３１０（１９８３）参照〕と
の一連の比較は、マウスに特異なアミノ酸配列（別途に
合成して免疫感作に使用できる）に関する情報を提供す
るととができる。
０（１９８１）参照〕。いったんＩＬ−２が精製される
と、臭化シアン処理または酵素的切断（例えば滅プシン
、トリプシンなど）のようなよく知られた方法を使って
その断片を作ることができる。また、１９８５年１０月
３日付の欧州特許出願８５３０７０９４．４（１９８６
年４月９日に第（１１７７３５７号として発行された）
はマウスエＬ−２活性を示すポリイプチビをコードする
ｃＤＮＡクローンのクローニングおよび発現を開示して
おり、この特許出願（参照によりここに引用される）は
マウスエＬ−２を外因性宿主（細菌、酵母およびサル細
胞を含む）内で生産する方法を提供し、その上清は適当
な抗原源である。ヒトＩＬ−２をコードするｃＤＮＡク
ローン〔谷口（Ｔａｎ、ｉｇｕｃｈｉ、Ｔ、 ）らのネ
イチャー３０２）３０５〜３１０（１９８３）参照〕と
の一連の比較は、マウスに特異なアミノ酸配列（別途に
合成して免疫感作に使用できる）に関する情報を提供す
るととができる。
免疫感作の実験方法はよく知られておシ、相当に変更し
得るが、それにもかかわらず効果的である。マウスエＬ
−２のような水溶性タンパク質の場合は通常アジュバン
トの使用が必要である。一般的には完全フロインドアジ
ュバントを使用スる。
得るが、それにもかかわらず効果的である。マウスエＬ
−２のような水溶性タンパク質の場合は通常アジュバン
トの使用が必要である。一般的には完全フロインドアジ
ュバントを使用スる。
これとは別に、抗原をみょうばん上に沈澱させ、その後
死滅した百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅ’１ａｐｅｒｔｕｓ
８ｉりまたはカサガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ
）ヘモシアニンと混合してもよい。抗原の第一次注射は
通常高度に凝結した形で与えられ、その後の免疫化は可
溶性物質または凝結物質のいずれかを使用する。
死滅した百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅ’１ａｐｅｒｔｕｓ
８ｉりまたはカサガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ
）ヘモシアニンと混合してもよい。抗原の第一次注射は
通常高度に凝結した形で与えられ、その後の免疫化は可
溶性物質または凝結物質のいずれかを使用する。
注射は皮下、腹腔内または血管内に行われる。
一般にラットの場合は１〜５０μｇを１〜２ｒｐｔｌの
エマルジョンとして与え、マウスの場合はそのＬ／１０
を与える。その後１〜１０回またはそれ以上の追加免疫
（第二次免疫注射）を２〜８週おきにおこない、最後の
注射は脾臓および／または局部ドレナージ（ｄｒａｉｎ
ａｇθ）リンパ節を摘出して融合用の抗体産生細胞（例
えば感作３９７２球）の細胞懸濁液を調製する２〜４日
前におこなう。
エマルジョンとして与え、マウスの場合はそのＬ／１０
を与える。その後１〜１０回またはそれ以上の追加免疫
（第二次免疫注射）を２〜８週おきにおこない、最後の
注射は脾臓および／または局部ドレナージ（ｄｒａｉｎ
ａｇθ）リンパ節を摘出して融合用の抗体産生細胞（例
えば感作３９７２球）の細胞懸濁液を調製する２〜４日
前におこなう。
Ｂ、融 合
本発明の・・イゾリド−マを形成する際の融合パートナ
−細胞として使用し得る細胞系は多数存在する。骨髄腫
細胞（特にそれら自身の免疫グロブリン鎖を産出しない
もの）が好ましいが、多くのＭＯＰＣ−２１変異細胞も
適しておシ、これらの全ては広く入手可能である。また
、別の骨髄腫細胞系および・・イブリッド細胞系も使用
できる。融合パートナーは一般にＨＰＣＲＴ酵素機能を
欠除するために、８−アザグアニンおよび／または６−
チオグアニンに対して薬剤耐性であル、それ故ＨＡＴ培
地で増殖することができない。
−細胞として使用し得る細胞系は多数存在する。骨髄腫
細胞（特にそれら自身の免疫グロブリン鎖を産出しない
もの）が好ましいが、多くのＭＯＰＣ−２１変異細胞も
適しておシ、これらの全ては広く入手可能である。また
、別の骨髄腫細胞系および・・イブリッド細胞系も使用
できる。融合パートナーは一般にＨＰＣＲＴ酵素機能を
欠除するために、８−アザグアニンおよび／または６−
チオグアニンに対して薬剤耐性であル、それ故ＨＡＴ培
地で増殖することができない。
実際の融合はたいてい分子量が約１０００〜１００００
ダルトンの範囲、通常約１５００ダルトンのポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）の存在下で行われる。その他の
濃度、融合促進剤および手順も知られており、許容でき
るものである。ＰＥＧ濃度は約７０〜８６２のｐＨにお
いて約３０〜６０％（重量／重量）、好ましくは３５〜
４０チであり、畢露時間はよシ高いＰＥＧ濃度では約１
〜２分であるが、より低い濃度ではもつと長くなるだろ
う（例えば約７〜１０分まで）。その後、細胞を遠心分
離により集めて収穫する。
ダルトンの範囲、通常約１５００ダルトンのポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）の存在下で行われる。その他の
濃度、融合促進剤および手順も知られており、許容でき
るものである。ＰＥＧ濃度は約７０〜８６２のｐＨにお
いて約３０〜６０％（重量／重量）、好ましくは３５〜
４０チであり、畢露時間はよシ高いＰＥＧ濃度では約１
〜２分であるが、より低い濃度ではもつと長くなるだろ
う（例えば約７〜１０分まで）。その後、細胞を遠心分
離により集めて収穫する。
Ｃ９選択、クローニングおよびスクリーニング続いて細
胞を希釈し、融合しなかった融合パートナ−の生存を阻
害する適当な選択培地（通常非融合抗体産生細胞は約７
日以内に死滅するだろう）を含有する別個のウェル内で
１週間またはそれ以上培養する。希釈はハイブリッド細
胞形成の予期される頻度（通常１０６ 個あたり約１個
）に応じて変えることができるが、好ましくは各クエル
内に少数の生存ハイブリーット９細胞（例えばウェルあ
たり平均して１個未満の生存／・イブリッド細胞）がも
たらされるように選ばれるだろう。
胞を希釈し、融合しなかった融合パートナ−の生存を阻
害する適当な選択培地（通常非融合抗体産生細胞は約７
日以内に死滅するだろう）を含有する別個のウェル内で
１週間またはそれ以上培養する。希釈はハイブリッド細
胞形成の予期される頻度（通常１０６ 個あたり約１個
）に応じて変えることができるが、好ましくは各クエル
内に少数の生存ハイブリーット９細胞（例えばウェルあ
たり平均して１個未満の生存／・イブリッド細胞）がも
たらされるように選ばれるだろう。
選択の後、固相ラジオイムノアッセイ、バイオアッセイ
、酵素結合免疫吸着法、ロゼツト形成法、免疫阻止検定
法などのよく知られた方法のいずれかを用いて、マウス
エＬ−２を認識しうる抗体の有無についてウェルをスク
リーニングする。その後、陽性ウェルは限界希釈法によ
り個々の細胞コロニーへとクローニングする。必要に応
じて、支持細胞（例えば適当な源からの胸腺リンパ球）
を添加してもよい。クローン化を確実にするためにほと
んどいつも再クローニングすることが適切である。
、酵素結合免疫吸着法、ロゼツト形成法、免疫阻止検定
法などのよく知られた方法のいずれかを用いて、マウス
エＬ−２を認識しうる抗体の有無についてウェルをスク
リーニングする。その後、陽性ウェルは限界希釈法によ
り個々の細胞コロニーへとクローニングする。必要に応
じて、支持細胞（例えば適当な源からの胸腺リンパ球）
を添加してもよい。クローン化を確実にするためにほと
んどいつも再クローニングすることが適切である。
交差反応性の試験は上記方法を利用する時点で行うこと
ができる。
ができる。
Ｄ、増 産
いったん目的のバイブリド９−マが同定および単離され
ると、必要な添加物を補足した培地中で培養することに
よｐ、ｉｎ ＶｉｔｒＯで大量のモノクローナル抗体が
産生される。一般に、培養物中の抗体濃度は個々のクロ
ーンおよび細胞密度に応じて約５〜５０μｇ、／ｍｅの
範囲である。
ると、必要な添加物を補足した培地中で培養することに
よｐ、ｉｎ ＶｉｔｒＯで大量のモノクローナル抗体が
産生される。一般に、培養物中の抗体濃度は個々のクロ
ーンおよび細胞密度に応じて約５〜５０μｇ、／ｍｅの
範囲である。
抗体が大量の場合は、動物における腫瘍のようにその・
・イブリビーマをｉｎ ｖｉｖｏで増殖する方が容易で
あり、血清または腹水は約５０ｍｆ／ｒｎｌまでのモノ
クローナル抗体を提供し得る。通常約１０６〜１０７個
の組織適合性ハイブリドーマ細胞をマウスまたはラット
に注射（好ましくは腹腔内）すると、数週間後に腫瘍が
形成されるだろう。その後、よく知られた方法を用いて
抗体を採取し、処理する。〔一般に、免疫学的方法（工
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａＩＭｅｔｈｏｄｓ ）、 ｖｏ
ｌ、 Ｉ＆ ■、レフコビツツ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ
。
・イブリビーマをｉｎ ｖｉｖｏで増殖する方が容易で
あり、血清または腹水は約５０ｍｆ／ｒｎｌまでのモノ
クローナル抗体を提供し得る。通常約１０６〜１０７個
の組織適合性ハイブリドーマ細胞をマウスまたはラット
に注射（好ましくは腹腔内）すると、数週間後に腫瘍が
形成されるだろう。その後、よく知られた方法を用いて
抗体を採取し、処理する。〔一般に、免疫学的方法（工
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａＩＭｅｔｈｏｄｓ ）、 ｖｏ
ｌ、 Ｉ＆ ■、レフコビツツ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ
。
１、）およびパーニス（ＰｓｒｎｉＳ、Ｂ、）編集、ア
カデミツクプレス、ニューヨーク（１９７９＆１９８１
）；フラニル・サイエンティフィック・パブリケーショ
ンズ、セントルイス（１９７８）を参照されたい。両文
献とも参照によりここに引用される。〕実施例１ 培地１ ｍｌあたり５ Ｘ １０６個の濃度のマウスヘ
ルパーＴ細胞系ＬＢ２−１ （ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ
−８６２９）由来の細胞を、血清を含まないが００５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールと４μｇ／ｒｎｌのコン
カナバリンＡ （ＣｏｎＡ： カリフォルニア州うジ
ョラ、カルバイオケム社）を含むＲＰＭ工１６４０培地
にューヨーク州グランド５アイランド９、ギブコ社〕中
でインキュベートすることにより抗原をつくった。３７
℃で２４時間インキュベートした後、細胞を遠心分離に
より除き、上清タン・ξり質はアミコンＹＭ５膜（マサ
チューセッツ州デンバーズ）を通して加圧下で濾過する
ことにより約３０倍に濃縮した。得られた濃縮物を完全
フロインドアジュバントと混合し、成熟ルイスラットに
腹腔内注射した。６ケ月間に６回の注射を行った。
カデミツクプレス、ニューヨーク（１９７９＆１９８１
）；フラニル・サイエンティフィック・パブリケーショ
ンズ、セントルイス（１９７８）を参照されたい。両文
献とも参照によりここに引用される。〕実施例１ 培地１ ｍｌあたり５ Ｘ １０６個の濃度のマウスヘ
ルパーＴ細胞系ＬＢ２−１ （ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ
−８６２９）由来の細胞を、血清を含まないが００５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールと４μｇ／ｒｎｌのコン
カナバリンＡ （ＣｏｎＡ： カリフォルニア州うジ
ョラ、カルバイオケム社）を含むＲＰＭ工１６４０培地
にューヨーク州グランド５アイランド９、ギブコ社〕中
でインキュベートすることにより抗原をつくった。３７
℃で２４時間インキュベートした後、細胞を遠心分離に
より除き、上清タン・ξり質はアミコンＹＭ５膜（マサ
チューセッツ州デンバーズ）を通して加圧下で濾過する
ことにより約３０倍に濃縮した。得られた濃縮物を完全
フロインドアジュバントと混合し、成熟ルイスラットに
腹腔内注射した。６ケ月間に６回の注射を行った。
最後の注射の３日後、ラットの脾臓を摘出して細胞を３
つの部分に分割した。２×１０８個の牌７覧細胞を４×
１０７個のＳＰ／２マウスハイブリット９細胞（シャｐ
ｖ−ｑ ：／ （Ｓｈｕｌｍａｎ、Ｍ、 ） らのネイ
チャー２７６：２６９〜２７０（１９，７８ン参照〕と
混合し、９００Ｘ ｇで７分遠心することによシ沈澱さ
せた。
つの部分に分割した。２×１０８個の牌７覧細胞を４×
１０７個のＳＰ／２マウスハイブリット９細胞（シャｐ
ｖ−ｑ ：／ （Ｓｈｕｌｍａｎ、Ｍ、 ） らのネイ
チャー２７６：２６９〜２７０（１９，７８ン参照〕と
混合し、９００Ｘ ｇで７分遠心することによシ沈澱さ
せた。
この細胞をＲＰＭ工１５４Ｑに再懸濁して再び沈澱させ
た。次にこの沈澱物を４０％（重量／重量）ＰＥＧ（分
子量８０００ ）２ｍｌに懸濁し、混合し、そして６０
０Ｘ ｇで６分遠心することにより再度沈澱させた。上
清を除去し、２０％ウシ胎児血清（ギブコ）を含むＲＰ
Ｍ工１６４０に沈澱物を懸濁した。この細胞を遠心によ
り再沈澱させ、そして０．１ｍＭ ヒポキサンチン、０
．０３ ｍＭチミジン、Ｏ，０００５ｍＭアメトプテリ
ン、０．０５■／ｒ！Ｌｇ ゲンタマイシンにュジャー
シー州ケニルワース、シェリング社）および０．０５ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）を加えた同一培
地に懸濁した。この７細胞懸濁液を１０枚の９６−ウェ
ル平底トレーに分配し、３７℃でインキュベートした。
た。次にこの沈澱物を４０％（重量／重量）ＰＥＧ（分
子量８０００ ）２ｍｌに懸濁し、混合し、そして６０
０Ｘ ｇで６分遠心することにより再度沈澱させた。上
清を除去し、２０％ウシ胎児血清（ギブコ）を含むＲＰ
Ｍ工１６４０に沈澱物を懸濁した。この細胞を遠心によ
り再沈澱させ、そして０．１ｍＭ ヒポキサンチン、０
．０３ ｍＭチミジン、Ｏ，０００５ｍＭアメトプテリ
ン、０．０５■／ｒ！Ｌｇ ゲンタマイシンにュジャー
シー州ケニルワース、シェリング社）および０．０５ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）を加えた同一培
地に懸濁した。この７細胞懸濁液を１０枚の９６−ウェ
ル平底トレーに分配し、３７℃でインキュベートした。
約３日後、アメトブテリン以外の同一補足物を含む新し
い培地と交換した。
い培地と交換した。
９６０のウェル全部からの上清を５つの群にプールし、
得られた１９２の試料はＩＬ−２バイオアツセイを阻害
する能力について試験することにより検定した。０．０
５ｒｎｌの試料を１０係ウシ胎児血清、２０００個のマ
ウスＨＴ２細胞［］ワトノ：ｙ （Ｗａｔｓｏｎ。
得られた１９２の試料はＩＬ−２バイオアツセイを阻害
する能力について試験することにより検定した。０．０
５ｒｎｌの試料を１０係ウシ胎児血清、２０００個のマ
ウスＨＴ２細胞［］ワトノ：ｙ （Ｗａｔｓｏｎ。
Ｊ、）のＪ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、 １５０： １５１０〜
１５１９（１９７９）参照〕、および２４時間の間最大
増殖を誘発するのに十分な工Ｌ−２源（上記のようにし
て調製したＣｏｎＡ−刺激ＬＢ２−１細胞の上清の０４
％希釈物として供給）を含むＲＰＭ工１６４００．０５
ｍ１！と混合した。このトレーを５％ＣＯＺ中３７℃で
インキュベートした。２０時間後、各培養物にリン酸緩
衝溶液（ＰＢＳ）中５■／な／ＭＴＴ〔臭化３−（４，
５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェ
ニルテトラゾリウム；ミズリー州セントルイス、シグマ
・ケミカル社） ０． ＯＩ ＷＬｌを加えた。４時間
後各培養物にインプロパツール中０．０４ Ｎ Ｈ（Ｊ
ｏ、 １５ ｍ／！を加えて十分に混合した。数分後、
このプレートをダイナチクＭＲ５８０マイクロエリザ自
動読取り機（カリフォルニア州トーラ／ス、ダイナテ“
・インスツルメント社）を使って波長５７０ｎｍ（）５
゛″・波長６３０ｎｍ）および目盛り調整１．９９にお
イーｃ 、ｊ・’ｊ取った。（モスマフ （Ｍｏｓｍａ
ｎｎ、Ｔ、 ）のＪ。
１５１９（１９７９）参照〕、および２４時間の間最大
増殖を誘発するのに十分な工Ｌ−２源（上記のようにし
て調製したＣｏｎＡ−刺激ＬＢ２−１細胞の上清の０４
％希釈物として供給）を含むＲＰＭ工１６４００．０５
ｍ１！と混合した。このトレーを５％ＣＯＺ中３７℃で
インキュベートした。２０時間後、各培養物にリン酸緩
衝溶液（ＰＢＳ）中５■／な／ＭＴＴ〔臭化３−（４，
５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェ
ニルテトラゾリウム；ミズリー州セントルイス、シグマ
・ケミカル社） ０． ＯＩ ＷＬｌを加えた。４時間
後各培養物にインプロパツール中０．０４ Ｎ Ｈ（Ｊ
ｏ、 １５ ｍ／！を加えて十分に混合した。数分後、
このプレートをダイナチクＭＲ５８０マイクロエリザ自
動読取り機（カリフォルニア州トーラ／ス、ダイナテ“
・インスツルメント社）を使って波長５７０ｎｍ（）５
゛″・波長６３０ｎｍ）および目盛り調整１．９９にお
イーｃ 、ｊ・’ｊ取った。（モスマフ （Ｍｏｓｍａ
ｎｎ、Ｔ、 ）のＪ。
工ｍｍｕｎｏ１Ｍｅｔｈ、 ６５ ： ５５〜６３ （
１９８３）を参照されたい。） １つを除く全てのウェルがＨＴ２細胞の増殖を示し、こ
のことは１つの試料のみが工Ｌ−２を阻害できたことを
示している。この試料に関係のある５つのウェルをそれ
ぞれ別個に試験し、１つのウェル（３４Ｂ６と呼ぶ）が
強力な阻害活性を有していた。このウェルからのハイブ
リド−マ細胞を限界希釈法によシ再クローニングし、個
々のクローンを採取した。これらのサブクローンの１つ
を次の実験に使用した。
１９８３）を参照されたい。） １つを除く全てのウェルがＨＴ２細胞の増殖を示し、こ
のことは１つの試料のみが工Ｌ−２を阻害できたことを
示している。この試料に関係のある５つのウェルをそれ
ぞれ別個に試験し、１つのウェル（３４Ｂ６と呼ぶ）が
強力な阻害活性を有していた。このウェルからのハイブ
リド−マ細胞を限界希釈法によシ再クローニングし、個
々のクローンを採取した。これらのサブクローンの１つ
を次の実験に使用した。
８４Ｂ５細胞の世代時間は、１０％ウシ胎児血清および
０．０５ｍＭ ２ＭＫを含むＲＰＭ工１６４０中で増殖
させる場合、約２０時間である。この細胞は血清不含の
ＲＰＭ工１６４０または規定培地ＨＢ１０２（カリフォ
ルニア州パークレー、ハナ・メディア社）中に短期間の
間ラットエｇＧ２ａサブクラス抗体を分泌する。このハ
イブリド−マは１週間前に・、０、５ ｙｔｌのプリス
タンで感作し且つ細胞（マウスあたり約２ Ｘ １０６
個 ）を腹腔内注射する直前に１５０−４５ＯＲガンマ
線を照射したマウスの腹水ととして増殖する。
０．０５ｍＭ ２ＭＫを含むＲＰＭ工１６４０中で増殖
させる場合、約２０時間である。この細胞は血清不含の
ＲＰＭ工１６４０または規定培地ＨＢ１０２（カリフォ
ルニア州パークレー、ハナ・メディア社）中に短期間の
間ラットエｇＧ２ａサブクラス抗体を分泌する。このハ
イブリド−マは１週間前に・、０、５ ｙｔｌのプリス
タンで感作し且つ細胞（マウスあたり約２ Ｘ １０６
個 ）を腹腔内注射する直前に１５０−４５ＯＲガンマ
線を照射したマウスの腹水ととして増殖する。
実施例２
３４Ｂ５培養物からの上清をアミコンＰＭ−３０フィル
ター膜を使って１００倍に濃縮し、この抗体調製物を９
６−ウェルトレーにおいて一組１６ウエル（各々０．０
５−）の三組について倍加希釈法によシ滴定した。次に
全ウェルは約２０００個のＨＴ２細胞および２４時間の
間最大増殖を誘発するのに十分な工Ｌ−２源（マウスエ
Ｌ−２ＣＤＮＡクローンを発現する大腸菌の溶菌液の４
Ｘ １０−’％希釈物として供給）を含む培地０．０
５ｍ／！を受は取った。２４時間後このプレートをＭＴ
Ｔ検定法により検定し、その結果を下の表１に示した。
ター膜を使って１００倍に濃縮し、この抗体調製物を９
６−ウェルトレーにおいて一組１６ウエル（各々０．０
５−）の三組について倍加希釈法によシ滴定した。次に
全ウェルは約２０００個のＨＴ２細胞および２４時間の
間最大増殖を誘発するのに十分な工Ｌ−２源（マウスエ
Ｌ−２ＣＤＮＡクローンを発現する大腸菌の溶菌液の４
Ｘ １０−’％希釈物として供給）を含む培地０．０
５ｍ／！を受は取った。２４時間後このプレートをＭＴ
Ｔ検定法により検定し、その結果を下の表１に示した。
データは工Ｌ−２が存在するが抗体が存在しない状態の
ＨＴ２ 細胞から発せられる信号の阻害チとして表わし
た。
ＨＴ２ 細胞から発せられる信号の阻害チとして表わし
た。
表 １
８４Ｂ５上隋の希釈 阻害チ
１／３２７６ ｓ ３実施例３
３４Ｂ５培養物からの上清を最終濃度１２．５ ％で９
６−ウェルトレーにおいて三組ずつ試験した。
６−ウェルトレーにおいて三組ずつ試験した。
全てのウェルは約２０００個のＨＴ２細胞および２４時
間の間最大増殖を誘発するのに十分な工Ｌ−２源を受は
取り、最終容量０．１ｍＡ’とした。２４時間′後プレ
ートをＭＴＴ検定法で検定し、その結果を表Ｈに示した
。データは工Ｌ−２が存在するが抗体が存在しない状態
においてＨＴ２細胞から発せられる信号の阻害パーセン
トとして表わした。
間の間最大増殖を誘発するのに十分な工Ｌ−２源を受は
取り、最終容量０．１ｍＡ’とした。２４時間′後プレ
ートをＭＴＴ検定法で検定し、その結果を表Ｈに示した
。データは工Ｌ−２が存在するが抗体が存在しない状態
においてＨＴ２細胞から発せられる信号の阻害パーセン
トとして表わした。
表■
ＣｏｓマウスエＬ−２７１
ＣｏｓヒトエＬ−２９
酵母マウスエＬ−２７３
大腸菌マウスエＬ−２７０
ラットエＬ−２１
表■の説明：
ＬＢ２−１−７ウスエＬ −２−ＣｏｎＡ−刺激Ｉ、Ｂ
２−１細胞からの上清； ＣＯθマウスエＬ−２−マウスエＬ−２のｃＤＮＡクロ
ーンでトランスフェクトされたＣｏｓサル細胞からの上
清； ＣｏｓヒトＩＬ−２−ヒトＩＬ−２のｃＤＮＡクローン
でトランスフェクトされたＣｏｓサル細胞からの上清； 酵母マウスエＬ−２−マウスエＬ−２のｃＤＮＡクロー
ンを発現する酵母細胞からの酵母溶菌液；大腸菌マウス
エＬ−２−マウスＩＬ−２のｃＤＮＡクローン（３個の
余分のアミノ酸をＮ末端に含む）を発現する大腸菌から
の溶菌液； ラットエＬ−２−ＣｏｎＡ−刺激ラット脾臓細胞からの
上清。
２−１細胞からの上清； ＣＯθマウスエＬ−２−マウスエＬ−２のｃＤＮＡクロ
ーンでトランスフェクトされたＣｏｓサル細胞からの上
清； ＣｏｓヒトＩＬ−２−ヒトＩＬ−２のｃＤＮＡクローン
でトランスフェクトされたＣｏｓサル細胞からの上清； 酵母マウスエＬ−２−マウスエＬ−２のｃＤＮＡクロー
ンを発現する酵母細胞からの酵母溶菌液；大腸菌マウス
エＬ−２−マウスＩＬ−２のｃＤＮＡクローン（３個の
余分のアミノ酸をＮ末端に含む）を発現する大腸菌から
の溶菌液； ラットエＬ−２−ＣｏｎＡ−刺激ラット脾臓細胞からの
上清。
実施例４
プロティン−Ａセファロース（ミズリー州セントルイス
、シグマ社） ０．５ ａｔをカラムに装填し、リン酸
緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗った。このカラムにヤギ抗うッ
トＩｇＧ抗血清０．２ｍｌ、 次に３４Ｂ５上清５ｍ／
を通した。ＰＢＳで洗浄後、このカラムに・１９００単
位の工Ｌ−２を含むＬＢ２−１上清を通した。
、シグマ社） ０．５ ａｔをカラムに装填し、リン酸
緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗った。このカラムにヤギ抗うッ
トＩｇＧ抗血清０．２ｍｌ、 次に３４Ｂ５上清５ｍ／
を通した。ＰＢＳで洗浄後、このカラムに・１９００単
位の工Ｌ−２を含むＬＢ２−１上清を通した。
（１単位の工Ｌ−２は、０．１ ｒｕｇ中２０００個の
ＨＴ２細胞を２４時間使用して、最高値の５０％のＯＤ
を生ずる因子の量として定義される。）とのカラムを通
過するＩＬ−２の量はＨＴ２ 細胞に対するバイオアッ
セイによシ測定した。この検定（１０単位の比較的低い
検出限界を有する）においては工Ｌ−２が全く検出され
なかった。従って、■Ｌ−２の生物活性の９９チ以上が
結合８４Ｂ６抗体を含むカラムによって除かれた。
ＨＴ２細胞を２４時間使用して、最高値の５０％のＯＤ
を生ずる因子の量として定義される。）とのカラムを通
過するＩＬ−２の量はＨＴ２ 細胞に対するバイオアッ
セイによシ測定した。この検定（１０単位の比較的低い
検出限界を有する）においては工Ｌ−２が全く検出され
なかった。従って、■Ｌ−２の生物活性の９９チ以上が
結合８４Ｂ６抗体を含むカラムによって除かれた。
実施例５
グレイプ（Ｊ、Ｇｈｒａｙｅｂ） らによって開発さ
れた分泌にフタ−系を用いて、マウスエム２−２遺伝子
を大腸菌中で発現させた（ＥＭＢＯジャーナル３：２４
３７〜２４４２（１９８４）参照〕。オリゴヌクレオチ
ドに対する部位特異的突然変異誘発〔シーラー（Ｚｏｌ
ｌｅｒ、Ｍ、）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ、 Ｍ、 ）
のＭｅｔｈｏｄｓ Ｋｎｚｙｍｏｌｌｏｌ：４６８−４
７２（１９８３）参照〕を使用して、成熟マウスエＬ−
２配列の５′末端に直接ＥｃｏＲ工制限部位（ＧＡＡＴ
ＴＣ）を挿入した。
れた分泌にフタ−系を用いて、マウスエム２−２遺伝子
を大腸菌中で発現させた（ＥＭＢＯジャーナル３：２４
３７〜２４４２（１９８４）参照〕。オリゴヌクレオチ
ドに対する部位特異的突然変異誘発〔シーラー（Ｚｏｌ
ｌｅｒ、Ｍ、）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ、 Ｍ、 ）
のＭｅｔｈｏｄｓ Ｋｎｚｙｍｏｌｌｏｌ：４６８−４
７２（１９８３）参照〕を使用して、成熟マウスエＬ−
２配列の５′末端に直接ＥｃｏＲ工制限部位（ＧＡＡＴ
ＴＣ）を挿入した。
その後、成熟遺伝子をＥｃｏＲニーＢＡｍＨＩ断片上に
単離し、唯一のＥｃｏＲ工およびＢａｍＨ工部位工部−
た大腸菌の分泌ベクターＰ工Ｎ−■−ｏｍＰＡ２ （第
１図に示す）内でクローニングした。形質転換体は３７
℃で５時間増殖させた。その後２００μｌ の細胞を淀
澱させ、５０μρの５ＤＳ−ゲル試料緩衝液に再懸濁ｊ
た。そして１０μ塁の試料を１５％５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミド１ゲルで電気泳動した。電気泳動の彼、ゲルを
電気泳動移行によって一枚のニトロセルロース紙へ移行
させた〔バーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、 Ｗ、） ＋
７）−ウェスターン法−：５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルから未修飾ニトロセルロースへのタン・ξり質の電
気泳動移行および抗体と放射性ヨウ素化プロティンＡで
のラジオグラフィー検出、Ａｎａｌ、 Ｂ ｉｏｃｈｅ
ｍ、 １１２ ：１９５〜２０３（１９８３）参照〕。
単離し、唯一のＥｃｏＲ工およびＢａｍＨ工部位工部−
た大腸菌の分泌ベクターＰ工Ｎ−■−ｏｍＰＡ２ （第
１図に示す）内でクローニングした。形質転換体は３７
℃で５時間増殖させた。その後２００μｌ の細胞を淀
澱させ、５０μρの５ＤＳ−ゲル試料緩衝液に再懸濁ｊ
た。そして１０μ塁の試料を１５％５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミド１ゲルで電気泳動した。電気泳動の彼、ゲルを
電気泳動移行によって一枚のニトロセルロース紙へ移行
させた〔バーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、 Ｗ、） ＋
７）−ウェスターン法−：５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルから未修飾ニトロセルロースへのタン・ξり質の電
気泳動移行および抗体と放射性ヨウ素化プロティンＡで
のラジオグラフィー検出、Ａｎａｌ、 Ｂ ｉｏｃｈｅ
ｍ、 １１２ ：１９５〜２０３（１９８３）参照〕。
このタンバク質と結合させるために本発明抗体を２時間
添加した。その後１２５工、−標識ヤギ抗ラツ）工ｇを
加えて第一の抗体に結合させた。最後にニトロセルロー
ス紙を乾かして一７０℃でコダックＸＲフィルムに感光
させた。
添加した。その後１２５工、−標識ヤギ抗ラツ）工ｇを
加えて第一の抗体に結合させた。最後にニトロセルロー
ス紙を乾かして一７０℃でコダックＸＲフィルムに感光
させた。
その結果を第２図に示す。
発明の効果
バイオアッセイ阻害の結果は、８４Ｂ５によって産生さ
れるモノクローナル抗体が工Ｌ−２の活性を阻害し得る
ことを示している。このことは抗体が工Ｌ−２または標
的細胞ＨＴ２のいずれかに結合するためであろう。上記
の他の実験は３４Ｂ６が実際にマウスエＬ−２を認識す
ることを立証している。
れるモノクローナル抗体が工Ｌ−２の活性を阻害し得る
ことを示している。このことは抗体が工Ｌ−２または標
的細胞ＨＴ２のいずれかに結合するためであろう。上記
の他の実験は３４Ｂ６が実際にマウスエＬ−２を認識す
ることを立証している。
ＨＴ２は抗体の存在下でさえヒトまたはラット工Ｌ−２
によって刺激されるので、抗体がＨＴ２細胞に作用する
ことはあシそうもない。さらに、結合３４Ｂ５抗体を含
むカラムを通すことによるｒＬ′−２の除去は、その抗
体が工Ｌ−２と直接結合することを示している。最後に
、大腸菌において発現された工Ｌ−２のウェスターン法
もモノクローナル抗体がマウスエＬ−２と直接結合する
ことを立証している。
によって刺激されるので、抗体がＨＴ２細胞に作用する
ことはあシそうもない。さらに、結合３４Ｂ５抗体を含
むカラムを通すことによるｒＬ′−２の除去は、その抗
体が工Ｌ−２と直接結合することを示している。最後に
、大腸菌において発現された工Ｌ−２のウェスターン法
もモノクローナル抗体がマウスエＬ−２と直接結合する
ことを立証している。
３４Ｂ５の特異性に関するいくつかの情報はこれらのデ
ータから推察することができる。抗原決定基は大腸菌で
合成された工Ｌ−２に存在するので、その決定基は多分
ポリＲプチド配列であるだろう。
ータから推察することができる。抗原決定基は大腸菌で
合成された工Ｌ−２に存在するので、その決定基は多分
ポリＲプチド配列であるだろう。
なぜなら大腸菌はタンノξり質をグリコシル化しないか
らである。さらに、この抗体はラットまたはヒト由来の
工Ｌ−２を認識せず、この抗原決定基が特異なマウスＩ
Ｌ−２配列によることを示している。
らである。さらに、この抗体はラットまたはヒト由来の
工Ｌ−２を認識せず、この抗原決定基が特異なマウスＩ
Ｌ−２配列によることを示している。
この決定基は例えばヒ） 工Ｌ−２に見られないが、マ
ウスＩＬ−２に見られる１２個のグルタミンの広が９で
あるだろう。
ウスＩＬ−２に見られる１２個のグルタミンの広が９で
あるだろう。
前述のことから、本発明のバイブリド９−マはマウスエ
Ｌ−２に特異的であるが、他の源（例えばヒトやラット
）からの工Ｌ−２に特異的でないモノクローナル抗体を
産生ずることが認められるだろう。
Ｌ−２に特異的であるが、他の源（例えばヒトやラット
）からの工Ｌ−２に特異的でないモノクローナル抗体を
産生ずることが認められるだろう。
さら、に、本発明はマウスエＬ−２の精製に、各種の動
物実験に、そして一般に実験研究能力を高めるために有
用であるモノクローナル抗体を大量生産する方法を提供
する。
物実験に、そして一般に実験研究能力を高めるために有
用であるモノクローナル抗体を大量生産する方法を提供
する。
第１図は成熟マウスエＬ−２活性をコードするｃＤＮＡ
り白−ン（外層膜プロティン−Ａシグナルにプチビに融
合される）を保有するプラスミド、ｐｏｍｐＡ２ ｍ
工Ｌ−’ｌを示す。 第２図は本発明のモノクローナル抗体、ならびに工Ｌ−
２ｃＤＮＡ挿入物を含む（＋）および含まれない′、−
）第１図記載のプラスミドを組み入れた細菌培養からの
上清を利用するウェスターン法を示す。 （外５名） 第１口 茗λ図
り白−ン（外層膜プロティン−Ａシグナルにプチビに融
合される）を保有するプラスミド、ｐｏｍｐＡ２ ｍ
工Ｌ−’ｌを示す。 第２図は本発明のモノクローナル抗体、ならびに工Ｌ−
２ｃＤＮＡ挿入物を含む（＋）および含まれない′、−
）第１図記載のプラスミドを組み入れた細菌培養からの
上清を利用するウェスターン法を示す。 （外５名） 第１口 茗λ図
Claims (16)
- （１）マウスインターロイキン−２に対して特異的であ
るが、他の哺乳動物種由来の天然インターロイキン−２
と実質的に交差反応しないモノクローナル抗体。 - （２）哺乳動物種がヒトまたはラットである特許請求の
範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 - （３）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−８７９４のハイブリドー
マ。 - （４）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−８７９４のハイブリドー
マに由来するラットＩｇＧ＿２＿ａサブクラスのモノク
ローナル抗体。 - （５）ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−８７９４のハイブリドー
マを培養し、モノクローナル抗体を回収することから成
る、マウスインターロイキン−２と反応するがヒトまた
はラット由来の天然インターロイキン−２と有意に反応
しないモノクローナル抗体の産生方法。 - （６）特許請求の範囲第５項記載の方法によつて産生さ
れた、マウスインターロイキン−２に特異的であるが他
の哺乳動物種由来の天然インターロイキン−２と実質的
に交差反応しないモノクローナル抗体。 - （７）マウスインターロイキン−２を産生する細胞系か
らの上清を用いてラットを免疫感作し；該ラットからリ
ンパ球を取り出し； 該リンパ球と骨髄腫型の細胞系とを融合して細胞ハイブ
リッドを作製し； 個々の細胞ハイブリッドを限界希釈法により選択および
クローニングして、マウスインターロイキン−２に特異
的な抗体を産生する細胞ハイブリッドをスクリーニング
および単離し；そしてラットおよびヒト由来の天然イン
ターロイキン−２に対する交差反応性について検定して
下記のハイブリドーマを同定する； 各工程から成る自然グリコシル化または非グリコシル化
マウスインターロイキン−２と結合するが、ヒトまたは
ラット源由来の天然インターロイキン−２と有意に結合
しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの
作製方法。 - （８）骨髄腫型の細胞系が骨髄腫細胞系またはハイブリ
ッド細胞系であり、特にマウスまたはラット由来のもの
である特許請求の範囲第７項記載の方法。 - （９）抗マウスインターロイキン−２抗体産生細胞と融
合パートナー細胞とを融合してハイブリドーマを作製し
；該ハイブリドーマを増殖させ；そして他の哺乳動物種
由来のインターロイキン−２と実質的に交差反応しない
ハイブリドーマから産生される抗体を回収する；ことか
ら成るマウスインターロイキン−２に特異的なモノクロ
ーナル抗体の産生方法。 - （１０）抗体産生細胞がマウスインターロイキン−２ま
たはマウスインターロイキン−２に特徴的なその断片に
よつて免疫感作されたマウス以外の哺乳動物から得られ
る、特許請求の範囲第９項記載の方法。 - （１１）抗体産生細胞が脾臓細胞またはリンパ節細胞に
由来するＢリンパ球である、特許請求の範囲第９項また
は第１０項記載の方法。 - （１２）ハイブリドーマをｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ
ｖｉｔｒｏで増殖させる特許請求の範囲第９〜１１項の
いずれか１項に記載の方法。 - （１３）融合パートナー細胞と抗体産生細胞とが異なる
種から得られる特許請求の範囲第９〜１２項のいずれか
１項に記載の方法。 - （１４）融合パートナー細胞が骨髄腫細胞またはハイブ
リッド細胞である特許請求の範囲第９〜１３項のいずれ
か１項に記載の方法。 - （１５）抗体産生細胞が脾臓細胞であり、融合パートナ
ー細胞がマウスハイブリドーマ細胞である特許請求の範
囲第９〜１４項のいずれか１項に記載の方法。 - （１６）ハイブリドーマを組織培養培地においてｉｎｖ
ｉｔｒｏで、またはマウス腹腔においてｉｎ ｖｉｖｏ
で増殖させる特許請求の範囲第９〜１５項のいずれか１
項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/730,308 US4690893A (en) | 1985-05-03 | 1985-05-03 | Hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies which specifically bind to mouse interleukin-2 |
| US730308 | 2000-12-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6244175A true JPS6244175A (ja) | 1987-02-26 |
Family
ID=24934790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61102959A Pending JPS6244175A (ja) | 1985-05-03 | 1986-05-02 | マウスインタ−ロイキン−２に特異的なモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−マ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4690893A (ja) |
| EP (1) | EP0200554A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6244175A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5939832A (ja) * | 1982-08-28 | 1984-03-05 | Ajinomoto Co Inc | モノクロ−ナル抗体ならびにその製法、使用法 |
| DE69128809T2 (de) * | 1990-04-16 | 1998-05-14 | Fuji Photo Film Co Ltd | Durch Erwärmung entwickelbares farbempfindliches Material |
| US5986054A (en) * | 1995-04-28 | 1999-11-16 | The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership | Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease |
| AU2003274102B2 (en) * | 2002-12-20 | 2007-01-25 | Unilever Ip Holdings B.V. | Preparation of antifreeze protein |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4196265A (en) * | 1977-06-15 | 1980-04-01 | The Wistar Institute | Method of producing antibodies |
| US4444887A (en) * | 1979-12-10 | 1984-04-24 | Sloan-Kettering Institute | Process for making human antibody producing B-lymphocytes |
| US4390623A (en) * | 1980-10-02 | 1983-06-28 | Hooper Trading Company | Serum-free and mitogen-free T-cell growth factor and process for making same |
| US4438032A (en) * | 1981-01-30 | 1984-03-20 | The Regents Of The University Of California | Unique T-lymphocyte line and products derived therefrom |
| US4517293A (en) * | 1981-03-26 | 1985-05-14 | Hooper Trading Co. N.V. | High yield process for in vitro production of serum-free and mitogen-free interleukin-2 using a roller bottle culture system |
| US4448879A (en) * | 1981-03-26 | 1984-05-15 | Hooper Trading Company | High yield process for in vitro production of serum-free and mitogen-free interleukin-2 |
| US4411992A (en) * | 1981-04-14 | 1983-10-25 | Immunex Corporation | Process for preparing murine interleukin 2 |
| US4401756A (en) * | 1981-04-14 | 1983-08-30 | Immunex Corporation | Process for preparing human interleukin 2 |
| US4473642A (en) * | 1981-04-29 | 1984-09-25 | Immunex Corporation | Constitutive production of interleukin 2 by a T cell hybridoma |
| US4473493A (en) * | 1981-04-29 | 1984-09-25 | Immunex Corporation | Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity |
| US4407945A (en) * | 1981-04-29 | 1983-10-04 | Immunex Corporation | Constitutive production of interleukin 2 by a T cell hybridoma |
| US4411993A (en) * | 1981-04-29 | 1983-10-25 | Steven Gillis | Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity |
| US4404280A (en) * | 1981-07-16 | 1983-09-13 | Steven Gillis | Process for preparing murine interleukin 2 in the presence of interleukin 1 from an interleukin 2 nonproducer malignant cell line and cell line therefor |
| US4490289A (en) * | 1982-09-16 | 1984-12-25 | Hoffmann-La Roche Inc. | Homogeneous human interleukin 2 |
| EP0111344A2 (en) * | 1982-12-13 | 1984-06-20 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Anti-interleukin-2 monoclonal antibodies |
-
1985
- 1985-05-03 US US06/730,308 patent/US4690893A/en not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-05-01 EP EP86303327A patent/EP0200554A3/en not_active Withdrawn
- 1986-05-02 JP JP61102959A patent/JPS6244175A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0200554A3 (en) | 1988-08-24 |
| EP0200554A2 (en) | 1986-11-05 |
| US4690893A (en) | 1987-09-01 |
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