JPH06181776A - セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ハイホミクロビウム・メチロボラムＧＭ２が生
産するセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（Ｓ
ＨＭＴ）をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた
組換え体ベクターおよび該ベクターを含有する微生物。 【効果】本発明のＤＮＡでコードされるＳＨＭＴは、医
療、食品等に有用なＬ−セリンを効率的に生産するため
に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、セリンヒドロキシメチ
ルトランスフェラーゼ（以下、ＳＨＭＴと略記する）を
コードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた組換え体ベ
クターおよび該ベクターを含有する微生物に関する。Ｓ
ＨＭＴは、医療、食品などに有用なＬ−セリンを効率的
に生産するために利用することができる。

【０００２】

【従来の技術】ＳＨＭＴはウサギ肝臓のほか、種々の微
生物で見いだされており、それらのＳＨＭＴをコードす
るＤＮＡの塩基配列も報告されている〔Plamann ら, Nu
cleicAcids Research,11 ,2065 (1983)、特開平2-586
1、Chanら, Gene,101, 51(1990)、Rossbachら, Molecul
ar Microbiology,5,39 (1991)、Martinら,Journal of B
ilogical Chemistry,262 , 5499 (1987) 、Steiert ら,
DNA Sequence 1, 107 (1990)〕。Ｌ−セリンの効率的
生産法に利用されているハイホミクロビウム(Hyphomicr
obium)属に属する微生物が生産するＳＨＭＴとしては、
ハイホミクロビウム・メチロボラム(Hyphomicrobium m
ethyloborum)ＧＭ２が生産するＳＨＭＴが知られている
〔Eur.J.Biochem.,162, 533 (1987)〕。しかしながら、
ハイホミクロビウム属に属する微生物が生産するＳＨＭ
ＴをコードするＤＮＡの塩基配列は報告されていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、医
療、食品、などに有用なＬ−セリンの効率的生産に利用
することができるＳＨＭＴをコードするＤＮＡを提供す
ることにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＳＨＭＴをコ
ードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた組換え体ベク
ターおよび該ベクターを含有する微生物に関する。ＳＨ
ＭＴは、スレオニン、グリシンの代謝分解過程におい
て、セリン、ピルビン酸を経てアセチル−ＣｏＡに至る
経路の中間に位置する酵素であり、グリシンからＬ−セ
リンを生産する反応などを触媒する。

【０００５】本発明のＤＮＡでコードされるＳＨＭＴ
は、配列番号２に記載したアミノ酸配列のうち、１〜４
３５番目のアミノ酸配列を含む。以下に、本発明のＤＮ
Ａの製造法を示す。 （ａ）ＳＨＭＴをコードするＤＮＡを有するＤＮＡ断片
および組換えベクターの調製 ＳＨＭＴをコードするＤＮＡを有するＤＮＡ断片は、本
発明のＤＮＡでコードされるＳＨＭＴを生産する微生物
であればいずれの微生物からも調製することができる。
例えば、ハイホミクロビウム属に属する微生物、とくに
ハイホミクロビウム・メチロボラムＧＭ２が好適に用い
られる。ハイホミクロビウム・メチロボラムＧＭ２は平
成４年10月20日付けで工業技術院微生物工業技術研究所
にFERM BP-4039として寄託されている。

【０００６】該微生物を培養し、遠心分離などにより菌
体を集め、この菌体より染色体ＤＮＡを調製する。この
染色体ＤＮＡにBamHI 、HindIII などの制限酵素を用い
て、部分分解、あるいは完全分解し、さらにエタノール
沈澱などの濃縮手段でＳＨＭＴをコードするＤＮＡを含
むＤＮＡ断片の混合物を得る。一方、本発明に用いるベ
クターＤＮＡとしては、本発明のＤＮＡを組み込むこと
ができ、宿主細胞で発現できるものであれば、プラスミ
ドベクター、ファージベクターいずれでもよく、例えば
ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１９（宝酒造社製）、pBlueskrip
tSK(+)（Stratagene社製）、ｐＫＫ３２２−３（Pharma
cia 社製）、λZAP （Stratagene社製）などがあげられ
る。

【０００７】次に、上記ベクターＤＮＡにＳＨＭＴをコ
ードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片の混合物を連結する。
連結は、例えば大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造社製）を用いる。この組換えプラスミドを
E.coliJM109 、ME5427、DH5α、XL1-blue、HB101 株な
どに形質転換あるいは形質導入して組換えプラスミドの
含有株を得、これをＳＨＭＴをコードするＤＮＡのジー
ンバンクとする。形質転換および形質導入は、例えばモ
レキュラー・クローニング（Molecular cloning 第２
版；Maniatisら,Cold Spring Harbor Laboratory,1982)
記載の方法で行うことができる。

【０００８】（ｂ）ＳＨＭＴをコードするＤＮＡを含む
組換えベクター含有株の選択 上記ジーンバンクより、ＳＨＭＴをコードするＤＮＡを
含む組換えベクターを含有する菌株を検索する方法は、
公知のハイブリダイゼーションによる方法（分子遺伝学
実験法，85頁, 1983年, 共立出版）や、ＳＨＭＴ遺伝子
の変異によりＳＨＭＴ活性を欠損しており、グリシン
（以下、Ｇｌｙと略記する）の要求性を示す変異株に対
し、ＳＨＭＴをコードするＤＮＡを含む組換えベクター
を導入することによりＳＨＭＴ活性が発現し、Ｇｌｙの
要求性が消失することを指標にする相補試験などの方法
で行うことができる。ハイブリダイゼーション法で用い
るプローブＤＮＡ断片は、公知のＳＨＭＴをコードする
ＤＮＡの塩基配列を比較し、いずれの菌株にも高い頻度
で共通に見いだされる保存された塩基配列を選択し、そ
の配列を有するＤＮＡ断片をもとに、微生物由来のＳＨ
ＭＴをコードするＤＮＡを用いてＰＣＲ法（Polymerase
chain reaction 法）より増幅し、分離する。

【０００９】本発明のＳＨＭＴをコードするＤＮＡを含
有するプラスミドとしては、ｐＡＢ２などがあげられ
る。ｐＡＢ２を含む大腸菌であるEscherichia coli ME5
427/pAB2は平成４年10月20日付けで工業技術院微生物工
業技術研究所にFERM BP-4040として寄託されている。

【００１０】（ｃ）ＳＨＭＴをコードするＤＮＡの塩基
配列の決定 上記組換えプラスミドよりＳＨＭＴをコードするＤＮＡ
の塩基配列を決定するには、公知の方法、例えばSanger
らによるdideoxy 法[Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A. ,74 ,
5463 (1977）] で行うことができる。

【００１１】このようにして得られた本発明のＳＨＭＴ
をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に記
載した塩基配列のうち、１５４〜１４５８番目の塩基配
列を含むＤＮＡがあげられる。

【００１２】（ｄ）ＳＨＭＴの精製 本発明のＤＮＡでコードされるＳＨＭＴの精製は、公知
のＳＨＭＴの精製法〔Miyazakiら、Eur.J.Biochem., 16
2 ,533 (1987) 〕を用いることができる。例えば、無細
胞抽出液より硫酸プロタミンによる除核酸、硫安分画、
ＤＥＡＥ−セファロース、フェニルセファロースカラム
などのクロマトグラフィー、Matrex-gel-red A (Amicon
社製) などのアフィニティークロマトグラフィー、ゲル
濾過などを用いて精製することができる。

【００１３】（ｅ）ＳＨＭＴ活性の測定 ＳＨＭＴの酵素活性は、グリシンを基質として生成する
Ｌ−セリンを測定する方法や反応液中に残存するホルム
アルデヒドを測定する方法〔Miyazakiら、Eur.J.Bioche
m.,162, 533 (1987)〕で測定することができる。

【００１４】なお、プラスミドの調製、抽出、精製、切
断、連結などの一般的な遺伝子工学的手法は、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular cloning 第２版，Mani
atisら，Cold Spring Harbor Laboratory ，1989年刊）
に記載の方法を用いた。以下に本発明の実施例を示す。

【００１５】

【実施例】

実施例１ （１）ハイホミクロビウム・メチロボラムの染色体ＤＮ
Ａの調製 ハイホミクロビウム・メチロボラムＧＭ２(FERM BP-403
9)をＭII培地（リン酸水素アンモニウム 3g,リン酸二カ
リウム 2g,塩化ナトリウム 1g,硫酸マグネシウム７水塩
0.2g,硫酸第一鉄７水塩 10mg;硫酸マンガン５水塩 5 m
g,チアミン塩酸塩 10 μg,リボフラビン 20 μg,パント
テン酸カルシウム 20 μg,ピリドキシン塩酸 20 μg,ビ
オチン 1μg,パラアミノ安息香酸 10 μg,ニコチン酸 1
0 μg を１リットルの水に溶解し、１２１℃、２０分間
の加熱滅菌後、室温まで冷却し、メタノールを１％容添
加した培地）５ｍｌを入れた試験管（直径１６ｍｍ，長
さ１６５ｍｍ）に、ＭII寒天培地〔２％のアガー(DIFCO
社製) を加えたＭＩＩ培地〕で２８℃、２日間培養した
菌体を約１白金耳接種し、さらに２日間、２８℃で振盪
培養した。つづいて、ＭII培地を５００ｍｌ入れた２リ
ットル容の三角フラスコに、上記培養液５ｍｌを接種
し、再び２日間、２８℃で振盪培養した。

【００１６】この培養液を冷却下、遠心分離して菌体を
集め、０. １５Ｍ塩化ナトリウム水溶液に懸濁し、遠心
分離することにより菌体を洗浄した。この菌体を、２ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む２０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７. ５）６０ｍｌに懸濁した。この
懸濁液にリゾチーム溶液〔リゾチームを２０ｍｇ／ｍｌ
の割合で、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ
７. ５）に溶解したもの〕７. ５ｍｌを加え、３０℃で
１時間静置した。これに、２０％ラウリル硫酸ナトリウ
ム溶液７. ５ｍｌを加え、ゆっくりと攪拌した。次にこ
の溶液に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７. ５）を飽和させたフェノール７５ｍｌを加
え、十分に攪拌した。この溶液を遠心分離し、水層７０
ｍｌを分取した。このフェノール抽出操作を３回繰り返
し、得られた水層７５ｍｌに２. ５Ｍ酢酸ナトリウム溶
液７. ５ｍｌを加えた後、さらにエタノール１５０ｍｌ
をゆっくり攪拌しながら加え、析出した染色体ＤＮＡを
ガラス棒で巻取った。この染色体ＤＮＡを乾燥後、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.
５）１０ｍｌに溶解し、これにリボヌクレアーゼＡ（シ
グマ社製）を５０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７
℃、３０分間静置した。前記と同様のフェノール抽出を
行った後、２. ５Ｍ酢酸カリウム１ｍｌおよびエタノー
ル２０ｍｌを加えた後、２０℃で１６時間静置した。さ
らに、遠心分離によって得られたペレットを７０％エタ
ノールで洗浄し、乾燥させて染色体ＤＮＡを得た。これ
を１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７. ５）に溶解し、染色体ＤＮＡ溶液とした。保存は−
２０℃で行った。

【００１７】（２）ハイブリダイゼーション用のプロー
ブの作成 （２−１）プローブ用ＤＮＡ断片の増幅 公知のエシェリキア・コリ(Escherichia coli)[Plamann
ら、Nuc.Acid.Res.,11,2065 (1983)], サルモネラ・テ
ィフィムリウム(Salmonella typhimurium)[Steiertら,
DNA Sequence 1, 107 (1990)],バチルス・ステアロサー
モフィラス(Bacillus stearothermophilus)[Miyamoto
ら、特開平2-5861],ブラディリゾビウム・ジャポニカム
(Bradyrhizobium japonicum)[Rossbach ら、Molecular
Microbiology,5,39(1991)]に属する微生物のＳＨＭＴを
コードするＤＮＡの塩基配列を比較し、いずれの微生物
由来のＳＨＭＴをコードするＤＮＡでも高頻度に共通に
見いだされる配列を検索した。その中から約５００塩基
対ほど離れている組合せを選択し、その塩基配列に相補
するＤＮＡ断片をＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に使うプラ
イマーとして用いた。即ち、プライマーとして、配列番
号３および４に記載した塩基配列を有する２種類の一本
鎖ＤＮＡ断片を合成した。合成は、リン酸アミダイド法
による固相法〔Beaucageら、Tetrahedron Letter、22,1
859 (1981)〕に従い、ＤＮＡ自動合成機３８０Ａ（アプ
ライドバイオシステム社製）を用いた。

【００１８】この配列番号３および４記載の塩基配列を
有するＤＮＡをそれぞれ５’側、３’側プライマーとし
て、ＰＣＲ法により、（１）で調製したハイホミクロビ
ウム・メチロボラムの染色体ＤＮＡより、ＳＨＭＴをコ
ードするＤＮＡの部分断片を以下のようにして増幅、分
離した。ジーンＡｍｐＤＮＡアンプリフィケーションリ
エージェントキット（宝酒造社製）を使い、（１）で調
製したハイホミクロビウム・メチロボラムの染色体ＤＮ
Ａの１ｎｇ／１００μｌを鋳型として、上記の配列番号
３および４記載の塩基配列を有する合成ＤＮＡの各１.
０μＭをプライマーとして、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰを各２００μＭ、ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼを２. ５Ｕ／１００μｌとし、９４℃で１. ５分
間、４０℃で２分間、７２℃で２分間の反応をプログラ
ムテンプコントロールシステムＰＣ７００（ＡＳＴＥＣ
社製）用いて、３０回繰り返し、約５００塩基対のＤＮ
Ａ断片を取得した。

【００１９】（２−２）プローブＤＮＡ断片のクローニ
ング 上記のようにして得られた、ＰＣＲ反応物であるＤＮＡ
断片１μｇを含む溶液２０μｌに EcoRI、およびPstIを
加えて消化切断を行った。別にベクタープラスミドｐＵ
Ｃ１９（宝酒造社製）１μｇを含む溶液２０μｌも同様
に消化切断を行った。切断された上記ＤＮＡ断片および
プラスミドＤＮＡを、フェノール抽出およびエタノール
沈澱によって精製した。この精製したＤＮＡ断片１００
ｎｇおよび精製したプラスミドＤＮＡ２０ｎｇを、６６
ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７. ６）、６６ｍＭ塩化マグネ
シウム、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）および
０. １ｍＭ ＡＴＰを含む溶液に懸濁した。これにＴ４
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を１０単位添加後、１４
℃で１６時間反応させ、双方のＤＮＡを連結すること
で、組換えプラスミドを作成した。次に、E.coliDH5 α
株（宝酒造社製）をＬＢ液体培地（Bact-peptone 1％,
Bact-yeast extract 0.5％，塩化ナトリウム 1％，ｐＨ
7.0 ）５０ｍｌを入れた２００ｍｌ容三角フラスコに植
菌し、３７℃で４時間振盪培養した。次に、遠心分離で
菌体を集め、氷上で冷却した５０ｍＭ塩化カルシウム溶
液２０ｍｌに懸濁した。さらに氷上で２０分間静置した
後、冷却下、遠心分離して集菌し、冷却した５０ｍＭの
塩化カルシウム溶液４０ｍｌに懸濁し、プラスミドによ
る形質転換に用いるコンピテントセル懸濁液を調製し
た。

【００２０】このコンピテントセル懸濁液１００μｌに
上記の組換えプラスミド溶液１０μｌを加えた後、０℃
で１０分間静置した。次いで、４２℃で９０秒間熱処理
した後、この細胞懸濁液を、１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリンと２０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロイン
ドリル−β−ガラクトサイド（Ｘ−ｇａｌ）を含むＬＢ
寒天培地に塗布した。この平板培地を３７℃で２４時間
培養した。

【００２１】出現したコロニーの中、白色のコロニーを
それぞれアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ液体培
地で一晩培養後、集菌し、常法によりプラスミドＤＮＡ
を抽出した。このプラスミドが、ＰＣＲ法で調製したＤ
ＮＡ断片のEcoRI およびPstI消化物と同じ分子量の断片
を含有していることをアガロースゲル電気泳動で確認
し、プローブ用ＤＮＡ断片とした。

【００２２】（３）ＳＨＭＴをコードするＤＮＡのクロ
ーニング （３−１）ジーンバンクの作成 （１）で調製したハイホミクロビウム・メチロボラムの
染色体ＤＮＡの１０μｇをHindIII で消化後、アガロー
スゲル電気泳動で２ｋｂ以下の長さの断片を除いた。次
にベクタープラスミドとして pBluescript SK(+)（Stra
tagene社製）を用いHindIII 消化し、フェノール処理お
よびエタノール沈澱で精製した。

【００２３】HindIII で消化した染色体ＤＮＡ約１００
ｎｇおよび、ベクタープラスミド２０ｎｇを用い、（２
−２）と同様に連結し、組換えプラスミドを作成した。

【００２４】（３−２）コロニーハイブリダイゼーショ
ン （２−２）で調製したプローブ用ＤＮＡ断片１μｇをノ
ンラジオシステムＤＮＡ標識および検出キット（ＤＩＧ
−ＥＬＩＳＡ法、カタログＮｏ. １０９３６５７、ベー
リンガーマンハイム社製）に従って標識し、これをＳＨ
ＭＴをコードするＤＮＡ検出用プローブとした。

【００２５】次に、（３−１）で調製したジーンバンク
用組換えプラスミドを、（２−２）と同様にしてE.coli
DH5αに形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含むＬＢ寒天培地上に塗布した。コロニーが形成され
た後、平板寒天上にナイトラン膜などのメンブレンフィ
ルターＮＹ１３Ｎ（Schleicher＆Scheull 社製）をの
せ、平板寒天上のコロニーと接触させた後、すぐに剥離
した。これを裏返して１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含む別の新しいＬＢ寒天培地にのせ、３７℃で約１２
時間培養した。上面にコロニーが形成したこのメンブラ
ンフィルターを寒天培地より剥し、０. ５規定水酸化ナ
トリウムを含む濾紙上に１０分間、０. ５Ｍトリス緩衝
液（ｐＨ７. ３）を含む濾紙上に５分間、０. ５Ｍ塩化
ナトリウムを含有する０. ５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７.
３）を含む濾紙上に５分間、２×ＳＳＣ（０. ３Ｍ塩化
ナトリウム、０. ０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.
０）を含む濾紙上に５分間、順次静置した後、８０℃で
約３時間加熱した。このメンブレンフィルターをノンラ
ジオシステムＤＮＡ標識および検出キット（ベーリンガ
ーマンハイム社製）の手法に従い、上記で調製したＳＨ
ＭＴをコードするＤＮＡ検出用プローブを使い、プロー
ブとハイブリダイズしたクローンとして、目的ＤＮＡを
もつコロニーを選択した。約１８０００コロニーから５
株の陽性クローンを得た。

【００２６】（４）ＳＨＭＴをコードするＤＮＡの塩基
配列の決定 （３−２）で得られた陽性クローンの中より１株を選ん
で、常法によりプラスミドを調製した。このプラスミド
をｐＳＡ１と名付け、その構造を制限酵素消化により確
認した。ｐＳＡ１のＳＨＭＴをコードするＤＮＡを含む
ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１に示した。

【００２７】次に、ｐＳＡ１のHindIII 断片（約11kb)
中、ＳＨＭＴをコードすると思われる部分を、（３−
２）で使用したプローブ断片を用いたハイブリダイゼー
ションで特定し、ＳＨＭＴをコードするＤＮＡの塩基配
列の決定を行った。すなわち、Taq dye primer cycle s
equencing kit （Applied biosystem 社製）あるいは、
Sequenase （United States Biochemical 社製）のキッ
トを使い、pBlueskriptの二本鎖ＤＮＡを鋳型としたdid
eoxy chain termination 法で自動ＤＮＡシークエンサ
ーmodel 373A（Applied Biosystem 社製）でＤＮＡ塩基
配列を決定した。そのＤＮＡ配列を配列番号１に示し
た。このＤＮＡ塩基配列がコードするアミノ酸配列を配
列番号２に示した。その分子量は45993 と計算され、公
知のハイホミクロビウム・メチロボラムＧＭ２が生産す
るＳＨＭＴの推定分子量48000 〔 Eur.J.Biochem. ,16
2, 533 (1987)〕とほぼ一致した。

【００２８】（５）ＳＨＭＴをコードするＤＮＡ断片に
よる変異の相補試験 ＳＨＭＴ遺伝子の変異によりＳＨＭＴ活性が欠損してお
り、Ｇｌｙの要求性を示す変異株E.coli ME5427 に、ク
ローニングしたＳＨＭＴをコードするＤＮＡを含むプラ
スミドを導入し、変異したＳＨＭＴ遺伝子が相補される
か検討した。

【００２９】最初に、１１ｋｂのHindIII 断片として得
られたＳＨＭＴをコードするＤＮＡのサブクローニング
として、ＳＨＭＴのコード領域のみの増幅をＰＣＲ法で
行った。まず、コード領域のＤＮＡ配列全てをカバーで
きるようにプライマーを設計し、配列番号５および６記
載の塩基配列を有する２種類のＤＮＡ断片を（２−１）
と同様の方法で合成した。

【００３０】クローニングしたＳＨＭＴプラスミド（ｐ
ＳＡ１）１０ｎｇを鋳型とし、配列番号５および６記載
の塩基配列を有する合成プライマー各１００ｐｍｏｌｅ
を用い、（２−１）と同様のＰＣＲ法でＳＨＭＴをコー
ドしている領域を増幅し、さらにアガロースゲル電気泳
動でＤＮＡ断片を精製した。別に、Ｔａｑプロモーター
を持つベクタープラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマ
シア社製）をEcoRI で切断し、ＤＮＡBlunting Kit（宝
酒造社製）で切断末端を平滑化したベクタープラスミド
を調製した。これに、前記の精製したＰＣＲ産物をＴ４
リガーゼ反応で連結し、組換えプラスミドを作成し、こ
のプラスミドをｐＡＢ２と名付けた。

【００３１】変異株E.coli ME5427 を（２−２）と同様
の方法で培養し、形質転換用にコンピテントセルを作成
した。このE.coli ME5427 に上記の組換えプラスミドを
（２−２）と同様に形質転換したところ、得られた形質
転換クローンはＧｌｙの要求性が消失しており、ｐＡＢ
２上のＳＨＭＴをコードするＤＮＡが、E.coli中の変異
を相補していることが確かめられた。

【００３２】（６）ＳＨＭＴ活性の測定 （５）で得られたプラスミドｐＡＢ２を含有する形質転
換クローンE.coli ME5427/pAB2とベクタープラスミドの
みで形質転換したE.coli ME5427 /pKK223-3 をアンピシ
リン１００ｍｇ／ｌを含むＬＢ液体培地５００ｍｌで一
晩培養し、遠心分離して集菌後、０. １５Ｍ塩化ナトリ
ウム水溶液を用いて洗浄した。この菌体を５０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７. ５）２０ｍｌに懸濁し、懸
濁液を超音波破砕機（Kaijo Denki 社製）で１０℃以
下、１９ｋＨｚで１５分間処理し、遠心分離で菌体残査
を除去し、無細胞抽出液を調製した。

【００３３】この無細胞抽出液のＳＨＭＴ活性をMiyaza
kiらの方法〔Eur.J.Biochem.,162,533 (1987) 〕に従
い、以下のようにして測定した。０. ５Ｍリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７. ５）、０. ４ｍＭ ｄｌ−テトラヒ
ドロ葉酸、０. ３ｍＭピリドキサールリン酸、２５ｍＭ
ホルムアルデヒド、１.０Ｍ Ｇｌｙおよび無細胞抽出
で全量を１. ０ｍｌとした反応液を、３７℃で１５分間
反応させ、１５％のトリクロロ酢酸０. ３ｍｌを加え反
応を停止した。対照としては、反応液からＧｌｙを除い
た反応液を用いた。

【００３４】反応終了後、遠心分離し、上清中のＬ−セ
リン量を高速液体クロマトグラフィーを用いたアミノ酸
分析機（日本分光社製、アミノ酸分析システム）で測定
し、反応生成物を定量した。Ｌ−セリンを１時間に１μ
ｍｏｌｅ生成する活性を１ｕｎｉｔ（Ｕ）とした。その
結果を第１表に示す。

【００３５】

【表１】

【００３６】第１表に示したように、ｐＡＢ２を含有す
るE.coli ME5427 株はＳＨＭＴを生産したが、ベクター
のみを含有するE.coli ME5427 株はＳＨＭＴを全く生産
しなかった。

【００３７】

【発明の効果】本発明は、Ｌーセリンの効率的生産に用
いられるハイホミクロビウム・メチロボラムが生産する
ＳＨＭＴをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた
ベクターおよび該ベクターを含有する微生物を提供す
る。

【００３８】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1489 配列の型：核酸 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 起源 生物名：ハイホミクロビウム メチロボラム(Hyphomicr
obium methyloborum) 株名：ＧＭ２ 配列： CGCAACGGCC GTTCCCGCGC CCTTGTTACA CGGGGCTCGG GGTCGGTTGA GTGCTGGTGT 60 CCAGCCTCGT ACTATGGTTC AAAGCTCGTT GGCCGGACTT GACTCCGTGT CCTGAGCGCG 120 CAGTTAAATC ACTTTCATTT TGAAGGAAAA CAC ATG TCG TCC GCA CCG GCT GCA 174 Met Ser Ser Ala Pro Ala Ala 1 5 GGT ACT GCT TCT ACG TCC CGT TTT TTC AAG TCG CAC GTG TCG GAG ACG 222 Gly Thr Ala Ser Thr Ser Arg Phe Phe Lys Ser His Val Ser Glu Thr 10 15 20 GAT CCC GAT ATT TTC AGC GCC ATC CAA AAG GAA TTT GGC CGC CAG CAG 270 Asp Pro Asp Ile Phe Ser Ala Ile Gln Lys Glu Phe Gly Arg Gln Gln 25 30 35 CAC GAG ATC GAG CTG ATC GCG TCT GAG AAC ATC GTT TCG CAG GCC GTT 318 His Glu Ile Glu Leu Ile Ala Ser Glu Asn Ile Val Ser Gln Ala Val 40 45 50 55 CTC GAT GCA GCT GGT TCG GTG CTG ACC AAC AAG TAT GCC GAG GGC TAT 366 Leu Asp Ala Ala Gly Ser Val Leu Thr Asn Lys Tyr Ala Glu Gly Tyr 60 65 70 CCG GGC AAG CGC TAC TAC GGC GGC TGC CAG TAC GTC GAC ATC GTT GAA 414 Pro Gly Lys Arg Tyr Tyr Gly Gly Cys Gln Tyr Val Asp Ile Val Glu 75 80 85 GAC ATC GCG ATC GAC CGC GCA AAG AAG CTC TTC AAC TGC GAA TTC GCG 462 Asp Ile Ala Ile Asp Arg Ala Lys Lys Leu Phe Asn Cys Glu Phe Ala 90 95 100 AAC GTG CAG CCG AAC TCC GGC AGC CAG GCG AAC CAG GGC GTG TTC AAT 510 Asn Val Gln Pro Asn Ser Gly Ser Gln Ala Asn Gln Gly Val Phe Asn 105 110 115 GCG CTC GCG CAG CCG GGC GAC ACC ATC CTC GGT CTC TCG CTC GCT GCC 558 Ala Leu Ala Gln Pro Gly Asp Thr Ile Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala 120 125 130 135 GGT GGT CAC TTG ACC CAC GGC GCG CCG GTG AAC CAG TCC GGC AAG TGG 606 Gly Gly His Leu Thr His Gly Ala Pro Val Asn Gln Ser Gly Lys Trp 140 145 150 TTC AAG GCC GTG CAC TAC ATG GTC AAG CCC GAC TCG CAC CTC ATC GAC 654 Phe Lys Ala Val His Tyr Met Val Lys Pro Asp Ser His Leu Ile Asp 155 160 165 ATG GAC GAA GTG CGC AAG CTG GCC CAG GAG CAC AAG CCG CGC ATC ATC 702 Met Asp Glu Val Arg Lys Leu Ala Gln Glu His Lys Pro Arg Ile Ile 170 175 180 ATC GCT GGT GGT TCG GCC TAT CCG CGC AAG ATC GAT TTC GCT GCA TTT 750 Ile Ala Gly Gly Ser Ala Tyr Pro Arg Lys Ile Asp Phe Ala Ala Phe 185 190 195 CGC GCG ATT GCG GAT GAG GTT GGC GCG ATC TTC CTC GTC GAT ATG GCG 798 Arg Ala Ile Ala Asp Glu Val Gly Ala Ile Phe Leu Val Asp Met Ala 200 205 210 215 CAC TTC GCC GGT CTT GTT GCG GCC GGT CTC ATT CCG AGC CCG TTC CCG 846 His Phe Ala Gly Leu Val Ala Ala Gly Leu Ile Pro Ser Pro Phe Pro 220 225 230 CAT GCC CAC GTC GTA ACG ACG ACG ACG CAC AAG ACG CTG CGC GGA CCC 894 His Ala His Val Val Thr Thr Thr Thr His Lys Thr Leu Arg Gly Pro 235 240 245 CGT GGC GGC ATG ATT TTA ACG AAC GAC GCG GAC ATC GCG AAG AAG ATC 942 Arg Gly Gly Met Ile Leu Thr Asn Asp Ala Asp Ile Ala Lys Lys Ile 250 255 260 AAC TCG GCG ATC TTC CCT GGC ATT CAG GGC GGC CCG CTC ATG CAC GTT 990 Asn Ser Ala Ile Phe Pro Gly Ile Gln Gly Gly Pro Leu Met His Val 265 270 275 ATC GCC GGT AAG GCC GTC GCA TTC GGC GAG GCT CTG CGT CCG GAC TTC 1038 Ile Ala Gly Lys Ala Val Ala Phe Gly Glu Ala Leu Arg Pro Asp Phe 280 285 290 295 AAG GTC TAC ATC AAG CAG GTG ATG GAC AAC GCC CGC GCG CTC GGT GAA 1086 Lys Val Tyr Ile Lys Gln Val Met Asp Asn Ala Arg Ala Leu Gly Glu 300 305 310 GTG CTT GTG CAG AAC GGC TTC GCG CTC GTT TCT GGC GGC ACC GAC ACG 1134 Val Leu Val Gln Asn Gly Phe Ala Leu Val Ser Gly Gly Thr Asp Thr 315 320 325 CAC CTC GTT CTC GTC GAT CTG CGG CCG AAG AAG CTG ACC GGT ACG AAG 1182 His Leu Val Leu Val Asp Leu Arg Pro Lys Lys Leu Thr Gly Thr Lys 330 335 340 GCT GAG AAG GCG CTT GGC CGT GCC AAC ATC ACC TGC AAC AAG AAC GGC 1230 Ala Glu Lys Ala Leu Gly Arg Ala Asn Ile Thr Cys Asn Lys Asn Gly 345 350 355 ATT CCG TTC GAC CCC GAG AAG CCG ATG GTG ACG TCG GGC ATT CGT TTG 1278 Ile Pro Phe Asp Pro Glu Lys Pro Met Val Thr Ser Gly Ile Arg Leu 360 365 370 375 GGT TCG CCT GCA GGC ACG ACG CGC GGC TTC GGC GTT GCC GAA TTC CAG 1326 Gly Ser Pro Ala Gly Thr Thr Arg Gly Phe Gly Val Ala Glu Phe Gln 380 385 390 GAA ATC GGC CGC CTG ATC TCG GAA GTT CTG GAT GGC GTT GCG AAG AAC 1374 Glu Ile Gly Arg Leu Ile Ser Glu Val Leu Asp Gly Val Ala Lys Asn 395 400 405 GGC GAA GAT GGC AAC GGC GCC GTC GAA GCG GCC GTC AAG GCA AAG GCT 1422 Gly Glu Asp Gly Asn Gly Ala Val Glu Ala Ala Val Lys Ala Lys Ala 410 415 420 ATC GCT CTT TGC GAT CGC TTC CCG ATT TAC GCA TAACGCTGTT 1465 Ile Ala Leu Cys Asp Arg Phe Pro Ile Tyr Ala 425 430 434 TACGCACATT TGAAGATATG CTTG 1489

【００３９】配列番号：2 配列の長さ：434 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ハイホミクロビウム メチロボラム(Hyphomicr
obium methyloborum) 株名：ＧＭ２ 配列： ATG TCG TCC GCA CCG GCT GCA GGT ACT GCT TCT ACG TCC CGT TTT TTC 48 Met Ser Ser Ala Pro Ala Ala Gly Thr Ala Ser Thr Ser Arg Phe Phe 1 5 10 15 AAG TCG CAC GTG TCG GAG ACG GAT CCC GAT ATT TTC AGC GCC ATC CAA 96 Lys Ser His Val Ser Glu Thr Asp Pro Asp Ile Phe Ser Ala Ile Gln 20 25 30 AAG GAA TTT GGC CGC CAG CAG CAC GAG ATC GAG CTG ATC GCG TCT GAG 144 Lys Glu Phe Gly Arg Gln Gln His Glu Ile Glu Leu Ile Ala Ser Glu 35 40 45 AAC ATC GTT TCG CAG GCC GTT CTC GAT GCA GCT GGT TCG GTG CTG ACC 192 Asn Ile Val Ser Gln Ala Val Leu Asp Ala Ala Gly Ser Val Leu Thr 50 55 60 AAC AAG TAT GCC GAG GGC TAT CCG GGC AAG CGC TAC TAC GGC GGC TGC 240 Asn Lys Tyr Ala Glu Gly Tyr Pro Gly Lys Arg Tyr Tyr Gly Gly Cys 65 70 75 80 CAG TAC GTC GAC ATC GTT GAA GAC ATC GCG ATC GAC CGC GCA AAG AAG 288 Gln Tyr Val Asp Ile Val Glu Asp Ile Ala Ile Asp Arg Ala Lys Lys 85 90 95 CTC TTC AAC TGC GAA TTC GCG AAC GTG CAG CCG AAC TCC GGC AGC CAG 336 Leu Phe Asn Cys Glu Phe Ala Asn Val Gln Pro Asn Ser Gly Ser Gln 100 105 110 GCG AAC CAG GGC GTG TTC AAT GCG CTC GCG CAG CCG GGC GAC ACC ATC 384 Ala Asn Gln Gly Val Phe Asn Ala Leu Ala Gln Pro Gly Asp Thr Ile 115 120 125 CTC GGT CTC TCG CTC GCT GCC GGT GGT CAC TTG ACC CAC GGC GCG CCG 432 Leu Gly Leu Ser Leu Ala Ala Gly Gly His Leu Thr His Gly Ala Pro 130 135 140 GTG AAC CAG TCC GGC AAG TGG TTC AAG GCC GTG CAC TAC ATG GTC AAG 480 Val Asn Gln Ser Gly Lys Trp Phe Lys Ala Val His Tyr Met Val Lys 145 150 155 160 CCC GAC TCG CAC CTC ATC GAC ATG GAC GAA GTG CGC AAG CTG GCC CAG 528 Pro Asp Ser His Leu Ile Asp Met Asp Glu Val Arg Lys Leu Ala Gln 165 170 175 GAG CAC AAG CCG CGC ATC ATC ATC GCT GGT GGT TCG GCC TAT CCG CGC 576 Glu His Lys Pro Arg Ile Ile Ile Ala Gly Gly Ser Ala Tyr Pro Arg 180 185 190 AAG ATC GAT TTC GCT GCA TTT CGC GCG ATT GCG GAT GAG GTT GGC GCG 624 Lys Ile Asp Phe Ala Ala Phe Arg Ala Ile Ala Asp Glu Val Gly Ala 195 200 205 ATC TTC CTC GTC GAT ATG GCG CAC TTC GCC GGT CTT GTT GCG GCC GGT 672 Ile Phe Leu Val Asp Met Ala His Phe Ala Gly Leu Val Ala Ala Gly 210 215 220 CTC ATT CCG AGC CCG TTC CCG CAT GCC CAC GTC GTA ACG ACG ACG ACG 720 Leu Ile Pro Ser Pro Phe Pro His Ala His Val Val Thr Thr Thr Thr 225 230 235 240 CAC AAG ACG CTG CGC GGA CCC CGT GGC GGC ATG ATT TTA ACG AAC GAC 768 His Lys Thr Leu Arg Gly Pro Arg Gly Gly Met Ile Leu Thr Asn Asp 245 250 255 GCG GAC ATC GCG AAG AAG ATC AAC TCG GCG ATC TTC CCT GGC ATT CAG 816 Ala Asp Ile Ala Lys Lys Ile Asn Ser Ala Ile Phe Pro Gly Ile Gln 260 265 270 GGC GGC CCG CTC ATG CAC GTT ATC GCC GGT AAG GCC GTC GCA TTC GGC 864 Gly Gly Pro Leu Met His Val Ile Ala Gly Lys Ala Val Ala Phe Gly 275 280 285 GAG GCT CTG CGT CCG GAC TTC AAG GTC TAC ATC AAG CAG GTG ATG GAC 912 Glu Ala Leu Arg Pro Asp Phe Lys Val Tyr Ile Lys Gln Val Met Asp 290 295 300 AAC GCC CGC GCG CTC GGT GAA GTG CTT GTG CAG AAC GGC TTC GCG CTC 960 Asn Ala Arg Ala Leu Gly Glu Val Leu Val Gln Asn Gly Phe Ala Leu 305 310 315 320 GTT TCT GGC GGC ACC GAC ACG CAC CTC GTT CTC GTC GAT CTG CGG CCG 1008 Val Ser Gly Gly Thr Asp Thr His Leu Val Leu Val Asp Leu Arg Pro 325 330 335 AAG AAG CTG ACC GGT ACG AAG GCT GAG AAG GCG CTT GGC CGT GCC AAC 1056 Lys Lys Leu Thr Gly Thr Lys Ala Glu Lys Ala Leu Gly Arg Ala Asn 340 345 350 ATC ACC TGC AAC AAG AAC GGC ATT CCG TTC GAC CCC GAG AAG CCG ATG 1104 Ile Thr Cys Asn Lys Asn Gly Ile Pro Phe Asp Pro Glu Lys Pro Met 355 360 365 GTG ACG TCG GGC ATT CGT TTG GGT TCG CCT GCA GGC ACG ACG CGC GGC 1152 Val Thr Ser Gly Ile Arg Leu Gly Ser Pro Ala Gly Thr Thr Arg Gly 370 375 380 TTC GGC GTT GCC GAA TTC CAG GAA ATC GGC CGC CTG ATC TCG GAA GTT 1200 Phe Gly Val Ala Glu Phe Gln Glu Ile Gly Arg Leu Ile Ser Glu Val 385 390 395 400 CTG GAT GGC GTT GCG AAG AAC GGC GAA GAT GGC AAC GGC GCC GTC GAA 1248 Leu Asp Gly Val Ala Lys Asn Gly Glu Asp Gly Asn Gly Ala Val Glu 405 410 415 GCG GCC GTC AAG GCA AAG GCT ATC GCT CTT TGC GAT CGC TTC CCG ATT 1296 Ala Ala Val Lys Ala Lys Ala Ile Ala Leu Cys Asp Arg Phe Pro Ile 420 425 430 TAC GCA 1302 Tyr Ala 434

【００４０】配列番号：3 配列の長さ：24 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GCTGACCAAC AAATATGCTG AAGG 24

【００４１】配列番号：4 配列の長さ：29 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： ACCGGGTTCG GGTAGACGCC AGCAGCAAC 29

【００４２】配列番号：5 配列の長さ：18 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： ACATGTCGTC CGCACCGG 18

【００４３】配列番号：6 配列の長さ：20 配列の型：核酸 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GCGTAAACAG CGTTATGCGT 20

【図面の簡単な説明】

【図１】は、組換えプラスミドｐＳＡ１のHindIII 断片
の制限酵素地図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１記載の塩基配列のうち、１５
   ４〜１４５８番目の塩基配列を含むセリンヒドロキシメ
   チルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 ハイホミクロビウム・メチロボラムＧＭ
   ２（FERM BP-4039)が生産する請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１記載のＤＮＡが組み込まれた組
   換え体ベクター。
4. 【請求項４】 請求項３記載の組換え体ベクターを含有
   する微生物。
5. 【請求項５】 請求項３記載の組換え体ベクターを含有
   するエシェリキア・コリに属する微生物。
6. 【請求項６】 請求項３記載の組換え体ベクターを含有
   するエシェリキア・コリME5427/pAB2(FERM BP-4040) 。