JPH0618914B2 - 支持体表面上への巨大分子の共有結合的付着 - Google Patents
支持体表面上への巨大分子の共有結合的付着Info
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- JPH0618914B2 JPH0618914B2 JP2004654A JP465490A JPH0618914B2 JP H0618914 B2 JPH0618914 B2 JP H0618914B2 JP 2004654 A JP2004654 A JP 2004654A JP 465490 A JP465490 A JP 465490A JP H0618914 B2 JPH0618914 B2 JP H0618914B2
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
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- C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ポリスチレン表面、特に実験器具を、分子の
共有結合のために機能化することに関する。
共有結合のために機能化することに関する。
生物学的研究や商業的な生物学的応用が拡大するにつれ
て、相補的なリガンドおよびレセプターに特異的に結合
することのできる実験装置に対する要求が付随して増加
してきている。固体支持体、特に実験器具に特異的複合
体形成を用意するためには、広範なリガンドおよびレセ
プター、頻繁にはタンパク質を、表面に結合させる必要
がある。結合は、非特異的結合を最小にし、処理の間の
表面に結合した分子の損失を最小にし、そして効率的な
複合体形成を考慮に入れた方法で化合物が高密度で表面
に結合するような表面を提供すべきである。
て、相補的なリガンドおよびレセプターに特異的に結合
することのできる実験装置に対する要求が付随して増加
してきている。固体支持体、特に実験器具に特異的複合
体形成を用意するためには、広範なリガンドおよびレセ
プター、頻繁にはタンパク質を、表面に結合させる必要
がある。結合は、非特異的結合を最小にし、処理の間の
表面に結合した分子の損失を最小にし、そして効率的な
複合体形成を考慮に入れた方法で化合物が高密度で表面
に結合するような表面を提供すべきである。
現時点では、ポリスチレン実験器具の表面に巨大分子を
共有結合的に結合するための単純で且つ確かな方法が無
く、特に透明度の保持が所望される場合、高密度で巨大
分子を結合するための方法が無い。固相ペプチド合成の
ために架橋ポリスチレンを化学的に活性化するかまたは
誘導化するのに使われるほとんど全ての普通の有機溶
媒、特に塩化メチレンやＤＭＦなどの溶媒は、未架橋ポ
リスチレンを容易に溶解するかまたはひどく曇らせる。
既知の固体支持体に結合した巨大分子の多くは、低い巨
大分子表面濃度を示すか、または結合した巨大分子が部
分的にのみ生物活性を示す。或る場合には、巨大分子の
全体の電荷が変化することがあり、活性エステルを使用
するタンパク質接合技術（タンパク質のアミノ基をアミ
ドに転換する）のような場合がそうである。また、支持
体の表面に結合する巨大分子の収率が低いこともある。
更に、支持体の表面活性化が支持体に色を与え、従って
エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA)
のようなアッセイにおいて支持体の有用性を減少させる
かまたは除去してしまうことがある。
共有結合的に結合するための単純で且つ確かな方法が無
く、特に透明度の保持が所望される場合、高密度で巨大
分子を結合するための方法が無い。固相ペプチド合成の
ために架橋ポリスチレンを化学的に活性化するかまたは
誘導化するのに使われるほとんど全ての普通の有機溶
媒、特に塩化メチレンやＤＭＦなどの溶媒は、未架橋ポ
リスチレンを容易に溶解するかまたはひどく曇らせる。
既知の固体支持体に結合した巨大分子の多くは、低い巨
大分子表面濃度を示すか、または結合した巨大分子が部
分的にのみ生物活性を示す。或る場合には、巨大分子の
全体の電荷が変化することがあり、活性エステルを使用
するタンパク質接合技術（タンパク質のアミノ基をアミ
ドに転換する）のような場合がそうである。また、支持
体の表面に結合する巨大分子の収率が低いこともある。
更に、支持体の表面活性化が支持体に色を与え、従って
エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA)
のようなアッセイにおいて支持体の有用性を減少させる
かまたは除去してしまうことがある。
従って、改良された活性化固体支持体の開発、共有結合
により結合された巨大分子を有する改良された活性化固
体支持体およびそれらの組成物を製造するための改良方
法に引き続き関心がある。
により結合された巨大分子を有する改良された活性化固
体支持体およびそれらの組成物を製造するための改良方
法に引き続き関心がある。
ポリスチレンを含む活性化された支持体、および支持体
に結合された種々の生物活性物質は、米国特許第４，７
３６，０１９；４，６５７，８７３；４，６５４，２９
９；４，４１９，４４４；および４，０８１，３２９号
明細書中に記載されている。ポリスチレンの機能化もま
た米国特許第３，９５６，２１９；３，８８６，４８
６；３，９７４，１１０；３，９９５，０９４；および
４，２２６，９５８号明細書中に記載されている。それ
ぞれ1987年５月29日および1987年５月19日に出願された
同時係属出願第０５５，５２８号および第０５１，９１
７号、並びに EPO出願第88／304516.3号明細書も参照の
こと。ポリスチレンを含むポリマーを誘導化するための
ニトロベンゼン／H2SO4 中でのＮ−ヒドロキシメチル−
２−クロロアセトアミドの使用は、 EPO出願第83／1099
05.6号明細書中に記載されている。
に結合された種々の生物活性物質は、米国特許第４，７
３６，０１９；４，６５７，８７３；４，６５４，２９
９；４，４１９，４４４；および４，０８１，３２９号
明細書中に記載されている。ポリスチレンの機能化もま
た米国特許第３，９５６，２１９；３，８８６，４８
６；３，９７４，１１０；３，９９５，０９４；および
４，２２６，９５８号明細書中に記載されている。それ
ぞれ1987年５月29日および1987年５月19日に出願された
同時係属出願第０５５，５２８号および第０５１，９１
７号、並びに EPO出願第88／304516.3号明細書も参照の
こと。ポリスチレンを含むポリマーを誘導化するための
ニトロベンゼン／H2SO4 中でのＮ−ヒドロキシメチル−
２−クロロアセトアミドの使用は、 EPO出願第83／1099
05.6号明細書中に記載されている。
成形された実質的に未架橋のポリスチレン製品は、フェ
ニル基上での求電子置換のためにヒドロキシメチルアミ
ドを使って機能化される。置換メチルアミドは、求核置
換を可能にする置換可能な官能基を含むが、これはアリ
ール置換の条件下では安定である。得られた機能化され
たポリスチレンは、広範囲の官能基との反応、特に巨大
分子との結合のために使用して高密度の共有結合された
巨大分子を提供することができる。この方法は、芳香族
求電子置換のための溶媒としてポリスチレン不溶性溶媒
を使用する。得られた機能化されたポリスチレンは、相
補的結合ペア間の複合体形成に有用である表面を提供す
るために巨大分子と反応させることができる。
ニル基上での求電子置換のためにヒドロキシメチルアミ
ドを使って機能化される。置換メチルアミドは、求核置
換を可能にする置換可能な官能基を含むが、これはアリ
ール置換の条件下では安定である。得られた機能化され
たポリスチレンは、広範囲の官能基との反応、特に巨大
分子との結合のために使用して高密度の共有結合された
巨大分子を提供することができる。この方法は、芳香族
求電子置換のための溶媒としてポリスチレン不溶性溶媒
を使用する。得られた機能化されたポリスチレンは、相
補的結合ペア間の複合体形成に有用である表面を提供す
るために巨大分子と反応させることができる。
本発明によれば、ポリスチレン表面は、ポリスチレン不
溶性溶媒、特にテトラメチレンスルホン（ＴＭＳ）中
で、芳香族求電子置換条件下において、ヒドロキシメチ
ルアミドまたはそれの誘導体と反応せしめることにより
機能化される。該アミドは、穏和な条件下で求核置換が
可能であるがその一方で芳香族求電子置換の条件下では
安定である官能基を有することにより特徴付けられる。
得られた機能化されたポリスチレンを、求核置換が可能
な種々の官能基、特に巨大分子と反応せしめて、特異的
結合ペア間の複合体形成に利用され得る表面を提供する
ことができる。特に着目されるのは、相補的結合ペアメ
ンバーと特異的に結合する種々の物質の単離において、
アッセイにおいて、アフィニティーカラムとして等で利
用することのできる実験器具の機能化である。
溶性溶媒、特にテトラメチレンスルホン（ＴＭＳ）中
で、芳香族求電子置換条件下において、ヒドロキシメチ
ルアミドまたはそれの誘導体と反応せしめることにより
機能化される。該アミドは、穏和な条件下で求核置換が
可能であるがその一方で芳香族求電子置換の条件下では
安定である官能基を有することにより特徴付けられる。
得られた機能化されたポリスチレンを、求核置換が可能
な種々の官能基、特に巨大分子と反応せしめて、特異的
結合ペア間の複合体形成に利用され得る表面を提供する
ことができる。特に着目されるのは、相補的結合ペアメ
ンバーと特異的に結合する種々の物質の単離において、
アッセイにおいて、アフィニティーカラムとして等で利
用することのできる実験器具の機能化である。
活性化されるポリスチレン目的物は、大部分については
架橋していない、普通約０．５％より低い架橋率、より
普通には約０．１％より低い架橋率を有するものであろ
う。ポリスチレン製品は、傷や割れ目のほとんどない滑
面を与えるために、分子が該表面に結合できそして容易
に他の分子への結合に利用できるために、通常は成形さ
れる。
架橋していない、普通約０．５％より低い架橋率、より
普通には約０．１％より低い架橋率を有するものであろ
う。ポリスチレン製品は、傷や割れ目のほとんどない滑
面を与えるために、分子が該表面に結合できそして容易
に他の分子への結合に利用できるために、通常は成形さ
れる。
固体表面はどんな形で存在してもよく、反応器、試薬び
ん、ビーカー、キュベット、カラム、ミクロタイタープ
レート、ペトリ皿、二次加工品、ビーズ、棒材、繊維、
ストランド、膜、ディスクまたはプレートを含むが、こ
れに限定されない。加工品は、少なくとも実質的に架橋
なしで、ポリスチレンを成形し、通常透明で滑らかな表
面を生じさせることにより製造される。
ん、ビーカー、キュベット、カラム、ミクロタイタープ
レート、ペトリ皿、二次加工品、ビーズ、棒材、繊維、
ストランド、膜、ディスクまたはプレートを含むが、こ
れに限定されない。加工品は、少なくとも実質的に架橋
なしで、ポリスチレンを成形し、通常透明で滑らかな表
面を生じさせることにより製造される。
支持体の透明性のために、必要な時には、実験器具の壁
を通して観察することができそして効率的な光の透過を
行うことができる。この透明性は、比色法または蛍光測
定法が関係しそして壁を通過する光を観察するようなア
ッセイにおいて特に重要である。別の因子は、分子寸法
に関して傷および割れ目を有さないようにする表面の平
滑性である。製品が平らでない表面を有する場合、表面
に結合される分子は割れ目の内部または割れ目の壁に沿
って結合し、相補的な特異的結合メンバーへの結合に利
用できない分子となり得る。従って、多数の分子が該表
面に共有結合的に結合するために高い表面活性化率を得
ることができる場合でも、該分子の一部分のみがそれら
の相補的メンバーとの結合に利用可能となるであろう。
対照的に、表面を成形したポリスチレンでは、表面は公
平に均質であり且つ平滑であるため、該表面と共有結合
で結合している分子は、表面から上向きに伸びており、
相補的ペアメンバーとの結合のための分子の部位への容
易な接近が可能である。従って、表面膜タンパク質や抗
体のようなレセプターを表面に結合させることができ、
それらの結合部位は相補的リガンドへの結合に容易に利
用可能である。
を通して観察することができそして効率的な光の透過を
行うことができる。この透明性は、比色法または蛍光測
定法が関係しそして壁を通過する光を観察するようなア
ッセイにおいて特に重要である。別の因子は、分子寸法
に関して傷および割れ目を有さないようにする表面の平
滑性である。製品が平らでない表面を有する場合、表面
に結合される分子は割れ目の内部または割れ目の壁に沿
って結合し、相補的な特異的結合メンバーへの結合に利
用できない分子となり得る。従って、多数の分子が該表
面に共有結合的に結合するために高い表面活性化率を得
ることができる場合でも、該分子の一部分のみがそれら
の相補的メンバーとの結合に利用可能となるであろう。
対照的に、表面を成形したポリスチレンでは、表面は公
平に均質であり且つ平滑であるため、該表面と共有結合
で結合している分子は、表面から上向きに伸びており、
相補的ペアメンバーとの結合のための分子の部位への容
易な接近が可能である。従って、表面膜タンパク質や抗
体のようなレセプターを表面に結合させることができ、
それらの結合部位は相補的リガンドへの結合に容易に利
用可能である。
成形ポリスチレンの望ましい性質の保持は、機能化され
たＹ−メチルアセトアミドを使って達成され、ここでＹ
−メチル基は穏和な条件下でルイス酸触媒の存在下でＴ
ＭＳ溶媒中でポリスチレンと反応し、そしてＹはルイス
酸触媒の存在下でアリール基、例えばベンゼンによる求
核置換を行うことのできる成分である。Ｙ−メチルアミ
ドのα−アシル官能基は、芳香族求電子置換の条件下で
は安定であるが、求核置換の条件下でルイス塩基により
容易に置換され得る基である。
たＹ−メチルアセトアミドを使って達成され、ここでＹ
−メチル基は穏和な条件下でルイス酸触媒の存在下でＴ
ＭＳ溶媒中でポリスチレンと反応し、そしてＹはルイス
酸触媒の存在下でアリール基、例えばベンゼンによる求
核置換を行うことのできる成分である。Ｙ−メチルアミ
ドのα−アシル官能基は、芳香族求電子置換の条件下で
は安定であるが、求核置換の条件下でルイス塩基により
容易に置換され得る基である。
ポリスチレンを機能化するのに使われる化合物は、大部
分については次の式を有するであろう。
分については次の式を有するであろう。
X(R)CHCONHCH2Y 上式中： Ｒは１〜３個、より普通には１〜２個の炭素原子を有す
るアルキル基または水素であり、通常は水素である。
るアルキル基または水素であり、通常は水素である。
Ｘはハロゲン（擬ハロゲンを含む）であり、ここで該ハ
ロゲンは少なくとも17の原子番号を有し、塩素、臭素も
しくはヨウ素、または擬ハロゲン、例えばアリールスル
ホン酸エステル、スルホニウム塩等であることができ
る。通常、ハロゲン以外の場合、アシル基のα−炭素原
子上の置換基は、少なくとも約２個の炭素原子を有し且
つ多くて約10個、通常多くて約８個の炭素原子を有する
ものであり、そして１〜６個、より普通には１〜５個、
好ましくは１〜４個のヘテロ原子を有することができ、
ハロゲンおよびカルコゲン（酸素および硫黄）を含むこ
とができる。ここで、対イオンは限定の範囲内に含まれ
ない。多数の他の官能基、例えばシアノおよびニトロが
存在し得るが、大部分は有用な役割をもたず、そしてそ
のような化合物は通常入手不可能である。
ロゲンは少なくとも17の原子番号を有し、塩素、臭素も
しくはヨウ素、または擬ハロゲン、例えばアリールスル
ホン酸エステル、スルホニウム塩等であることができ
る。通常、ハロゲン以外の場合、アシル基のα−炭素原
子上の置換基は、少なくとも約２個の炭素原子を有し且
つ多くて約10個、通常多くて約８個の炭素原子を有する
ものであり、そして１〜６個、より普通には１〜５個、
好ましくは１〜４個のヘテロ原子を有することができ、
ハロゲンおよびカルコゲン（酸素および硫黄）を含むこ
とができる。ここで、対イオンは限定の範囲内に含まれ
ない。多数の他の官能基、例えばシアノおよびニトロが
存在し得るが、大部分は有用な役割をもたず、そしてそ
のような化合物は通常入手不可能である。
ＹはＸと同じかまたは異なることができ、通常は異な
り、そして求核置換が可能な基、特にオキシ誘導体、ハ
ライドおよび擬ハライドであり、ここでオキシ誘導体は
有機もしくは無機のいずれかのエステル、またはエーテ
ルであることができる。Ｙは通常多くて20個、通常多く
て12個の炭素原子、および約８個まで、通常多くて約６
個のヘテロ原子を有する。Ｙ基はヒドロキシ、少なくと
も17の原子番号のハロゲン、擬ハロゲン、例えばアリー
ルスルホン酸エステル、リン酸エステル、カルボン酸エ
ステル、イミドエステル等、アルキルエーテル、アリー
ルエーテル、オキシアルキルエーテル等を包含する。
り、そして求核置換が可能な基、特にオキシ誘導体、ハ
ライドおよび擬ハライドであり、ここでオキシ誘導体は
有機もしくは無機のいずれかのエステル、またはエーテ
ルであることができる。Ｙは通常多くて20個、通常多く
て12個の炭素原子、および約８個まで、通常多くて約６
個のヘテロ原子を有する。Ｙ基はヒドロキシ、少なくと
も17の原子番号のハロゲン、擬ハロゲン、例えばアリー
ルスルホン酸エステル、リン酸エステル、カルボン酸エ
ステル、イミドエステル等、アルキルエーテル、アリー
ルエーテル、オキシアルキルエーテル等を包含する。
使用されるＮ−ヒドロキシメチルアセトアミドは２−置
換Ｎ−ヒドロキシメチルアセトアミドであり、Ｎ−（ヒ
ドロキシメチル）−２−クロロアセトアミド、Ｎ−（ヒ
ドロキシメチル）−２−ブロモアセトアミド、Ｎ−（ヒ
ドロキシメチル）−２−ヨードアセトアミド、Ｎ−（ヒ
ドロキシメチル）−Ｏ−（ｐ−ブロモベンゼンスルホニ
ル）グリコールアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）−Ｏ
−（ｐ−トルエンスルホニル）グリコールアミド、Ｎ−
（ヒドロキシメチル）−２−アセトアミドペンタメチレ
ンスルホニウムヨージド、およびＮ−（ヒドロキシメチ
ル）−２−アセトアミドペンタメチレンスルホニウムト
リフルオロアセテートを含むが、これに限定されない。
これらの各化合物についての合成反応は実施例において
示す。
換Ｎ−ヒドロキシメチルアセトアミドであり、Ｎ−（ヒ
ドロキシメチル）−２−クロロアセトアミド、Ｎ−（ヒ
ドロキシメチル）−２−ブロモアセトアミド、Ｎ−（ヒ
ドロキシメチル）−２−ヨードアセトアミド、Ｎ−（ヒ
ドロキシメチル）−Ｏ−（ｐ−ブロモベンゼンスルホニ
ル）グリコールアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）−Ｏ
−（ｐ−トルエンスルホニル）グリコールアミド、Ｎ−
（ヒドロキシメチル）−２−アセトアミドペンタメチレ
ンスルホニウムヨージド、およびＮ−（ヒドロキシメチ
ル）−２−アセトアミドペンタメチレンスルホニウムト
リフルオロアセテートを含むが、これに限定されない。
これらの各化合物についての合成反応は実施例において
示す。
Ｎ−ヒドロキシ化合物は、特定の酸またはヒドロキシル
置換基を用いて、α−置換アセトアミドのＮ−置換の間
に反応混合物中で、またはα−クロロメチルメトキシエ
チルエーテルなどのホルムアルデヒド誘導体を使って、
直接誘導化されるかまたは調製され得る。
置換基を用いて、α−置換アセトアミドのＮ−置換の間
に反応混合物中で、またはα−クロロメチルメトキシエ
チルエーテルなどのホルムアルデヒド誘導体を使って、
直接誘導化されるかまたは調製され得る。
ポリスチレンの活性化は、ポリスチレンを溶解したり膨
張させたりしない溶媒中で穏和な条件下で起こるだろ
う。好ましい溶媒はＴＭＳであるけれども、あまり効果
的でない他の溶媒、例えばアセトニトリル、ニトロメタ
ンおよびDMSO（ジメチルスルホキシド）もまた利用され
得る。
張させたりしない溶媒中で穏和な条件下で起こるだろ
う。好ましい溶媒はＴＭＳであるけれども、あまり効果
的でない他の溶媒、例えばアセトニトリル、ニトロメタ
ンおよびDMSO（ジメチルスルホキシド）もまた利用され
得る。
この反応は、強酸、特にプロトン酸、好ましくは有機
酸、例えばトリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスル
ホン酸、メタンスルホン酸、硫酸、リン酸、フッ化水素
酸の存在下で行われる。酸の濃度は通常約０．１〜２Ｍ
の範囲内であろう。反応は通常大気水分の実質的非存在
下にて行われ、これは反応混合物にカバーをすることに
より、不活性雰囲気を提供することにより、等で達成す
ることができる。
酸、例えばトリフルオロ酢酸、トリフルオロメタンスル
ホン酸、メタンスルホン酸、硫酸、リン酸、フッ化水素
酸の存在下で行われる。酸の濃度は通常約０．１〜２Ｍ
の範囲内であろう。反応は通常大気水分の実質的非存在
下にて行われ、これは反応混合物にカバーをすることに
より、不活性雰囲気を提供することにより、等で達成す
ることができる。
ポリスチレン表面は、該支持体の表面を活性化するのに
適当な温度および時間の範囲内でＮ−（Ｙ−メチル）ア
セトアミド化合物と接触される。通常、温度は約−５℃
〜約60℃、好ましくは約０℃〜約30℃の範囲内であり、
そして活性化時間は約５分〜約48時間、通常約２時間〜
約８時間の範囲内であろう。Ｎ−（Ｙ−メチル）アセト
アミド化合物の濃度は、典型的には約0.01〜２Ｍ、通常
約0.05〜０．５Ｍである。ほとんどの適用については、
固体支持体表面積平方センチメートル（cm2）あたり少
なくとも約0.05ml、通常０．１mlの反応溶液の使用が、
支持体表面上の求電子性基の反応による所望のレベルの
活性化を提供するのに充分であろう。
適当な温度および時間の範囲内でＮ−（Ｙ−メチル）ア
セトアミド化合物と接触される。通常、温度は約−５℃
〜約60℃、好ましくは約０℃〜約30℃の範囲内であり、
そして活性化時間は約５分〜約48時間、通常約２時間〜
約８時間の範囲内であろう。Ｎ−（Ｙ−メチル）アセト
アミド化合物の濃度は、典型的には約0.01〜２Ｍ、通常
約0.05〜０．５Ｍである。ほとんどの適用については、
固体支持体表面積平方センチメートル（cm2）あたり少
なくとも約0.05ml、通常０．１mlの反応溶液の使用が、
支持体表面上の求電子性基の反応による所望のレベルの
活性化を提供するのに充分であろう。
高分子の接合前に、緩衝液および／または水で洗浄する
ことにより幾らかの未反応のＮ−（Ｙ−メチル）アセト
アミド化合物を除去することができる。洗浄段階に使用
される特定の物質は本発明にとって重要でなく、そして
該アミドの置換可能基に影響を与えない条件である限
り、都合のよいように選択される。該表面は不活性環境
において保存すれば安定であるので、置換可能基の置換
は、活性化の直後でも、幾らか時間を置いた後でも行う
ことができる。
ことにより幾らかの未反応のＮ−（Ｙ−メチル）アセト
アミド化合物を除去することができる。洗浄段階に使用
される特定の物質は本発明にとって重要でなく、そして
該アミドの置換可能基に影響を与えない条件である限
り、都合のよいように選択される。該表面は不活性環境
において保存すれば安定であるので、置換可能基の置換
は、活性化の直後でも、幾らか時間を置いた後でも行う
ことができる。
活性化されたポリスチレン表面は、置換可能基を置換す
ることのできる化合物と反応せしめることができる。こ
れらの化合物は、大部分、不対電子対を有する原子、例
えば窒素、酸素および硫黄を有するだろう。大部分は、
それらの化合物はペプチド、特にタンパク質であろう。
ペプチドを反応させる場合、反応は穏和な条件下で、約
10-6〜２ｇ／ml、より普通には約10-3〜１ｇ／mlの範囲
内の濃度において、約６〜10、より普通には約７〜９．
５の範囲内のpHにおいて、該分子の溶液を接触させるこ
とにより行われる。
ることのできる化合物と反応せしめることができる。こ
れらの化合物は、大部分、不対電子対を有する原子、例
えば窒素、酸素および硫黄を有するだろう。大部分は、
それらの化合物はペプチド、特にタンパク質であろう。
ペプチドを反応させる場合、反応は穏和な条件下で、約
10-6〜２ｇ／ml、より普通には約10-3〜１ｇ／mlの範囲
内の濃度において、約６〜10、より普通には約７〜９．
５の範囲内のpHにおいて、該分子の溶液を接触させるこ
とにより行われる。
媒質は通常は便利な緩衝剤、例えばリン酸塩、ホウ酸
塩、または表面上の置換官能基との反応と競争できない
他の有機もしくは無機緩衝剤で緩衝化されているであろ
う。緩衝剤の濃度は通常約0.01〜０．５Ｍであろう。媒
質中に更に含まれ得るのは、種々の塩、特にアルカリ金
属のハロゲン化物塩であり、この場合塩の濃度は通常約
0.01〜０．５Ｍの範囲内であろう。
塩、または表面上の置換官能基との反応と競争できない
他の有機もしくは無機緩衝剤で緩衝化されているであろ
う。緩衝剤の濃度は通常約0.01〜０．５Ｍであろう。媒
質中に更に含まれ得るのは、種々の塩、特にアルカリ金
属のハロゲン化物塩であり、この場合塩の濃度は通常約
0.01〜０．５Ｍの範囲内であろう。
温度は通常約０〜40℃の範囲内、より普通には約10〜30
℃の範囲内であろう。反応に要する時間は、置換官能
基、置換する基の性質、反応媒質中の他の成分等に依存
して異なるであろう。通常、インキュベーション時間は
少なくとも約５分、普通少なくとも約30分で、且つ多く
ても約24時間、普通多くても約12時間であろう。
℃の範囲内であろう。反応に要する時間は、置換官能
基、置換する基の性質、反応媒質中の他の成分等に依存
して異なるであろう。通常、インキュベーション時間は
少なくとも約５分、普通少なくとも約30分で、且つ多く
ても約24時間、普通多くても約12時間であろう。
得られた活性化ポリスチレン表面は、化学的分析のため
の電子分光法(ESCA)により分析し、支持体表面上の元素
の量の割合を測定することができる。例４の中の第１表
はポリスチレン組織培養フラスコ（25cm2）について得
られたデータを示している。
の電子分光法(ESCA)により分析し、支持体表面上の元素
の量の割合を測定することができる。例４の中の第１表
はポリスチレン組織培養フラスコ（25cm2）について得
られたデータを示している。
ポリスチレン表面上に置換され得る基は、タンパク質、
特に生物学的に活性なタンパク質；リガンド、例えばハ
プテン、および抗原；レセプター、例えば抗体、モノク
ローナル抗体および抗体断片、酵素、並びに天然のレセ
プター、例えば表面膜タンパク質、レクチンおよび血液
タンパク質（例えばチロキシン結合グロブリン）；錯生
成剤、例えばクリプタン、クラウンエーテル、ポルフィ
リンおよびフタロシアニン；核酸、例えば RNA，DNA 、
オリゴヌクレオチド、合成ヌクレオチド、例えばメチル
ホスホネート；ペプチド；指示薬物質、例えば色素、蛍
光物質および化学発光物質；抗体結合タンパク質（例え
ばブドウ球菌のプロテインＡまたは補体成分酵素）；リ
ガンド、例えばセレブロシド、スフィンゴミエリンおよ
びガングリオシド；グリコシド；酵素（この場合の酵素
はレセブターとしてよりもむしろ触媒として使用され
る）、酵素基質、阻害剤または補因子；または、同一も
しくは異なる分子を検出のために着目され得る他の分
子；または、着目の結果がもたらされるような操作、単
離、反応、相互作用もしくは他の現象のために使用され
るものを包含するが、これに限定されない。
特に生物学的に活性なタンパク質；リガンド、例えばハ
プテン、および抗原；レセプター、例えば抗体、モノク
ローナル抗体および抗体断片、酵素、並びに天然のレセ
プター、例えば表面膜タンパク質、レクチンおよび血液
タンパク質（例えばチロキシン結合グロブリン）；錯生
成剤、例えばクリプタン、クラウンエーテル、ポルフィ
リンおよびフタロシアニン；核酸、例えば RNA，DNA 、
オリゴヌクレオチド、合成ヌクレオチド、例えばメチル
ホスホネート；ペプチド；指示薬物質、例えば色素、蛍
光物質および化学発光物質；抗体結合タンパク質（例え
ばブドウ球菌のプロテインＡまたは補体成分酵素）；リ
ガンド、例えばセレブロシド、スフィンゴミエリンおよ
びガングリオシド；グリコシド；酵素（この場合の酵素
はレセブターとしてよりもむしろ触媒として使用され
る）、酵素基質、阻害剤または補因子；または、同一も
しくは異なる分子を検出のために着目され得る他の分
子；または、着目の結果がもたらされるような操作、単
離、反応、相互作用もしくは他の現象のために使用され
るものを包含するが、これに限定されない。
反応終了後、反応混合物を捨て、そして溶媒、緩衝液ま
たは水で表面を洗浄し、残りの非共有結合的に結合した
物質を除去することができる。この洗浄段階で使用され
る溶液は本発明にとって重要でなく、都合のよいように
選択される。
たは水で表面を洗浄し、残りの非共有結合的に結合した
物質を除去することができる。この洗浄段階で使用され
る溶液は本発明にとって重要でなく、都合のよいように
選択される。
本発明の製品、即ち、その活性化状態かまたは共有結合
的に結合された高分子もしくは他の分子を含有する状態
のいずれかにおけるポリアリール付加ポリマー、の用途
は次のように多数ありそして様々である。
的に結合された高分子もしくは他の分子を含有する状態
のいずれかにおけるポリアリール付加ポリマー、の用途
は次のように多数ありそして様々である。
改良された装置は、特に生体外での診断および療法、血
液、他の生理的液または分散された組織からの細胞の単
離において非常に様々な用途を見い出す。表面上に結合
されているであろう種々の組成物の濃度が高いために、
相補的結合メンバーが細胞上に見い出され得る場合に
は、細胞が該表面に結合され得、従って細胞混合物から
細胞のサブセットを分離することが可能である。加え
て、この分離方法は、細胞の高レベルの生存力および細
胞の回収の容易さが考慮されている。表面の透明性が維
持されるために、表面への細胞の結合をモニターするこ
とができ、並びに細胞の処理、例えば有糸分裂保進剤お
よびリンホカインでの膨張、免疫複合体での活性化等を
モニターすることができる。
液、他の生理的液または分散された組織からの細胞の単
離において非常に様々な用途を見い出す。表面上に結合
されているであろう種々の組成物の濃度が高いために、
相補的結合メンバーが細胞上に見い出され得る場合に
は、細胞が該表面に結合され得、従って細胞混合物から
細胞のサブセットを分離することが可能である。加え
て、この分離方法は、細胞の高レベルの生存力および細
胞の回収の容易さが考慮されている。表面の透明性が維
持されるために、表面への細胞の結合をモニターするこ
とができ、並びに細胞の処理、例えば有糸分裂保進剤お
よびリンホカインでの膨張、免疫複合体での活性化等を
モニターすることができる。
本発明の表面は、表面への特異的結合ペアメンバーの効
率的な結合を考慮した診断アッセイにおいて利用され得
る。表面の透明性のために、試料および容器の底、例え
ばミクロタイタープレートの底を通して光を透過させる
ことができる。更に、高い結合能力のために、特に複数
の部位に結合する可能性が存在する場合には、洗浄を比
較的徹底的に且つ活発に行って、どんな非特異的に結合
したアッセイ成分でも実質的な非存在を確実にすること
ができる。
率的な結合を考慮した診断アッセイにおいて利用され得
る。表面の透明性のために、試料および容器の底、例え
ばミクロタイタープレートの底を通して光を透過させる
ことができる。更に、高い結合能力のために、特に複数
の部位に結合する可能性が存在する場合には、洗浄を比
較的徹底的に且つ活発に行って、どんな非特異的に結合
したアッセイ成分でも実質的な非存在を確実にすること
ができる。
次の例は説明のためであり限定のためではない。
例１ ２−ハロアセトアミド化合物（25ｇ、 267ミリモル）を
水（75ml）および37％ホルムアルデヒド（8.01ｇ、20m
l、 267ミリモル）中に懸濁し、そして懸濁液をK2CO3(2
5ｇ、18ミリモル）で処理することにより、幾つかのＮ
−ヒドロキシメチルアセトアミド化合物を調製した。溶
液は数分間攪拌した後に生成する。次いで反応混合物を
４℃に一晩置き、濾過し、そして真空中（0.01mm、18時
間、室温）で乾燥した。
水（75ml）および37％ホルムアルデヒド（8.01ｇ、20m
l、 267ミリモル）中に懸濁し、そして懸濁液をK2CO3(2
5ｇ、18ミリモル）で処理することにより、幾つかのＮ
−ヒドロキシメチルアセトアミド化合物を調製した。溶
液は数分間攪拌した後に生成する。次いで反応混合物を
４℃に一晩置き、濾過し、そして真空中（0.01mm、18時
間、室温）で乾燥した。
２−クロロアセトアミドを用いて上記方法を使って、1
2.5ｇ（38％）のＮ−（ヒドロキシメチル）−２−クロ
ロアセトアミド（化合物１）が無色結晶として得られ
た。融点98−99℃。
2.5ｇ（38％）のＮ−（ヒドロキシメチル）−２−クロ
ロアセトアミド（化合物１）が無色結晶として得られ
た。融点98−99℃。
２−ブロモアセトアミドを用いて上記方法を使って、43
％のＮ−（ヒドロキシメチル）−２−ブロモアセトアミ
ド（２）が無色結晶として得られた。融点88−89℃。
％のＮ−（ヒドロキシメチル）−２−ブロモアセトアミ
ド（２）が無色結晶として得られた。融点88−89℃。
２−ヨードアセトアミドを用いて上記方法を使って、43
％のＮ−（ヒドロキシメチル）−２−ヨードアセトアミ
ド（３）が無色結晶として得られた。融点 117−118
℃。
％のＮ−（ヒドロキシメチル）−２−ヨードアセトアミ
ド（３）が無色結晶として得られた。融点 117−118
℃。
例２ Ｎ−（ヒドロキシメチル）−Ｏ−（ｐ−ブロモベンゼン
スルホニル）グリコールアミド（４）を次のようにして
調製した。DMF(21ml)中のＯ−（ｐ−ブロモベンゼンス
ルホニル）グリコールアミド（７．１ｇ、24ミリモル）
の溶液を37％ホルムアルデヒド（２．２ｇ、５．４ml、
72ミリモル）およびK2CO3(50mg／mlの水溶液１ml、0.36
ミリモル)で処理した。30分後、反応液を10倍の容量の
水で希釈し、氷上で冷却し、そして濾過した。固体を真
空乾燥し、そしてEt0Ac から再結晶すると、無色結晶と
して５．９ｇ（76％）の４が得られた。融点99−100
℃。
スルホニル）グリコールアミド（４）を次のようにして
調製した。DMF(21ml)中のＯ−（ｐ−ブロモベンゼンス
ルホニル）グリコールアミド（７．１ｇ、24ミリモル）
の溶液を37％ホルムアルデヒド（２．２ｇ、５．４ml、
72ミリモル）およびK2CO3(50mg／mlの水溶液１ml、0.36
ミリモル)で処理した。30分後、反応液を10倍の容量の
水で希釈し、氷上で冷却し、そして濾過した。固体を真
空乾燥し、そしてEt0Ac から再結晶すると、無色結晶と
して５．９ｇ（76％）の４が得られた。融点99−100
℃。
Ｎ−（ヒドロキシメチル）−Ｏ−（ｐ−トルエンスルホ
ニル）グリコールアミド（５）は、４と同じ方法を使っ
て調製された。無色結晶として収率70％の５が得られ
た。融点91−93℃。
ニル）グリコールアミド（５）は、４と同じ方法を使っ
て調製された。無色結晶として収率70％の５が得られ
た。融点91−93℃。
Ｎ−（ヒドロキシメチル）−２−アセトアミドペンタメ
チレンスルホニウムヨージド（６ａ）３ （１．０ｇ、４．６ミリモル）およびペンタメチレン
スルフィド（２．４ｇ、２．５ml、24ミリモル）のアセ
トン溶液を４℃にて48時間冷却することにより（６ａ）
を調製した。結晶化した固体をグラスフィルター上に集
め、エーテルで洗浄し、そして真空中で乾燥すると、無
色結晶として 560mg（38％）のヨージド塩が得られた。
融点93−95℃。
チレンスルホニウムヨージド（６ａ）３ （１．０ｇ、４．６ミリモル）およびペンタメチレン
スルフィド（２．４ｇ、２．５ml、24ミリモル）のアセ
トン溶液を４℃にて48時間冷却することにより（６ａ）
を調製した。結晶化した固体をグラスフィルター上に集
め、エーテルで洗浄し、そして真空中で乾燥すると、無
色結晶として 560mg（38％）のヨージド塩が得られた。
融点93−95℃。
Ｎ−（ヒドロキシメチル）−２−アセトアミドペンタメ
チレンスルホニウムトリルフルオロアセテート（６） 上記で調製したヨージド塩を10倍過剰のAG1-X4(-O2CC
F3)カラムを通して水で溶出させることにより（６）を
調製した。ＵＶ活性(254nm)画分を凍結乾燥し、回転式
蒸発器(rotovap)中で無水アセトニトリルから乾燥し、
そして真空中で（0.05mm、18時間、室温）乾燥すると、
定量的収量の６（出発のヨージドを基にして）が淡黄色
結晶として得られた。融点66.5−67℃。
チレンスルホニウムトリルフルオロアセテート（６） 上記で調製したヨージド塩を10倍過剰のAG1-X4(-O2CC
F3)カラムを通して水で溶出させることにより（６）を
調製した。ＵＶ活性(254nm)画分を凍結乾燥し、回転式
蒸発器(rotovap)中で無水アセトニトリルから乾燥し、
そして真空中で（0.05mm、18時間、室温）乾燥すると、
定量的収量の６（出発のヨージドを基にして）が淡黄色
結晶として得られた。融点66.5−67℃。
例３ 支持体表面の調製 テトラメチレンスルホン（ＴＭＳ）中のＮ−ヒドロキシ
メチルアセトアミド誘導体１−６の０．２Ｍ溶液を、Ｔ
ＭＳ中の２Ｍトリフルオロメタンスルホン酸(TFMSA)溶
液と１：１の比で混合し、この反応溶液を、誘導化しよ
うとするポリスチレン表面に即座に添加した。組織培養
フラスコ(Corning社から商業的に入手可能）を製造業者
により提供されたスクリューキャップでしっかりと蓋を
した。ミクロタイタープレート（96，24または６ウェ
ル、非照射ポリスチレン）またはリムーブアウェル(Rem
oveawell)(Immulon 1;Dynatech社から入手可能）を、 M
ylar粘着テープでカバーした。反応溶液を室温で５時間
ポリスチレン表面と接触させておき、無臭になるまで水
で洗浄し、そして室温で一晩風乾した。この表面は、乾
燥した遮光環境中で少なくとも２週間は安定であった。
メチルアセトアミド誘導体１−６の０．２Ｍ溶液を、Ｔ
ＭＳ中の２Ｍトリフルオロメタンスルホン酸(TFMSA)溶
液と１：１の比で混合し、この反応溶液を、誘導化しよ
うとするポリスチレン表面に即座に添加した。組織培養
フラスコ(Corning社から商業的に入手可能）を製造業者
により提供されたスクリューキャップでしっかりと蓋を
した。ミクロタイタープレート（96，24または６ウェ
ル、非照射ポリスチレン）またはリムーブアウェル(Rem
oveawell)(Immulon 1;Dynatech社から入手可能）を、 M
ylar粘着テープでカバーした。反応溶液を室温で５時間
ポリスチレン表面と接触させておき、無臭になるまで水
で洗浄し、そして室温で一晩風乾した。この表面は、乾
燥した遮光環境中で少なくとも２週間は安定であった。
例４ Ｎ−ヒドロキシメチルアセトアミド化合物１−６の各々
の溶液を、ＴＭＳ中１ＭのTFMSA を用いて０．１Ｍの濃
度に作製し、そして得られた溶液を使って、組織培養フ
ラスコ(Corning社から入手可能)またはミクロタイター
プレート(Immulon I，Dynatech社から入手可能)を室温
にて５時間該溶液と接触させることにより、該フラスコ
およびプレートの両方を活性化した。活性化段階には非
照射ポリスチレンのみを使った。組織培養フラスコおよ
びミクロタイタープレートには、ポリスチレン表面積１
cm2あたり少なくとも０．１mlの反応溶液を使った。反
応溶液の導入の直後に組織培養フラスコをしっかりと蓋
するか、またはミクロタイタープレートを Mylar粘着テ
ープでカバーすることにより、反応混合物を水分から保
護した。調製された表面７−12は下記に概説される： 表面７−12を有するT-25（25cm 2）組織培養フラスコに
ついてのESCAデータを下記の第１表に示す。
の溶液を、ＴＭＳ中１ＭのTFMSA を用いて０．１Ｍの濃
度に作製し、そして得られた溶液を使って、組織培養フ
ラスコ(Corning社から入手可能)またはミクロタイター
プレート(Immulon I，Dynatech社から入手可能)を室温
にて５時間該溶液と接触させることにより、該フラスコ
およびプレートの両方を活性化した。活性化段階には非
照射ポリスチレンのみを使った。組織培養フラスコおよ
びミクロタイタープレートには、ポリスチレン表面積１
cm2あたり少なくとも０．１mlの反応溶液を使った。反
応溶液の導入の直後に組織培養フラスコをしっかりと蓋
するか、またはミクロタイタープレートを Mylar粘着テ
ープでカバーすることにより、反応混合物を水分から保
護した。調製された表面７−12は下記に概説される： 表面７−12を有するT-25（25cm 2）組織培養フラスコに
ついてのESCAデータを下記の第１表に示す。
出発のポリスチレンは、その表面上に３−５％の酸素を
有することがわかった。
有することがわかった。
例５ 誘導化されたポリスチレン表面７−12を分析するため
に、減衰全反射率フーリエ変換赤外分光法(ATR-FTIR)も
適用した。どの場合においても、強いアミドＩおよびア
ミドII吸収が検出された。スルホン酸エステル10および
11については一連の強い対称および非対称のＯ−Ｓ−Ｏ
吸収も検出された。データは下の第２表に要約される。
に、減衰全反射率フーリエ変換赤外分光法(ATR-FTIR)も
適用した。どの場合においても、強いアミドＩおよびア
ミドII吸収が検出された。スルホン酸エステル10および
11については一連の強い対称および非対称のＯ−Ｓ−Ｏ
吸収も検出された。データは下の第２表に要約される。
例６ 1250−2000cm-1領域でのポリスチレンおよび８のATR-FT
IRスペクトルの詳細な研究は、表面分析を行う際のFTIR
の力量を証明する。スペクトルＡはT-25組織培養フラス
コからの誘導化されていないポリスチレン、即ち表面８
（スペクトルＢ）の出発材料である。この両スペクトル
の数字化した形を保存することができ、そしてスペクト
ルＡを差し引くことによりスペクトルＢにおけるポリス
チレンの寄与を除去し、差スペクトルＣを作成すること
ができる。スペクトルＣにおいて、アミドＩ，IIおよび
IIIのバンドは容易に明らかである。アミドIIの二重線
の性質は、該アミドのｓ−シスとｓ−トランスの両方が
８のポリスチレン表面上に存在することを示すであろ
う。ポリスチレンの２つの別々のスキャンを差し引く
と、差スペクトルＤは全く人為的特徴がなくなることが
わかった。
IRスペクトルの詳細な研究は、表面分析を行う際のFTIR
の力量を証明する。スペクトルＡはT-25組織培養フラス
コからの誘導化されていないポリスチレン、即ち表面８
（スペクトルＢ）の出発材料である。この両スペクトル
の数字化した形を保存することができ、そしてスペクト
ルＡを差し引くことによりスペクトルＢにおけるポリス
チレンの寄与を除去し、差スペクトルＣを作成すること
ができる。スペクトルＣにおいて、アミドＩ，IIおよび
IIIのバンドは容易に明らかである。アミドIIの二重線
の性質は、該アミドのｓ−シスとｓ−トランスの両方が
８のポリスチレン表面上に存在することを示すであろ
う。ポリスチレンの２つの別々のスキャンを差し引く
と、差スペクトルＤは全く人為的特徴がなくなることが
わかった。
例７ 35Ｓ−ラベル化ヒトＩｇＧを用いたタンパク質結
合プロトコール 上記の例において製造された表面７−11を有するリムー
ブアウェル(Removeawell)、およびイムロン１(Immulon
1)を、ＰＢＳ中20μｇ／ml、 100μｌ／ウェルにおいて
室温にて16時間35Ｓ−ラベル化ヒトＩｇＧ（比活性＞３
dpm／ng）でコーティングした。表面12も同じ形式で
処理したが、コーティング緩衝液は０．１Ｍホウ酸塩、
pH９．２であった。インキュベーション後、放射性溶液
を注意深く除去し、そしてウェルをＰＢＳで10回洗浄し
た。ウェルを割って別々にし、１％SDS(３ウェル／10m
l)中に入れ、そして55℃で14時間インキュベートした。
ＳＤＳ溶液からウェルを取り出し、もう一度更にＰＢＳ
洗浄を行い、そしてFisher Scintiverse II中でカウン
トした。24時間後に再びウェルをカウントした。２つの
カウント値は常に５％以内で一致した。
合プロトコール 上記の例において製造された表面７−11を有するリムー
ブアウェル(Removeawell)、およびイムロン１(Immulon
1)を、ＰＢＳ中20μｇ／ml、 100μｌ／ウェルにおいて
室温にて16時間35Ｓ−ラベル化ヒトＩｇＧ（比活性＞３
dpm／ng）でコーティングした。表面12も同じ形式で
処理したが、コーティング緩衝液は０．１Ｍホウ酸塩、
pH９．２であった。インキュベーション後、放射性溶液
を注意深く除去し、そしてウェルをＰＢＳで10回洗浄し
た。ウェルを割って別々にし、１％SDS(３ウェル／10m
l)中に入れ、そして55℃で14時間インキュベートした。
ＳＤＳ溶液からウェルを取り出し、もう一度更にＰＢＳ
洗浄を行い、そしてFisher Scintiverse II中でカウン
トした。24時間後に再びウェルをカウントした。２つの
カウント値は常に５％以内で一致した。
この結果は下の表にまとめられ、そして誘導化されたポ
リスチレン表面は、誘導化されないImmulon 1 の２．２
〜２．８倍のタンパク質を結合したことを示す。
リスチレン表面は、誘導化されないImmulon 1 の２．２
〜２．８倍のタンパク質を結合したことを示す。
例８ 本発明に従って製造された、巨大分子と結合され活性化
された支持体を ELISAプロトコールにおいて利用した。
された支持体を ELISAプロトコールにおいて利用した。
ウサギ×ヒトIgG(Jackson Immunoresearchから商業的に
入手可能)の１mg／ml溶液の連続希釈を用いて、０．１
Ｍホウ酸塩（pH ９．２）中の 100，70，30，10， 3お
よび１×10-4mg／mlの濃度の溶液を用意した。各濃度の
溶液 100μｌを有する４つのポリスチレンウェル（本発
明に従って化合物７で活性化されている）を、覆いをし
たミクロタイタープレート中室温で16時間該抗体でコー
ティングした（振盪せず）。更に４つのウェルを緩衝液
のみでコーティングした。抗体溶液を振りおとし、そし
て一枚のタオル上で軽くたたいて乾燥した。全てのウェ
ルの非特異的結合をＰＢＳ中５％BSA200μｌでブロック
し、覆いをしたプレート中で室温にてインキュベートし
た。プレートを PBS／0.02％Tween 20で５回洗浄し(Whe
aton噴霧器を使って）、そして PBS／0.02％Tween 20中
のヤギ×ヒトＩｇＧ(H＋L)−AP（アルカリホスファター
ゼ）接合体の１：3000希釈液を全ウェルに添加し、覆い
をしたプレート中室温で３時間インキュベートした。次
いでプレートを PBS／0.02％Tween 20で３回、およびＰ
ＢＳで３回洗浄した。全てのウェルに１Ｍトリエタノー
ルアミン（pH9.6 ）中１mg／mlの濃度のアルカリホスフ
ァターゼ基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート）100
μｌを添加した。７分間発色させ、そして25μｌ／ウェ
ルの３Ｍ NaOH の添加により終了させた。次いでプレー
トをモレキュラーデバイシスＶmax キネティックミクロ
プレートリーダー(Molecular DevicesＶmax Kinetic Mi
croplate Reader)上で 405ｎｍにて読み取った。
入手可能)の１mg／ml溶液の連続希釈を用いて、０．１
Ｍホウ酸塩（pH ９．２）中の 100，70，30，10， 3お
よび１×10-4mg／mlの濃度の溶液を用意した。各濃度の
溶液 100μｌを有する４つのポリスチレンウェル（本発
明に従って化合物７で活性化されている）を、覆いをし
たミクロタイタープレート中室温で16時間該抗体でコー
ティングした（振盪せず）。更に４つのウェルを緩衝液
のみでコーティングした。抗体溶液を振りおとし、そし
て一枚のタオル上で軽くたたいて乾燥した。全てのウェ
ルの非特異的結合をＰＢＳ中５％BSA200μｌでブロック
し、覆いをしたプレート中で室温にてインキュベートし
た。プレートを PBS／0.02％Tween 20で５回洗浄し(Whe
aton噴霧器を使って）、そして PBS／0.02％Tween 20中
のヤギ×ヒトＩｇＧ(H＋L)−AP（アルカリホスファター
ゼ）接合体の１：3000希釈液を全ウェルに添加し、覆い
をしたプレート中室温で３時間インキュベートした。次
いでプレートを PBS／0.02％Tween 20で３回、およびＰ
ＢＳで３回洗浄した。全てのウェルに１Ｍトリエタノー
ルアミン（pH9.6 ）中１mg／mlの濃度のアルカリホスフ
ァターゼ基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート）100
μｌを添加した。７分間発色させ、そして25μｌ／ウェ
ルの３Ｍ NaOH の添加により終了させた。次いでプレー
トをモレキュラーデバイシスＶmax キネティックミクロ
プレートリーダー(Molecular DevicesＶmax Kinetic Mi
croplate Reader)上で 405ｎｍにて読み取った。
上記の結果から、本発明の方法論は非常に効果的で、単
純であり、そして種々の用途を見出す機能化された表面
をもたらす。表面の透明性は、細胞が処理されている表
面の観察、容器を通した光の透過、および容器中での出
来事をモニターする能力を可能にする。加えて、本発明
の方法は、表面に結合されている非常に高密度の分子を
提供し、抗体を用いると、高レベルの配向性を有する利
用可能な結合部位が存在することがわかる。滑らかなポ
リスチレン表面は比較的傷や割れ目がないので、分子ス
ケールにおいて表面に結合されているタンパク質が他の
分子や細胞との結合に利用可能である。
純であり、そして種々の用途を見出す機能化された表面
をもたらす。表面の透明性は、細胞が処理されている表
面の観察、容器を通した光の透過、および容器中での出
来事をモニターする能力を可能にする。加えて、本発明
の方法は、表面に結合されている非常に高密度の分子を
提供し、抗体を用いると、高レベルの配向性を有する利
用可能な結合部位が存在することがわかる。滑らかなポ
リスチレン表面は比較的傷や割れ目がないので、分子ス
ケールにおいて表面に結合されているタンパク質が他の
分子や細胞との結合に利用可能である。
今まで本発明を理解の明確化のために説明および例によ
り幾分詳細に記載してきたが、本発明の教示を考慮して
特許請求の範囲および精神を逸脱することなく幾つかの
変更および改良を行い得ることは当業者にとって容易に
明らかであろう。
り幾分詳細に記載してきたが、本発明の教示を考慮して
特許請求の範囲および精神を逸脱することなく幾つかの
変更および改良を行い得ることは当業者にとって容易に
明らかであろう。
Claims (12)
- 【請求項１】ポリスチレン表面に着目の成分を共有結合
により結合させるための高密度の官能基を提供するため
に、該ポリスチレン表面を機能化する方法であって、こ
こで前記ポリスチレンは透明でありそして少なくとも実
質的に架橋しておらず、 ルイス酸触媒の存在下で前記ポリスチレン表面とα−置
換Ｎ−（Ｙ−メチル）アセトアミドとを、前記ポリスチ
レンのベンゼン環によるＹの置換に充分な時間接触さ
せ、透明度を保持したアセトアミド置換表面を生成せし
めることを含んで成り、ここで前記α−置換基は、求核
性置換基により置換可能な基であり、そしてＹはルイス
酸触媒の存在下でのアリール基による求電子置換が可能
な基である、前記ポリスチレンを機能化する方法。 - 【請求項２】前記酸触媒がプロトン系触媒である、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記酸触媒がトリフルオロメタンスルホン
酸である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】前記α−置換基がハロゲンまたは擬ハロゲ
ンである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】前記触媒が約０〜４０℃の範囲内の温度に
て行われる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】ポリスチレン表面に共有結合により結合し
た高密度の着目の成分を提供するために、該ポリスチレ
ンを機能化する方法であって、ここで前記ポリスチレン
表面は透明でありそして少なくとも実質的に架橋してお
らず、前記着目の成分は求核置換の可能な基を含んで成
り、 前記ポリスチレン表面とα−置換Ｎ−ヒドロキシメチル
アセトアミドとを、酸触媒の存在下でテトラメチレンス
ルホン中で、前記Ｎ−ヒドロキシメチルアセトアミドが
前記ポリスチレンのベンゼン環と反応するのに充分な時
間接触せしめ、透明度を保持したアセトアミド置換表面
を生成せしめ、ここで前記α−置換基は求核性置換基に
より置換可能な基であり； 前記テトラメチレンスルホン溶液を除去し；そして 前記アセトアミド置換表面と前記着目の成分とを極性溶
媒中で接触せしめ、それにより前記求核性基が前記表面
に高密度で共有結合的に結合するようになる； ことを含んで成る方法。 - 【請求項７】前記α−置換基がハロゲンまたは擬ハロゲ
ンである、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】前記成分がタンパク質である、請求項６に
記載の方法。 - 【請求項９】前記タンパク質が抗体である、請求項８に
記載の方法。 - 【請求項１０】請求項１の方法に従って調製されたポリ
スチレン表面。 - 【請求項１１】請求項６の方法に従って調製されたポリ
スチレン表面。 - 【請求項１２】請求項９の方法に従って調製されたポリ
スチレン表面。
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