JPH06201694A - ノルトリプチリン誘導体およびコンジュゲート - Google Patents
ノルトリプチリン誘導体およびコンジュゲートInfo
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- JPH06201694A JPH06201694A JP5218757A JP21875793A JPH06201694A JP H06201694 A JPH06201694 A JP H06201694A JP 5218757 A JP5218757 A JP 5218757A JP 21875793 A JP21875793 A JP 21875793A JP H06201694 A JPH06201694 A JP H06201694A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ノルトリプチリンを測定する方法およびその
ための試薬を提供すること。 【構成】 式 【化１】 で表される化合物に応答して生産されたを必須の試薬と
して使用して、ノルトリプチリンを酵素イムノアッセイ
法で測定する。
ための試薬を提供すること。 【構成】 式 【化１】 で表される化合物に応答して生産されたを必須の試薬と
して使用して、ノルトリプチリンを酵素イムノアッセイ
法で測定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】ノルトリプチリンは、広く使用さ
れている３環系抗うつ剤である。この薬剤の治療濃度範
囲は、５０〜１７５ng／mlである。 用量が低いと有意
な作用が得られず、過量は生命をおびやかす副作用を招
く。過量は、けいれん、昏睡、心臓性不整脈並びに散瞳
および頻脈のような抗コリン作動性徴候を招くことがあ
る。薬剤の代謝速度は、個人、および薬剤に対する個人
の感受性により著しく異なることが判明した。それ故、
適当な用量レベルを確保するためには、血漿レベルを監
視して治療用量を維持し得るようにしなければならな
い。用量レベルの監視に際しては、ノルトリプチリンの
簡単、正確、迅速な測定法であって、ノルトリプチリン
レベルについて誤まった値を与え得る他の薬剤およびノ
ルトリプチリン代謝産物からノルトリプチリンを識別し
得る方法の存在が望まれる。
れている３環系抗うつ剤である。この薬剤の治療濃度範
囲は、５０〜１７５ng／mlである。 用量が低いと有意
な作用が得られず、過量は生命をおびやかす副作用を招
く。過量は、けいれん、昏睡、心臓性不整脈並びに散瞳
および頻脈のような抗コリン作動性徴候を招くことがあ
る。薬剤の代謝速度は、個人、および薬剤に対する個人
の感受性により著しく異なることが判明した。それ故、
適当な用量レベルを確保するためには、血漿レベルを監
視して治療用量を維持し得るようにしなければならな
い。用量レベルの監視に際しては、ノルトリプチリンの
簡単、正確、迅速な測定法であって、ノルトリプチリン
レベルについて誤まった値を与え得る他の薬剤およびノ
ルトリプチリン代謝産物からノルトリプチリンを識別し
得る方法の存在が望まれる。
【０００２】
【従来の技術】ノルトリプチリンは、アミトリプチリン
に極めて化学的関連性が強い。生物体液中のアミトリプ
チリンに関する既知の測定技術には、薄層クロマトグラ
フィー、気液クロマトグラフィー(ＧＬＣ)、およびＧＬ
Ｃ−質量スペクトロメトリーを用いるものが含まれる。
グリフォード等、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィ
ー(Ｊ．Ｃhrom.) １０５巻１０７〜１１３頁(１９７５
年)、グプタ等、クリニカル・バイオケミストリー(Ｃli
n．Ｂiochem．) ９巻２４７〜５１頁(１９７６年)、ナ
イベルクおよびマーテンソン、ジャーナル・オブ・クロ
マトグラフィー(Ｊ．Ｃhromatography) １４３巻４９１
頁(１９７７年)、ワトソンおよびスチュワート、ジャー
ナル・オブ・クロマトグラフィー(Ｊ．Ｃhrom.)１３４
巻１８２頁(１９７７年)、同誌１３２巻１５５〜１５９
頁(１９７７年)参照。アミトリプチリンのラジオイムノ
アッセイは、アヘーヌ等、ブリテイッシュ・ジャーナル
・オブ・クリニカル・ファーマコロジー(Ｂr．Ｊ．Ｃli
n．Ｐharmac．) ３巻５６１頁(１９７６年)、ターナ
ー、ランセット(Ｌancet)１３１６頁、(１９７７年)、
およびアヘーヌ等、ランセット(Ｌancet)１２１４頁(１
９７７年)に報告されている。アヘーヌ等の同誌には、
抗体産生用抗原の合成が記載され、そこではノルトリプ
チリンをアミノブチレンで置換した後カルボジイミドで
うし血清アルブミンとコンジュゲート(抱合)している。
カウル等、ジャーナル・オブ・アナリティカル・トキシ
コロジー(Ｊ．Ａnal．Ｔox.)１巻２３６頁 (１９７７
年) に報告された別の抗原コンジュゲート合成では、ス
クシニック基を用いてノルトリプチリンをうし血清アル
ブミンにコンジュゲートしている。生成する抗体は、多
数の他の３環系薬剤と顕著な交差反応性を示すことが判
明している。
に極めて化学的関連性が強い。生物体液中のアミトリプ
チリンに関する既知の測定技術には、薄層クロマトグラ
フィー、気液クロマトグラフィー(ＧＬＣ)、およびＧＬ
Ｃ−質量スペクトロメトリーを用いるものが含まれる。
グリフォード等、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィ
ー(Ｊ．Ｃhrom.) １０５巻１０７〜１１３頁(１９７５
年)、グプタ等、クリニカル・バイオケミストリー(Ｃli
n．Ｂiochem．) ９巻２４７〜５１頁(１９７６年)、ナ
イベルクおよびマーテンソン、ジャーナル・オブ・クロ
マトグラフィー(Ｊ．Ｃhromatography) １４３巻４９１
頁(１９７７年)、ワトソンおよびスチュワート、ジャー
ナル・オブ・クロマトグラフィー(Ｊ．Ｃhrom.)１３４
巻１８２頁(１９７７年)、同誌１３２巻１５５〜１５９
頁(１９７７年)参照。アミトリプチリンのラジオイムノ
アッセイは、アヘーヌ等、ブリテイッシュ・ジャーナル
・オブ・クリニカル・ファーマコロジー(Ｂr．Ｊ．Ｃli
n．Ｐharmac．) ３巻５６１頁(１９７６年)、ターナ
ー、ランセット(Ｌancet)１３１６頁、(１９７７年)、
およびアヘーヌ等、ランセット(Ｌancet)１２１４頁(１
９７７年)に報告されている。アヘーヌ等の同誌には、
抗体産生用抗原の合成が記載され、そこではノルトリプ
チリンをアミノブチレンで置換した後カルボジイミドで
うし血清アルブミンとコンジュゲート(抱合)している。
カウル等、ジャーナル・オブ・アナリティカル・トキシ
コロジー(Ｊ．Ａnal．Ｔox.)１巻２３６頁 (１９７７
年) に報告された別の抗原コンジュゲート合成では、ス
クシニック基を用いてノルトリプチリンをうし血清アル
ブミンにコンジュゲートしている。生成する抗体は、多
数の他の３環系薬剤と顕著な交差反応性を示すことが判
明している。
【０００３】米国特許第４２７５１６０号は、イミプラ
ミン誘導体およびポリ(アミノ酸)コンジュゲートを記載
している。米国特許第４３０７２４５号は、抗原性蛋白
質および酵素に対するアミトリプチリンコンジュゲート
を記載している。米国特許第４２２０７２２号は、ハロ
アシル基を用いた、ポリアミノ化合物に対するコンジュ
ゲート法を記載している。米国特許第３４５８５７８号
は、４−アミノ−１０,１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ
[a'd]シクロヘプテン−５−オンを記載している。米国
特許第３８０３２３４号は、一般的開示として２および
３−ニトロ−１０,１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ
[a,d] シクロヘプテン−５−オンを記載している。
ミン誘導体およびポリ(アミノ酸)コンジュゲートを記載
している。米国特許第４３０７２４５号は、抗原性蛋白
質および酵素に対するアミトリプチリンコンジュゲート
を記載している。米国特許第４２２０７２２号は、ハロ
アシル基を用いた、ポリアミノ化合物に対するコンジュ
ゲート法を記載している。米国特許第３４５８５７８号
は、４−アミノ−１０,１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ
[a'd]シクロヘプテン−５−オンを記載している。米国
特許第３８０３２３４号は、一般的開示として２および
３−ニトロ−１０,１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ
[a,d] シクロヘプテン−５−オンを記載している。
【０００４】
【発明の構成】この発明によると、蛋白性材料、特に抗
原性および酵素性ポリ(アミノ酸)とコンジュゲートする
ために３位を官能化したノルトリプチリン誘導体の製造
法が提供される。抗原性コンジュゲートは、イムノアッ
セイに用いる抗体の産生に使用される。酵素コンジュゲ
ートは、イムノアッセイによるノルトリプチリン定量用
の試薬として用いられる。抗体および酵素コンジュゲー
トは、血清および他の生理学的液体中のノルトリプチリ
ンを迅速かつ正確に測定するために、キットの形に組合
わせて用いられる。
原性および酵素性ポリ(アミノ酸)とコンジュゲートする
ために３位を官能化したノルトリプチリン誘導体の製造
法が提供される。抗原性コンジュゲートは、イムノアッ
セイに用いる抗体の産生に使用される。酵素コンジュゲ
ートは、イムノアッセイによるノルトリプチリン定量用
の試薬として用いられる。抗体および酵素コンジュゲー
トは、血清および他の生理学的液体中のノルトリプチリ
ンを迅速かつ正確に測定するために、キットの形に組合
わせて用いられる。
【０００５】（好ましい実施態様）この発明により提供
される新規化合物は、抗原性または酵素であるポリ(ア
ミノ酸)に対してコンジュゲートできる官能基を３位に
有するノルトリプチリン誘導体である。抗原性コンジュ
ゲートは、ノルトリプチリンに対して特異的な抗体の産
生用の免疫原として用いられる。抗体はイムノアッセイ
に用いられる。酵素コンジュゲートは、ノルトリプチリ
ンの定量用酵素アッセイにおける試薬として用いられ
る。
される新規化合物は、抗原性または酵素であるポリ(ア
ミノ酸)に対してコンジュゲートできる官能基を３位に
有するノルトリプチリン誘導体である。抗原性コンジュ
ゲートは、ノルトリプチリンに対して特異的な抗体の産
生用の免疫原として用いられる。抗体はイムノアッセイ
に用いられる。酵素コンジュゲートは、ノルトリプチリ
ンの定量用酵素アッセイにおける試薬として用いられ
る。
【０００６】主として、この発明の化合物は下記の式
(Ｉ)で表わされる。
(Ｉ)で表わされる。
【化９】 [式中、ψおよびψ'は、一緒になって、酸素原子(オキ
ソ)に対する二重結合またはＧで置換された炭素原子に
対する二重結合 (すなわち、ψおよびψ'が＝ＣＨ−Ｇ)
(ここで、Ｇは水素以外に４〜８個の原子、通常水素以
外に５〜６個の原子を有する脂肪族の基であり、上記原
子は炭素および窒素であり、窒素はアミノ、好ましくは
第３級アミノである) を形成することができ、ここで、
Ｇは
ソ)に対する二重結合またはＧで置換された炭素原子に
対する二重結合 (すなわち、ψおよびψ'が＝ＣＨ−Ｇ)
(ここで、Ｇは水素以外に４〜８個の原子、通常水素以
外に５〜６個の原子を有する脂肪族の基であり、上記原
子は炭素および窒素であり、窒素はアミノ、好ましくは
第３級アミノである) を形成することができ、ここで、
Ｇは
【化１０】 (すなわち、ψおよびψ'が
【化１１】 であってもよく、ここでＪは水素原子、メチル、また
は、非オキソカルボニル、通常炭素原子数２〜６、好ま
しくは３〜４個のアルコキシカルボニルであって、これ
は炭素原子３個以上が存在する場合、通常β置換分とし
て、原子番号１７〜３５のハロゲン原子、通常塩素原子
を０〜３個を含有してもよい] (ここにいう非オキソカ
ルボニルは少なくとも１つのヘテロ原子で置換されたカ
ルボニル基をさす。適当な基としては、カルボン酸、エ
ステル、アミド、酸ハロゲン化物、無水物が含まれる。
は、非オキソカルボニル、通常炭素原子数２〜６、好ま
しくは３〜４個のアルコキシカルボニルであって、これ
は炭素原子３個以上が存在する場合、通常β置換分とし
て、原子番号１７〜３５のハロゲン原子、通常塩素原子
を０〜３個を含有してもよい] (ここにいう非オキソカ
ルボニルは少なくとも１つのヘテロ原子で置換されたカ
ルボニル基をさす。適当な基としては、カルボン酸、エ
ステル、アミド、酸ハロゲン化物、無水物が含まれる。
【０００７】ψおよびψ' は、それぞれ別個になる場
合、オキシ、通常ヒドロキシ、および水素以外に４〜８
個の原子、通常水素以外に５〜６個の原子を有する脂肪
族の基(ここで、上記原子は炭素および窒素、通常４〜
５個の炭素および０から１の窒素であり、窒素はアミ
ノ、好ましくは第３級アミノである) を表わすことがで
き、Ｒは、結合手、または、水素以外の原子数１〜２
０、好ましくは水素以外の原子数４〜１５、さらに好ま
しくは水素以外の原子数７〜１２の脂肪族連結基であ
り、上記原子は炭素、窒素、カルコゲン(酸素および硫
黄)であってよく、この基は水素以外の原子数１〜１
５、好ましくは水素以外の原子数３〜１２、さらに好ま
しくは水素以外の原子数５〜１０の鎖、通常１〜１０
個、好ましくは２〜６個の炭素、通常０〜５個、好まし
くは１〜３個の酸素 (オキソカルボニル、非オキソカル
ボニルまたはエーテル、特に非オキソカルボニルとして
存在する) 通常０〜３個、好ましくは１〜２個の窒素
(アミノとして存在し、好ましくは１個の窒素が芳香核
に連結する) および通常０〜２個の硫黄原子 (チオノま
たはジスルフィドとして存在する) を含み、ここで、上
記それぞれの炭素には、１個以下のヘテロ原子が飽和結
合により連結するものとし、
合、オキシ、通常ヒドロキシ、および水素以外に４〜８
個の原子、通常水素以外に５〜６個の原子を有する脂肪
族の基(ここで、上記原子は炭素および窒素、通常４〜
５個の炭素および０から１の窒素であり、窒素はアミ
ノ、好ましくは第３級アミノである) を表わすことがで
き、Ｒは、結合手、または、水素以外の原子数１〜２
０、好ましくは水素以外の原子数４〜１５、さらに好ま
しくは水素以外の原子数７〜１２の脂肪族連結基であ
り、上記原子は炭素、窒素、カルコゲン(酸素および硫
黄)であってよく、この基は水素以外の原子数１〜１
５、好ましくは水素以外の原子数３〜１２、さらに好ま
しくは水素以外の原子数５〜１０の鎖、通常１〜１０
個、好ましくは２〜６個の炭素、通常０〜５個、好まし
くは１〜３個の酸素 (オキソカルボニル、非オキソカル
ボニルまたはエーテル、特に非オキソカルボニルとして
存在する) 通常０〜３個、好ましくは１〜２個の窒素
(アミノとして存在し、好ましくは１個の窒素が芳香核
に連結する) および通常０〜２個の硫黄原子 (チオノま
たはジスルフィドとして存在する) を含み、ここで、上
記それぞれの炭素には、１個以下のヘテロ原子が飽和結
合により連結するものとし、
【０００８】Ｙは、酸素原子、イミノ(Ｎ−Ｈ)または硫
黄原子、好ましくは酸素原子、Ｚは、アミノ( r＝０)、
水素原子、炭素原子数１〜６、通常炭素原子数１〜３の
アルコキシ (硫黄類似体を含む) (ここで、上記硫黄類
似体Ｚは、Ｒと一緒になってジスルフィドを形成しても
よい)または、抗原または酵素であるポリ(アミノ酸)
(ＰＡＡ)、mは０または１であり、一般的には、ＺがＰ
ＡＡ以外の場合は１、r は０または１であり、Ｚがアミ
ノの場合は０、それ以外の場合は１、n はＺがＰＡＡ以
外の場合１、それ以外の場合平均して１とＺの分子量／
５００、さらに普通には／１０００、しばしば／１５０
０の間の数を表わし、一般的には、１〜５００、好まし
くは１〜１００(Ｚが抗原の場合)、または１〜３０、さ
らに普通には２〜２０、好ましくは２〜１６ (Ｚが酵素
の場合を表わす）］
黄原子、好ましくは酸素原子、Ｚは、アミノ( r＝０)、
水素原子、炭素原子数１〜６、通常炭素原子数１〜３の
アルコキシ (硫黄類似体を含む) (ここで、上記硫黄類
似体Ｚは、Ｒと一緒になってジスルフィドを形成しても
よい)または、抗原または酵素であるポリ(アミノ酸)
(ＰＡＡ)、mは０または１であり、一般的には、ＺがＰ
ＡＡ以外の場合は１、r は０または１であり、Ｚがアミ
ノの場合は０、それ以外の場合は１、n はＺがＰＡＡ以
外の場合１、それ以外の場合平均して１とＺの分子量／
５００、さらに普通には／１０００、しばしば／１５０
０の間の数を表わし、一般的には、１〜５００、好まし
くは１〜１００(Ｚが抗原の場合)、または１〜３０、さ
らに普通には２〜２０、好ましくは２〜１６ (Ｚが酵素
の場合を表わす）］
【０００９】ｒ が０、n が１である化合物は、式(II)
で表わされる。
で表わされる。
【化１２】 [式中、ψaおよびψa' は、一緒になって、酸素原子(オ
キソ)に対する二重結合、またはψa およびψa'は、そ
れぞれ別個に、オキシ、および水素以外に４〜９個の原
子、通常水素以外に５〜６個の原子を有する脂肪族の基
(ここで、上記原子は炭素および窒素であり、通常炭素
原子数４〜５、および窒素原子数０〜１であり、窒素は
アミノ、好ましくは第３級アミノである) を表わすこと
ができ、Ｚ' はアミノである。]
キソ)に対する二重結合、またはψa およびψa'は、そ
れぞれ別個に、オキシ、および水素以外に４〜９個の原
子、通常水素以外に５〜６個の原子を有する脂肪族の基
(ここで、上記原子は炭素および窒素であり、通常炭素
原子数４〜５、および窒素原子数０〜１であり、窒素は
アミノ、好ましくは第３級アミノである) を表わすこと
ができ、Ｚ' はアミノである。]
【００１０】mが０、r およびn が１であるこれらの化
合物は、一般に式(III)で表わされる。
合物は、一般に式(III)で表わされる。
【化１３】 [式中、ψbおよびψb'は、一緒になって、Ｇで置換され
た炭素原子に対する二重結合(すなわち、ψbおよびψb'
が＝Ｃ−Ｇ) (ここで、Ｇは水素以外に４〜８個の原
子、通常水素以外に５〜６個の原子を有する脂肪族の基
であり、上記原子は炭素および窒素であり、窒素はアミ
ノ、好ましくは第３級アミノである) を形成することが
でき、ここで、Ｇは
た炭素原子に対する二重結合(すなわち、ψbおよびψb'
が＝Ｃ−Ｇ) (ここで、Ｇは水素以外に４〜８個の原
子、通常水素以外に５〜６個の原子を有する脂肪族の基
であり、上記原子は炭素および窒素であり、窒素はアミ
ノ、好ましくは第３級アミノである) を形成することが
でき、ここで、Ｇは
【化１４】 (すなわち、ψおよびψ' が
【化１５】 であってもよく、ここでＪは水素原子、メチル、または
非オキソカルボニル、通常炭素原子数２〜６、好ましく
は３〜４個のアルコキシカルボニルであって、これは炭
素原子３個以上が存在する場合、通常β置換分として、
原子番号１７〜３５のハロゲン原子、通常塩素原子を０
〜３個を含有してもよく、
非オキソカルボニル、通常炭素原子数２〜６、好ましく
は３〜４個のアルコキシカルボニルであって、これは炭
素原子３個以上が存在する場合、通常β置換分として、
原子番号１７〜３５のハロゲン原子、通常塩素原子を０
〜３個を含有してもよく、
【００１１】Ｒ1 は
【化１６】 Ｚ2 は水素、または炭素原子数約１〜６個、好ましくは
炭素原子数１〜３個のアルキルチオである]Ｚ2 が水素
原子であり、Ｒ1 と一緒になってチオールを形成する場
合、化合物は塩、例えば酢酸塩として安定化するができ
る。
炭素原子数１〜３個のアルキルチオである]Ｚ2 が水素
原子であり、Ｒ1 と一緒になってチオールを形成する場
合、化合物は塩、例えば酢酸塩として安定化するができ
る。
【００１２】Ｚがポリ(アミノ酸)である場合、多くの場
合好ましくは化合物は式(IV)で示されるものである。
合好ましくは化合物は式(IV)で示されるものである。
【化１７】 [式中、Ｒ2はＭ(Ｑ)aＴＳＤであり、ここでＤは例えば
【化１８】
【化１９】 または
【化２０】 であることができ、
【００１３】Ｍはアミノ、ＱはＣ＝Ｗ、ここで、Ｗは酸
素原子、イミノ(Ｎ−Ｈ)、または硫黄原子、特に酸素原
子であり、a は０または１、ＴおよびＴ' は炭素原子数
１〜４個、好ましくは炭素原子数１〜２個の連結基であ
り、好ましくは脂肪族、さらに好ましくはアルキレン、
特にメチレンであり、a が０のとき、Ｔは少なくとも二
個の炭素を有するものとし、ＹおよびＹ' は独立して酸
素原子、イミノ(Ｎ−Ｈ)または硫黄、好ましくは酸素で
あり、Ａはイミノ、k は０または１、p は０または１、
好ましくは１、m2は０または１、好ましくは１、n2は少
なくとも１、および通例１より大きく、Ｚ3 が抗原性で
あるとき、n2は一般に少なくとも２であり、平均してＺ
3 の分子量／５００より大きくなく、通常Ｚ3 の分子量
／１０００より大きくなく、好ましくはＺ3 の分子量／
１５００より大きくなく、一般に約２〜５００の広い範
囲の数であり、Ｚ3 が酵素のとき、n2は少なくとも１で
あり、普通３０より大きくなく、さらに一般的には約２
〜２０の間で、好ましくは約２〜１６の間の数であり、
素原子、イミノ(Ｎ−Ｈ)、または硫黄原子、特に酸素原
子であり、a は０または１、ＴおよびＴ' は炭素原子数
１〜４個、好ましくは炭素原子数１〜２個の連結基であ
り、好ましくは脂肪族、さらに好ましくはアルキレン、
特にメチレンであり、a が０のとき、Ｔは少なくとも二
個の炭素を有するものとし、ＹおよびＹ' は独立して酸
素原子、イミノ(Ｎ−Ｈ)または硫黄、好ましくは酸素で
あり、Ａはイミノ、k は０または１、p は０または１、
好ましくは１、m2は０または１、好ましくは１、n2は少
なくとも１、および通例１より大きく、Ｚ3 が抗原性で
あるとき、n2は一般に少なくとも２であり、平均してＺ
3 の分子量／５００より大きくなく、通常Ｚ3 の分子量
／１０００より大きくなく、好ましくはＺ3 の分子量／
１５００より大きくなく、一般に約２〜５００の広い範
囲の数であり、Ｚ3 が酵素のとき、n2は少なくとも１で
あり、普通３０より大きくなく、さらに一般的には約２
〜２０の間で、好ましくは約２〜１６の間の数であり、
【００１４】Ｚ3 はポリ(アミノ酸)であり、その分子量
は約５０００から分子量の上限はないが、通常１０００
０より少なくなく、約６５００００よりも大きくない数
である] 分子量の範囲は、通常抗原または酵素の何れが
関係するかによって異なり、抗原の場合約５０００〜１
０7、 通常約２００００〜６５００００、さらに普通に
は約２５０００〜２５００００の分子量であり、酵素の
場合一般に約１００００〜６０００００、さらに普通に
は１００００〜３０００００の分子量である。通常コン
ジュゲート基は分子量５０００００につき少なくとも約
１個、さらに普通には分子量５００００につき少なくと
も１個存在する。中間分子量の抗原(３５０００〜１０
０００００)の場合、コンジュゲート基の数は通常約２
〜２５０であり、さらに一般的には１０〜１００であ
る。低分子量の抗原(３５０００以下)については、コン
ジュゲート基の数は一般的に約２〜１０の範囲にあり、
通常２〜５の間である。］
は約５０００から分子量の上限はないが、通常１０００
０より少なくなく、約６５００００よりも大きくない数
である] 分子量の範囲は、通常抗原または酵素の何れが
関係するかによって異なり、抗原の場合約５０００〜１
０7、 通常約２００００〜６５００００、さらに普通に
は約２５０００〜２５００００の分子量であり、酵素の
場合一般に約１００００〜６０００００、さらに普通に
は１００００〜３０００００の分子量である。通常コン
ジュゲート基は分子量５０００００につき少なくとも約
１個、さらに普通には分子量５００００につき少なくと
も１個存在する。中間分子量の抗原(３５０００〜１０
０００００)の場合、コンジュゲート基の数は通常約２
〜２５０であり、さらに一般的には１０〜１００であ
る。低分子量の抗原(３５０００以下)については、コン
ジュゲート基の数は一般的に約２〜１０の範囲にあり、
通常２〜５の間である。］
【００１５】この発明の好ましい化合物は下式で示され
る。
る。
【化２１】 ［式中、p、m2、およびn は前記の意味、ＰＡＡは前に
定義したポリ(アミノ酸)を表わす]
定義したポリ(アミノ酸)を表わす]
【００１６】種々のタイプの蛋白質をポリ(アミノ酸)と
しての抗原性物質として使用することができる。これら
のタイプには、アルブミン、血清蛋白質、例えばグロブ
リン、眼球レンズ蛋白質、リポプロティン等を含む。蛋
白質の具体例としては、うし血清アルブミン、ひざらが
い(Ｋeyhole Ｌimpet)ヘモシアニン、卵オボアルブミ
ン、うしγ−グロブリン等がある。また、これらの代り
に、合成ポリ(アミノ酸)であって利用できるアミノ基、
例えばリジンを充分な数だけもつものを製造できる。酵
素は、結果について望まれる速度およびノルトリプチリ
ンを測定すべき生理学的流体に応じて広範囲に変えるこ
とができる。酵素の選択をＩＵＢ(国際生化学連合)の分
類に基づいて述べると、主として、クラス１のオキシド
レダクターゼおよびクラス３のヒドラーゼである。特に
クラス１において興味のある酵素は、クラス１.１のデ
ヒドロゲナーゼ、さらにはクラス１.１.１、１.１.３お
よび１.１.９９のもの、およびクラス１.１１のペルオ
キシダーゼである。ヒドロラーゼでは、特にクラス３.
１のもの、さらに３.１.３のもの、およびクラス３.２
のもの、さらに３.２.１のものである。
しての抗原性物質として使用することができる。これら
のタイプには、アルブミン、血清蛋白質、例えばグロブ
リン、眼球レンズ蛋白質、リポプロティン等を含む。蛋
白質の具体例としては、うし血清アルブミン、ひざらが
い(Ｋeyhole Ｌimpet)ヘモシアニン、卵オボアルブミ
ン、うしγ−グロブリン等がある。また、これらの代り
に、合成ポリ(アミノ酸)であって利用できるアミノ基、
例えばリジンを充分な数だけもつものを製造できる。酵
素は、結果について望まれる速度およびノルトリプチリ
ンを測定すべき生理学的流体に応じて広範囲に変えるこ
とができる。酵素の選択をＩＵＢ(国際生化学連合)の分
類に基づいて述べると、主として、クラス１のオキシド
レダクターゼおよびクラス３のヒドラーゼである。特に
クラス１において興味のある酵素は、クラス１.１のデ
ヒドロゲナーゼ、さらにはクラス１.１.１、１.１.３お
よび１.１.９９のもの、およびクラス１.１１のペルオ
キシダーゼである。ヒドロラーゼでは、特にクラス３.
１のもの、さらに３.１.３のもの、およびクラス３.２
のもの、さらに３.２.１のものである。
【００１７】デヒドロゲナーゼの例には、リンゴ酸デヒ
ドロゲナーゼ、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナー
ゼ、および乳酸デヒドロゲナーゼが含まれる。オキシダ
ーゼの例は、グルコースオキシダーゼである。ペルオキ
シダーゼの例は、西洋わさび(horseradish) ペルオキシ
ダーゼである。ヒドロラーゼの例は、アルカリ性ホスフ
ァターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ダルコシダーゼ
およびリソチームである。特に好ましいのは、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤ)またはそのホス
フェート(ＮＡＤＰ)、 特に前者をコファクターとする
ものである。最も好ましい酵素は、グルコース−６−燐
酸デヒドロゲナーゼである。
ドロゲナーゼ、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナー
ゼ、および乳酸デヒドロゲナーゼが含まれる。オキシダ
ーゼの例は、グルコースオキシダーゼである。ペルオキ
シダーゼの例は、西洋わさび(horseradish) ペルオキシ
ダーゼである。ヒドロラーゼの例は、アルカリ性ホスフ
ァターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ダルコシダーゼ
およびリソチームである。特に好ましいのは、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤ)またはそのホス
フェート(ＮＡＤＰ)、 特に前者をコファクターとする
ものである。最も好ましい酵素は、グルコース−６−燐
酸デヒドロゲナーゼである。
【００１８】コンジュゲート酵素は、抗(ノルトリプチ
リン)で飽和されたとき少なくとも４０％、通常少なく
とも約６０％阻害されているのが望ましく、一方、コン
ジュゲートの不活性化は天然品の８０％以下、好ましく
は６０％以下である。
リン)で飽和されたとき少なくとも４０％、通常少なく
とも約６０％阻害されているのが望ましく、一方、コン
ジュゲートの不活性化は天然品の８０％以下、好ましく
は６０％以下である。
【００１９】この発明の化合物は、下記の方法により製
造される。方法は、式(XV)
造される。方法は、式(XV)
【化２２】 の化合物で始まり、この化合物を還元して式(XVI)
【化２３】 (式中、ψおよびψ'は前記の意味）を得る。還元は当技
術で公知の方法によって行なう。適当な方法は、例えば
接触水素化または亜ジチオナイトとの反応である。
術で公知の方法によって行なう。適当な方法は、例えば
接触水素化または亜ジチオナイトとの反応である。
【００２０】次いで、ψおよびψ’ が一緒になって酸
素原子に対する二重結合(オキソ)を形成する化合物(XV
I)を、グリニヤール試薬と反応させて、式(XVI) におい
てψおよびψ' がそれぞれ別個にオキシ (通常ヒドロキ
シ) および水素以外に４〜８個の原子を有する脂肪族の
基 (上記原子は炭素および窒素であり、窒素はアミノで
ある) の化合物を得る。グリニヤール反応は、当業界で
公知の適当な方法にしたがって行なう。例えば、グリニ
ヤール試薬Ｘ−Ｍg−Ｇ' [ここで、Ｘは原子番号１７〜
３５のハロゲン(好ましくは塩素または臭素)、Ｇ' は水
素以外に４〜８個(通常５〜６個)の原子を有する脂肪族
の基 (この原子は炭素および窒素であり、窒素はアミ
ノ、好ましくは第３級アミノであって、基は通常３−ジ
メチルアミノプロピルである)]を用いる。
素原子に対する二重結合(オキソ)を形成する化合物(XV
I)を、グリニヤール試薬と反応させて、式(XVI) におい
てψおよびψ' がそれぞれ別個にオキシ (通常ヒドロキ
シ) および水素以外に４〜８個の原子を有する脂肪族の
基 (上記原子は炭素および窒素であり、窒素はアミノで
ある) の化合物を得る。グリニヤール反応は、当業界で
公知の適当な方法にしたがって行なう。例えば、グリニ
ヤール試薬Ｘ−Ｍg−Ｇ' [ここで、Ｘは原子番号１７〜
３５のハロゲン(好ましくは塩素または臭素)、Ｇ' は水
素以外に４〜８個(通常５〜６個)の原子を有する脂肪族
の基 (この原子は炭素および窒素であり、窒素はアミ
ノ、好ましくは第３級アミノであって、基は通常３−ジ
メチルアミノプロピルである)]を用いる。
【００２１】次に、上記化合物を脱水して、式(XVI) に
おいてψおよびψ' が一緒になってＧで置換された炭素
原子に対する二重結合(すなわち、ψおよびψ'が＝ＣＨ
−Ｇ) [ここで、Ｇは水素以外に４〜８個の原子を有す
る脂肪族の基 (上記原子は炭素および窒素であり、窒素
はアミノである)]を形成する化合物を得る。脱水は常法
により行なう。適当な脱水剤としては、例えばパラトル
エンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸が含まれる。上
記の工程により、式(I)においてψおよびψ'が前記の意
味であり、r およびmが０、n が１、Ｚがアミノの化合
物が得られる。
おいてψおよびψ' が一緒になってＧで置換された炭素
原子に対する二重結合(すなわち、ψおよびψ'が＝ＣＨ
−Ｇ) [ここで、Ｇは水素以外に４〜８個の原子を有す
る脂肪族の基 (上記原子は炭素および窒素であり、窒素
はアミノである)]を形成する化合物を得る。脱水は常法
により行なう。適当な脱水剤としては、例えばパラトル
エンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸が含まれる。上
記の工程により、式(I)においてψおよびψ'が前記の意
味であり、r およびmが０、n が１、Ｚがアミノの化合
物が得られる。
【００２２】式(XVI)の化合物を、さらに反応性誘導体
【化２４】 [ここで、Ｒ、Ｙおよびmは前記の意味、Ｚ"は水素原
子、または炭素原子数１〜６のアルコキシ(その硫黄類
似体を含む)である]で処理して、式(Ｉ')においてψお
よびψ'、Ｒ、Ｙ並びにmは前記の意味であり、r が１、
n が１、Ｚが水素原子、または炭素原子数１〜６のアル
コキシ (その硫黄類似体を含む) の化合物を得る。この
工程の適当な反応条件は当業界で公知である。反応性誘
導体は、活性エステルのような適当な活性基、例えば非
オキソカルボニルを活性化してアミノ基と結合させるエ
ステル基、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル
により、アミノ基に結合される。
子、または炭素原子数１〜６のアルコキシ(その硫黄類
似体を含む)である]で処理して、式(Ｉ')においてψお
よびψ'、Ｒ、Ｙ並びにmは前記の意味であり、r が１、
n が１、Ｚが水素原子、または炭素原子数１〜６のアル
コキシ (その硫黄類似体を含む) の化合物を得る。この
工程の適当な反応条件は当業界で公知である。反応性誘
導体は、活性エステルのような適当な活性基、例えば非
オキソカルボニルを活性化してアミノ基と結合させるエ
ステル基、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル
により、アミノ基に結合される。
【００２３】次いで、この発明のコンジュゲートを、式
(I')の化合物とポリ(アミノ酸)のカップリングにより作
る。適当な活性化ポリ(アミノ酸)に対するコンジュゲー
ト化(抱合)は、当業界で公知の方法、例えば(I')のスル
フヒドリル基におけるカップリングにより行なう。ポリ
(アミノ酸)の活性化もまた、常法により、例えばハロゲ
ン原子またはオレフイン結合の存在を利用して行なう。
式(XVI)においてψおよびψ'が一緒になって酸素原子に
対する二重結合(オキソ)を形成する中間体は、３−ニト
ロベンゾスベロンであり、公知化合物ジベンゾスベロン
をニトロ化することにより製造される。３−ニトロベン
ゾスベロンは、グリニヤール試薬(好適には前記のもの)
と反応させることにより、式(XV)においてψおよびψ'
がそれぞれ別個のオキシ(通常ヒドロキシ)および水素以
外に４〜８個の原子を有する脂肪族の基 (上記原子は炭
素および窒素であり、窒素はアミノである)である化合
物に変換する。生成する化合物は、次いで(前記のよう
に)脱水して、式(XV)においてψおよびψ' が一緒にな
ってＧで置換された炭素原子に対する二重結合(すなわ
ち、ψおよびψ'が＝ＣＨ−Ｇ) [ここで、Ｇは水素以外
に４〜８個の原子を有する脂肪族の基 (上記原子は炭素
および窒素であり、窒素はアミノである)]を得る。前記
のように、これら式(XV)の化合物は、何れも(前記のよ
うな方法による) ニトロ基からアミノ基への還元により
式(XVI) の化合物に変換することができる。
(I')の化合物とポリ(アミノ酸)のカップリングにより作
る。適当な活性化ポリ(アミノ酸)に対するコンジュゲー
ト化(抱合)は、当業界で公知の方法、例えば(I')のスル
フヒドリル基におけるカップリングにより行なう。ポリ
(アミノ酸)の活性化もまた、常法により、例えばハロゲ
ン原子またはオレフイン結合の存在を利用して行なう。
式(XVI)においてψおよびψ'が一緒になって酸素原子に
対する二重結合(オキソ)を形成する中間体は、３−ニト
ロベンゾスベロンであり、公知化合物ジベンゾスベロン
をニトロ化することにより製造される。３−ニトロベン
ゾスベロンは、グリニヤール試薬(好適には前記のもの)
と反応させることにより、式(XV)においてψおよびψ'
がそれぞれ別個のオキシ(通常ヒドロキシ)および水素以
外に４〜８個の原子を有する脂肪族の基 (上記原子は炭
素および窒素であり、窒素はアミノである)である化合
物に変換する。生成する化合物は、次いで(前記のよう
に)脱水して、式(XV)においてψおよびψ' が一緒にな
ってＧで置換された炭素原子に対する二重結合(すなわ
ち、ψおよびψ'が＝ＣＨ−Ｇ) [ここで、Ｇは水素以外
に４〜８個の原子を有する脂肪族の基 (上記原子は炭素
および窒素であり、窒素はアミノである)]を得る。前記
のように、これら式(XV)の化合物は、何れも(前記のよ
うな方法による) ニトロ基からアミノ基への還元により
式(XVI) の化合物に変換することができる。
【００２４】この発明の化合物の合成経路を下記反応式
で示すが、これは説明のためのものであって限定するも
のではない。
で示すが、これは説明のためのものであって限定するも
のではない。
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【００２６】a) 例えば無水酢酸のような無水媒質中、
例えばＨＮＯ3 のようなニトロ化剤による b) Ｈ2 および触媒 c) 亜ジチオン酸金属、通常亜ジチオン酸ナトリウム d) Ｘ−Ｍg−Ｇ' [ここで、Ｘは原子番号１７〜３５の
ハロゲン(好ましくは塩素または臭素)、は水素以外に４
〜８個(通常５〜６個)の原子を有する脂肪族の基 (この
原子は炭素および窒素であり、窒素はアミノ、好ましく
は第３級アミノであり、通常３−ジメチルアミノプロピ
ルである)] e) 例えばパラトルエンスルホン酸またはトリフルオロ
酢酸のような脱水剤 f) Ｌ(Ｑ)aＦ1[ここで、Ｑおよびaは前記の意味、Ｌは
非オキソカルボニルをアミノ基に結合するエステル性活
性基 (好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル)、
Ｆ1は鎖中に水素以外に４〜１０個の原子を有する基
(この原子は炭素および硫黄であり、少なくとも１個の
炭素は非オキソカルボニルに結合し、硫黄はジチオエー
テルであり、通常Ｆ1はＴ−Ｓ−Ｓ−ＣＨ3 であって、
Ｔは前記の意味であり、好ましくはＦ1はＣＨ2−Ｓ
−Ｓ−ＣＨ3である)] g) Ｘ−Ｊ1(ここで、Ｘは前記の意味、Ｊ1はＪと同じ
意味。但しＪ＝水素原子を除く) h) 還元剤、通常原子番号２２〜３０の金属、好ましく
は亜鉛、および酸、通常酢酸 i)
例えばＨＮＯ3 のようなニトロ化剤による b) Ｈ2 および触媒 c) 亜ジチオン酸金属、通常亜ジチオン酸ナトリウム d) Ｘ−Ｍg−Ｇ' [ここで、Ｘは原子番号１７〜３５の
ハロゲン(好ましくは塩素または臭素)、は水素以外に４
〜８個(通常５〜６個)の原子を有する脂肪族の基 (この
原子は炭素および窒素であり、窒素はアミノ、好ましく
は第３級アミノであり、通常３−ジメチルアミノプロピ
ルである)] e) 例えばパラトルエンスルホン酸またはトリフルオロ
酢酸のような脱水剤 f) Ｌ(Ｑ)aＦ1[ここで、Ｑおよびaは前記の意味、Ｌは
非オキソカルボニルをアミノ基に結合するエステル性活
性基 (好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル)、
Ｆ1は鎖中に水素以外に４〜１０個の原子を有する基
(この原子は炭素および硫黄であり、少なくとも１個の
炭素は非オキソカルボニルに結合し、硫黄はジチオエー
テルであり、通常Ｆ1はＴ−Ｓ−Ｓ−ＣＨ3 であって、
Ｔは前記の意味であり、好ましくはＦ1はＣＨ2−Ｓ
−Ｓ−ＣＨ3である)] g) Ｘ−Ｊ1(ここで、Ｘは前記の意味、Ｊ1はＪと同じ
意味。但しＪ＝水素原子を除く) h) 還元剤、通常原子番号２２〜３０の金属、好ましく
は亜鉛、および酸、通常酢酸 i)
【化２８】 (ここで、Ｘ、Ｙ1、Ａ、k、Ｔ'、p、ＹおよびＺ3 は前
記の意味)
記の意味)
【００２７】この発明の化合物の製造に際しては、ジベ
ンゾスベロン(VI)を、好ましくは当量のニトロ化剤で処
理して、３−ニトロジベンゾスベロン(VII) を得る。化
合物(VII) の還元は、接触水素化または亜ジチオン酸
(塩)により行ない、化合物(VIII)を得る。化合物(VIII)
とグリニヤール試薬の反応により化合物(IX)を得、これ
を脱水して化合物(Ｘ)とする。化合物(XI)は、化合物
(Ｘ)と、アミノ基に結合する活性エステルを混合するこ
とにより得られる。化合物(XI)を緩和なアルカリ性条件
下で脱メチルして化合物(XII) とし、これを還元して第
２級アミン(XIII)を得る。化合物(XIII)のポリ(アミノ
酸)コンジュゲート(XIV)は、化合物(XIII)と、そのスル
フヒドリル基に結合する適当な活性化ポリ(アミノ酸)コ
ンジュゲート、例えばハロゲン原子またはオレフィン結
合により活性化されたものを結合させることにより製造
される。
ンゾスベロン(VI)を、好ましくは当量のニトロ化剤で処
理して、３−ニトロジベンゾスベロン(VII) を得る。化
合物(VII) の還元は、接触水素化または亜ジチオン酸
(塩)により行ない、化合物(VIII)を得る。化合物(VIII)
とグリニヤール試薬の反応により化合物(IX)を得、これ
を脱水して化合物(Ｘ)とする。化合物(XI)は、化合物
(Ｘ)と、アミノ基に結合する活性エステルを混合するこ
とにより得られる。化合物(XI)を緩和なアルカリ性条件
下で脱メチルして化合物(XII) とし、これを還元して第
２級アミン(XIII)を得る。化合物(XIII)のポリ(アミノ
酸)コンジュゲート(XIV)は、化合物(XIII)と、そのスル
フヒドリル基に結合する適当な活性化ポリ(アミノ酸)コ
ンジュゲート、例えばハロゲン原子またはオレフィン結
合により活性化されたものを結合させることにより製造
される。
【００２８】上記方法を用いると、ノルトリプチリンと
抗原性または酵素性ポリ(アミノ酸）とのコンジュゲー
トを製造することができる。合成後にノルトリプチリン
の構造が存在し、近縁化合物との区別をもたらす上記構
造要素の存在により、ノルトリプチリンを類似構造の化
合物から識別できる抗体の産生が可能となる。抗原性化
合物は、抗体製造の常法にしたがって、広範囲の脊椎動
物に注射することができる。通常動物から定期的に採血
し、後続採血は力価および特異性の向上を示すが、最高
値に達した後力価と特異性が減少する。この発明により
製造した抗体は、上記ノルトリプチリンに特異的な抗原
性および酵素性コンジュゲートと結合する能力を有し、
アミトリプチリンおよびイミプラミンのようなノルトリ
プチリン近縁化合物および代謝物から識別することがで
きる。
抗原性または酵素性ポリ(アミノ酸）とのコンジュゲー
トを製造することができる。合成後にノルトリプチリン
の構造が存在し、近縁化合物との区別をもたらす上記構
造要素の存在により、ノルトリプチリンを類似構造の化
合物から識別できる抗体の産生が可能となる。抗原性化
合物は、抗体製造の常法にしたがって、広範囲の脊椎動
物に注射することができる。通常動物から定期的に採血
し、後続採血は力価および特異性の向上を示すが、最高
値に達した後力価と特異性が減少する。この発明により
製造した抗体は、上記ノルトリプチリンに特異的な抗原
性および酵素性コンジュゲートと結合する能力を有し、
アミトリプチリンおよびイミプラミンのようなノルトリ
プチリン近縁化合物および代謝物から識別することがで
きる。
【００２９】前述のように、この発明により製造した抗
体および酵素試薬は、ノルトリプチリン定量用イムノア
ッセイに用いるに特に適する。ホモジニアス酵素イムノ
アッセイとしての上記イムノアッセイの実施法は、米国
特許第３８１７８３７号に記載されている。この方法
は、酵素コンジュゲート、（例えばクロマトグラフィー
分離により代謝物除去処理した) ノルトリプチリンの含
有が疑われる未知試料、およびノルトリプチリンの抗体
を、水性緩衝媒質中、約１０〜５０℃、通常約２０〜４
０℃の温度範囲で混合し、その酵素活性を既知量のノル
トリプチリンを含むアッセイ媒質の酵素活性と比較定量
することを含むものである。
体および酵素試薬は、ノルトリプチリン定量用イムノア
ッセイに用いるに特に適する。ホモジニアス酵素イムノ
アッセイとしての上記イムノアッセイの実施法は、米国
特許第３８１７８３７号に記載されている。この方法
は、酵素コンジュゲート、（例えばクロマトグラフィー
分離により代謝物除去処理した) ノルトリプチリンの含
有が疑われる未知試料、およびノルトリプチリンの抗体
を、水性緩衝媒質中、約１０〜５０℃、通常約２０〜４
０℃の温度範囲で混合し、その酵素活性を既知量のノル
トリプチリンを含むアッセイ媒質の酵素活性と比較定量
することを含むものである。
【００３０】
【実施例】以下に示す実施例は、この発明を説明するも
のであって、これを限定するものではない。温度は特記
しない限りセ氏で示す。液体の部および％は容量で示
し、他は重量で示す。下記の略号を用いる。 tlc…薄層クロマトグラフィー ＧＦ…ゲル瀘過 ＩＲ…赤外線吸収スペクトル ＣＤＣl3 …重クロロホルム Ｐmr…プロトン磁気共鳴スペクトル ＭＨz …メガヘルツ ＴＭＳ…トリメチルシラン ＭＳ…質量スペクトル h …時間 ＮＨＳ…Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ＤＭＦ…ジメチルホルムアミド ＥＤＣＩ…１−エチル−３−( ３−ジメチルアミノプロ
ピル) カルボジイミド塩酸塩 ＢＳＡ…うし血清アルブミン ＲＳＡ…家兎血清アルブミン ＢgＧ …うしガンマグロブリン Ｇ−６−ＰＤＨ…グルコース−６−燐酸デヒドロゲナー
ゼ Ｇ−６−ＰＮa …グルコース−６−燐酸ナトリウム塩 ＢＬＧ…ベータラクトグロブリン
のであって、これを限定するものではない。温度は特記
しない限りセ氏で示す。液体の部および％は容量で示
し、他は重量で示す。下記の略号を用いる。 tlc…薄層クロマトグラフィー ＧＦ…ゲル瀘過 ＩＲ…赤外線吸収スペクトル ＣＤＣl3 …重クロロホルム Ｐmr…プロトン磁気共鳴スペクトル ＭＨz …メガヘルツ ＴＭＳ…トリメチルシラン ＭＳ…質量スペクトル h …時間 ＮＨＳ…Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ＤＭＦ…ジメチルホルムアミド ＥＤＣＩ…１−エチル−３−( ３−ジメチルアミノプロ
ピル) カルボジイミド塩酸塩 ＢＳＡ…うし血清アルブミン ＲＳＡ…家兎血清アルブミン ＢgＧ …うしガンマグロブリン Ｇ−６−ＰＤＨ…グルコース−６−燐酸デヒドロゲナー
ゼ Ｇ−６−ＰＮa …グルコース−６−燐酸ナトリウム塩 ＢＬＧ…ベータラクトグロブリン
【００３１】実施例１ ３−ニトロジベンゾスベロンの製造 白色発煙硝酸(９０％、６.１ml、０.１３モル)に無水酢
酸(１５ ml)を室温で徐々に加えた。得られた温溶液(３
０°)を２５°に冷却し、ジベンゾスベロン (２０.８g
、０.１モル、アルドリッチ・ケミカル社製) と無水酢
酸２５ mlの溶液に３時間内に滴下した。添加後少量を
とり、水に入れ、ジクロロメタンに分配した。 tlcは３
−ニトロジベンゾスベロン、移動性の高い物質および出
発原料の存在を示した。次いで、反応混合物を氷水２リ
ットルに加え、油状生成物を３０分間攪拌した。生成す
る水層を傾斜して捨て、底の油状残渣をジクロロメタン
に溶かし、飽和重炭酸水素ナトリウム溶液および食塩水
で洗浄した。有機層をＭgＳＯ4で乾燥し、濃縮して淡黄
色油状物を得、これを温エーテルに溶かし、ヘキサンを
濁るまで加えて結晶化した。得られる澄明溶液を一夜冷
却(０℃)して淡黄色固体の３−ニトロジベンゾスベロン
６.５g (収率２６％)を得た。本品の tlcは主生成物と
微量の不純物を示した。本品は精製せずに用いた。元素
分析 : Ｃ15Ｈ11ＮＯ3 計算値 Ｃ７１.１５、Ｈ４.３５、Ｎ５.５３ 実測値
Ｃ６９.４２、Ｈ４.３４、Ｎ５.８５
酸(１５ ml)を室温で徐々に加えた。得られた温溶液(３
０°)を２５°に冷却し、ジベンゾスベロン (２０.８g
、０.１モル、アルドリッチ・ケミカル社製) と無水酢
酸２５ mlの溶液に３時間内に滴下した。添加後少量を
とり、水に入れ、ジクロロメタンに分配した。 tlcは３
−ニトロジベンゾスベロン、移動性の高い物質および出
発原料の存在を示した。次いで、反応混合物を氷水２リ
ットルに加え、油状生成物を３０分間攪拌した。生成す
る水層を傾斜して捨て、底の油状残渣をジクロロメタン
に溶かし、飽和重炭酸水素ナトリウム溶液および食塩水
で洗浄した。有機層をＭgＳＯ4で乾燥し、濃縮して淡黄
色油状物を得、これを温エーテルに溶かし、ヘキサンを
濁るまで加えて結晶化した。得られる澄明溶液を一夜冷
却(０℃)して淡黄色固体の３−ニトロジベンゾスベロン
６.５g (収率２６％)を得た。本品の tlcは主生成物と
微量の不純物を示した。本品は精製せずに用いた。元素
分析 : Ｃ15Ｈ11ＮＯ3 計算値 Ｃ７１.１５、Ｈ４.３５、Ｎ５.５３ 実測値
Ｃ６９.４２、Ｈ４.３４、Ｎ５.８５
【００３２】実施例２ ３−アミノジベンゾスベロンの製造 テトラヒドロフラン(８００ ml)、イソプロパノール
(８００ ml) およびりん酸緩衝液 [ pＨ６.５、１.６リ
ットル。１３.６g のＫＨ2ＰＯ4 (０.１モル)と２７.８
mlの１Ｎ−ＮaＯＨを混合し、生成した溶液を２リット
ルに希釈することにより製造] の混合液と実施例１で得
られた３−ニトロジベンゾスベロン (２７.２g 、０.１
０７モル) からなるけんだく液に、亜ジチオン酸ナトリ
ウム (２２０g 、イーストマン・オーガニック・ケミカ
ルズ製) を５分間にわたり加えた。固体は可溶性にな
り、１５分後 tlc は反応完結を示した。次いで、得ら
れる澄明溶液を酢酸エチルで完全に抽出し、有機層を飽
和ＮaＣl 溶液で洗浄し、Ｎa2ＳＯ4 で乾燥した。溶媒
を濃縮して得られた黄色粗生成物をシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーに付し、 エーテル／ヘキサン１ : で
溶解して、純酔な黄色３−アミノジベンゾスベロン８.
７g ( 収率３６％)を得た。
(８００ ml) およびりん酸緩衝液 [ pＨ６.５、１.６リ
ットル。１３.６g のＫＨ2ＰＯ4 (０.１モル)と２７.８
mlの１Ｎ−ＮaＯＨを混合し、生成した溶液を２リット
ルに希釈することにより製造] の混合液と実施例１で得
られた３−ニトロジベンゾスベロン (２７.２g 、０.１
０７モル) からなるけんだく液に、亜ジチオン酸ナトリ
ウム (２２０g 、イーストマン・オーガニック・ケミカ
ルズ製) を５分間にわたり加えた。固体は可溶性にな
り、１５分後 tlc は反応完結を示した。次いで、得ら
れる澄明溶液を酢酸エチルで完全に抽出し、有機層を飽
和ＮaＣl 溶液で洗浄し、Ｎa2ＳＯ4 で乾燥した。溶媒
を濃縮して得られた黄色粗生成物をシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーに付し、 エーテル／ヘキサン１ : で
溶解して、純酔な黄色３−アミノジベンゾスベロン８.
７g ( 収率３６％)を得た。
【００３３】実施例３ ３−アミノ−５−( ３−ジメチルアミノプロピル) −５
−ヒドロキシ−１０,１１−ジヒドロジベンゾ [ b , e
] シクロヘプタトリエンの製造 a ．Ｎ, Ｎ−ジメチルプロピルクロライドの製造 約１００ mlの水に溶かしたＮ, Ｎ−ジメチルプロピル
クロライド塩酸塩(１００g 、アルドリッチ・ケミカル
社製) 溶液に pＨ約１１〜１２となるまで１０％ＮaＯ
Ｈ を加えてアルカリ性にした。次いで、生成する二層
溶液をエーテルで抽出し、エーテル抽出物をＭgＳＯ4で
乾燥した。１気圧下簡単な蒸留装置を用いてエーテルを
蒸留し、生成する液体を４５°(圧力６０ mmＨg)で蒸留
してＮ,Ｎ−ジメチルプロピルクロライドの無色液体54.
5g を得た。
−ヒドロキシ−１０,１１−ジヒドロジベンゾ [ b , e
] シクロヘプタトリエンの製造 a ．Ｎ, Ｎ−ジメチルプロピルクロライドの製造 約１００ mlの水に溶かしたＮ, Ｎ−ジメチルプロピル
クロライド塩酸塩(１００g 、アルドリッチ・ケミカル
社製) 溶液に pＨ約１１〜１２となるまで１０％ＮaＯ
Ｈ を加えてアルカリ性にした。次いで、生成する二層
溶液をエーテルで抽出し、エーテル抽出物をＭgＳＯ4で
乾燥した。１気圧下簡単な蒸留装置を用いてエーテルを
蒸留し、生成する液体を４５°(圧力６０ mmＨg)で蒸留
してＮ,Ｎ−ジメチルプロピルクロライドの無色液体54.
5g を得た。
【００３４】b ．グリニヤール反応 :１, ２−ジブロモ
エタン (ジエイ・ティー・ベイカー・ケミカル社) 数滴
を、テトラヒドロフラン(５３ml、乾燥し、ベンゾフェ
ノンのナトリウム塩で新たに蒸留) 中のマグネシウム屑
(１３g 、０.５４モル)に窒素気流下加えた。この屑を
ガラス製ロッドを用いて粉砕し、気体の放出を認めた
後、Ｎ, Ｎ−ジメチルプロピルクロライド( 32.3g 、
０.２７モル)とテトラヒドロフラン (１５０ml)からな
る溶液を滴下した。この滴下をしている間溶液を十分に
加熱して穏やかな還流を維持した。還流下１時間攪拌
後、褐色の反応混合物を室温になるまで冷却し、乾燥テ
トラヒドロフラン ( ２２０ml)に溶かした実施例２で得
られた３−アミノジベンゾスベロン (１２.４g 、０.０
５６モル) を加えた。生成する褐色生成物を半時間室温
で攪拌しておき、飽和塩化アンモニウム (２００ml)を
用いて注意深く冷却した。生成する黄色残留物を酢酸エ
チルで抽出した。有機相を飽和ＮaＮＣＯ3 および食塩
水で洗浄し、乾燥し (Ｎa2ＳＯ4)、濃縮して３−アミノ
−５−( ３−ジメチルアミノプロピル) −５−ヒドロキ
シ−１０, １１−ジヒドロジベンゾ[ b , e ] シクロヘ
プタトリエンの黄色油状物(１７.２g)を得た。
エタン (ジエイ・ティー・ベイカー・ケミカル社) 数滴
を、テトラヒドロフラン(５３ml、乾燥し、ベンゾフェ
ノンのナトリウム塩で新たに蒸留) 中のマグネシウム屑
(１３g 、０.５４モル)に窒素気流下加えた。この屑を
ガラス製ロッドを用いて粉砕し、気体の放出を認めた
後、Ｎ, Ｎ−ジメチルプロピルクロライド( 32.3g 、
０.２７モル)とテトラヒドロフラン (１５０ml)からな
る溶液を滴下した。この滴下をしている間溶液を十分に
加熱して穏やかな還流を維持した。還流下１時間攪拌
後、褐色の反応混合物を室温になるまで冷却し、乾燥テ
トラヒドロフラン ( ２２０ml)に溶かした実施例２で得
られた３−アミノジベンゾスベロン (１２.４g 、０.０
５６モル) を加えた。生成する褐色生成物を半時間室温
で攪拌しておき、飽和塩化アンモニウム (２００ml)を
用いて注意深く冷却した。生成する黄色残留物を酢酸エ
チルで抽出した。有機相を飽和ＮaＮＣＯ3 および食塩
水で洗浄し、乾燥し (Ｎa2ＳＯ4)、濃縮して３−アミノ
−５−( ３−ジメチルアミノプロピル) −５−ヒドロキ
シ−１０, １１−ジヒドロジベンゾ[ b , e ] シクロヘ
プタトリエンの黄色油状物(１７.２g)を得た。
【００３５】実施例４ ３−アミノアミトリプチリンの製造 トリフルオロ酢酸(２９.６ml、０.１７５モル)を、実施
例３で得られた３−アミノ−５−( ３−ジメチルアミノ
プロピル)−５−ヒドロキシ−10,１１−ジヒドロジベン
ゾ[ b , e ] シクロヘプタトリエン(１７.１g 、０.０
５５モル)とジクロロメタン(３００ ml)からなる溶液に
加えた。生成する暗褐色の溶液を１８時間還流した。少
量の反応混合物の tlc は反応がまだ完結していないこ
とを示した。したがって、p −トルエンスルホン酸一水
化物(１０.５g 、０.０５５モル)を加えて一夜攪拌し
た。１８時間後反応の完結が認められた。反応生成物を
冷却し、エーテルで希釈し、濃アンモニア(２２ ml)を
用いてアルカリ性とし、次いで、酢酸エチルで抽出し
た。溶媒を濃縮すると、２つの主成分およびより高いＲ
f 値を有する不純物をいくらか含有する泡状生成物が得
られた。プレパラティブＨＰＬＣ (高速液体クロマトグ
ラフィー)[シリカゲルカラム、ＮＨ3 : ＭeＯＨ: ＣＨ2
Ｃl2／０.２４ : ３ : ９７(容量比)]を用いて試料を精
製した。
例３で得られた３−アミノ−５−( ３−ジメチルアミノ
プロピル)−５−ヒドロキシ−10,１１−ジヒドロジベン
ゾ[ b , e ] シクロヘプタトリエン(１７.１g 、０.０
５５モル)とジクロロメタン(３００ ml)からなる溶液に
加えた。生成する暗褐色の溶液を１８時間還流した。少
量の反応混合物の tlc は反応がまだ完結していないこ
とを示した。したがって、p −トルエンスルホン酸一水
化物(１０.５g 、０.０５５モル)を加えて一夜攪拌し
た。１８時間後反応の完結が認められた。反応生成物を
冷却し、エーテルで希釈し、濃アンモニア(２２ ml)を
用いてアルカリ性とし、次いで、酢酸エチルで抽出し
た。溶媒を濃縮すると、２つの主成分およびより高いＲ
f 値を有する不純物をいくらか含有する泡状生成物が得
られた。プレパラティブＨＰＬＣ (高速液体クロマトグ
ラフィー)[シリカゲルカラム、ＮＨ3 : ＭeＯＨ: ＣＨ2
Ｃl2／０.２４ : ３ : ９７(容量比)]を用いて試料を精
製した。
【００３６】フラクションを集め、屈折率および分析 t
lc (シリカゲルプレート、０.０８: １ :７／ＮＨ3: Ｍ
eＯＨ : ＣＨ2Ｃl2 )を用いて分析した。等しいＲf 値
を有するフラクションを合わせて濃縮し、 ６.８g のシ
ス−３−アミノアミトリプチリン(Ｒf ０.０８) および
３.６g のトランス−３−アミノアミトリプチリン(Ｒf
０.１５) を得た。２段階にわたる３−アミノジベンゾ
スベロンからの生成物の全収量は １０.４g (収率６４
％)である。 元素分析 : Ｃ20Ｈ24Ｎ2・１／２ Ｈ2Ｏ 計算値 Ｃ７９.７３、Ｈ８.３１、Ｎ９.３０ 実測値
Ｃ７９.５３、Ｈ７.９９、Ｎ８.８９
lc (シリカゲルプレート、０.０８: １ :７／ＮＨ3: Ｍ
eＯＨ : ＣＨ2Ｃl2 )を用いて分析した。等しいＲf 値
を有するフラクションを合わせて濃縮し、 ６.８g のシ
ス−３−アミノアミトリプチリン(Ｒf ０.０８) および
３.６g のトランス−３−アミノアミトリプチリン(Ｒf
０.１５) を得た。２段階にわたる３−アミノジベンゾ
スベロンからの生成物の全収量は １０.４g (収率６４
％)である。 元素分析 : Ｃ20Ｈ24Ｎ2・１／２ Ｈ2Ｏ 計算値 Ｃ７９.７３、Ｈ８.３１、Ｎ９.３０ 実測値
Ｃ７９.５３、Ｈ７.９９、Ｎ８.８９
【００３７】実施例５ Ｎ'−（メチルジチオアセチル)−３−アミノアミトリプ
チリンの製造 メチルジチオ酢酸のＮＨＳエステル( ２.９g 、１３.８
ミリモル)を、テトラヒドロフラン( ８０ ml、ナトリウ
ムベンゾフェノレートから新たに乾燥蒸留）およびジク
ロロメタン(２０ml、モレキュラーシーブ３Ａ上で乾
燥）の混合物と実施例４で得られたシス−３−アミノア
ミトリプチリン(２.７g 、９.３モル)からなる溶液に加
えた。生成溶液を室温で攪拌し続けた。４日後、 tlc
は反応の完結を示した。生成する淡黄色溶液を回転エバ
ポレータ上で濃縮乾固し、残留物を逆相シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー [シラン化されたシリカゲル６０
を３００g 含有] に付し、３％ＭeＯＨ／ＣＨ2Ｃl2（
１.４リットル)、次いで５％ ＭeＯＨ／ＣＨ2Ｃl2（６
００ml)で溶離した。溶媒を濃縮後、Ｎ'−(メチルジチ
オアセチル)−３−アミノアミトリプチリンを含有する
淡黄色泡状生成物 ４.３g が得られた。生成物を１００
mlのＣＨ2Ｃl2に溶解し、トリエチルアミン１mlを加え
た、有機層を飽和ＮaＣl で洗浄し、Ｎa2ＳＯ4 で乾燥
し、濃縮して、Ｎ'−メチル(ジチオアセチル）−３−ア
ミノアミトリプチリンの泡状生成物 ３.３g（収率８６
％)を得た。
チリンの製造 メチルジチオ酢酸のＮＨＳエステル( ２.９g 、１３.８
ミリモル)を、テトラヒドロフラン( ８０ ml、ナトリウ
ムベンゾフェノレートから新たに乾燥蒸留）およびジク
ロロメタン(２０ml、モレキュラーシーブ３Ａ上で乾
燥）の混合物と実施例４で得られたシス−３−アミノア
ミトリプチリン(２.７g 、９.３モル)からなる溶液に加
えた。生成溶液を室温で攪拌し続けた。４日後、 tlc
は反応の完結を示した。生成する淡黄色溶液を回転エバ
ポレータ上で濃縮乾固し、残留物を逆相シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー [シラン化されたシリカゲル６０
を３００g 含有] に付し、３％ＭeＯＨ／ＣＨ2Ｃl2（
１.４リットル)、次いで５％ ＭeＯＨ／ＣＨ2Ｃl2（６
００ml)で溶離した。溶媒を濃縮後、Ｎ'−(メチルジチ
オアセチル)−３−アミノアミトリプチリンを含有する
淡黄色泡状生成物 ４.３g が得られた。生成物を１００
mlのＣＨ2Ｃl2に溶解し、トリエチルアミン１mlを加え
た、有機層を飽和ＮaＣl で洗浄し、Ｎa2ＳＯ4 で乾燥
し、濃縮して、Ｎ'−メチル(ジチオアセチル）−３−ア
ミノアミトリプチリンの泡状生成物 ３.３g（収率８６
％)を得た。
【００３８】実施例６ Ｎ(β, β, β−トリクロロエトキシカルボニル)−Ｎ−
メチル(ジチオアセチル)−３−アミノノルトリプチリン
の製造 クロロぎ酸トリクロロエチル（９.６ml、７０ミリモ
ル）を室温で窒素雰囲気下、実施例５で得られたＮ'−
（ジチオアセチル)−３−アミノアミトリプチリン(３g
、７ミリモル)とジクロロメタン(１２０ml、モレキュ
ラーシーブ３Ａ上で乾燥)からなる溶液に滴下し、次い
で１５分内にトリエチルアミン(９.７ml、７０ミリモ
ル)を加えた。微温反応混合物を水浴を用いて冷却し、
次に室温で ３.５時間放置した。分析シリカゲルプレー
ト上で観察したところ反応は完結した。生成する黄色溶
液を濃縮乾固した。エーテル(１００ ml)を加えた。生
成した白色沈殿物を濾過し、次いでエーテルで洗浄し
た。エーテル濾液を集めて濃縮して褐色油状物を得、こ
れをシリカゲルクロマトグラフィーに付した。フラクシ
ョンを tlc により分析した。生成物はＵＶ発色団を示
すが不純物はＵＶ吸収をせず、Ｉ2 チャンバー内で展開
するとより高いＲf 値の位置に褐色スポットを示すた
め、ＵＶおよびＩ2 の両者を用いて上記フラクションを
検査した。フラクションを合わせてＮ−( β, β, β−
トリクロロエトキシカルボニル）−３−アミノ−Ｎ'−
(メチルジチオアセチル）ノルトリプチリンを白色泡状
生成物として得た(３.２g 、収率７７％ )。不純物を次
の反応においてメチルジチオアセチル誘導体の還元的開
裂を防げるため、不純物を含有するフラクションは再び
クロマトグラフィーに付すか捨てた。カラムクロマトグ
ラフィー後の試料は、正しい構造を示した。 元素分析 : Ｃ25Ｈ27Ｎ2Ｏ3Ｃl3Ｓ2 計算値 Ｃ５２.３１、Ｈ４.７１、Ｎ４.８８ Ｃ １
８.５７、Ｓ１１.１６ 実測値 Ｃ５２.４１、Ｈ４.８５、Ｎ４.７３ Ｃ １
８.１４、Ｓ１０.８４
メチル(ジチオアセチル)−３−アミノノルトリプチリン
の製造 クロロぎ酸トリクロロエチル（９.６ml、７０ミリモ
ル）を室温で窒素雰囲気下、実施例５で得られたＮ'−
（ジチオアセチル)−３−アミノアミトリプチリン(３g
、７ミリモル)とジクロロメタン(１２０ml、モレキュ
ラーシーブ３Ａ上で乾燥)からなる溶液に滴下し、次い
で１５分内にトリエチルアミン(９.７ml、７０ミリモ
ル)を加えた。微温反応混合物を水浴を用いて冷却し、
次に室温で ３.５時間放置した。分析シリカゲルプレー
ト上で観察したところ反応は完結した。生成する黄色溶
液を濃縮乾固した。エーテル(１００ ml)を加えた。生
成した白色沈殿物を濾過し、次いでエーテルで洗浄し
た。エーテル濾液を集めて濃縮して褐色油状物を得、こ
れをシリカゲルクロマトグラフィーに付した。フラクシ
ョンを tlc により分析した。生成物はＵＶ発色団を示
すが不純物はＵＶ吸収をせず、Ｉ2 チャンバー内で展開
するとより高いＲf 値の位置に褐色スポットを示すた
め、ＵＶおよびＩ2 の両者を用いて上記フラクションを
検査した。フラクションを合わせてＮ−( β, β, β−
トリクロロエトキシカルボニル）−３−アミノ−Ｎ'−
(メチルジチオアセチル）ノルトリプチリンを白色泡状
生成物として得た(３.２g 、収率７７％ )。不純物を次
の反応においてメチルジチオアセチル誘導体の還元的開
裂を防げるため、不純物を含有するフラクションは再び
クロマトグラフィーに付すか捨てた。カラムクロマトグ
ラフィー後の試料は、正しい構造を示した。 元素分析 : Ｃ25Ｈ27Ｎ2Ｏ3Ｃl3Ｓ2 計算値 Ｃ５２.３１、Ｈ４.７１、Ｎ４.８８ Ｃ １
８.５７、Ｓ１１.１６ 実測値 Ｃ５２.４１、Ｈ４.８５、Ｎ４.７３ Ｃ １
８.１４、Ｓ１０.８４
【００３９】実施例７ ３−アミノ−Ｎ'−（メチカプトアセチル)ノルトリプチ
リンの製造 メルカプト誘導体の処理に用いて全溶液を少なくとも１
０分間室温で各溶液にアルゴン気泡を通すことにより脱
気した。活性化亜鉛末( １.５g )を室温で窒素気流下、
実施例６で得られたＮ−（β,β, β−トリクロロエト
キシカルボニル)−３−アミノ−Ｎ'−（メチルジチオア
セチル)ノルトリプチリン(５００mg、０.８７ミリモル)
と氷酢酸(１０ mlからなる溶液に加えた。２％ＨＣl１
００ mlで４〜５分間十分に洗浄することにより亜鉛末
を活性化し、次いで瀘過し、亜鉛粉末を水、エチルアル
コール、アセトンおよび乾燥エーテルで洗浄した。次い
で、この粉末を室温で減圧下一夜乾燥し、次に還元に用
いた。反応混合物を室塩で一夜攪拌したままにした。２
２時間後、反応混合物を瀘過し、約４０ mlの水で洗浄
し、瀘過を氷浴中で冷却した。白色沈殿(Ｒf ０.９５、
１１４mg）が生成し、これを瀘去して捨て、瀘液を１０
mlのエーテル／ヘキサン(１ : １）で２回抽出する
か、または、副産物を完全に除去した。次いで、生成す
る水溶液を総量２００ mlのジクロロメタンで抽出し、
有機溶液を食塩水で洗浄し、Ｎa2ＳＯ4 で乾燥した。溶
媒を濃縮して３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトアセチル）
ノルトリプチリン酢酸塩の澄明な粘稠性油状物(１０４m
g 、収率２９％、Ｒf ０.３１)を得た。生成物は、１日
以内のうちに室温で減圧下に分解するのが認められた。
しかしながら、酸性条件下、例えば酢酸塩の場合生成物
はより安定することがわかった。３−アミノ−Ｎ'−(メ
ルカプトアセチル）ノルトリプチリン酢酸塩を窒素また
はアルゴン雰囲気下でたくわえ、ドライアイス温度で保
った。
リンの製造 メルカプト誘導体の処理に用いて全溶液を少なくとも１
０分間室温で各溶液にアルゴン気泡を通すことにより脱
気した。活性化亜鉛末( １.５g )を室温で窒素気流下、
実施例６で得られたＮ−（β,β, β−トリクロロエト
キシカルボニル)−３−アミノ−Ｎ'−（メチルジチオア
セチル)ノルトリプチリン(５００mg、０.８７ミリモル)
と氷酢酸(１０ mlからなる溶液に加えた。２％ＨＣl１
００ mlで４〜５分間十分に洗浄することにより亜鉛末
を活性化し、次いで瀘過し、亜鉛粉末を水、エチルアル
コール、アセトンおよび乾燥エーテルで洗浄した。次い
で、この粉末を室温で減圧下一夜乾燥し、次に還元に用
いた。反応混合物を室塩で一夜攪拌したままにした。２
２時間後、反応混合物を瀘過し、約４０ mlの水で洗浄
し、瀘過を氷浴中で冷却した。白色沈殿(Ｒf ０.９５、
１１４mg）が生成し、これを瀘去して捨て、瀘液を１０
mlのエーテル／ヘキサン(１ : １）で２回抽出する
か、または、副産物を完全に除去した。次いで、生成す
る水溶液を総量２００ mlのジクロロメタンで抽出し、
有機溶液を食塩水で洗浄し、Ｎa2ＳＯ4 で乾燥した。溶
媒を濃縮して３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトアセチル）
ノルトリプチリン酢酸塩の澄明な粘稠性油状物(１０４m
g 、収率２９％、Ｒf ０.３１)を得た。生成物は、１日
以内のうちに室温で減圧下に分解するのが認められた。
しかしながら、酸性条件下、例えば酢酸塩の場合生成物
はより安定することがわかった。３−アミノ−Ｎ'−(メ
ルカプトアセチル）ノルトリプチリン酢酸塩を窒素また
はアルゴン雰囲気下でたくわえ、ドライアイス温度で保
った。
【００４０】実施例８ ３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトアセチル）ノルトリプチ
リンおよびブロモアセチルグリシル ＢgＧのコンジュゲ
ートの製造 a．ブロモアセチルグリシンのＮＨＳエステルの製造 粉末状ＮＨＳ（１g ）およびＥＤＣＩ（１g 、５.２ミ
リモル)を、０°で窒素雰囲気下ブロモアセチルグリシ
ン(１g 、mp．１１４〜１１５°)とＤＭＦ１０ mlから
なる溶液に加えた。次いで、生成する澄明溶液を５°で
１８時間後まで攪拌し続け、ＮＨＳエステルを単離せず
に直接用いた。
リンおよびブロモアセチルグリシル ＢgＧのコンジュゲ
ートの製造 a．ブロモアセチルグリシンのＮＨＳエステルの製造 粉末状ＮＨＳ（１g ）およびＥＤＣＩ（１g 、５.２ミ
リモル)を、０°で窒素雰囲気下ブロモアセチルグリシ
ン(１g 、mp．１１４〜１１５°)とＤＭＦ１０ mlから
なる溶液に加えた。次いで、生成する澄明溶液を５°で
１８時間後まで攪拌し続け、ＮＨＳエステルを単離せず
に直接用いた。
【００４１】ｂ．ブロモアセチルグリシンとＢｇＧの結
合 ブロモアセチルグリシンのＮＨＳエステル（６ mlのＤ
ＭＦ中５００mg、前記と同様に製造）を、０°で３０分
内にりん酸緩衝液（１００ml、pH９、０.０５Ｍ）とＤ
ＭＦ（５ ml）の混合液に溶かしたＢｇＧ（１.５ｇ）の
澄明溶液に滴下した。ＮＨＳ溶液を加える前の ＢｇＧ
溶液のｐＨは８であった。ＮＨＳ溶液を添加後 ｐＨは
６.３まで下がった。次いで ｐＨを６.８に調節した。
生成する混合物を５°で一夜攪拌し続けた。１８時間
後、このコンジュゲートを４×４リットルのりん酸緩衝
液（０.０１２５Ｍ、ｐＨ６.８）および２×４リットル
(０.０５Ｍ、ｐＨ６.８）に対して透析した。このコン
ジュゲートを１５０ mlまで希釈し、さらに結合させる
ために貯留した。この蛋白質コンジュゲートの濃度をＵ
Ｖにより測定すると９.５８mg／mlであった。
合 ブロモアセチルグリシンのＮＨＳエステル（６ mlのＤ
ＭＦ中５００mg、前記と同様に製造）を、０°で３０分
内にりん酸緩衝液（１００ml、pH９、０.０５Ｍ）とＤ
ＭＦ（５ ml）の混合液に溶かしたＢｇＧ（１.５ｇ）の
澄明溶液に滴下した。ＮＨＳ溶液を加える前の ＢｇＧ
溶液のｐＨは８であった。ＮＨＳ溶液を添加後 ｐＨは
６.３まで下がった。次いで ｐＨを６.８に調節した。
生成する混合物を５°で一夜攪拌し続けた。１８時間
後、このコンジュゲートを４×４リットルのりん酸緩衝
液（０.０１２５Ｍ、ｐＨ６.８）および２×４リットル
(０.０５Ｍ、ｐＨ６.８）に対して透析した。このコン
ジュゲートを１５０ mlまで希釈し、さらに結合させる
ために貯留した。この蛋白質コンジュゲートの濃度をＵ
Ｖにより測定すると９.５８mg／mlであった。
【００４２】ｃ．３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトアセチ
ル)ノルトリプチリンとブロモアセチルグリシル Ｂｇ
Ｇの結合 実施例７で製造した３−アミノ−Ｎ’−(メルカプトア
セチル)ノルトリプチリンアセテート（ＤＭＦ１.７５ml
巾３５mg ）を、前述のように製造したブロモアセチル
グリシル ＢｇＧ溶液（２１２mg)を０．１モルのりん
酸緩衝液( pH７、窒素により予め脱気）３０ mlに溶か
したものに加えた。生成する不澄明溶液を５°で７０時
間窒素気流下に置いた。次いで、乳液を、４リットルの
ＮＨ4ＯＨ−Ｈ2Ｏ、ｐＨ９、２×１リットルの８Ｍ尿
素、１リットルの４Ｍ尿素、１リットルの２Ｍ尿素およ
び次に５×４リットルのＮＨ4ＯＨ−Ｈ2Ｏ、ｐＨ９に対
して透析した。コンジュゲートのｐＨを１５％ ＮＨ4
ＯＨを用いて１０に調節し、１０分間３Ｋで遠心分離し
た。上清を凍結乾燥してハプテン番号４６のコンジュゲ
ート（２０５mg）を得た。
ル)ノルトリプチリンとブロモアセチルグリシル Ｂｇ
Ｇの結合 実施例７で製造した３−アミノ−Ｎ’−(メルカプトア
セチル)ノルトリプチリンアセテート（ＤＭＦ１.７５ml
巾３５mg ）を、前述のように製造したブロモアセチル
グリシル ＢｇＧ溶液（２１２mg)を０．１モルのりん
酸緩衝液( pH７、窒素により予め脱気）３０ mlに溶か
したものに加えた。生成する不澄明溶液を５°で７０時
間窒素気流下に置いた。次いで、乳液を、４リットルの
ＮＨ4ＯＨ−Ｈ2Ｏ、ｐＨ９、２×１リットルの８Ｍ尿
素、１リットルの４Ｍ尿素、１リットルの２Ｍ尿素およ
び次に５×４リットルのＮＨ4ＯＨ−Ｈ2Ｏ、ｐＨ９に対
して透析した。コンジュゲートのｐＨを１５％ ＮＨ4
ＯＨを用いて１０に調節し、１０分間３Ｋで遠心分離し
た。上清を凍結乾燥してハプテン番号４６のコンジュゲ
ート（２０５mg）を得た。
【００４３】実施例９ ３−アミノ−Ｎ'−（メルカプトアセチル)ノルトリプチ
リンおよびブロモアセチルグリシルＢＳＡのコンジュゲ
ートの製造 ａ．ブロモアセチルグリシンのＢＳＡのコンジュゲート
の製造 ブロモアセチルグリシンのＮＨＳエステル(５００mg）
を６ mlのＤＭＦに溶かしたものを、３０分内に０°で
ＢＳＡ( １．５ｇ )とりん酸緩衝液(ｐＨ９.０、０.０
５Ｍ、１００ ml）およびＤＭＦ(６ml）からなる澄明溶
液に滴下した。ＮＨＳエステルを加える前のＢＳＡ溶液
のｐＨは約 ８.０であった。ＮＨＳエステルを添加後は
ｐＨは５〜６まで下がった。反応混合物のｐＨ（５．８
６)を ６.８に調節し、５°で一夜攪拌した。次いで、
生成するコンジュゲートと３×４リットルのりん酸緩衝
液（０.０１２５Ｍ、ｐＨ６.８）および２×４リットル
のりん酸緩衝液（０.０５Ｍ、 ｐＨ６.８）に対して透
析した。コンジュゲートを１５０ mlに希釈し、さらに
結合させるために貯留した。蛋白質コンジュゲートの濃
度をＵＶにより測定すると８.８mg 蛋白質／ml溶液で
あった。
リンおよびブロモアセチルグリシルＢＳＡのコンジュゲ
ートの製造 ａ．ブロモアセチルグリシンのＢＳＡのコンジュゲート
の製造 ブロモアセチルグリシンのＮＨＳエステル(５００mg）
を６ mlのＤＭＦに溶かしたものを、３０分内に０°で
ＢＳＡ( １．５ｇ )とりん酸緩衝液(ｐＨ９.０、０.０
５Ｍ、１００ ml）およびＤＭＦ(６ml）からなる澄明溶
液に滴下した。ＮＨＳエステルを加える前のＢＳＡ溶液
のｐＨは約 ８.０であった。ＮＨＳエステルを添加後は
ｐＨは５〜６まで下がった。反応混合物のｐＨ（５．８
６)を ６.８に調節し、５°で一夜攪拌した。次いで、
生成するコンジュゲートと３×４リットルのりん酸緩衝
液（０.０１２５Ｍ、ｐＨ６.８）および２×４リットル
のりん酸緩衝液（０.０５Ｍ、 ｐＨ６.８）に対して透
析した。コンジュゲートを１５０ mlに希釈し、さらに
結合させるために貯留した。蛋白質コンジュゲートの濃
度をＵＶにより測定すると８.８mg 蛋白質／ml溶液で
あった。
【００４４】ｂ．３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトアセチ
ル)ノルトリプチリンとブロモアセチルグリシルＢＳＡ
の結合 ＤＭＦ３ mlに溶かした３−アミノ−Ｎ'−(メルカプト
アセチル)ノルトリプチン遊離塩基（６５mg、実施例７
と同様にして製造）を、りん酸緩衝液（４１ml、ｐＨ
７）およびＤＭＦ（８ ml)の混合液に前述のように製造
されたブロモアセチルグリシルＢＳＡ（２５０mg）を溶
かしたもの［結合に用いられた溶液は窒素ガスで飽和し
た] に加えた。次いで、生成する混合物を全部で７２時
間５°で窒素雰囲気下攪拌し、ＮＨ4ＯＨ／Ｈ2Ｏ（ １
０×４）に対して完全に透析した。次いで、コンジュゲ
ートを凍結乾燥して蛋白質１９４mgを得た（ハプテン番
号２４）。
ル)ノルトリプチリンとブロモアセチルグリシルＢＳＡ
の結合 ＤＭＦ３ mlに溶かした３−アミノ−Ｎ'−(メルカプト
アセチル)ノルトリプチン遊離塩基（６５mg、実施例７
と同様にして製造）を、りん酸緩衝液（４１ml、ｐＨ
７）およびＤＭＦ（８ ml)の混合液に前述のように製造
されたブロモアセチルグリシルＢＳＡ（２５０mg）を溶
かしたもの［結合に用いられた溶液は窒素ガスで飽和し
た] に加えた。次いで、生成する混合物を全部で７２時
間５°で窒素雰囲気下攪拌し、ＮＨ4ＯＨ／Ｈ2Ｏ（ １
０×４）に対して完全に透析した。次いで、コンジュゲ
ートを凍結乾燥して蛋白質１９４mgを得た（ハプテン番
号２４）。
【００４５】実施例１０ トランス−３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトアセチル)ノ
ルトリプチリンおよびブロモアセチルグリシルＧ−６−
ＰＤＨのコンジュゲートの製造 ａ．ブロモアセチルグリシン（ＢＡＧ）およびＧ−６−
ＰＤＨの製造 米国特許第４,２２０,７２２号明細書第１８〜１９段に
開示された手順にしたがい、前記ＢＡＧ／Ｇ−６−ＰＤ
Ｈ結合体を製造した（この公報を引用して説明の一部と
する）。この結合体を４リットルのトリス緩衝液に対し
て透析したが保存剤は用いない（０.０５％アジ化物、
０.０５％チメラソールThimerasol ）。こうして６.１
ml中、結合体１３.８mg を得た。
ルトリプチリンおよびブロモアセチルグリシルＧ−６−
ＰＤＨのコンジュゲートの製造 ａ．ブロモアセチルグリシン（ＢＡＧ）およびＧ−６−
ＰＤＨの製造 米国特許第４,２２０,７２２号明細書第１８〜１９段に
開示された手順にしたがい、前記ＢＡＧ／Ｇ−６−ＰＤ
Ｈ結合体を製造した（この公報を引用して説明の一部と
する）。この結合体を４リットルのトリス緩衝液に対し
て透析したが保存剤は用いない（０.０５％アジ化物、
０.０５％チメラソールThimerasol ）。こうして６.１
ml中、結合体１３.８mg を得た。
【００４６】ｂ．トランス−３−アミノ−Ｎ'−(メルカ
プトアセチル)ノルトリプチリンとブロモアセチルグリ
シルＧ−６−ＰＤＨのコンジュゲート 実施例７で得たトランス−３−アミノ−Ｎ'−（メルカ
プトアセチル）ノルトリプチリン１９mgと氷酢酸５０μ
ｌを含有するＤＭＦ０.５mlからなる溶液を製造した。
この溶液（１２５μｌ）をアルゴンを用いて脱余し、前
に透析されたＢＡＧ／Ｇ−６−ＰＤＨ ６.１ mlに加え
た。生成する混合物を４°で ３.５時間攪拌し、次い
で遠心分離した。上清をセファデックス（Sephadex ）
Ｇ−５０カラム上クロマトグラフィーに付し、蛋白質含
有フラクションを集めた。生成物は８４％不活性化され
４０％抑制可能であった。
プトアセチル)ノルトリプチリンとブロモアセチルグリ
シルＧ−６−ＰＤＨのコンジュゲート 実施例７で得たトランス−３−アミノ−Ｎ'−（メルカ
プトアセチル）ノルトリプチリン１９mgと氷酢酸５０μ
ｌを含有するＤＭＦ０.５mlからなる溶液を製造した。
この溶液（１２５μｌ）をアルゴンを用いて脱余し、前
に透析されたＢＡＧ／Ｇ−６−ＰＤＨ ６.１ mlに加え
た。生成する混合物を４°で ３.５時間攪拌し、次い
で遠心分離した。上清をセファデックス（Sephadex ）
Ｇ−５０カラム上クロマトグラフィーに付し、蛋白質含
有フラクションを集めた。生成物は８４％不活性化され
４０％抑制可能であった。
【００４７】実施例１１ Ｇ−６−ＰＤＨおよび５−（３−Ｎ−メチルアミノプロ
ピル）−１０,１１−ジヒドロ−１０−チオアセトアミ
ド−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ,ｆ］アゼピンのコンジュゲー
トの製造 ａ．０.０５５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８.０）８mlを用い
て４°でブロモアセチルグリシンおよびＧ−６−ＰＤＨ
（６１mg）のコンジュゲートを製造し、Ｇ−６−Ｐ（Ｎ
ａ2）塩およびＮＡＤＨのそれぞれ３２０mgを加えて溶
解させた。この溶液に、前記実施例１０のように製造し
た０.５ＭブロモアセチルグリシルＮＨＳエステルＤＭ
Ｆ溶液を攪拌しながら徐々に加えて酵素の不活性度を６
５％とした。この溶液を１８時間トリス緩衝液（０.０
５５Ｍ、ｐＨ８．０、４０００ｍｌ）に対して透析し
た。
ピル）−１０,１１−ジヒドロ−１０−チオアセトアミ
ド−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ,ｆ］アゼピンのコンジュゲー
トの製造 ａ．０.０５５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８.０）８mlを用い
て４°でブロモアセチルグリシンおよびＧ−６−ＰＤＨ
（６１mg）のコンジュゲートを製造し、Ｇ−６−Ｐ（Ｎ
ａ2）塩およびＮＡＤＨのそれぞれ３２０mgを加えて溶
解させた。この溶液に、前記実施例１０のように製造し
た０.５ＭブロモアセチルグリシルＮＨＳエステルＤＭ
Ｆ溶液を攪拌しながら徐々に加えて酵素の不活性度を６
５％とした。この溶液を１８時間トリス緩衝液（０.０
５５Ｍ、ｐＨ８．０、４０００ｍｌ）に対して透析し
た。
【００４８】ｂ．５−（３−Ｎ−メチルアミノプロピ
ル）−１０,１１−ジヒドロ−１０−チオアセトアミド
−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピンとブロモアセチル
グリシルＧ−６−ＰＤＨのコンジュゲート 実施例５で得たハプテン原料（６３mg）を脱気ＤＭＦ
１.５ml中で再構成させた。実施例９で得た全ての透析
された原料をフラスコ内に入れ、４°まで冷却し、アル
ゴン気流下２時間脱気した。ハプテン対酵素比率約９５
になるまでこのハプテンを攪拌しながら徐々に加えた。
抗ＤＭＩ抗体に対する抑制率は４５〜５０％であった。
次いで、Ｇ−６胤ＰＤＨコンジュゲートをＧ５０カラム
上４°で保存剤を含むトリス緩衝液（０.０５５Ｍ、ｐ
Ｈ８.０）を用いて脱塩した。
ル）−１０,１１−ジヒドロ−１０−チオアセトアミド
−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］アゼピンとブロモアセチル
グリシルＧ−６−ＰＤＨのコンジュゲート 実施例５で得たハプテン原料（６３mg）を脱気ＤＭＦ
１.５ml中で再構成させた。実施例９で得た全ての透析
された原料をフラスコ内に入れ、４°まで冷却し、アル
ゴン気流下２時間脱気した。ハプテン対酵素比率約９５
になるまでこのハプテンを攪拌しながら徐々に加えた。
抗ＤＭＩ抗体に対する抑制率は４５〜５０％であった。
次いで、Ｇ−６胤ＰＤＨコンジュゲートをＧ５０カラム
上４°で保存剤を含むトリス緩衝液（０.０５５Ｍ、ｐ
Ｈ８.０）を用いて脱塩した。
【００４９】実施例１２ ノルトリプチリンアッセイ この発明に従って製造された化合物の有効性を明らかに
するため、実施例８のコンジュゲートに対応して従来方
法で製造された抗体および実施例１１で製造された酵素
コンジュゲートをいくつかのノルトリプチリンアッセイ
で用いた。アッセイを行なう際、フローセルのついたサ
ーモキュベットと共にギルフォード・スティザー［（Gi
lford Stazar）商標］ 分光光度計を用いた。全示数を
３４０mnで測定した。アッセイで用いる試剤として次の
溶液を製造した。
するため、実施例８のコンジュゲートに対応して従来方
法で製造された抗体および実施例１１で製造された酵素
コンジュゲートをいくつかのノルトリプチリンアッセイ
で用いた。アッセイを行なう際、フローセルのついたサ
ーモキュベットと共にギルフォード・スティザー［（Gi
lford Stazar）商標］ 分光光度計を用いた。全示数を
３４０mnで測定した。アッセイで用いる試剤として次の
溶液を製造した。
【００５０】緩衝液 :０.０５５Ｍトリス−ＨＣｌ ｐ
Ｈ８.１（ＲＴ）実施例１１ｂで得た酵素コンジュゲー
ト 緩衝液 ０.９％ ＮａＣｌ １.０％ ＢＬＧ、ｐＨ ８.１（ＲＴ） アッセイ媒質において７００〜１０００に等しいΔＯＤ
の最大割合を与えるのに十分な実施例１１による酵素コ
ンジュゲート アッセイ緩衝液 緩衝液 ０.５％ ＮａＣl １.００％［ｖ／ｖ．トリトン（Triton ）Ｘ−１００、
ｐＨ８.１(ＲＴ)］ 抗体試薬 緩衝液 ０.１％ ＢＬＧ Ｇ−６−Ｐ（Ｎａ）０.１９８Ｍ ＮＡＤ ０.１２Ｍ、ｐＨ５（ＲＴ） アッセイに最適な抗ノルトリプチリン（実施例９のコン
ジュゲートを用いてひつじ中で製造された抗体） ％は全て ｗ／ｖ、ｇ／ml
Ｈ８.１（ＲＴ）実施例１１ｂで得た酵素コンジュゲー
ト 緩衝液 ０.９％ ＮａＣｌ １.０％ ＢＬＧ、ｐＨ ８.１（ＲＴ） アッセイ媒質において７００〜１０００に等しいΔＯＤ
の最大割合を与えるのに十分な実施例１１による酵素コ
ンジュゲート アッセイ緩衝液 緩衝液 ０.５％ ＮａＣl １.００％［ｖ／ｖ．トリトン（Triton ）Ｘ−１００、
ｐＨ８.１(ＲＴ)］ 抗体試薬 緩衝液 ０.１％ ＢＬＧ Ｇ−６−Ｐ（Ｎａ）０.１９８Ｍ ＮＡＤ ０.１２Ｍ、ｐＨ５（ＲＴ） アッセイに最適な抗ノルトリプチリン（実施例９のコン
ジュゲートを用いてひつじ中で製造された抗体） ％は全て ｗ／ｖ、ｇ／ml
【００５１】アッセイを実施するために用いる実験計画
は次のとおりであった。まず最初に試料を処理して代謝
産物を除去した。１００ｍｇのＣ−２カラムを約１ ml
のメタノール、次に約１ mlの水で洗浄した。試料（５
００μｌ）をカラムの頂部に置いた。減圧装置を底につ
けてカラムを減圧した。得られた溶離剤を捨て、カラム
を７０％ ０.１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.２）、３０
％アセトニトリルおよび５ mMヘプタンスルホネートか
らなる溶液９００μｌで洗浄した。再びカラムを真空状
態にし、溶離剤を捨てた。次に、カラムを、５０％アセ
トニトリル、２５％メタノールおよび２５％５ミリモル
Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ７からなる溶液５００μｌと接触させ
た。溶離剤を集め、アッセイ工程で用いた。
は次のとおりであった。まず最初に試料を処理して代謝
産物を除去した。１００ｍｇのＣ−２カラムを約１ ml
のメタノール、次に約１ mlの水で洗浄した。試料（５
００μｌ）をカラムの頂部に置いた。減圧装置を底につ
けてカラムを減圧した。得られた溶離剤を捨て、カラム
を７０％ ０.１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.２）、３０
％アセトニトリルおよび５ mMヘプタンスルホネートか
らなる溶液９００μｌで洗浄した。再びカラムを真空状
態にし、溶離剤を捨てた。次に、カラムを、５０％アセ
トニトリル、２５％メタノールおよび２５％５ミリモル
Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ７からなる溶液５００μｌと接触させ
た。溶離剤を集め、アッセイ工程で用いた。
【００５２】上記試料１５マイクロリットル（μｌ）を
希釈器に導入した。この試料を２５０マイクロリットル
のアッセイ緩衝液と共に１ミリリットルのクローン(Cro
an）カップへ投入した。このクローンカップ中にアッセ
イ緩衝液２５０μｌと共に抗体試薬１１５μｌを導入
し、次に酵素試薬１５μｌとアッセイ緩衝液２５０μｌ
を加えた。酵素添加後直ちに、試料全体をフローセルに
吸引した。１０秒後最初の示数を読み取り、５０秒おい
て２番目の示数を読み取った。結果は吸収×２.６６７
の差として記録した。
希釈器に導入した。この試料を２５０マイクロリットル
のアッセイ緩衝液と共に１ミリリットルのクローン(Cro
an）カップへ投入した。このクローンカップ中にアッセ
イ緩衝液２５０μｌと共に抗体試薬１１５μｌを導入
し、次に酵素試薬１５μｌとアッセイ緩衝液２５０μｌ
を加えた。酵素添加後直ちに、試料全体をフローセルに
吸引した。１０秒後最初の示数を読み取り、５０秒おい
て２番目の示数を読み取った。結果は吸収×２.６６７
の差として記録した。
【００５３】
【表１】
【００５４】このアッセイは血しょうのような生物学的
流体におけるノルトリプチリンを測定する高感度かつ正
確な方法を提供する。この発明はノルトリプチリンに対
して特異的な試剤を提供するものであり、ノルトリプチ
リンの濃度変化に伴なう酵素活性の変化の実質的範囲を
もたらすものである。この方泡は速やかに行なえるもの
であり、実験計画は単純で、比較的技術者が誘発する誤
差が少ないものであり、酵素アッセイと実質的に同様に
行なうことができる。前述の発明について、明確さと理
解しやすさを目的として例証および実施例を通して詳し
く記述してきたが、明らかに本明細書の特許請求の範囲
内において変更または修正を行なうことができるもので
ある。
流体におけるノルトリプチリンを測定する高感度かつ正
確な方法を提供する。この発明はノルトリプチリンに対
して特異的な試剤を提供するものであり、ノルトリプチ
リンの濃度変化に伴なう酵素活性の変化の実質的範囲を
もたらすものである。この方泡は速やかに行なえるもの
であり、実験計画は単純で、比較的技術者が誘発する誤
差が少ないものであり、酵素アッセイと実質的に同様に
行なうことができる。前述の発明について、明確さと理
解しやすさを目的として例証および実施例を通して詳し
く記述してきたが、明らかに本明細書の特許請求の範囲
内において変更または修正を行なうことができるもので
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 プリシパル・シング アメリカ合衆国カリフォルニア94087、サ ニーベイル、イーグル・ドライブ1614番
Claims (5)
- 【請求項１】 式 【化１】 ［式中、Ｒ2は 【化２】 Ｗは酸素原子、イミノ（ＮＨ）、または硫黄原子、Ｔと
Ｔ'は炭素原子数１〜４の連結基、ＹとＹ'はそれぞれ酸
素原子、イミノ(ＮＨ)または硫黄原子、ａ、ｋ、ｐおよ
びｍ2はそれぞれ０または１、ｎ2は少なくとも１であ
り、平均してＺ3の分子量／５００よりは大きくない
数、Ｚ3は抗原性ポリ(アミノ酸)である。］で表される
化合物に応答して生産された抗体であって、上記式で表
される化合物、上記式で表されるがＺ3が酵素である対
応化合物およびノルトリプチリンに結合するもの。 - 【請求項２】 （ａ）水性媒質中、ノルトリプチリンを
含んでいる疑いのあるサンプルを（１）式 【化３】 ［式中、Ｒ2は 【化４】 Ｗは酸素原子、イミノ（ＮＨ）、または硫黄原子、Ｔと
Ｔ'は炭素原子数１〜４の連結基、ＹとＹ'はそれぞれ酸
素原子、イミノ(ＮＨ)または硫黄原子、ａ、ｋ、ｐおよ
びｍ2はそれぞれ０または１、ｎ2は少なくとも１であ
り、平均してＺ3の分子量／５００よりは大きくない
数、Ｚ3は抗原性ポリ(アミノ酸)である。］で表される
化合物に応答して生産された抗体および（２）上記式で
表されるがＺ3が酵素である対応化合物と混合し、
（ｂ）この混合物の酵素活性を測定し、（ｃ）当該酵素
活性をノルトリプチリンの既知量を含む検定媒質の酵素
活性と比較して前記サンプル中におけるノルトリプチリ
ンの存否を決定することを特徴とする、ノルトリプチリ
ンの測定方法。 - 【請求項３】 （１）式 【化５】 ［式中、Ｒ2は 【化６】 Ｗは酸素原子、イミノ（ＮＨ）、または硫黄原子、Ｔと
Ｔ'は炭素原子数１〜４の連結基、ＹとＹ'はそれぞれ酸
素原子、イミノ(ＮＨ)または硫黄原子、ａ、ｋ、ｐおよ
びｍ2はそれぞれ０または１、ｎ2は少なくとも１であ
り、平均してＺ3の分子量／５００よりは大きくない
数、Ｚ3は抗原性ポリ(アミノ酸)である。］で表される
化合物に応答して生産された抗体と（２）上記式で表さ
れるが、Ｚ3が酵素である対応化合物を使用することを
特徴とする、ノルトリプチリン測定用酵素イムノアッセ
イ法。 - 【請求項４】 （ａ）ノルトリプチリンを測定すべき血
清サンプルを洗浄したクロマトグラフカラムに加え、
（ｂ）このカラムを約７０％０.１Ｍ酢酸ナトリウム溶
液（ｐＨ約４.２）、約３０％アセトニトリルおよび約
５ｍＭヘプタンスルホネートで洗浄して該カラムからノ
ルトリプチリン代謝産物を実質的に除去する一方、該カ
ラムにノルトリプチリンを残存せしめ、（ｃ）このカラ
ムに約５０％アセトニトリル、約２５％メタノールおよ
び約２５％５ｍＭＫ2ＨＰＯ4 ｐＨ約７を流してノルト
リプチリンの本質的な部分を溶出させることを特徴とす
るノルトリプチリン測定用血清サンプルの調整法。 - 【請求項５】 式 【化７】 ［式中、Ｊは水素原子、メチルまたはＸ（ここにＸはカ
ルボン酸、エステル、アミド、ハライド、またはアンハ
イドライド）、Ｒ1は 【化８】 Ｚ2は水素原子または炭素原子数約１〜６のアルキルで
置換されたチオである。］で表される化合物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/613,709 US4795822A (en) | 1984-05-23 | 1984-05-23 | Nortriptyline conjugates to antigenic proteins and enzymes |
| US613709 | 1984-05-23 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60111277A Division JPH0689039B2 (ja) | 1984-05-23 | 1985-05-22 | ノルトリプチリン誘導体およびコンジユゲート |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7259835A Division JP2609083B2 (ja) | 1984-05-23 | 1995-10-06 | ノルトリプチリン測定用血清サンプルの調製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06201694A true JPH06201694A (ja) | 1994-07-22 |
| JP2526359B2 JP2526359B2 (ja) | 1996-08-21 |
Family
ID=24458404
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60111277A Expired - Lifetime JPH0689039B2 (ja) | 1984-05-23 | 1985-05-22 | ノルトリプチリン誘導体およびコンジユゲート |
| JP5218757A Expired - Lifetime JP2526359B2 (ja) | 1984-05-23 | 1993-09-02 | ノルトリプチリン測定方法および測定用試薬抗体 |
| JP7259835A Expired - Lifetime JP2609083B2 (ja) | 1984-05-23 | 1995-10-06 | ノルトリプチリン測定用血清サンプルの調製法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60111277A Expired - Lifetime JPH0689039B2 (ja) | 1984-05-23 | 1985-05-22 | ノルトリプチリン誘導体およびコンジユゲート |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7259835A Expired - Lifetime JP2609083B2 (ja) | 1984-05-23 | 1995-10-06 | ノルトリプチリン測定用血清サンプルの調製法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4795822A (ja) |
| EP (1) | EP0167256B1 (ja) |
| JP (3) | JPH0689039B2 (ja) |
| AT (1) | ATE66534T1 (ja) |
| CA (1) | CA1279592C (ja) |
| DE (1) | DE3583830D1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2601141A1 (fr) * | 1986-07-02 | 1988-01-08 | Centre Nat Rech Scient | Produit de couplage a base d'haptene, utile notamment comme substance immunogene, anticorps correspondants et applications |
| US5407835A (en) * | 1991-07-31 | 1995-04-18 | Abbott Laboratories | Reagents and methods for the quantification of amitriptyline or nortriptyline in biological fluids |
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