JPH08105894A - ノルトリプチリン測定用血清サンプルの調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 正確なノルトリプチリン測定方法のための血
清サンプルの調製法を提供すること。 【解決手段】 （ａ）ノルトリプチリンを測定すべき血
清サンプルを洗浄したクロマトグラフカラムに加え、
（ｂ）このカラムを約７０％０.１Ｍ酢酸ナトリウム溶
液（ｐＨ約４.２）、約３０％アセトニトリルおよび約
５mＭヘプタンスルホネートで洗浄して、該カラムから
ノルトリプチリン代謝産物を実質的に除去し、（ｃ）こ
のカラムに約５０％アセトニトリル、約２５％メタノー
ルおよび約２５％５mＭＫ₂ＨＰＯ₄ ｐＨ約７を流して残
存ノルトリプチリンを溶出させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】ノルトリプチリンは、広く使用さ
れている３環系抗うつ剤である。この薬剤の治療濃度範
囲は、５０〜１７５ng／mlである。 用量が低いと有意
な作用が得られず、過量は生命を脅かす副作用を招く。
過量は、けいれん、昏睡、心臓性不整脈並びに散瞳およ
び頻脈のような抗コリン作動性徴候を招くことがある。
薬剤の代謝速度は、個人、および薬剤に対する個人の感
受性により著しく異なることが判明した。それ故、適当
な用量レベルを確保するためには、血漿レベルを監視し
て治療用量を維持し得るようにしなければならない。用
量レベルの監視に際しては、ノルトリプチリンの簡単、
正確、迅速な測定法であって、ノルトリプチリンレベル
について誤まった値を与え得る他の薬剤およびノルトリ
プチリン代謝産物からノルトリプチリンを識別し得る方
法の存在が望まれる。

【０００２】

【従来の技術】ノルトリプチリンは、アミトリプチリン
に極めて化学的関連性が強い。生物体液中のアミトリプ
チリンに関する既知の測定技術には、薄層クロマトグラ
フィー、気液クロマトグラフィー(ＧＬＣ)、およびＧＬ
Ｃ−質量スペクトロメトリーを用いるものが含まれる。
グリフォード等、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィ
ー(Ｊ．Ｃhrom.) １０５巻１０７〜１１３頁(１９７５
年)、グプタ等、クリニカル・バイオケミストリー(Ｃli
n．Ｂiochem．) ９巻２４７〜５１頁(１９７６年)、ナ
イベルクおよびマーテンソン、ジャーナル・オブ・クロ
マトグラフィー(Ｊ．Ｃhromatography) １４３巻４９１
頁(１９７７年)、ワトソンおよびスチュワート、ジャー
ナル・オブ・クロマトグラフィー(Ｊ．Ｃhrom.)１３４
巻１８２頁(１９７７年)、同誌１３２巻１５５〜１５９
頁(１９７７年)参照。アミトリプチリンのラジオイムノ
アッセイは、アヘーヌ等、ブリテイッシュ・ジャーナル
・オブ・クリニカル・ファーマコロジー(Ｂr．Ｊ．Ｃli
n．Ｐharmac．) ３巻５６１頁(１９７６年)、ターナ
ー、ランセット(Ｌancet)１３１６頁、(１９７７年)、
およびアヘーヌ等、ランセット(Ｌancet)１２１４頁(１
９７７年)に報告されている。アヘーヌ等の同誌には、
抗体産生用抗原の合成が記載され、そこではノルトリプ
チリンをアミノブチレンで置換した後カルボジイミドで
うし血清アルブミンとコンジュゲート(抱合)している。
カウル等、ジャーナル・オブ・アナリティカル・トキシ
コロジー(Ｊ．Ａnal．Ｔox.)１巻２３６頁 (１９７７
年) に報告された別の抗原コンジュゲート合成では、ス
クシニック基を用いてノルトリプチリンをうし血清アル
ブミンにコンジュゲートしている。生成する抗体は、多
数の他の３環系薬剤と顕著な交差反応性を示すことが判
明している。

【０００３】米国特許第４２７５１６０号は、イミプラ
ミン誘導体およびポリ(アミノ酸)コンジュゲートを記載
している。米国特許第４３０７２４５号は、抗原性蛋白
質および酵素に対するアミトリプチリンコンジュゲート
を記載している。米国特許第４２２０７２２号は、ハロ
アシル基を用いた、ポリアミノ化合物に対するコンジュ
ゲート法を記載している。米国特許第３４５８５７８号
は、４−アミノ−１０,１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ
[ａ,ｄ]シクロヘプテン−５−オンを記載している。米
国特許第３８０３２３４号は、一般的開示として２およ
び３−ニトロ−１０,１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ
[ａ,ｄ] シクロヘプテン−５−オンを記載している。

【０００４】

【発明の構成】この発明によると、イムノアッセイ等に
よるノルトリプチリンの測定に特に適した血清サンプル
の調製法が提供される。この血清サンプルの調製法は、
本発明者らの発明にかかる後述の３位を官能化したノル
トリプチリン誘導体を用いて産生された抗体および酵素
コンジュゲートを用いるノルトリプチリンのイムノアッ
セイに特に適している。

【０００５】上記の３位を官能化したノルトリプチリン
誘導体は、新規化合物であって、抗原性または酵素であ
るポリ(アミノ酸)に対してコンジュゲートできる官能基
を３位に有するノルトリプチリン誘導体である。抗原性
コンジュゲートは、ノルトリプチリンに対して特異的な
抗体の産生用の免疫原として用いられる。抗体はイムノ
アッセイに用いられる。酵素コンジュゲートは、ノルト
リプチリンの定量用酵素アッセイにおける試薬として用
いられる。

【０００６】主として、この化合物は下記の式(Ｉ)で表
わされる。

【化１】 [式中、ψおよびψ'は、一緒になって、酸素原子(オキ
ソ)に対する二重結合またはＧで置換された炭素原子に
対する二重結合 (すなわち、ψおよびψ'が＝ＣＨ−Ｇ)
(ここで、Ｇは水素以外に４〜８個の原子、通常水素以
外に５〜６個の原子を有する脂肪族の基であり、上記原
子は炭素および窒素であり、窒素はアミノ、好ましくは
第３級アミノである) を形成することができ、ここで、
Ｇは

【化２】 (すなわち、ψおよびψ'が

【化３】 であってもよく、ここでＪは水素原子、メチル、また
は、非オキソカルボニル、通常炭素原子数２〜６、好ま
しくは３〜４個のアルコキシカルボニルであって、これ
は炭素原子３個以上が存在する場合、通常β置換分とし
て、原子番号１７〜３５のハロゲン原子、通常塩素原子
を０〜３個を含有してもよい] (ここにいう非オキソカ
ルボニルは少なくとも１つのヘテロ原子で置換されたカ
ルボニル基をさす。適当な基としては、カルボン酸、エ
ステル、アミド、酸ハロゲン化物、無水物が含まれる。

【０００７】ψおよびψ' は、それぞれ別個になる場
合、オキシ、通常ヒドロキシ、および水素以外に４〜８
個の原子、通常水素以外に５〜６個の原子を有する脂肪
族の基(ここで、上記原子は炭素および窒素、通常４〜
５個の炭素および０から１の窒素であり、窒素はアミ
ノ、好ましくは第３級アミノである) を表わすことがで
き、Ｒは、結合手、または、水素以外の原子数１〜２
０、好ましくは水素以外の原子数４〜１５、さらに好ま
しくは水素以外の原子数７〜１２の脂肪族連結基であ
り、上記原子は炭素、窒素、カルコゲン(酸素および硫
黄)であってよく、この基は水素以外の原子数１〜１
５、好ましくは水素以外の原子数３〜１２、さらに好ま
しくは水素以外の原子数５〜１０の鎖、通常１〜１０
個、好ましくは２〜６個の炭素、通常０〜５個、好まし
くは１〜３個の酸素（オキソカルボニル、非オキソカル
ボニルまたはエーテル、特に非オキソカルボニルとして
存在する) 通常０〜３個、好ましくは１〜２個の窒素
(アミノとして存在し、好ましくは１個の窒素が芳香核
に連結する) および通常０〜２個の硫黄原子 (チオノま
たはジスルフィドとして存在する) を含み、ここで、上
記それぞれの炭素には、１個以下のヘテロ原子が飽和結
合により連結するものとし、

【０００８】Ｙは、酸素原子、イミノ(Ｎ−Ｈ)または硫
黄原子、好ましくは酸素原子、Ｚは、アミノ（r＝０)、
水素原子、炭素原子数１〜６、通常炭素原子数１〜３の
アルコキシ (硫黄類似体を含む) (ここで、上記硫黄類
似体Ｚは、Ｒと一緒になってジスルフィドを形成しても
よい)または、抗原または酵素であるポリ(アミノ酸)
(ＰＡＡ)、mは０または１であり、一般的には、ＺがＰ
ＡＡ以外の場合は１、r は０または１であり、Ｚがアミ
ノの場合は０、それ以外の場合は１、n はＺがＰＡＡ以
外の場合１、それ以外の場合平均して１とＺの分子量／
５００、さらに普通には／１０００、しばしば／１５０
０の間の数を表わし、一般的には、１〜５００、好まし
くは１〜１００(Ｚが抗原の場合)、または１〜３０、さ
らに普通には２〜２０、好ましくは２〜１６ (Ｚが酵素
の場合を表わす)]

【０００９】r が０、n が１である化合物は、式(II)で
表わされる。

【化４】 [式中、ψaおよびψa' は、一緒になって、酸素原子(オ
キソ)に対する二重結合、またはψa およびψa'は、そ
れぞれ別個に、オキシ、および水素以外に４〜９個の原
子、通常水素以外に５〜６個の原子を有する脂肪族の基
(ここで、上記原子は炭素および窒素であり、通常炭素
原子数４〜５、および窒素原子数０〜１であり、窒素は
アミノ、好ましくは第３級アミノである) を表わすこと
ができ、Ｚ' はアミノである。]

【００１０】mが０、r およびn が１であるこれらの化
合物は、一般に式(III)で表わされる。

【化５】 [式中、ψbおよびψb'は、一緒になって、Ｇで置換され
た炭素原子に対する二重結合(すなわち、ψbおよびψb'
が＝Ｃ−Ｇ) (ここで、Ｇは水素以外に４〜８個の原
子、通常水素以外に５〜６個の原子を有する脂肪族の基
であり、上記原子は炭素および窒素であり、窒素はアミ
ノ、好ましくは第３級アミノである) を形成することが
でき、ここで、Ｇは

【化６】 (すなわち、ψおよびψ'が

【化７】 であってもよく、ここでＪは水素原子、メチル、または
非オキソカルボニル、通常炭素原子数２〜６、好ましく
は３〜４個のアルコキシカルボニルであって、これは炭
素原子３個以上が存在する場合、通常β置換分として、
原子番号１７〜３５のハロゲン原子、通常塩素原子を０
〜３個を含有してもよく、

【００１１】Ｒ¹は

【化８】 Ｚ²は水素、または炭素原子数約１〜６個、好ましくは
炭素原子数１〜３個のアルキルチオである] Ｚ²が水素原子であり、Ｒ¹と一緒になってチオールを形
成する場合、化合物は塩、例えば酢酸塩として安定化す
るができる。

【００１２】Ｚがポリ(アミノ酸)である場合、多くの場
合好ましくは化合物は式(IV)で示されるものである。

【化９】 [式中、Ｒ₂はＭ(Ｑ)aＴＳＤであり、ここでＤは例えば

【化１０】

【化１１】 または

【化１２】 であることができ、

【００１３】Ｍはアミノ、ＱはＣ＝Ｗ、ここで、Ｗは酸
素原子、イミノ(Ｎ−Ｈ)、または硫黄原子、特に酸素原
子であり、a は０または１、ＴおよびＴ' は炭素原子数
１〜４個、好ましくは炭素原子数１〜２個の連結基であ
り、好ましくは脂肪族、さらに好ましくはアルキレン、
特にメチレンであり、a が０のとき、Ｔは少なくとも二
個の炭素を有するものとし、ＹおよびＹ' は独立して酸
素原子、イミノ(Ｎ−Ｈ)または硫黄、好ましくは酸素で
あり、Ａはイミノ、k は０または１、p は０または１、
好ましくは１、m²は０または１、好ましくは１、n²は少
なくとも１、および通例１より大きく、Ｚ³ が抗原性で
あるとき、n²は一般に少なくとも２であり、平均してＺ
³ の分子量／５００より大きくなく、通常Ｚ³ の分子量
／１０００より大きくなく、好ましくはＺ³ の分子量／
１５００より大きくなく、一般に約２〜５００の広い範
囲の数であり、Ｚ³ が酵素のとき、n²は少なくとも１で
あり、普通３０より大きくなく、さらに一般的には約２
〜２０の間で、好ましくは約２〜１６の間の数であり、

【００１４】Ｚ³はポリ(アミノ酸)であり、その分子量
は約５０００から分子量の上限はないが、通常１０００
０より少なくなく、約６５００００よりも大きくない数
である] 分子量の範囲は、通常抗原または酵素の何れが
関係するかによって異なり、抗原の場合約５０００〜１
０⁷、通常約２００００〜６５００００、さらに普通に
は約２５０００〜２５００００の分子量であり、酵素の
場合一般に約１００００〜６０００００、さらに普通に
は１００００〜３０００００の分子量である。通常コン
ジュゲート基は分子量５０００００につき少なくとも約
１個、さらに普通には分子量５００００につき少なくと
も１個存在する。中間分子量の抗原(３５０００〜１０
０００００)の場合、コンジュゲート基の数は通常約２
〜２５０であり、さらに一般的には１０〜１００であ
る。低分子量の抗原(３５０００以下)については、コン
ジュゲート基の数は一般的に約２〜１０の範囲にあり、
通常２〜５の間である。]

【００１５】この好ましい化合物は下式で示される。

【化１３】 [式中、p、m²、およびn は前記の意味、ＰＡＡは前に定
義したポリ(アミノ酸)を表わす］

【００１６】種々のタイプの蛋白質をポリ（アミノ酸)
としての抗原性物質として使用することができる。これ
らのタイプには、アルブミン、血清蛋白質、例えばグロ
ブリン、眼球レンズ蛋白質、リポプロティン等を含む。
蛋白質の具体例としては、うし血清アルブミン、ひざら
がい(Ｋeyhole Ｌimpet)ヘモシアニン、卵オボアルブミ
ン、うしγ−グロブリン等がある。また、これらの代り
に、合成ポリ(アミノ酸)であって利用できるアミノ基、
例えばリジンを充分な数だけもつものを製造できる。酵
素は、結果について望まれる速度およびノルトリプチリ
ンを測定すべき生理学的流体に応じて広範囲に変えるこ
とができる。酵素の選択をＩＵＢ(国際生化学連合)の分
類に基づいて述べると、主として、クラス１のオキシド
レダクターゼおよびクラス３のヒドラーゼである。特に
クラス１において興味のある酵素は、クラス１.１のデ
ヒドロゲナーゼ、さらにはクラス１.１.１、１.１.３お
よび１.１.９９のもの、およびクラス１.１１のペルオ
キシダーゼである。ヒドロラーゼでは、特にクラス３.
１のもの、さらに３.１.３のもの、およびクラス３.２
のもの、さらに３.２.１のものである。

【００１７】デヒドロゲナーゼの例には、リンゴ酸デヒ
ドロゲナーゼ、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナー
ゼ、および乳酸デヒドロゲナーゼが含まれる。オキシダ
ーゼの例は、グルコースオキシダーゼである。ペルオキ
シダーゼの例は、西洋わさび(horseradish) ペルオキシ
ダーゼである。ヒドロラーゼの例は、アルカリ性ホスフ
ァターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ダルコシダーゼ
およびリソチームである。特に好ましいのは、ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド(ＮＡＤ)またはそのホス
フェート(ＮＡＤＰ)、 特に前者をコファクターとする
ものである。最も好ましい酵素は、グルコース−６−燐
酸デヒドロゲナーゼである。

【００１８】コンジュゲート酵素は、抗(ノルトリプチ
リン)で飽和されたとき少なくとも４０％、通常少なく
とも約６０％阻害されているのが望ましく、一方、コン
ジュゲートの不活性化は天然品の８０％以下、好ましく
は６０％以下である。

【００１９】この化合物は、下記の方法により製造され
る。方法は、式(XV)

【化１４】 の化合物で始まり、この化合物を還元して式(XVI)

【化１５】 (式中、ψおよびψ'は前記の意味)を得る。還元は当技
術で公知の方法によって行なう。適当な方法は、例えば
接触水素化または亜ジチオナイトとの反応である。

【００２０】次いで、ψおよびψ' が一緒になって酸素
原子に対する二重結合(オキソ)を形成する化合物(XVI)
を、グリニヤール試薬と反応させて、式(XVI) において
ψおよびψ' がそれぞれ別個にオキシ (通常ヒドロキ
シ) および水素以外に４〜８個の原子を有する脂肪族の
基 (上記原子は炭素および窒素であり、窒素はアミノで
ある) の化合物を得る。グリニヤール反応は、当業界で
公知の適当な方法にしたがって行なう。例えば、グリニ
ヤール試薬Ｘ−Ｍg−Ｇ' [ここで、Ｘは原子番号１７〜
３５のハロゲン(好ましくは塩素または臭素)、Ｇ' は水
素以外に４〜８個(通常５〜６個)の原子を有する脂肪族
の基 (この原子は炭素および窒素であり、窒素はアミ
ノ、好ましくは第３級アミノであって、基は通常３−ジ
メチルアミノプロピルである)]を用いる。

【００２１】次に、上記化合物を脱水して、式(XVI) に
おいてψおよびψ' が一緒になってＧで置換された炭素
原子に対する二重結合(すなわち、ψおよびψ'が＝ＣＨ
−Ｇ) [ここで、Ｇは水素以外に４〜８個の原子を有す
る脂肪族の基 (上記原子は炭素および窒素であり、窒素
はアミノである)]を形成する化合物を得る。脱水は常法
により行なう。適当な脱水剤としては、例えばパラトル
エンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸が含まれる。上
記の工程により、式(I)においてψおよびψ'が前記の意
味であり、r およびmが０、n が１、Ｚがアミノの化合
物が得られる。

【００２２】式(XVI)の化合物を、さらに反応性誘導体

【化１６】 [ここで、Ｒ、Ｙおよびmは前記の意味、Ｚ"は水素原
子、または炭素原子数１〜６のアルコキシ(その硫黄類
似体を含む)である]で処理して、式(Ｉ')においてψお
よびψ'、Ｒ、Ｙ並びにmは前記の意味であり、r が１、
n が１、Ｚが水素原子、または炭素原子数１〜６のアル
コキシ (その硫黄類似体を含む) の化合物を得る。この
工程の適当な反応条件は当業界で公知である。反応性誘
導体は、活性エステルのような適当な活性基、例えば非
オキソカルボニルを活性化してアミノ基と結合させるエ
ステル基、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル
により、アミノ基に結合される。

【００２３】次いで、このコンジュゲートを、式(I')の
化合物とポリ(アミノ酸)のカップリングにより作る。適
当な活性化ポリ(アミノ酸)に対するコンジュゲート化
(抱合)は、当業界で公知の方法、例えば(I')のスルフヒ
ドリル基におけるカップリングにより行なう。ポリ(ア
ミノ酸)の活性化もまた、常法により、例えばハロゲン
原子またはオレフイン結合の存在を利用して行なう。式
(XVI)においてψおよびψ'が一緒になって酸素原子に対
する二重結合(オキソ)を形成する中間体は、３−ニトロ
ベンゾスベロンであり、公知化合物ジベンゾスベロンを
ニトロ化することにより製造される。３−ニトロベンゾ
スベロンは、グリニヤール試薬(好適には前記のもの)と
反応させることにより、式(XV)においてψおよびψ' が
それぞれ別個のオキシ(通常ヒドロキシ)および水素以外
に４〜８個の原子を有する脂肪族の基 (上記原子は炭素
および窒素であり、窒素はアミノである)である化合物
に変換する。生成する化合物は、次いで(前記のように)
脱水して、式(XV)においてψおよびψ' が一緒になって
Ｇで置換された炭素原子に対する二重結合(すなわち、
ψおよびψ'が＝ＣＨ−Ｇ) [ここで、Ｇは水素以外に４
〜８個の原子を有する脂肪族の基 (上記原子は炭素およ
び窒素であり、窒素はアミノである)]を得る。前記のよ
うに、これら式(XV)の化合物は、何れも(前記のような
方法による) ニトロ基からアミノ基への還元により式(X
VI) の化合物に変換することができる。

【００２４】この化合物の合成経路を下記反応式で示す
が、これは説明のためのものであって限定するものでは
ない。

【化１７】

【化１８】

【化１９】

【００２５】a) 例えば無水酢酸のような無水媒質中、
例えばＨＮＯ₃ のようなニトロ化剤による b) Ｈ₂ および触媒 c) 亜ジチオン酸金属、通常亜ジチオン酸ナトリウム d) Ｘ−Ｍg−Ｇ' [ここで、Ｘは原子番号１７〜３５の
ハロゲン(好ましくは塩素または臭素)、は水素以外に４
〜８個(通常５〜６個)の原子を有する脂肪族の基 (この
原子は炭素および窒素であり、窒素はアミノ、好ましく
は第３級アミノであり、通常３−ジメチルアミノプロピ
ルである)] e) 例えばパラトルエンスルホン酸またはトリフルオロ
酢酸のような脱水剤 f) Ｌ(Ｑ)aＦ¹[ここで、Ｑおよびaは前記の意味、Ｌは
非オキソカルボニルをアミノ基に結合するエステル性活
性基 (好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル)、
Ｆ¹は鎖中に水素以外に４〜１０個の原子を有する基
(この原子は炭素および硫黄であり、少なくとも１個の
炭素は非オキソカルボニルに結合し、硫黄はジチオエー
テルであり、通常Ｆ¹はＴ−Ｓ−Ｓ−ＣＨ₃ であって、
Ｔは前記の意味であり、好ましくはＦ¹はＣＨ₂−Ｓ
−Ｓ−ＣＨ₃である)] g) Ｘ−Ｊ¹(ここで、Ｘは前記の意味、Ｊ¹はＪと同じ
意味。但しＪ＝水素原子を除く) h) 還元剤、通常原子番号２２〜３０の金属、好ましく
は亜鉛、および酸、通常酢酸 i)

【化２０】 (ここで、Ｘ、Ｙ¹、Ａ、k、Ｔ'、p、ＹおよびＺ³ は前
記の意味)

【００２６】この化合物の製造に際しては、ジベンゾス
ベロン(VI)を、好ましくは当量のニトロ化剤で処理し
て、３−ニトロジベンゾスベロン(VII) を得る。化合物
(VII)の還元は、接触水素化または亜ジチオン酸(塩)に
より行ない、化合物(VIII)を得る。化合物(VIII)とグリ
ニヤール試薬の反応により化合物(IX)を得、これを脱水
して化合物(Ｘ)とする。化合物(XI)は、化合物(Ｘ)と、
アミノ基に結合する活性エステルを混合することにより
得られる。化合物(XI)を緩和なアルカリ性条件下で脱メ
チルして化合物(XII) とし、これを還元して第２級アミ
ン(XIII)を得る。化合物(XIII)のポリ(アミノ酸)コンジ
ュゲート(XIV)は、化合物(XIII)と、そのスルフヒドリ
ル基に結合する適当な活性化ポリ(アミノ酸)コンジュゲ
ート、例えばハロゲン原子またはオレフィン結合により
活性化されたものを結合させることにより製造される。

【００２７】上記方法を用いると、ノルトリプチリンと
抗原性または酵素性ポリ(アミノ酸)とのコンジュゲート
を製造することができる。合成後にノルトリプチリンの
構造が存在し、近縁化合物との区別をもたらす上記構造
要素の存在により、ノルトリプチリンを類似構造の化合
物から識別できる抗体の産生が可能となる。抗原性化合
物は、抗体製造の常法にしたがって、広範囲の脊椎動物
に注射することができる。通常動物から定期的に採血
し、後続採血は力価および特異性の向上を示すが、最高
値に達した後力価と特異性が減少する。この発明により
製造した抗体は、上記ノルトリプチリンに特異的な抗原
性および酵素性コンジュゲートと結合する能力を有し、
アミトリプチリンおよびイミプラミンのようなノルトリ
プチリン近縁化合物および代謝物から識別することがで
きる。

【００２８】前述のようにして製造した抗体および酵素
試薬は、ノルトリプチリン定量用イムノアッセイに用い
るに特に適する。ホモジニアス酵素イムノアッセイとし
ての上記イムノアッセイの実施法は、米国特許第３８１
７８３７号に記載されている。この方法は、酵素コンジ
ュゲート、(例えばクロマトグラフィー分離により代謝
物除去処理した) ノルトリプチリンの含有が疑われる未
知試料、およびノルトリプチリンの抗体を、水性緩衝媒
質中、約１０〜５０℃、通常約２０〜４０℃の温度範囲
で混合し、その酵素活性を既知量のノルトリプチリンを
含むアッセイ媒質の酵素活性と比較定量することを含む
ものである。

【００２９】

【実施例】以下に示す実施例は、この発明を説明するも
のであって、これを限定するものではない。温度は特記
しない限りセ氏で示す。液体の部および％は容量で示
し、他は重量で示す。下記の略号を用いる。 tlc…薄層クロマトグラフィー ＧＦ…ゲル瀘過 ＩＲ…赤外線吸収スペクトル ＣＤＣl₃ …重クロロホルム Ｐmr…プロトン磁気共鳴スペクトル ＭＨz …メガヘルツ ＴＭＳ…トリメチルシラン ＭＳ…質量スペクトル h …時間 ＮＨＳ…Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ＤＭＦ…ジメチルホルムアミド ＥＤＣＩ…１−エチル−３−( ３−ジメチルアミノプロ
ピル) カルボジイミド塩酸塩 ＢＳＡ…うし血清アルブミン ＲＳＡ…家兎血清アルブミン ＢgＧ …うしガンマグロブリン Ｇ−６−ＰＤＨ…グルコース−６−燐酸デヒドロゲナー
ゼ Ｇ−６−ＰＮa …グルコース−６−燐酸ナトリウム塩 ＢＬＧ…ベータラクトグロブリン

【００３０】参考例１ ３−ニトロジベンゾスベロンの製造 白色発煙硝酸(９０％、６.１ml、０.１３モル)に無水酢
酸(１５ml)を室温で徐々に加えた。得られた温溶液(３
０℃)を２５℃に冷却し、ジベンゾスベロン (２０.８g
、０.１モル、アルドリッチ・ケミカル社製) と無水酢
酸２５mlの溶液に３時間内に滴下した。添加後少量をと
り、水に入れ、ジクロロメタンに分配した。tlcは３−
ニトロジベンゾスベロン、移動性の高い物質および出発
原料の存在を示した。次いで、反応混合物を氷水２リッ
トルに加え、油状生成物を３０分間攪拌した。生成する
水層を傾斜して捨て、底の油状残渣をジクロロメタンに
溶かし、飽和重炭酸水素ナトリウム溶液および食塩水で
洗浄した。有機層をＭgＳＯ₄で乾燥し、濃縮して淡黄色
油状物を得、これを温エーテルに溶かし、ヘキサンを濁
るまで加えて結晶化した。得られる澄明溶液を一夜冷却
(０℃)して淡黄色固体の３−ニトロジベンゾスベロン
６.５g(収率２６％)を得た。本品のtlcは主生成物と微
量の不純物を示した。本品は精製せずに用いた。 元素分析 : Ｃ₁₅Ｈ₁₁ＮＯ_３ 計算値 Ｃ７１.１５、Ｈ４.３５、Ｎ５.５３ 実測
値 Ｃ６９.４２、Ｈ４.３４、Ｎ５.８５

【００３１】参考例２ ３−アミノジベンゾスベロンの製造 テトラヒドロフラン(８００ml)、イソプロパノール(８
００ml) およびりん酸緩衝液［pＨ６.５、１.６リット
ル。１３.６g のＫＨ₂ＰＯ₄ (０.１モル)と２７.８mlの
１Ｎ−ＮaＯＨを混合し、生成した溶液を２リットルに
希釈することにより製造］の混合液と参考例１で得られ
た３−ニトロジベンゾスベロン (２７.２g、０.１０７
モル) からなる懸濁液に、亜ジチオン酸ナトリウム（２
２０g、イーストマン・オーガニック・ケミカルズ製)
を５分間にわたり加えた。固体は可溶性になり、１５分
後tlc は反応完結を示した。次いで、得られる澄明溶液
を酢酸エチルで完全に抽出し、有機層を飽和ＮaＣl溶液
で洗浄し、Ｎa₂ＳＯ₄で乾燥した。溶媒を濃縮して得ら
れた黄色粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ
ーに付し、エーテル／ヘキサン１：１で溶解して、純酔
な黄色３−アミノジベンゾスベロン８.７g( 収率３６
％)を得た。

【００３２】参考例３ ３−アミノ−５−(３−ジメチルアミノプロピル)−５−
ヒドロキシ−１０,１１−ジヒドロジベンゾ[ｂ,ｅ]シク
ロヘプタトリエンの製造 a ．Ｎ,Ｎ−ジメチルプロピルクロライドの製造 約１００mlの水に溶かしたＮ,Ｎ−ジメチルプロピルク
ロライド塩酸塩(１００g、アルドリッチ・ケミカル社
製) 溶液にpＨ約１１〜１２となるまで１０％ＮaＯＨを
加えてアルカリ性にした。次いで、生成する二層溶液を
エーテルで抽出し、エーテル抽出物をＭgＳＯ₄で乾燥し
た。１気圧下簡単な蒸留装置を用いてエーテルを蒸留
し、生成する液体を４５℃(圧力６０mmＨg)で蒸留して
Ｎ,Ｎ−ジメチルプロピルクロライドの無色液体５４.５
g を得た。

【００３３】b ．グリニヤール反応 :1,２−ジブロモエ
タン(ジエイ・ティー・ベイカー・ケミカル社) 数滴
を、テトラヒドロフラン(５３ml、乾燥し、ベンゾフェ
ノンのナトリウム塩で新たに蒸留）中のマグネシウム屑
(１３g、０.５４モル)に窒素気流下加えた。この屑をガ
ラス製ロッドを用いて粉砕し、気体の放出を認めた後、
Ｎ,Ｎ−ジメチルプロピルクロライド( ３２.３g、０.２
７モル)とテトラヒドロフラン（１５０ml）からなる溶
液を滴下した。この滴下の間、溶液を十分に加熱して穏
やかな還流を維持した。還流下１時間攪拌後、褐色の反
応混合物を室温になるまで冷却し、乾燥テトラヒドロフ
ラン(２２０ml)に溶かした参考例２で得られた３−アミ
ノジベンゾスベロン(１２.４g、０.０５６モル)を加え
た。生成する褐色生成物を半時間室温で攪拌しておき、
飽和塩化アンモニウム(２００ml)を用いて注意深く冷却
した。生成する黄色残留物を酢酸エチルで抽出した。有
機相を飽和 ＮaＮＣＯ₃および食塩水で洗浄し、乾燥し
(Ｎa₂ＳＯ₄)、濃縮して３−アミノ−５−(３−ジメチル
アミノプロピル)−５−ヒドロキシ−１０,１１−ジヒド
ロジベンゾ[ｂ,e]シクロヘプタトリエンの黄色油状物
(１７.２g)を得た。

【００３４】参考例４ ３−アミノアミトリプチリンの製造 トリフルオロ酢酸(２９.６ml、０.１７５モル)を、参考
例３で得られた３−アミノ−５−(３−ジメチルアミノ
プロピル)−５−ヒドロキシ−１０,１１−ジヒドロジベ
ンゾ[ｂ,ｅ]シクロヘプタトリエン(１７.１g、０.０５
５モル)とジクロロメタン(３００ml)からなる溶液に加
えた。生成する暗褐色の溶液を１８時間還流した。少量
の反応混合物のtlc は反応がまだ完結していないことを
示した。したがって、p−トルエンスルホン酸一水化物
(１０.５g、０.０５５モル)を加えて一夜攪拌した。１
８時間後反応の完結が認められた。反応生成物を冷却
し、エーテルで希釈し、濃アンモニア(２２ml)を用いて
アルカリ性とし、次いで、酢酸エチルで抽出した。溶媒
を濃縮すると、２つの主成分およびより高いＲf値を有
する不純物をいくらか含有する泡状生成物が得られた。
分取ＨＰＬＣ(高速液体クロマトグラフィー)[シリカゲ
ルカラム、ＮＨ₃：ＭeＯＨ：ＣＨ₂Ｃl₂／０.２４：３：
９７(容量比)]を用いて試料を精製した。

【００３５】フラクションを集め、屈折率および分析tl
c(シリカゲルプレート、０.０８：１：７／ＮＨ₃： Ｍe
ＯＨ：ＣＨ₂Ｃl₂)を用いて分析した。等しいＲf値を有
するフラクションを合わせて濃縮し、６.８gのシス−３
−アミノアミトリプチリン(Ｒf０.０８)および３.６gの
トランス−３−アミノアミトリプチリン(Ｒf０.１５)を
得た。２段階にわたる３−アミノジベンゾスベロンから
の生成物の全収量は１０.４g(収率６４％)である。 元素分析：Ｃ₂₀Ｈ₂₄Ｎ₂・１／２ Ｈ₂Ｏ 計算値 Ｃ７９.７３、Ｈ８.３１、Ｎ９.３０ 実測値
Ｃ７９.５３、Ｈ７.９９、Ｎ８.８９

【００３６】参考例５ Ｎ'−（メチルジチオアセチル)−３−アミノアミトリプ
チリンの製造 メチルジチオ酢酸のＮＨＳエステル(２.９g、１３.８ミ
リモル)を、テトラヒドロフラン（８０ ml、ナトリウム
ベンゾフェノレートから新たに乾燥蒸留）およびジクロ
ロメタン(２０ml、モレキュラーシーブ３Ａ上で乾燥）
の混合物と参考例４で得られたシス−３−アミノアミト
リプチリン(２.７g 、９.３モル)からなる溶液に加え
た。生成溶液を室温で攪拌し続けた。４日後、tlc は反
応の完結を示した。生成する淡黄色溶液を回転エバポレ
ータ上で濃縮乾固し、残留物を逆相シリカゲルカラムク
ロマトグラフィー[シラン化されたシリカゲル６０を３
００g含有]に付し、３％ＭeＯＨ／ＣＨ₂Ｃl₂（１.４リ
ットル)、次いで５％ＭeＯＨ／ＣＨ₂Ｃl₂（６００ml）
で溶離した。溶媒を濃縮後、Ｎ'−(メチルジチオアセチ
ル)−３−アミノアミトリプチリンを含有する淡黄色泡
状生成物４.３g が得られた。生成物を１００mlのＣＨ₂
Ｃl₂に溶解し、トリエチルアミン１mlを加えた、有機層
を飽和ＮaＣlで洗浄し、Ｎa₂ＳＯ₄で乾燥し、濃縮し
て、Ｎ'−メチル(ジチオアセチル)−３−アミノアミト
リプチリンの泡状生成物３.３g（収率８６％)を得た。

【００３７】参考例６ Ｎ(β,β,β−トリクロロエトキシカルボニル)−Ｎ−メ
チル(ジチオアセチル)−３−アミノノルトリプチリンの
製造 クロロぎ酸トリクロロエチル（９.６ml、７０ミリモ
ル）を室温で窒素雰囲気下、参考例５で得られたＮ'−
(ジチオアセチル)−３−アミノアミトリプチリン(３g、
７ミリモル）とジクロロメタン（１２０ml、モレキュラ
ーシーブ３Ａ上で乾燥）からなる溶液に滴下し、次いで
１５分内にトリエチルアミン(９.７ml、７０ミリモル)
を加えた。微温反応混合物を水浴を用いて冷却し、次に
室温で３.５時間放置した。分析シリカゲルプレート上
で観察したところ反応は完結した。生成する黄色溶液を
濃縮乾固した。エーテル(１００ml)を加えた。生成した
白色沈殿物を濾過し、次いでエーテルで洗浄した。エー
テル濾液を集めて濃縮して褐色油状物を得、これをシリ
カゲルクロマトグラフィーに付した。フラクションをtl
cにより分析した。生成物はＵＶ発色団を示すが不純物
はＵＶ吸収をせず、Ｉ₂チャンバー内で展開するとより
高いＲf値の位置に褐色スポットを示すため、ＵＶおよ
びＩ₂の両者を用いて上記フラクションを検査した。フ
ラクションを合わせてＮ−(β,β,β−トリクロロエト
キシカルボニル)−３−アミノ−Ｎ'−(メチルジチオア
セチル)ノルトリプチリンを白色泡状生成物として得た
(３.２g 、収率７７％ )。不純物を次の反応においてメ
チルジチオアセチル誘導体の還元的開裂を防げるため、
不純物を含有するフラクションは再びクロマトグラフィ
ーに付すか捨てた。カラムクロマトグラフィー後の試料
は、正しい構造を示した。 元素分析：Ｃ₂₅Ｈ₂₇Ｎ₂Ｏ₃Ｃl₃Ｓ₂ 計算値 Ｃ５２.３１、Ｈ４.７１、Ｎ４.８８ Ｃ １
８.５７、Ｓ１１.１６ 実測値 Ｃ５２.４１、Ｈ４.８５、Ｎ４.７３ Ｃ １
８.１４、Ｓ１０.８４

【００３８】参考例７ ３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトアセチル)ノルトリプチ
リンの製造 メルカプト誘導体の処理に用いて全溶液を少なくとも１
０分間室温で各溶液にアルゴン気泡を通すことにより脱
気した。活性化亜鉛末(１.５g)を室温で窒素気流下、参
考例６で得られたＮ−(β,β,β−トリクロロエトキシ
カルボニル)−３−アミノ−Ｎ'−(メチルジチオアセチ
ル)ノルトリプチリン（５００mg、０.８７ミリモル）と
氷酢酸（１０ml）からなる溶液に加えた。２％ＨＣl １
００mlで４〜５分間十分に洗浄することにより亜鉛粉末
を活性化し、次いで瀘過し、亜鉛粉末を水、エチルアル
コール、アセトンおよび乾燥エーテルで洗浄した。次い
で、この粉末を室温で減圧下一夜乾燥し、次に還元に用
いた。反応混合物を室塩で一夜攪拌したままにした。２
２時間後、反応混合物を瀘過し、約４０mlの水で洗浄
し、瀘過を氷浴中で冷却した。白色沈殿(Ｒf０.９５、
１１４mg）が生成し、これを瀘去して捨て、瀘液を１０
mlのエーテル／ヘキサン（１：１）で２回抽出するか、
または、副産物を完全に除去した。次いで、生成する水
溶液を総量２００mlのジクロロメタンで抽出し、有機溶
液を食塩水で洗浄し、Ｎa₂ＳＯ₄で乾燥した。溶媒を濃
縮して３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトアセチル)ノルト
リプチリン酢酸塩の澄明な粘稠性油状物（１０４mg、収
率２９％、Ｒf０.３１)を得た。生成物は、１日以内の
うちに室温で減圧下に分解するのが認められた。しかし
ながら、酸性条件下、例えば酢酸塩の場合生成物はより
安定することがわかった。３−アミノ−Ｎ'−(メルカプ
トアセチル)ノルトリプチリン酢酸塩を窒素またはアル
ゴン雰囲気下で蓄え、ドライアイス温度で保った。

【００３９】参考例８ ３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトアセチル）ノルトリプチ
リンおよびブロモアセチルグリシルＢgＧのコンジュゲ
ートの製造 a．ブロモアセチルグリシンのＮＨＳエステルの製造 粉末状ＮＨＳ（１g）およびＥＤＣＩ（１g、５.２ミリ
モル）を、０℃で窒素雰囲気下ブロモアセチルグリシン
（１g、mp.１１４〜１１５℃）とＤＭＦ１０mlからなる
溶液に加えた。次いで、生成する透明溶液を５℃で１８
時間後まで攪拌し続け、ＮＨＳエステルを単離せずに直
接用いた。

【００４０】ｂ．ブロモアセチルグリシンとＢgＧの結
合 ブロモアセチルグリシンのＮＨＳエステル（６mlのＤＭ
Ｆ中５００mg、前記と同様に製造）を、０℃で３０分内
にりん酸緩衝液（１００ml、pＨ９、０.０５Ｍ）とＤＭ
Ｆ（５ml）の混合液に溶かしたＢgＧ（１.５g）の透明
溶液に滴下した。ＮＨＳ溶液を加える前のＢｇＧ溶液の
pＨは８であった。ＮＨＳ溶液を添加後pＨは６.３まで
下がった。次いでpＨを６.８に調節した。生成する混合
物を５℃で一夜攪拌し続けた。１８時間後、このコンジ
ュゲートを４×４リットルのりん酸緩衝液（０.０１２
５Ｍ、pＨ６.８）および２×４リットル（０.０５Ｍ、p
Ｈ６.８）に対して透析した。このコンジュゲートを１
５０mlまで希釈し、さらに結合させるために貯留した。
この蛋白質コンジュゲートの濃度をＵＶにより測定する
と９.５８mg／mlであった。

【００４１】ｃ．３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトアセチ
ル)ノルトリプチリンとブロモアセチルグリシルＢgＧの
結合 参考例７で製造した３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトアセ
チル)ノルトリプチリンアセテート（ＤＭＦ１.７５ml巾
３５mg）を、前述のように製造したブロモアセチルグリ
シルＢgＧ溶液（２１２mg）を０.１モルのりん酸緩衝液
（pＨ７、窒素により予め脱気）３０mlに溶かしたもの
に加えた。生成する不透明溶液を５℃で７０時間窒素気
流下に置いた。次いで、乳液を、４リットルのＮＨ₄Ｏ
Ｈ−Ｈ₂Ｏ、pＨ９、２×１リットルの８Ｍ尿素、１リッ
トルの４Ｍ尿素、１リットルの２Ｍ尿素および次に５×
４リットルのＮＨ₄ＯＨ−Ｈ₂Ｏ、pＨ９に対して透析し
た。コンジュゲートのpＨを１５％ＮＨ₄ＯＨを用いて１
０に調節し、１０分間３Ｋで遠心分離した。上清を凍結
乾燥してハプテン番号４６のコンジュゲート（２０５m
g）を得た。

【００４２】参考例９ ３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトアセチル)ノルトリプチ
リンおよびブロモアセチルグリシルＢＳＡのコンジュゲ
ートの製造 ａ．ブロモアセチルグリシンのＢＳＡのコンジュゲート
の製造 ブロモアセチルグリシンのＮＨＳエステル（５００mg）
を６mlのＤＭＦに溶かしたものを、３０分内に０℃でＢ
ＳＡ（１.５g)とりん酸緩衝液（pＨ９.０、０.０５Ｍ、
１００ml）およびＤＭＦ（６ml）からなる澄明溶液に滴
下した。ＮＨＳエステルを加える前のＢＳＡ溶液のpＨ
は約８.０であった。ＮＨＳエステルを添加後はpＨは５
〜６まで下がった。反応混合物のpＨ（５.８６)を６.８
に調節し、５℃で一夜攪拌した。次いで、生成するコン
ジュゲートと３×４リットルのりん酸緩衝液（０.０１
２５Ｍ、pＨ６.８）および２×４リットルのりん酸緩衝
液（０.０５Ｍ、 pＨ６.８）に対して透析した。コンジ
ュゲートを１５０mlに希釈し、さらに結合させるために
貯留した。蛋白質コンジュゲートの濃度をＵＶにより測
定すると８.８mg蛋白質／ml溶液であった。

【００４３】ｂ．３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトアセチ
ル)ノルトリプチリンとブロモアセチルグリシルＢＳＡ
の結合 ＤＭＦ３mlに溶かした３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトア
セチル)ノルトリプチン遊離塩基（６５mg、参考例７と
同様にして製造）を、りん酸緩衝液（４１ml、pＨ７）
およびＤＭＦ（８ml)の混合液に前述のように製造され
たブロモアセチルグリシルＢＳＡ（２５０mg）を溶かし
たもの［結合に用いられた溶液は窒素ガスで飽和した］
に加えた。次いで、生成する混合物を全部で７２時間５
℃で窒素雰囲気下攪拌し、ＮＨ₄ＯＨ／Ｈ₂Ｏ（１０×
４）に対して完全に透析した。次いで、コンジュゲート
を凍結乾燥して蛋白質１９４mgを得た（ハプテン番号２
４）。

【００４４】参考例１０ トランス−３−アミノ−Ｎ'−(メルカプトアセチル)ノ
ルトリプチリンおよびブロモアセチルグリシルＧ−６−
ＰＤＨのコンジュゲートの製造 ａ．ブロモアセチルグリシン（ＢＡＧ）およびＧ−６−
ＰＤＨの製造 米国特許第４,２２０,７２２号明細書第１８〜１９段に
開示された手順に従い、前記ＢＡＧ／Ｇ−６−ＰＤＨ結
合体を製造した（この公報を引用して説明の一部とす
る）。この結合体を４リットルのトリス緩衝液に対して
透析したが保存剤は用いない（０.０５％アジ化物、０.
０５％チメラソール（Thimerasol))。こうして６.１ml
中、結合体１３.８mgを得た。

【００４５】ｂ．トランス−３−アミノ−Ｎ'−(メルカ
プトアセチル)ノルトリプチリンとブロモアセチルグリ
シルＧ−６−ＰＤＨのコンジュゲート 参考例７で得たトランス−３−アミノ−Ｎ'−(メルカプ
トアセチル)ノルトリプチリン１９mgと氷酢酸５０μlを
含有するＤＭＦ０.５mlからなる溶液を製造した。この
溶液（１２５μl）をアルゴンを用いて脱余し、前に透
析されたＢＡＧ／Ｇ−６−ＰＤＨ ６.１mlに加えた。生
成する混合物を４℃で３.５時間攪拌し、次いで遠心分
離した。上清をセファデックス（Sephadex）Ｇ−５０カ
ラム上クロマトグラフィーに付し、蛋白質含有フラクシ
ョンを集めた。生成物は８４％不活性化され４０％抑制
可能であった。

【００４６】参考例１１ Ｇ−６−ＰＤＨおよび５−(３−Ｎ−メチルアミノプロ
ピル)−１０,１１−ジヒドロ−１０−チオアセトアミド
−５Ｈ−ジベンゾ[ｂ,ｆ]アゼピンのコンジュゲートの
製造 ａ．０.０５５Ｍトリス緩衝液（pＨ８.０）８mlを用い
て４℃でブロモアセチルグリシンおよびＧ−６−ＰＤＨ
（６１mg）のコンジュゲートを製造し、Ｇ−６−Ｐ（Ｎ
a₂）塩およびＮＡＤＨのそれぞれ３２０mgを加えて溶解
させた。この溶液に、前記参考例１０のように製造した
０.５ＭブロモアセチルグリシルＮＨＳエステルＤＭＦ
溶液を攪拌しながら徐々に加えて酵素の不活性度を６５
％とした。この溶液を１８時間トリス緩衝液（０.０５
５Ｍ、pＨ８.０、４０００ml）に対して透析した。

【００４７】ｂ．５−(３−Ｎ−メチルアミノプロピル)
−１０,１１−ジヒドロ−１０−チオアセトアミド−５
Ｈ−ジベンゾ[ｂ,ｆ]アゼピンとブロモアセチルグリシ
ルＧ−６−ＰＤＨのコンジュゲート 参考例５で得たハプテン原料（６３mg）を脱気ＤＭＦ
１.５ml中で再構成させた。参考例９で得た全ての透析
された原料をフラスコ内に入れ、４℃まで冷却し、アル
ゴン気流下２時間脱気した。ハプテン対酵素比率約９５
になるまでこのハプテンを攪拌しながら徐々に加えた。
抗ＤＭＩ抗体に対する抑制率は４５〜５０％であった。
次いで、Ｇ−６−ＰＤＨコンジュゲートをＧ５０カラム
上４℃で保存剤を含むトリス緩衝液（０.０５５Ｍ、pＨ
８.０）を用いて脱塩した。

【００４８】実施例１ ノルトリプチリンアッセイ この発明に従って製造された化合物の有効性を明らかに
するため、参考例８のコンジュゲートに対応して従来方
法で製造された抗体および参考例１１で製造された酵素
コンジュゲートをいくつかのノルトリプチリンアッセイ
で用いた。アッセイを行なう際、フローセルのついたサ
ーモキュベットと共にギルフォード・スティザー［（Gi
lford Stazar）商標］分光光度計を用いた。全示数を３
４０nmで測定した。アッセイで用いる試剤として次の溶
液を製造した。

【００４９】緩衝液 :０.０５５Ｍトリス−ＨＣｌ pＨ
８.１（ＲＴ）参考例１１ｂで得た酵素コンジュゲート 緩衝液 ０.９％ ＮaＣｌ １.０％ ＢＬＧ、ｐＨ ８.１（ＲＴ） アッセイ媒質において７００〜１０００に等しいΔＯＤ
の最大割合を与えるのに十分な参考例１１による酵素コ
ンジュゲート アッセイ緩衝液 緩衝液 ０.５％ ＮaＣl １.００％［v／v．トリトン（Triton ）Ｘ−１００、p
Ｈ８.１(ＲＴ)］ 抗体試薬 緩衝液 ０.１％ ＢＬＧ Ｇ−６−Ｐ（Ｎa）０.１９８Ｍ ＮＡＤ ０.１２Ｍ、ｐＨ５（ＲＴ） アッセイに最適な抗ノルトリプチリン（参考例９のコン
ジュゲートを用いてひつじ中で製造された抗体） ％は全て w／v、g／ml

【００５０】アッセイを実施するために用いる実験計画
は次のとおりであった。まず最初に試料を処理して代謝
産物を除去した。１００mgのＣ−２カラムを約１mlのメ
タノール、次に約１mlの水で洗浄した。試料（５００μ
l）をカラムの頂部に置いた。減圧装置を底につけてカ
ラムを減圧した。得られた溶離剤を捨て、カラムを７０
％０.１Ｍ酢酸ナトリウム（pＨ４.２）、３０％アセト
ニトリルおよび５mMヘプタンスルホネートからなる溶液
９００μlで洗浄した。再びカラムを真空状態にし、溶
離剤を捨てた。次に、カラムを、５０％アセトニトリ
ル、２５％メタノールおよび２５％５ミリモルＫ₂ＨＰ
Ｏ₄、pＨ７からなる溶液５００μlと接触させた。溶離
剤を集め、アッセイ工程で用いた。

【００５１】上記試料１５マイクロリットル（μl）を
希釈器に導入した。この試料を２５０マイクロリットル
のアッセイ緩衝液と共に１ミリリットルのクローン(Cro
an）カップへ投入した。このクローンカップ中にアッセ
イ緩衝液２５０μlと共に抗体試薬１１５μlを導入し、
次に酵素試薬１５μlとアッセイ緩衝液２５０μlを加え
た。酵素添加後直ちに、試料全体をフローセルに吸引し
た。１０秒後最初の示数を読み取り、５０秒おいて２番
目の示数を読み取った。結果は吸収×２.６６７の差と
して記録した。

【００５２】

【表１】

【００５３】このアッセイは血漿のような生物学的流体
におけるノルトリプチリンを測定する高感度かつ正確な
方法を提供する。この発明はノルトリプチリンに対して
特異的な試剤を提供するものであり、ノルトリプチリン
の濃度変化に伴なう酵素活性の変化の実質的範囲をもた
らすものである。この方法は速やかに行なえるものであ
り、実験計画は単純で、比較的技術者が誘発する誤差が
少ないものであり、酵素アッセイと実質的に同様に行な
うことができる。前述の発明について、明確さと理解し
易さを目的として例証および実施例を通して詳しく記述
してきたが、明らかに本明細書の特許請求の範囲内にお
いて変更または修正を行なうことができるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 プリシパル・シング アメリカ合衆国カリフォルニア94087、サ ニーベイル、イーグル・ドライブ1614番

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）ノルトリプチリンを測定すべき血
   清サンプルを洗浄したクロマトグラフカラムに加え、
   （ｂ）このカラムを約７０％０.１Ｍ酢酸ナトリウム溶
   液（ｐＨ約４.２）、約３０％アセトニトリルおよび約
   ５mＭヘプタンスルホネートで洗浄して該カラムからノ
   ルトリプチリン代謝産物を実質的に除去する一方、該カ
   ラムにノルトリプチリンを残存せしめ、（ｃ）このカラ
   ムに約５０％アセトニトリル、約２５％メタノールおよ
   び約２５％５mＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄ ｐＨ約７を流してノルト
   リプチリンの本質的な部分を溶出させることを特徴とす
   るノルトリプチリン測定用血清サンプルの調製法。