JPS6178398A - ビリルビンオキシダ−ゼによる基質の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はビリルビンオキシダーゼによる基質の定量法に
関する。さらに詳しくはビリルビンオキシダーゼにより
ヒドロキシ化合物又はアミノ化合物を定量する方法に関
し、体液中の各種加水分解酵素活性の定量法に適用でき
る。

体液中の各種加水分解酵素活性の定■は有用な診断情報
を与えるものとして臨床的意義の重要性が高い。加水分
解酵素としては例えばロイシンアミノペプチダーゼ、ｒ
−グルタミルトランスベブチターゼ、シスチンアミノペ
プチダーゼの様な各種（アミノ）ペプチダーゼやトリプ
シン、α−キモトリプシン、プラスミン、トロンビン、
カリクレイン、ウロキナーゼ、エンドトキシン、第Ｘａ
　の因子、コラゲナーゼ、エラスターゼ、カヂブシンの
様な各種プロテアーゼ、アミラーゼやグルフシダーゼの
様な各種糖加水分解酵素、アルカリフＡスファターゼ、
酸性フォスファターゼの様な各種フォスファターゼ、エ
ステラーゼ、リパーゼの様な各種脂質加水分解酵素等が
挙げられる。これらの臨床的意義としては各種臓器疾患
、腫瘍等の診断して有効な情報を与える。

（従来の技術） フェノール又はその誘導体、アニリン又はその誘導体の
定量法としては例えばフォスファターゼ活性の測定して
よく利用されているフェノール化合物をフェリシアン化
カリウム存在下、４−アミノアンチピリンと酸化縮合さ
せ比色定置する方法（例えば斉藤正行他　眸床化学分析
■Ｊ（昭和４６゜う ７．２１東京化学同人ｐｌｏｏ　）やｒ−グルタミルド
（ンスベプチダーゼ活性測定によく利用されているアミ
ノ化合物をメタ過ヨード酸により適当なカプラーと酸化
縮合させ比色定量をする方法（例えば高林利行他、臨床
病理（補）　２９．　ｐ５３ａ（１９７９））、あるい
はロイシンアミノペプチダーゼ活性測定テみられるアミ
ノ化合物を亜硝酸塩でジアゾ化して適当なカプラーとカ
ップリングさせそののち比色定置する方法（例えばＪ、
Ａ、Ｇｏｌｄｂａｒｇ、Ｃａｎｃｅｒ　ｕ。

ｐ２Ｂ３（１９５８））などの化学的な方法による比色
定量法がある。

一方酵素を利用する定量法としては例えばフォスファタ
ーゼ活性を測定する場合、過酸化水素の存在下フェノー
ル化合物をペルオキシダーゼを用いて適当な、例えば４
−アミノアンチピリンと酸化縮合させ比色定置する方法
が知られている。

（発明が解決しようとする問題点） 化学的酸化剤（例えばフェリシアン化カリ、メタ過ヨー
ド酸）や亜硝酸塩を用いるジアゾカップリング法を用い
る化学的な方法では目的とする酵素活性は、目的とする
酵素の反応条件と検出して利用される酸化反応やジアゾ
カップリング反応条件が異なることや、検出反応して利
用される酸化剤やジアゾ化剤が目的とする酵素を阻害す
る点などにより、検出反応と同時同一の反応条件下で検
出することが出来ない為に操作段階が多く、測定時間も
長く、全体に測定が繁雑となる・又フェリシアン化カリ
ウムの様な有害な薬品を使用する点や塩酸酸性下でのジ
アゾ化反応の様に苛酷な反応条件が必要な点で問題があ
る。一方ベルオキシダ５去 一ゼを用いる酵素制は反応に過酸化水素が必要であるが
、過酸化水素は非常に不安定な物質である為に正確な測
定が出来ずほとんど利用されていない。

（問題を解決する為の手段） 本発明者等はかかる従来の欠点を解消し、温和な反応条
件下で操作性、簡便性の点で優れ、正確度の高いヒドロ
キシ化合物又はアミノ化合物の定量法を見い出すべく、
鋭意検討の結果、カプラーノ共存下、下記化合物〔工〕
にビリルビンオキシダーゼを作用させることによりその
目的を達成することが見出された。すなわち本発明は下
記一般式（１）で表わされる基質にカプラーの共存下、
ビリルビンオキシダーゼを作用させ・生成する色素を測
定することを特徴とするビリルビンオキシダーゼによる
基質の定量法である。

（式中、Ｘは水酸基又はアミン基を示し、Ｚは置換基Ｘ
以外の置換基を示し、それは水素原子、）１０ゲン原子
、低級アルキル基、低級アルコキシル基、アミ７基、水
酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、置換アミ７基を
示し、ｎ−１〜５である。

複数のＺは同じでも異なっていてもよく１又置換基Ｘの
オルト位とメタ位で環を形成する基であってもよい。） 従来、ビリルビンオキシダーゼはビリルビンをビリベル
ジンに変換する酸化酵素（Ｎ、Ｔａｎａｋａ。

Ａｇｒｉｏ　Ｂｉｏｌ、（！ｈｅｍ、、４ａ、２３８３
　（１９８１）　）として知られ、その基質特異性につ
いては日本臨床化学会年金記録、２３巻、第７の頁に４
−アミノアンチピリンがビリルビン以外の基質として成
り得ることが記載されているがその特異性はビリルビン
を１００％とした場合、わずか２％以下で、実際にはビ
リルビンに非常に高い基質特異性がある酸化酵素として
知られていた。ところが本発明者らは意外ニもビリルビ
ンオキシダーゼが上記化合物（Ｉ）で示される様な構造
をもったアミノ化合物、ヒドロキシ化合物が基質として
成り得ることを見い出した。

その化合物の特徴は芳香族化合物でアミン基、水酸基を
もつ化合物である点であり、上記の４−アミノアンチピ
リンと異なる構造式をもつもので、しかも実用的に実施
可能な高い反応性を示すものである。

本発明では被検液中の一般式（１）で表わされる化合物
にカプラーの共存下、ビリルビンオキシダーゼを作用さ
せることにより温和な反応条件下で操作性簡便性に優れ
、正確度の高い上記化合物ＣＩ）の定量法を行なうこと
ができる。

使用されるビリルビンオキシダーゼとしては、反応にお
いて酸素の存在下化合物ＣＩ）と共存するカプラーと反
応させて新たな分光学的な吸収を示す酸化縮合物を生成
するものであれば、いかなる起源のものでもよい。例え
ばミロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　）属由来（
Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃ！ｈｅｍ、、　４５゜２３８
３（１９８１）　　）のものが知られている。

次に使用されるカプラーとしては一般式（１）で表わさ
れる化合物と酸化縮合して分光学的に新たな吸収をもつ
化合物を形成するものであればいかなるものでもよい。

例えばフェノール、ｐ−キシロフェノールスルホン酸、
３−ハイドロキシ−２゜４．６−ドリヨード安息香酸の
様なフェノールまたはその誘導体や・Ｎ、Ｎ−ジメチル
アニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチルーｍ−トルイジン、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−）ルイジン、３−メチルーＮ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシエチル）アニリン、ｐ−Ｎ、Ｎ−ジエ
チルアミノアニリンの様なアニリン誘導体やナフトール
又は１−ナフトール−２−スルホン酸の様なナフトール
またはその誘導体や、３−メチル−２−ベンゾチアゾリ
ノンヒドラゾンの様なベンゾチアゾリノン誘導体等が挙
げられる。

基質として一般式（１）で表わされるヒドロキシ化合物
を定量する場合には、カプラーとじで上記第三級アミノ
基を有するアニリン誘導体、ベンゾチアゾリノン誘導体
が好ましい。基質として一般式ＣＩ）で表わされるアミ
ン化合物を定量する場合■ には、カプラー鬼して上記フェノール又はその誘導体、
ナフトール又はその誘導体、上記第三級アミノ基を有す
るアニリン誘導体、ベンゾチアゾリノン誘導体が好まし
い。例えば、４−ヒドロキシ−３，５−ジブロモアニリ
ン、ｐ　−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリン、ｐ−モル
７オリノアニリン、５−アミノサリチル酸、２−アミノ
−５−ジエチルアミノトルエン、４−アミノ−Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（β−メタンスルホンアミドエチル）−ｍ−ト
ルイジン、４−アミノ−３−メチル−Ｎ−（β−ヒドロ
キシエチル）−Ｎ−エチルアニリン、ｐ−アミノ−Ｎ−
エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリン等のアミノ化合
物が挙げられる。ヒドロキシ化合物としては５−アミノ
−サリチル酸、２．４−ジクロロフェノール、３，５−
ジクロロフェノールスルホン酸、３−ハイドロキシ−２
，４，６−）リョード安息香酸１−す７トールー２−ス
ルホン酸、４−アミノ−３，５−ジブロムフェノール等
の化合物が挙げられる。

ビリルビンオキシダーゼを作用させる条件とし一　〇　
− では、特に限定はないが被検液中の加水分解酵素活性を
求める様な場合は、該加水分解酵素が作用する条件の田
を保つ綴衝液で使用することが多い。

通常用は４．０〜１０．０　　に保つ様な綴衝液が用い
られる。使用量としては反応が充分進行する量であれば
よく、例えば反応液１−当り０．１〜１００単位もあれ
ば充分である。反応温間としては通常臨床化学分析に利
用される温度、例えば２０〜５０°０の範囲で行えば良
い。用いられるカップラーの濃度としては化合物ＣＩ）
に対して等モル以上を用いればよく、場合によっては上
限として酵素活性を阻害しない程変の量となる。

ビリルビンオキシダーゼを作用させた後の化合物（１）
の実際の定量は生成してくる酸化縮合物の分光学的な吸
光度の変化を測定するか、またはビリルビンオキシダー
ゼにより消費される酸素を酸素電極等で測定するかして
対応する化合物ＣＩ）あるいは加水分解酵素活性を求め
る。

（発明の効果） 本発明に従えば温和な条件で簡単な操作で簡便に正確度
高く化合物ＣＩ）の定量が可能となり、臨床検査の診断
分野における加水分解酵素の分析にとって極めて有意義
である。

（実施例） 以下実施例により本発明を説明する。

実施例　Ｌ 被検液中の各種アミノ化合物として下記化合物を用い、
下記各種カプラーとビリルビンオキシダーゼを含試薬と
反応させた。

Ａ、アミノ化合物 １、、ｐ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリンＺｐ−モル
ホリノアニリン ＆　４−アミノ−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−メタンスルホ
ンアミドエチル）−ｍ−トハイジン Ｂ、カプラー １、　　ｐ−キシレノール ２＋２．５−ジクロロフェノールスルホン酸＆　Ｎ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
ｍ−）ルイジン Ｃ０試薬 ビリルビンオキシダーゼ（天野製薬製）　ｌ　Ｕ／ｍｌ
カプラー　　　　　　　　　　　　　４ｍＭ０．Ｉ　Ｍ
リン酸緩衝液（田ワ、０） Ｄ、測定方法 上記試薬（Ｃ）　２．５　＠ｔに各種アミン化合物（０
，１５ｍＭ相当）０．５−を加えて３７℃で反応させる
。生成した色素の吸収波長を第１図〜第９図に示す。ア
ミノ化合物とカプラーの組合せは第１表に示す。

実施例　２ 被検液中の各種ヒドロキシ化合物（Ａ）を下記試薬（Ｃ
）を用い、下記各種カプラー（Ｂ）とビリルビンオキシ
ダーゼと反応させた。

ｚ　３−ハイドロキシ−２，４，６−）リョード安息香
酸 ＆３．５−ジクロロフェノールスルホン酸Ｂ、カプラー Ｌ　ジエチルフェニレンジアミン ｚ　２，６ジブロモアミノフエノール Ｃ１試薬 ビリルビン機をダーゼ（天野製薬製）１を廓カプラー　
　　　　　　　　　　０　、０１５ｍＭＯ１ＩＭリン酸
緩衝液（田７．０） Ｄ、測定方法 上記試薬（Ｃ）２．５ｓＬｔに各種ヒドロキシ化合物（
Ａ）　（２０ｍ　Ｍ相当）０．９−を加えて３７℃で反
応させる。生成した色素の吸収曲線を第１０図〜第１４
図に示す。ヒドロキシ化合物とカプラーの組合せは第２
表に示す。

第　　２　　表 実施例　工 被検浴中のｒ−ＧＴＰを下記試薬を用い、下記方法によ
り定量した。

Ｌ試薬 ０．１５Ｍグリシルグリミン緩衝液（ｐＨ’７．９）Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロヒル
）−ｍ−トルイジン　３．６ｍＭビリルビンオキシダー
ゼ（天野製薬製）　　　ＩＵ／ｍＬ−ｒ−グルタミル−
ｐ−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアミノアニリド
（和光紬薬製）　　　６ｍＭ田は苛性ソーダで調整する
。

２　測定方法 上記試薬２．９−に被検液５０μｌ　を加え、３７℃で
反応させ、波長’７４５　ｎｍ　での吸光度の変化を測
定し、レートアッセイ法によりｒ−ＧＴＰ活性を定量す
る。

第１５図にその検量線を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第９図は本発明の実施例１における生成した色
素の吸収波長を示す。 第１０図〜第１４図は本発明の実施例２における生成し
た色素の吸収波長を示す。 第１５図は本発明の実施例３における生成した色素の吸
収波長を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記一般式（ I ）で表わされる基質にカプラーの共存
   下、ビリルビンオキシダーゼを作用させ、生成する色素
   を測定することを特徴とするビリルビンオキシダーゼに
   よる基質の定量法。 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 （式中、Ｘは水酸基又はアミノ基を示し、Ｚは置換基Ｘ
   以外の置換基を示し、それは水素原子、ハロゲン原子、
   低級アルキル基、低級アルコキシル基、アミノ基、水酸
   基、カルボキシル基、スルホン酸基、置換アミノ基を示
   し、ｎ＝１〜５である。 複数のＺは同じでも異なつていてもよく、又置換基Ｘの
   オルト位とメタ位で環を形成する基であつてもよい。）