JPH06209666A - シクラメン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 シクラメンの優良個体のクローン大量増殖技
術の確立を図ること。 【構成】 無菌化して吸水催芽処理した完熟種子より取
り出した胚を２，４−Ｄとサイトカイニンとショ糖を含
むＬＳ固形培地に置床して培養して品種、系統間で分化
の程度に大きな差がないようなシクラメンの不定胚を誘
導する。また。シクラメンの不定胚を棒状胚まで分化、
発育させた後、暗黒下、１０〜２５℃で培養し、発根
（発芽）率を向上させる。また、シクラメンの不定胚を
２，４−Ｄとカイネチンを用いて固形培地上で培養して
植物体を再生するシクラメン育種母本の作出することで
不定胚由来のシクラメンのＦ₁ハイブリッド親の作出の
効率化を図る。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

【０００１】本発明は、シクラメンの植物体の再生方法
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】シクラメンの優良園芸品種の大量増殖に
関する研究は現在までのところ、ほとんど報告されてい
ないが、大谷らは品種「テーブル ミニ ライラック
ローズ」の播種後一年目の植物体の展開葉からカルスを
誘導して、そのカルスから不定胚を得る方法について報
告している（園芸学会雑誌、第５８巻別冊１、１９８９
年５７４頁）。これによれば、大谷らの不定胚誘導手順
は次の通りである。

【０００３】まず、展開葉を滅菌後、２，４−ジクロロ
フェノキシ酢酸（以下、２，４−Ｄと言う。）、カイネ
チン、ジェランガム、５％ショ糖を加え、ｐＨを５．０
にしたＬＳ培地で暗黒下に培養して二種類のカルスを得
る。一つはフライアブルなカルスで、他方は緻密で硬い
カルスである。フライアブルカルスをＬＳ培地にα−ナ
フタレン酢酸（以下、ＮＡＡと言う。）、カイネチン等
を添加して、カルス増殖と不定胚形成を同時に続けて、
４０〜５０日間隔で継代培養する。

【０００４】継代培養培地で形成された不定胚をＮＡ
Ａ、カイネチン、ジェランガム、５％ショ糖等を加えた
１／２濃度のＬＳ培地で照明下に培養すると塊茎様体を
経て幼植物体が得られる。この幼植物体を１／２濃度の
ＬＳホルモンフリー培地（１．５％ショ糖、０．２％ジ
ェランガム含有）で照明下に培養して植物体を得る。そ
して、展開葉が５〜１０枚になった植物体を鉢上げする
と開花する。なお、不定胚から幼植物体誘導時に上記ホ
ルモンの他にインドール酢酸（ＩＡＡ）を添加する報告
（Ｇ．ＷＩＣＡＲＴら、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ １１
９巻 １５９−１６７頁、１９８４年）もある。

【０００５】また、大橋らは品種ショパンＮｏ．１２の
培養株の組織（根）から軟カルス、不定胚を経て小植物
を得ることができたと報告している（園芸学会雑誌、第
６０巻、別冊１（１９９１年））。この報告によれば、
つぼみ内組織（花柱、子房壁、花弁、葯、胎座）または
同系統の培養株の組織（葉身、葉柄、塊茎、根）をショ
糖６％、ｐＨ５．６、ゲルライト０．２％を含むＭＳ培
地を基本培地として、これに２，４−Ｄ１．０ｍｇ／リ
ットルおよび２，４−Ｄ１．０ｍｇ／リットル、ＢＡ
０．１ｍｇ／リットルを添加した二種類の培地に置床し
て、置床３０日間経過後にショ糖６％、ｐＨ５．６、ゲ
ルライト０．２％を含むＭＳ培地に移植する。この間の
培養はすべて２５℃、暗黒下に行い、軟カルスの形成が
あったのは胎座と根であり、根を２，４−Ｄ１．０ｍｇ
／リットル、ＢＡ０．１ｍｇ／リットルの培地に置床し
たときにのみ、不定胚が形成され、１９個（置床数の９
５％）の小植物が分化したというものである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記、大谷らのシクラ
メンのカルスおよび不定胚誘導法によると、１ｍｇ／リ
ットルの２，４−Ｄ（オーキシン）と０．５ｍｇ／リッ
トルのカイネチン（サイトカイニン）からは１００％カ
ルスが誘導されるが、このカルスからは不定胚を形成す
るフライアブルカルスは全く得られていない。フライア
ブルカルスはホルモンとして１ｍｇ／リットルの２，４
−Ｄを単独で添加した培地と１ｍｇ／リットルの２，４
−Ｄと０．１ｍｇ／リットルのカイネチンを含む培地か
らそれぞれ１４．３％（緻密で硬いカルスを含めると３
５．７％）、４６．７％得られるのみである。このよう
にフライアブルカルスの形成率が低いと、カルスからの
不定胚大量培養に有利な液体培養に適さない。また、前
記大橋らの誘導方法では、シクラメンの胚様体カルスの
誘導は品種、系統間で分化の程度に大きな差がみられ、
分化のみられる品種、系統でも最適な植物調節物質の濃
度は異なることが報告されている。

【０００７】本発明者らは既に、パーシカム系固定種シ
クラメンの外植片を２，４−Ｄとカイネチンを含む培地
で培養してカルスを誘導し、該カルスをホルモンを含ま
ない培地で不定胚を誘導すること、および該不定胚を液
体培地で振とう培養することで、不定胚を分離すること
に成功し、その方法について特許出願（特願平２−４１
６８８０号）している。

【０００８】また、本発明者らは、大量培養に適した液
体培養系でのシクラメンの不定胚の効率的な誘導法を確
立すべく次のような液体培養技術を完成し、特許出願し
た（特願平３−３４９１２６号）。すなわち、その方法
はシクラメンの外植片を２，４−Ｄとカイネチンを含む
固形培地にて培養し、カルスを生成させた後、ホルモン
類を含まない固形培地にて、小瘤状の不定胚を誘導し、
該不定胚を２，４−Ｄとカイネチンを含む液体培地にて
培養し、得られた培養物から３０μｍ以上、２ｍｍ以下
の大きさの細胞塊のみをメッシュで選別しながら継代増
殖させるシクラメンの不定胚誘導方法である。しかし、
この方法も葉柄を外植片としている場合に成功したにす
ぎず、シクラメンでは品種間差、個体差が大きく、これ
を解決する手段を必要としていた。そこで、本発明の第
一の目的はシクラメンの胚様体カルスの誘導は品種、系
統間で分化の程度に大きな差がないようなシクラメンの
不定導方法を確立することである。

【０００９】また、シクラメンの種子の発芽適温は２０
℃前後であるが、不定胚の発根については前記大谷らの
報告では２６℃で発芽させ、前記大橋らの報告では２０
℃と２５℃で発芽させた例があるのみで、シクラメンの
種子から誘導した不定胚の発根条件についての詳細な検
討はなされていない。そこで本発明の第二の目的はシク
ラメンの種子等の不定胚から分化、発育させた棒状胚の
発根条件を確立することを目的としている。

【００１０】さらに、イネの不定胚由来の再生植物体は
培養系の種類により稔実率が−８５．９％から−２７％
と低下したが、これは雄性不稔によるものであることが
松野らによって報告されている（育種学雑誌第４１巻、
別冊２、３１２頁、１９９１年）。一方、シクラメンで
は大谷らが前記雑誌に不定胚から再生した植物体は正常
であったことを報告している。一方、本発明者らは本発
明者らが開発したシクラメンの不定胚から植物体を再生
すべく研究を重ねて来た。そこで、本発明の第三の目的
はシクラメンの不定胚由来のシクラメンのＦ₁ハイブリ
ッド親の作出の効率化を図ることである。このように本
発明はシクラメンの優良個体のクローン大量増殖技術の
確立を図ることを目的としている。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記本発明の第一の目的
は次の第一発明の構成によって達成される。すなわち、
無菌化して吸水催芽処理した完熟種子より取り出した胚
を２，４−Ｄとサイトカイニンとショ糖を含むＬＳ固形
培地に置床して培養するシクラメン胚様体カルスの誘導
方法である。２，４−Ｄとサイトカイニンの培地への添
加量は特に制限はないが、それぞれ０．１〜１０ｐｐ
ｍ、０．００１〜１０ｐｐｍ含ませることが好ましい。
サイトカイニンとしてはカイネチン、ＢＡ（ベンジルア
ミノプリン）またはゼアチンを用いることができる。ま
た、培地はショ糖を１〜１２％以上含むことが胚様体カ
ルスの誘導には望ましい。本発明に用いられる完熟種子
から取り出した胚の培養を行う培地は固形培地であれ
ば、一般的に植物の培養に用いられる培地を使用するこ
とができる。また、本発明で行われる無菌化処理は一般
的に行われている無菌化処理法を適用できる。また、吸
水催芽処理も一般的に行われている無菌化処理法を適用
できる。

【００１２】本発明によると胚様体カルスは球状胚や棒
状胚状の不定胚を生成しながら増殖する。本発明者らは
先にシクラメン不定胚の液体培地での大量培養法を提案
しているが（特願平３−３４９１２６号）が、これは葉
柄を外植片としている。前記したように、この特願平３
−３４９１２６号記載の方法では液体で大量培養可能な
不定胚は２ｍｍ以下３０μｍ以上のメッシュで選別され
たものである。本発明によれば、完熟種子中の胚の長さ
約２ｍｍ、径約０．２ｍｍ程度の棒状胚であるが、その
棒状胚から誘導されたカルスは長さ約２ｍｍ程度の棒状
胚、それ以下の大きさの球状胚、そして、それ以下の小
細胞塊より構成され、上記特願平３−３４９１２６号公
報に開示した液体培養の目的にかなうカルスとなり得
る。こうして、品種、系統間で分化の程度に大きな差が
ないカルスから不定胚の大量培養が可能となり、シクラ
メンの液体培養での不定胚を利用した効率的大量増殖法
の開発の可能性が広がった。

【００１３】本発明の第二の目的は次の第二発明の構成
によって達成される。すなわち、シクラメンの不定胚を
棒状胚まで分化、発育させた後、暗黒下、１０〜２５℃
で発根させるシクラメンの不定胚の発根方法である。不
定胚の発根温度は１０〜２５℃であるが、好ましくは１
５〜２３℃である。このとき、棒状胚を発根させる固形
培地のゲルライト濃度を０．２〜０．４％とすると不定
胚の発芽（塊茎化・発根・出芽）率が向上する。また、
棒状胚を発根させる固形培地の無機塩濃度を分化、発育
させた基本培地１／２以下とすることでも不定胚の発根
率が向上する。なお、不定胚は根端部からでも得ること
ができる。ただし、根端部の培養に用いるサイトカイニ
ンはカイネチンに限定される。

【００１４】本発明の第三の目的は次の第三発明の構成
によって達成される。すなわち、シクラメンの不定胚を
２，４−Ｄとカイネチンを用いて固形培地上で培養して
植物体を再生するシクラメン育種母本の作出方法であ
る。また、このとき再生植物体のうち染色体数が正常で
雄性不稔の変異株を選抜すすることで熟練の必要な除雄
交配を必要としないＦ₁ハイブリッド作出が可能とな
る。

【００１５】

【作用】本発明の第一発明は種子が強固な種皮を持つこ
とに着目したもので、強固な種皮を持つ種子を苛酷な滅
菌処理をしても中の胚にはほとんど影響せず、外植片
（胚）の無菌化が容易であるを見いだしたことに基づき
完成されたものである。

【００１６】一般に、葉片や葉柄の無菌化は非常に困難
で、そのため黄化処理（光を当てずに葉を黄色にさせる
処理（図解組織培養入門、古川仁朗編著、誠文堂新光
社、７２頁、参照）などをしてから無菌化している。さ
らには塩化水銀という強力で有害な滅菌剤も利用されて
いる。一方、本発明によれば、完熟種子を無菌化して吸
水催芽処理して取り出した胚を外植片として用いるの
で、ほとんどの品種について胚様体カルスが得られる。

【００１７】第二発明によれば、２５℃では全体平均１
％しか発根しないが、２０℃では全体平均で３８％が発
根し、約４０倍分化率が向上した（カルス化したものを
除く）。このように、不定胚の分化率（発根率）を向上
させることにより不定胚培養系における苗生産コストの
低減を図れる。

【００１８】一般に、Ｆ₁ハイブリッドを作るためには
雄性不稔系と維持系と回復系の３種の株が必要であり、
交配による選抜は栽培期間が長い（シクラメンで約１
年）ため効率が悪かったが、第三発明によれば、フラス
コレベルの培養で変異を誘発させ雄性不稔系を作出でき
るため効率が上がる。いったん雄性不稔の培養系をつく
れば培養でクローン増殖できるで維持系は不要となり、
雄性不稔系と回復系たけの２系法でハイブリッドの作出
が可能となる。不定胚由来の再生植物体で染色体数が正
常で雄性不稔のシクラメンが得られる。

【００１９】

【実施例】本発明の実施例を説明する。 実施例１ シクラメンの品種「フィンランディア」の完熟種子を７
０％エタノールに１０秒間、１％アンチホルミンに４０
分間浸漬して滅菌処理して無菌化した後、吸水催芽処理
を行い、次いで、ＬＳホルモンフリー固形培地で２５
℃、暗黒下に１〜３０日間静置して吸水催芽処理する。
そして、胚を取り出し、これを２、４−Ｄを１ｐｐｍ、
カイネチンを０．１ｐｐｍ、ショ糖を５％含むＬＳ固形
培地に２５℃で暗黒下、２カ月間静置させて、胚様体カ
ルスを得る。得られた胚様体カルスの写真を図１に示
す。また、本発明は品種等を選ばない方法であるので、
その他の品種、例えば「嵯峨」、「ロザムンデ」、「ラ
ージホワイト」等でも同様に誘導が可能である。

【００２０】前記したように、この特願平３−３４９１
２６号記載の方法では液体で大量培養可能な不定胚は２
ｍｍ以下３０μｍ以上のメッシュで選別されたものであ
る。本実施例に記載の完熟種子中の胚は、その長さ約２
ｍｍ、径約０．２ｍｍ程度の棒状胚であるが、その棒状
胚から誘導されたカルスは長さ約２ｍｍ程度の棒状胚、
それ以下の大きさの球状胚、そして、それ以下の小細胞
塊より構成され、上記特願平３−３４９１２６号公報に
開示した液体培養の目的にかなうカルスとなり得る。こ
うして、品種、系統間で分化の程度に大きな差がないカ
ルスから不定胚の大量培養が可能となる。

【００２１】実施例２ 本実施例はシクラメンの不定胚から発根させる方法であ
る。シクラメンの葉柄からカルス、不定胚を誘導し、不
定胚から発根させるまでの手順を説明する。まず、品種
「ラージホワイト」の葉柄から２，４−Ｄを１ｐｐｍ、
カイネチンを０．５ｐｐｍ、ショ糖５％を含むＬＳ固形
培地で２５℃、暗黒下に３０日間静置しカルスを誘導す
る。このカルスをショ糖を３％含むＭＳ固形培地に２５
℃で暗黒下、３０日間静置して不定胚を誘導する。得ら
れた不定胚を２，４−Ｄを１ｐｐｍ、カイネチンを０．
５ｐｐｍ、ショ糖を５％含むＬＳ液体培地で２５℃で暗
黒下に２１日間液体培養する。２１日経過すると得られ
た不定胚をフィルターにより、大きさが５００μｍより
小さく１０６μｍ以上のものと５００μｍ以上のものに
選別し、５００μｍより小さく１０６μｍ以上のものは
再度前記不定胚液体培養系に戻し、５００μｍ以上の大
きさのものをＭＳ液体培地で棒状胚まで分化、発育処理
する。このとき、ＭＳ液体培地における不定胚密度は１
００ケ／ｍｌ以下とする。こうして不定胚を分化、発育
させて得られた棒状胚は、以下の条件で発根させるた。
２５℃と２０℃における発根データを表１と表２に示
す。

【００２２】 （表１） シクラメン不定胚の発根率に対する環境条件の影響 （温度×ゲルライト濃度×無機塩濃度） ゲルライト濃度（％） ０．２ ０．２５ ０．３ ０．４ 無 １ ０ ０ ０ ６ 機 濃 １／２ ０ ６ ０ ０ 塩 度 １／５ − ０ ０ ０ （％） １／１０ − − ０ ０ 全体平均発根率：１％ (２５℃)

【００２３】 （表２） シクラメン不定胚の発根率に対する環境条件の影響 （温度×ゲルライト濃度×無機塩濃度） ゲルライト濃度（％） ０．２ ０．２５ ０．３ ０．４ 無 １ １９ １３ ３８ １９ 機 濃 １／２ １９ ４４ ３８ ３８ 塩 度 １／５ − ５０ ５０ ５０ （％） １／１０ − − ６９ ５６ 全体平均発根率：３８％ ( ２０℃) なお、表１、表２に示す実験は共に次のような条件でお
こなった。 （１）カルス化したものは発根個体数から除外 （２）各区の不定胚供試数は１６ケ （３）２５℃、２０℃とも暗条件下、２カ月間培養、基
本培地はＭＳ培地（分化、発育の基本培地と同じ）な
お、表で（−）は培地が固化しないため実験が不可能で
あったことを示す。

【００２４】また、図２には無機塩濃度×１、２５℃、
暗黒下、２ケ月間の培養でのゲルライト濃度０．２％
（図中左上の１−１）、０．２５％（図中右上の１−
２）、０．３％（図中左下の１−３）、０．４％（図中
右下の１−４）の各発根の様子を示す。また、図３には
２０℃における無機塩濃度×１に対して、ゲルライト濃
度０．２％（図中左上の１−１）、０．２５（図中右上
の１−２）、０．３％（図中左下の１−３）、０．４％
（図中右下の１−４）の各発根の様子を示す。また、図
４には無機塩濃度×１／２、２０℃、暗黒下、２ケ月間
の培養でのゲルライト濃度０．２％（図中左上の２−
１）、０．２５（図中右上の２−２）、０．３％（図中
左下２−３）、０．４％（図中右下の２−４）の各発根
の様子を示す。図５には無機塩濃度×１／５、２０℃、
暗黒下、２ケ月間の培養でのゲルライト濃度０．２５％
（図中上の３−２）、０．３％（図中左下の３−３）、
０．４％（図中右下の３−４）の各発根の様子を示す。
また、図６には無機塩濃度×１／１０、２０℃、暗黒
下、２ケ月間の培養でのゲルライト濃度０．３％（図中
左の４−３）、０．４（図中右の４−４）の各発根の様
子を示す。表１、表２に示すように、２５℃では全体平
均１％しか発根しないが、２０℃では全体平均で３８％
発根し、約４０倍分化率が向上した（カルス化したもの
を除く）。また、ゲルライト濃度を０．２〜０．４％ま
で変化させた時の発根率は最大４４％となった。温度を
２０℃にした時の平均発根率３８％に対し、４４／３８
≒１．２倍発根率が向上したことになる。また、無機塩
濃度を１／５以下にした場合の発根率５０％以上で、最
大６９％となり、６９／４４≒１．６倍に向上した。ま
た、無機塩濃度は１／１０以下とすると培地が固化せず
発根生長が抑制される。

【００２５】また、本実施例に関連して、次の方法でシ
クラメンの不定胚から発根させることができる。この方
法はシクラメンの葉柄より２，４−Ｄとカイネチンを含
む固形培地でカルスを誘導させた後、ホルモンを除いた
固形培地にて不定胚を誘導し、この不定胚を再び２，４
−Ｄとカイネチンを含む液体培地にて振とう培養し、５
００μｍ以上の球状胚をホルモンを含まない液体培地に
て棒状胚まで分化、発育させ、棒状胚をホルモンを含ま
ず、かつ窒素源のアンモニア態窒素と硝酸態窒素の比を
１／１０以下とした固形培地にて培養して発根させる方
法である。

【００２６】さらに具体的に上記発根方法を記載すると
「ラージホワイト」の葉柄を２，４−Ｄを１ｐｐｍ、カ
イネチンを０．５ｐｐｍ、ショ糖を５％含むＬＳ固形培
地で２５℃、暗黒下に３０日間培養し、カルスを誘導す
る。ついでこのカルスから不定胚を誘導するために、シ
ョ糖を３％含有するＭＳ液体培地で２５℃、暗黒下３０
日間置き、得られた不定胚を、次いで２、４−Ｄを１ｐ
ｐｍ、カイネチンを０．０１ｐｐｍ、ショ糖５％を含む
ＬＳ液体培地で、２５℃、暗黒下に２１日間培養する。
こうして、得られた不定胚から５００μｍより小さく１
０６μｍ以上の大きさのものと５００μｍ以上の大きさ
のものとの選別を行い、５００μｍより小さく１０６μ
ｍ以上の大きさの不定胚は前記ＬＳ液体培地に戻し、再
度液体培養を行う。一方、５００μｍ以上の大きさの不
定胚は不定胚密度１００ケ／ｍｌ以下でＭＳ液体培地で
分化、発育させる。２０℃、暗黒下２１日間経過後発芽
（塊茎化・発根・出芽）した。発芽した様子を図７、ゲ
ルライト濃度０．２％）に示す。

【００２７】５００μｍ以上の球状胚をホルモンを含ま
ない液体培地にて棒状胚まで分化、発育させる前記方法
によると、発根率が４４／５０×１００＝８８％と実施
例２のＭＳ培地を使用した時の８８／６９＝１．２８倍
向上した。また、実施例３のＭＳ培地では棒状胚からカ
ルス化するものが５〜３０％程度でるのに対し、この方
法ではカルス化は完全に抑えられる。

【００２８】さらに、分化率（発根率）を向上させるこ
とにより不定胚培養系における苗生産コストを低減でき
る。一般に、不定胚からプラグ苗化させる際に未発芽の
部分は欠株となり、この部分を発芽したものを交換する
のに大きな労力を必要とするが、この方法により、前記
工程の省略化には発芽率向上が重要であり、前記方法は
この工程の省略化に対する効果が大である。さらに、ア
ンモニア態窒素と硝酸態窒素の比（モル比）が１／２の
ＭＳ培地で発根させた場合の発根率は最大６９％（実施
例２）であり、発根までの期間は２カ月間であるが、こ
の方法だと１カ月で可能となり期間が１／２に短縮でき
る。

【００２９】棒状胚は次の方法で誘導することもでき
る。すなわち、シクラメンの外植片を２，４−Ｄとカイ
ネチンを含む固形培地にて培養し、カルスを生成させた
後、ホルモンを含まない固形培地にて小瘤状の不定胚を
誘導し、該不定胚を２，４−Ｄとカイネチンを含む液体
培地にて培養し、得られた培養物から１００μｍ以上、
好ましくは５００μｍ以上の不定胚をホルモンを含まな
い液体培地にて振とう培養し、該不定胚を分化、発育す
る際に、不定胚密度を１００ケ／ｍｌ以下とすることを
特徴とする方法である。

【００３０】ニンジンでは不定胚の分化、発育に密度が
影響し、１５０ケ／ｍｌ以下にすると８０〜９０％が分
化（分化、発育）することが知られている。しかし、い
ままで、シクラメンでは球状胚から棒状胚への分化、発
育のための最適条件を検討した例は知られていない。上
記分化、発育方法でシクラメンの不定胚は不定胚密度を
１００ケ／ｍｌ以下にしないと分化、発育せず、約１５
０ケ／ｍｌでの分化率は約４５％となることを本発明者
らは発見した。液体培地により、この分化、発育が制御
できるのでタンク培養へのスケールアップが可能とな
る。また、球状胚に対して同調的に分化、発育できるの
で苗生産コストを低減させることができる。

【００３１】具体例で説明する。まず、「ラージホワイ
ト」の葉柄をＬＳ固形培地（２，４−Ｄ１ｐｐｍ、カイ
ネチン０．５ｐｐｍ、ショ糖５％含有）で２５℃、暗黒
下に３０日間培養しカルスを誘導する。得られたカルス
からショ糖を３％含むＭＳ固形培地で不定胚を２５℃、
暗黒下に３０日間培養する。ついで、この不定胚を２，
４−Ｄを１ｐｐｍ、カイネチンを０．０１ｐｐｍ、ショ
糖を５％含むＬＳ液体培地で２５℃、暗黒下に２１日間
培養する。そして、５００μｍより小さく１０６μｍ以
上の大きさの不定胚と５００μｍ以上の大きさのの不定
胚と選別し、前者は前記ＬＳ液体培地で２５℃、暗黒下
に培養する方法を繰り返し、５００μｍ以上の大きさの
不定胚はホルモンを含まないＭＳ液体培地で２５℃、２
１日間処理をすると棒状胚に分化、発育する。不定胚の
分化、発育に対する培養密度の効果を表３に示す。

【００３２】 （表３） (不定胚の分化、発育に対する培養密度の効果) 培養初発密度 分化、発育した不定胚（棒状胚） 分化、発育率 （ケ／ｍｌ） 密度 （ケ／ｍｌ） （％） ６５５ ０ ０ ３２１ ０ ０ ９１ ６ ６．６ ４７ ２１ ４４．７ また、低密度で分化、発育させた不定胚の写真を図８
に、高密度で分化、発育しない不定胚の写真を図９に示
す。

【００３３】また、本実施例に関連してシクラメンの不
定胚を誘導する２つの方法について述べる。その１つ
は、シクラメンの発芽された植物体の根端部を２，４−
Ｄとカイネチンを含み、かつ、ショ糖を３％以上含むＬ
Ｓ固形培地に置床して、培養することを特徴とするシク
ラメン胚様体カルスを誘導する方法である。当該カルス
は球状胚や棒状胚状の不定胚を生成しながら増殖する。

【００３４】この方法を具体的に述べるとシクラメンの
品種「嵯峨」を７０％エタノールに１０秒間、１％アン
チホルシンに４０分間浸漬処理して、ＬＳホルモンフリ
ー培地に置床、２０℃、暗黒下、静置培養することで無
菌的に播種し、幼植物を形成させ、その根端部を２，４
−Ｄを１ｐｐｍ、カイネチンを０．１ｐｐｍおよびショ
糖を９％含むＬＳ固形培地で２０℃、暗黒下、２カ月間
培養する。得られた胚様体カルスを図１０に示す。な
お、図１１にはショ糖を１％にした他は前記と同様のＬ
Ｓ固形培地で、同一条件でカルスを培養したが胚様体は
全く生成しなかった（図１１）。なお、このとき、ＬＳ
固形培地中のショ糖濃度が１％では胚様体カルスがまっ
たく得られなかった。

【００３５】この根端部を用いるシクラメン胚様体カル
ス誘導方法は前記大谷らの方法とは、外植片に根を使う
ところが異なっている以外は同じ方法であり、また、前
記大橋らの方法とはサイトカイニンのＢＡをカイネチン
に基本培地をＭＳ培地からＬＳ培地に置き換えた以外は
同じ方法である。

【００３６】シクラメンの根端部は側根も含めて１個体
から多数の外植片が得られ、根端部は生長点同様の分裂
・増殖が盛んな組織であり、種子と同様に滅菌処理にも
強い長所がある。さらに、同様に品種・個体によっては
ほとんどの組織で胚様体カルスが得られない場合でも根
を外植片とすれば得られる。さらに、外植片あたりの胚
様体カルス誘導の再現性は「嵯峨」で９２％（１２コ／
１３コ×１００）、「フィンランディア」で１７％（２
コ／１２コ×１００）であった。

【００３７】次の方法はピクロラムを含有するＭＳ液体
培地で、増殖維持しているシクラメンの液体培養細胞を
ピクロラムとゼアチンを含むＭＳ液体培地のリン酸濃度
を１／１００〜１／２に減らした培地にて培養し、不定
胚を誘導とすることを特徴とする不定胚誘導法である。
この方法でのリン酸濃度は１／２０〜１／５に減らすこ
とが好ましい。この方法では本発明者らが先に出願した
液体培養での不定胚誘導方法（特願平３−８４７３３
号）の不定胚（塊茎様体）誘導効率は１ｍｌあたり１２
ケであったのに比べ、不定胚誘導効率が２０ケ／ｍｌと
従来の１．６７倍となった。例えば、ピクロラムを１ｐ
ｐｍ含むＭＳ培地で液体培養（２５℃、暗黒下）して次
いで、ピクロラムを２ｐｐｍ、ゼアチンを０．２ｐｐｍ
を含み、リン酸濃度１／１０のＭＳ培地で培養する。２
週間目で球状胚の初期段階の胚様体が２０ケ／ｍｌで得
られた。得られた胚様体（不定胚）の写真を図１２に示
す。

【００３８】一般に植物は通常環境条件が悪化（寒さ、
乾燥等）してくると開花、結実し、悪条件下でも生命の
維持が可能な種子という形態をとり、次世代を存続させ
る。この方法では、生命の維持に必須のリン酸を減少さ
せるというストレスを与えたことが細胞が潜在的に有す
る種子形成（不定胚誘導）機能を呼びお越したと考えら
れる。この方法は液体培養系なのでタンク培養へのスケ
ールアップが可能となる。タンク培養など、工業的生産
が可能となり計画的な苗生産が可能となる。

【００３９】実施例３ 本実施例はシクラメンの育種母体の作出方法に関するも
のであり、次のような方法により行った。まず、「ラー
ジホワイト」の葉柄を２，４−Ｄを１ｐｐｍ、カイネチ
ンを０．５ｐｐｍ、ショ糖を５％含むＬＳ固形培地に１
カ月間、暗黒下に２５℃で培養する。次いで、ショ糖を
３％含むＭＳ固形培地に２５℃、暗黒下に１カ月間静置
して不定胚を誘導する。この不定胚をさらに、ホルモン
を含まないＭＳ固形培地に移し、３カ月間、暗黒下で２
０℃で培養する。苗化した個体は鉢上し、栽培した。開
花した７株で雄性不稔の調査をしたところ、前記７株と
も不稔であった。不稔株を図１３に示す。

【００４０】今まで、不定胚から再生したシクラメンで
雄性不稔のものは知られていない。本実施例により除雄
性交配を必要としないＦ_１ハイブリッド作出が可能とな
るための交配作業の省略化がはかれる。例えば、網室内
に雄性不稔の株と回復系の株を置き、ハチやハエなどを
放飼することにより、Ｆ_１種子が得られる。除雄交配は
熟練を要するが、本実施例の方法では当業者の技術レベ
ルが高くなくても可能である。

【００４１】

【発明の効果】本発明の第一によれば、品種間、個体間
の差異を問わず、胚様体カルスを誘導することができ
る。また、第二発明によれば、不定胚からの分化率が向
上する。また、第三発明によれば、いったん雄性不稔の
培養系をつくれば培養でクローン増殖でき、除雄性交配
を必要としないＦ_１ハイブリッド作出が可能となるため
の交配作業の省略化がはかれる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の実施例１で得られた胚様体カルスに
関する生物の形態を示す写真。

【図２】 本発明の実施例２の不定胚の発根に対するゲ
ルライト濃度の効果を示す生物の形態の写真。

【図３】 本発明の実施例２の不定胚の発根に対するゲ
ルライト濃度の効果を示す生物の形態の写真。

【図４】 本発明の実施例２の不定胚の発根に対するゲ
ルライト濃度の効果を示す生物の形態の写真。

【図５】 本発明の実施例２の不定胚の発根に対する無
機塩濃度の効果を示す生物の形態の写真。

【図６】 本発明の実施例２の不定胚の発根に対する無
機塩濃度の効果を示す生物の形態の写真。

【図７】 本発明の実施例２に関連する棒状胚からの発
根の様子を示す生物の形態の写真。

【図８】 本発明の実施例２に関連する培養初発密度が
低密度で分化、発育させた不定胚を示す生物の形態の写
真。

【図９】 本発明の実施例２に関連する培養初発密度が
高密度で分化、発育しない不定胚を示す生物の形態の写
真。

【図１０】 本発明の実施例２に関連する胚様体カルス
に関する生物の形態を示す写真。

【図１１】 本発明の実施例２に関連する比較例で得ら
れた胚様体カルスに関する生物の形態を示す写真。

【図１２】 本発明の実施例２に関連するリン酸飢餓培
養２週間目で誘導された胚様体に関する生物の形態を示
す写真。

【図１３】 本発明の実施例３の不定胚由来の雄性不稔
株に関する生物の形態を示す写真。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 無菌化して吸水催芽処理した完熟種子か
   ら取り出した胚を２，４−Ｄとサイトカイニンとショ糖
   を含むＬＳ固形培地に置床して培養することを特徴とす
   るシクラメン胚様体カルスの誘導方法。
2. 【請求項２】 シクラメンの不定胚を棒状胚まで分化、
   発育させた後、暗黒下、１０〜２５℃で発根させること
   を特徴とするシクラメン不定胚の発根法。
3. 【請求項３】 シクラメンの不定胚を２，４−Ｄとカイ
   ネチンを含む固形培地で培養して植物体を再生すること
   を特徴とするシクラメン育種母本の作出方法。