JPH06209773A - ラムノースを得るためのα−Ｌ−ラムノシダーゼ、その製造方法およびその使用 - Google Patents
ラムノースを得るためのα−Ｌ−ラムノシダーゼ、その製造方法およびその使用Info
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- JPH06209773A JPH06209773A JP5296361A JP29636193A JPH06209773A JP H06209773 A JPH06209773 A JP H06209773A JP 5296361 A JP5296361 A JP 5296361A JP 29636193 A JP29636193 A JP 29636193A JP H06209773 A JPH06209773 A JP H06209773A
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- rhamnose
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/0104—Alpha-L-rhamnosidase (3.2.1.40)
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- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ラムノース含有グリコシドの末端ラムノース
とアグリコンとの間の結合の切断を触媒してＬ（＋）−
ラムノース（６−デオキシ−Ｌ−マンノース）を製造す
るためのα−Ｌ−ラムノシダーゼとその製造方法の提
供。 【構成】 ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２５お
よび／または６８２６を培養し、培養液から末端アミノ
酸配列 Ｄ−Ｔ−Ｎ−Ｄ−Ｑ−Ｔ−Ｓ−Ａ−Ｋ−Ｖ−Ｄ−Ｒ−Ｇ
−Ｔ−Ｆ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｌ または Ｆ−Ｆ−Ｇ−Ｓ−Ｘ−Ｑ−Ｓ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｖ
−Ｌ−Ｋ−Ｆ−Ｇ−Ｔ−Ｌ−Ｆ−Ｄ−Ｘ−Ａ を有し、６０〜１００kdの分子量を有する上記α−Ｌ−
ラムノシダーゼを得る。
とアグリコンとの間の結合の切断を触媒してＬ（＋）−
ラムノース（６−デオキシ−Ｌ−マンノース）を製造す
るためのα−Ｌ−ラムノシダーゼとその製造方法の提
供。 【構成】 ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２５お
よび／または６８２６を培養し、培養液から末端アミノ
酸配列 Ｄ−Ｔ−Ｎ−Ｄ−Ｑ−Ｔ−Ｓ−Ａ−Ｋ−Ｖ−Ｄ−Ｒ−Ｇ
−Ｔ−Ｆ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｌ または Ｆ−Ｆ−Ｇ−Ｓ−Ｘ−Ｑ−Ｓ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｖ
−Ｌ−Ｋ−Ｆ−Ｇ−Ｔ−Ｌ−Ｆ−Ｄ−Ｘ−Ａ を有し、６０〜１００kdの分子量を有する上記α−Ｌ−
ラムノシダーゼを得る。
Description
【０００１】本発明は、ラムノース含有グリコシドの末
端Ｌ（＋）−ラムノースとアグリコンとの間の結合の切
断を触媒するα−Ｌ−ラムノシダーゼおよびバイオテク
ノロジー的手段によるその製造方法およびＬ（＋）−ラ
ムノース（６−デオキシ−Ｌ−マンノース）製造のため
のその使用に関する。以下においてこの後者の糖はＬ−
ラムノースと表示される。
端Ｌ（＋）−ラムノースとアグリコンとの間の結合の切
断を触媒するα−Ｌ−ラムノシダーゼおよびバイオテク
ノロジー的手段によるその製造方法およびＬ（＋）−ラ
ムノース（６−デオキシ−Ｌ−マンノース）製造のため
のその使用に関する。以下においてこの後者の糖はＬ−
ラムノースと表示される。
【０００２】Ｌ−ラムノースは様々な化合物を製造する
ためのキラール構造成分として用いるのに極めて適して
いる。Ｌ−ラムノースまたはその誘導体は、医薬品およ
び植物防護剤の合成に、また動植物細胞学、微生物学、
免疫生物学および芳香物質製造の領域においてもますま
すその使用度合を高めつつある。すなわち、例えばＬ−
ラムノースを出発化合物として用いて２,５−ジメチル
−４−ヒドロキシ−２,３−ジヒドロフラン−３−オン
（FuraneolR）を製造することができ、そしてこれはさ
らに食品および香料産業において様々な芳香物質のため
の親物質として用いられる。
ためのキラール構造成分として用いるのに極めて適して
いる。Ｌ−ラムノースまたはその誘導体は、医薬品およ
び植物防護剤の合成に、また動植物細胞学、微生物学、
免疫生物学および芳香物質製造の領域においてもますま
すその使用度合を高めつつある。すなわち、例えばＬ−
ラムノースを出発化合物として用いて２,５−ジメチル
−４−ヒドロキシ−２,３−ジヒドロフラン−３−オン
（FuraneolR）を製造することができ、そしてこれはさ
らに食品および香料産業において様々な芳香物質のため
の親物質として用いられる。
【０００３】Ｌ−ラムノースは化学的経路では得られる
にしても極めて多大な困難を伴う。しかしながら、それ
は様々天然給源、例えばフラボングリコシドであるヘス
ペリジン、ルチン、ナリンギンおよびクエルシトリンか
ら、あるいは例えばアラビアゴムまたは海藻から酸加水
分解後に抽出単離することができる〔Biotechnologyand
Bioengineering, Vol. 33, p. 365（1989）, R.J. Lin
hardt et al.；EP-A-0 317 033；JPA 62293〕。これら
の方法の短所は、Ｌ−ラムノース単離のためのこみ入っ
た工程であり、中には有機溶媒、そしてさらに、仕上げ
処理中に生じる潜在的に有毒な芳香族副生成物、および
季節変動に応じて組成が変動する天然原料成分の使用を
伴う。
にしても極めて多大な困難を伴う。しかしながら、それ
は様々天然給源、例えばフラボングリコシドであるヘス
ペリジン、ルチン、ナリンギンおよびクエルシトリンか
ら、あるいは例えばアラビアゴムまたは海藻から酸加水
分解後に抽出単離することができる〔Biotechnologyand
Bioengineering, Vol. 33, p. 365（1989）, R.J. Lin
hardt et al.；EP-A-0 317 033；JPA 62293〕。これら
の方法の短所は、Ｌ−ラムノース単離のためのこみ入っ
た工程であり、中には有機溶媒、そしてさらに、仕上げ
処理中に生じる潜在的に有毒な芳香族副生成物、および
季節変動に応じて組成が変動する天然原料成分の使用を
伴う。
【０００４】Ｌ−ラムノースは様々な属の細菌、例えば
アルカリゲネス（Alcaligenes）、アシネトバクター（A
cinetobacter）、クレブシエラ（Klebsiella）、ストレ
プトコッカス（Streptococcus）またはラクトバチルス
（Lactobacillus）などの細菌を用いた発酵により、ラ
ムノース含有ヘテロ多糖の形で調製することもできる。
〔Enzyme Microb. Technol., Vol. 10, p. 198（198
8）, M. Graber et al.；J. Amer. Chem. Soc., Vol. 7
1, p. 4124（1945）, F.G. JarvisおよびM.J. Johnso
n；J. Bacteriol., Vol. 68, p. 645（1954）, G. Haus
erおよびM.L. Karnovsky〕。
アルカリゲネス（Alcaligenes）、アシネトバクター（A
cinetobacter）、クレブシエラ（Klebsiella）、ストレ
プトコッカス（Streptococcus）またはラクトバチルス
（Lactobacillus）などの細菌を用いた発酵により、ラ
ムノース含有ヘテロ多糖の形で調製することもできる。
〔Enzyme Microb. Technol., Vol. 10, p. 198（198
8）, M. Graber et al.；J. Amer. Chem. Soc., Vol. 7
1, p. 4124（1945）, F.G. JarvisおよびM.J. Johnso
n；J. Bacteriol., Vol. 68, p. 645（1954）, G. Haus
erおよびM.L. Karnovsky〕。
【０００５】これらの方法の短所は粘度に条件付けられ
る、定常的に低い収率、およびヘテロ多糖の加水分解的
切断後に必要となる各種糖の混合物からのＬ−ラムノー
スの分離である。
る、定常的に低い収率、およびヘテロ多糖の加水分解的
切断後に必要となる各種糖の混合物からのＬ−ラムノー
スの分離である。
【０００６】多くの刊行物および特許がシュードモナス
・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）を用いた発
酵によるラムノリピドの生産を扱っている。〔Applied
andEnvironmental Microbiology, Vol. 51, p. 985（19
86）, H.E. Reiling et al.；J. Chem. Techn. Biotech
nol., Vol. 45, p. 249（1989）, K. Venkata Ramana e
t al.；米国特許 4 933 281, Daniels et al.；ドイツ
公開特許出願 2 150 375, 1972；米国特許 4 814 272,
Wagner et al.〕。
・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）を用いた発
酵によるラムノリピドの生産を扱っている。〔Applied
andEnvironmental Microbiology, Vol. 51, p. 985（19
86）, H.E. Reiling et al.；J. Chem. Techn. Biotech
nol., Vol. 45, p. 249（1989）, K. Venkata Ramana e
t al.；米国特許 4 933 281, Daniels et al.；ドイツ
公開特許出願 2 150 375, 1972；米国特許 4 814 272,
Wagner et al.〕。
【０００７】原則として、その微生物培養液中には四種
類のラムノリピド（ＲＬ１〜ＲＬ４、下記式参照）が存
在し、またそれらラムノリピドは１または２個のＬ
（＋）−ラムノース単位と１または２個のβ−ヒドロキ
シデカン酸とで構成されている〔Z. Naturforsch. 40c,
p. 61（1985）, C. Syldatk et al.〕。ラムノリピド
１および３が量的に最も重要である。ここで微生物由来
のラムノリピドの化学構造を示すと次の通りである。
類のラムノリピド（ＲＬ１〜ＲＬ４、下記式参照）が存
在し、またそれらラムノリピドは１または２個のＬ
（＋）−ラムノース単位と１または２個のβ−ヒドロキ
シデカン酸とで構成されている〔Z. Naturforsch. 40c,
p. 61（1985）, C. Syldatk et al.〕。ラムノリピド
１および３が量的に最も重要である。ここで微生物由来
のラムノリピドの化学構造を示すと次の通りである。
【０００８】
【化１】
【０００９】
【化２】
【００１０】
【化３】
【００１１】
【化４】
【００１２】さらに、可溶性のまたは固定化されたα−
Ｌ−ラムノシダーゼであるナリンギナーゼおよびヘスペ
リジナーゼを用いた酵素切断によりフラボングリコシ
ド、ラムノリピドまたはオリゴ糖からＬ−ラムノースを
取得することも知られている〔米国特許５,０７７,２０
６；欧州特許８８２０２５９５.０；Turecek, P. およ
びPittner, F., Appl. Biochem. and Biotech. 13, 1-1
3（1986)〕。ナリンギナーゼおよびヘスペリジナーゼは
各々約９０kdの分子量を有し、そしてそれぞれペニシリ
ウム・デカムベンス（Penicillium decumbens）および
アスペルジルス・ニガー（Aspergillus niger）から単
離された。
Ｌ−ラムノシダーゼであるナリンギナーゼおよびヘスペ
リジナーゼを用いた酵素切断によりフラボングリコシ
ド、ラムノリピドまたはオリゴ糖からＬ−ラムノースを
取得することも知られている〔米国特許５,０７７,２０
６；欧州特許８８２０２５９５.０；Turecek, P. およ
びPittner, F., Appl. Biochem. and Biotech. 13, 1-1
3（1986)〕。ナリンギナーゼおよびヘスペリジナーゼは
各々約９０kdの分子量を有し、そしてそれぞれペニシリ
ウム・デカムベンス（Penicillium decumbens）および
アスペルジルス・ニガー（Aspergillus niger）から単
離された。
【００１３】ナリンギナーゼおよびヘスペリジナーゼは
二つの単糖間の結合の切断、主としてフラボングリコシ
ド例えばヘスペリジンおよびナリンギンから、またはラ
ムノリピド３または４からの末端ラムノースの除去を触
媒する。
二つの単糖間の結合の切断、主としてフラボングリコシ
ド例えばヘスペリジンおよびナリンギンから、またはラ
ムノリピド３または４からの末端ラムノースの除去を触
媒する。
【００１４】ナリンギナーゼおよびヘスペリジナーゼは
ラムノース含有グリコシド中の末端ラムノースとアグリ
コンとの間の結合の切断を認め得る程により緩慢に触媒
する（ファクター：１０〜１００；実施例１参照）。
ラムノース含有グリコシド中の末端ラムノースとアグリ
コンとの間の結合の切断を認め得る程により緩慢に触媒
する（ファクター：１０〜１００；実施例１参照）。
【００１５】この結果、ラムノリピド１〜４混合物から
ラムノースを完全に切断するには極めて長時間を要す
る。何故ならば、微生物培養液中に量的に一番多く存在
するラムノリピド１および３はＬ−ラムノースとアグリ
コン（脂肪酸）とで構成されているからである。
ラムノースを完全に切断するには極めて長時間を要す
る。何故ならば、微生物培養液中に量的に一番多く存在
するラムノリピド１および３はＬ−ラムノースとアグリ
コン（脂肪酸）とで構成されているからである。
【００１６】今般、驚くべきことに、ラムノース含有グ
リコシドの末端Ｌ−ラムノースとアグリコンとの間の結
合の切断を触媒する、すなわち、既知のα−Ｌ−ラムノ
シダーゼであるナリンギナーゼおよびヘスペリジナーゼ
とは逆の特異性を有するα−Ｌ−ラムノシダーゼが単離
された。
リコシドの末端Ｌ−ラムノースとアグリコンとの間の結
合の切断を触媒する、すなわち、既知のα−Ｌ−ラムノ
シダーゼであるナリンギナーゼおよびヘスペリジナーゼ
とは逆の特異性を有するα−Ｌ−ラムノシダーゼが単離
された。
【００１７】すなわち、本発明は、 １． ペニシリウム・エスピー．（Penicillium sp.）
ＤＳＭ６８２５および／または６８２６を発酵させ、そ
の培養液からバイオマスを分離し、そしてその培養上清
を濃縮することにより取得され得るα−Ｌ−ラムノシダ
ーゼ ２． アミノ末端アミノ酸配列 Ｄ−Ｔ−Ｎ−Ｄ−Ｑ−Ｔ−Ｓ−Ａ−Ｋ−Ｖ−Ｄ−Ｒ−Ｇ
−Ｔ−Ｆ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｌ または Ｆ−Ｆ−Ｇ−Ｓ−Ｘ−Ｑ−Ｓ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｖ
−Ｌ−Ｋ−Ｆ−Ｇ−Ｔ−Ｌ−Ｆ−Ｄ−Ｘ−Ａ を含み、そしてラムノース含有グリコシドの末端Ｌ−ラ
ムノースとアグリコンとの間の結合の切断を触媒する、
６０〜１００kdの分子量を有するα−Ｌ−ラムノシダー
ゼ
ＤＳＭ６８２５および／または６８２６を発酵させ、そ
の培養液からバイオマスを分離し、そしてその培養上清
を濃縮することにより取得され得るα−Ｌ−ラムノシダ
ーゼ ２． アミノ末端アミノ酸配列 Ｄ−Ｔ−Ｎ−Ｄ−Ｑ−Ｔ−Ｓ−Ａ−Ｋ−Ｖ−Ｄ−Ｒ−Ｇ
−Ｔ−Ｆ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｌ または Ｆ−Ｆ−Ｇ−Ｓ−Ｘ−Ｑ−Ｓ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｖ
−Ｌ−Ｋ−Ｆ−Ｇ−Ｔ−Ｌ−Ｆ−Ｄ−Ｘ−Ａ を含み、そしてラムノース含有グリコシドの末端Ｌ−ラ
ムノースとアグリコンとの間の結合の切断を触媒する、
６０〜１００kdの分子量を有するα−Ｌ−ラムノシダー
ゼ
【００１８】３． ペニシリウム・エスピー．を栄養培
地中で培養物中にα−Ｌ−ラムノシダーゼが蓄積するま
で培養し、次いでその培養液からバイオマスを分離し、
そしてこのようにして得られた培養上清を濃縮すること
より成るα−Ｌ−ラムノシダーゼの製造方法 ４． Ｌ−ラムノース製造のためのα−Ｌ−ラムノシダ
ーゼの使用 ５． ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２５ ６． ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２６ に関する。
地中で培養物中にα−Ｌ−ラムノシダーゼが蓄積するま
で培養し、次いでその培養液からバイオマスを分離し、
そしてこのようにして得られた培養上清を濃縮すること
より成るα−Ｌ−ラムノシダーゼの製造方法 ４． Ｌ−ラムノース製造のためのα−Ｌ−ラムノシダ
ーゼの使用 ５． ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２５ ６． ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２６ に関する。
【００１９】本発明を以下、特にその好ましい態様につ
いて詳述する。化合物Ｌ（＋）−ラムノース（＝６−デ
オキシ−Ｌ−マンノース）はＬ−ラムノースと表示され
る。糖を全く含まない化合物、または化合物の部分はア
グリコンと表示される。本発明において、特に脂肪酸化
合物またはフラボン化合物がアグリコンと表示される。
いて詳述する。化合物Ｌ（＋）−ラムノース（＝６−デ
オキシ−Ｌ−マンノース）はＬ−ラムノースと表示され
る。糖を全く含まない化合物、または化合物の部分はア
グリコンと表示される。本発明において、特に脂肪酸化
合物またはフラボン化合物がアグリコンと表示される。
【００２０】専門家文献に知られる一文字コードに相当
する次の略語をアミノ酸について用いる。
する次の略語をアミノ酸について用いる。
【００２１】 アミノ酸 省略形 文字コード グリシン Ｇｌｙ Ｇ Ｌ−アラニン Ａｌａ Ａ Ｌ−バリン Ｖａｌ Ｖ Ｌ−ロイシン Ｌｅｕ Ｌ Ｌ−イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ Ｌ−フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ Ｌ−プロリン Ｐｒｏ Ｐ Ｌ−セリン Ｓｅｒ Ｓ Ｌ−トレオニン Ｔｈｒ Ｔ Ｌ−システイン Ｃｙｓ Ｃ Ｌ−メチオニン Ｍｅｔ Ｍ Ｌ−トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ Ｌ−チロシン Ｔｙｒ Ｙ Ｌ−アスパラギン Ａｓｎ Ｎ Ｌ−グルタミン Ｇｌｎ Ｑ Ｌ−アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ Ｌ−リジン Ｌｙｓ Ｋ Ｌ−アルギニン Ａｒｇ Ｒ Ｌ−ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ
【００２２】α−Ｌ−ラムノシダーゼは、培養液から、
少量（１ｇまで）および多量（≦１kg）のいずれでも単
離できる。何故ならばこの製造プロセスは実験室規模
（１リットルまでの容量での微生物発酵）、および工業
規模（m3規模での微生物発酵）で実施できるからであ
る。
少量（１ｇまで）および多量（≦１kg）のいずれでも単
離できる。何故ならばこの製造プロセスは実験室規模
（１リットルまでの容量での微生物発酵）、および工業
規模（m3規模での微生物発酵）で実施できるからであ
る。
【００２３】本発明によるα−Ｌ−ラムノシダーゼの分
子量はＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナト
リウム）により、そしてゲルクロマトグラフィーにより
測定される。このゲルクロマトグラフィー法は例えばMo
lecular Biology of the Cell, Bruce Alberts et al.,
Garland Publishing, Inc. New York & London, 第３
版, 1983, pp. 174, 265-266に記載されている。
子量はＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナト
リウム）により、そしてゲルクロマトグラフィーにより
測定される。このゲルクロマトグラフィー法は例えばMo
lecular Biology of the Cell, Bruce Alberts et al.,
Garland Publishing, Inc. New York & London, 第３
版, 1983, pp. 174, 265-266に記載されている。
【００２４】“ＩＥＰ”という略語は“等電点”を表わ
し、そしてタンパク質、あるいは本発明の場合には酵
素、上の正味電荷がゼロであるpHとして定義される。Ｉ
ＥＰはクロマトフォーカシングによって測定される。
し、そしてタンパク質、あるいは本発明の場合には酵
素、上の正味電荷がゼロであるpHとして定義される。Ｉ
ＥＰはクロマトフォーカシングによって測定される。
【００２５】ペニシリウム・エスピー．は、ドイツ国、
６２３２ Bad Sodenの庭園廃棄物より成る堆肥から単離
された。微生物は培養液希釈しそして選択寒天培地にプ
レートすることにより当業者に知られた方法に従って単
離し精製した。例えば堆肥サンプルを０.９％強度塩化
ナトリウム溶液に懸濁することができ、そしてラムノリ
ピドおよび／またはラムノリピド誘導体、好ましくはラ
ムノリピド−２のＣ1〜Ｃ18−アルキルエステルを唯一
炭素源として含有する選択培地中でこの懸濁液の濃縮培
養物を調製することができる。ラムノリピド−２のＣ1
〜Ｃ4−アルキルエステル例えばメチルラムノリピド−
２またはtert−ブチルラムノリピド−２が特に好ましい
Ｃ源として用いられる。
６２３２ Bad Sodenの庭園廃棄物より成る堆肥から単離
された。微生物は培養液希釈しそして選択寒天培地にプ
レートすることにより当業者に知られた方法に従って単
離し精製した。例えば堆肥サンプルを０.９％強度塩化
ナトリウム溶液に懸濁することができ、そしてラムノリ
ピドおよび／またはラムノリピド誘導体、好ましくはラ
ムノリピド−２のＣ1〜Ｃ18−アルキルエステルを唯一
炭素源として含有する選択培地中でこの懸濁液の濃縮培
養物を調製することができる。ラムノリピド−２のＣ1
〜Ｃ4−アルキルエステル例えばメチルラムノリピド−
２またはtert−ブチルラムノリピド−２が特に好ましい
Ｃ源として用いられる。
【００２６】ラムノリピド２ tert−ブチルエステル
【化５】
【００２７】ラムノリピド２ メチルエステル
【化６】
【００２８】ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２５
およびＤＳＭ６８２６は次の形態学的特徴を有している
（R.A. Samson et al., Introduction to Food-borne F
ungi, Institute of the Royal Netherlands Academy o
f Arts and Sciences, 第３版，1988による）。
およびＤＳＭ６８２６は次の形態学的特徴を有している
（R.A. Samson et al., Introduction to Food-borne F
ungi, Institute of the Royal Netherlands Academy o
f Arts and Sciences, 第３版，1988による）。
【００２９】 ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２５ 分生子の分岐 単軸分岐 梗子 アムプラ状（ampulliform） 分生子 とげ状
【００３０】 ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２６ 分生子の分岐 二軸分岐 梗子 フラスコ状 分生子 いぼ状
【００３１】ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２５
および６８２６は一緒に、または個別に発酵させてもよ
い。酵素α−Ｌ−ラムノシダーゼを生産する限り、変異
株（mutant）および変種株（variant）を単離物ＤＳＭ
６８２５および／または６８２６に代えて用いることも
できる。かかる変異株は自体知られた方法により、例え
ば照射、例えば紫外線またはＸ線を用いた照射により、
あるいは化学的変異原物質例えばエチルメタンスルホネ
ート（ＥＭＳ）、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾ
フェノン（ＭＯＢ）またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）を用いて生産する
ことができる。
および６８２６は一緒に、または個別に発酵させてもよ
い。酵素α−Ｌ−ラムノシダーゼを生産する限り、変異
株（mutant）および変種株（variant）を単離物ＤＳＭ
６８２５および／または６８２６に代えて用いることも
できる。かかる変異株は自体知られた方法により、例え
ば照射、例えば紫外線またはＸ線を用いた照射により、
あるいは化学的変異原物質例えばエチルメタンスルホネ
ート（ＥＭＳ）、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾ
フェノン（ＭＯＢ）またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）を用いて生産する
ことができる。
【００３２】前述のα−Ｌ−ラムノシダーゼの製造方法
は次の通りである。選択培地で生成微生物の混合培養物
の継代を繰り返すことによりペニシリウム・エスピー．
を単離し精製した後、本発明による酵素を生産する微生
物の濃縮が達成される。混合培養物から純培養物を取得
するために、このようにして得られた微生物を寒天プレ
ート（選択培地）にプレートする。純培養物を複製しそ
してそれらの本発明酵素形成能をテストする。
は次の通りである。選択培地で生成微生物の混合培養物
の継代を繰り返すことによりペニシリウム・エスピー．
を単離し精製した後、本発明による酵素を生産する微生
物の濃縮が達成される。混合培養物から純培養物を取得
するために、このようにして得られた微生物を寒天プレ
ート（選択培地）にプレートする。純培養物を複製しそ
してそれらの本発明酵素形成能をテストする。
【００３３】ペニシリウム属エスピー．の微生物が本発
明酵素を形成することがわかる。菌の属は当業者に知ら
れた方法による形態学的、分類学的および生化学的基準
を用いて決定される。コロニーの色は緑である。
明酵素を形成することがわかる。菌の属は当業者に知ら
れた方法による形態学的、分類学的および生化学的基準
を用いて決定される。コロニーの色は緑である。
【００３４】ペニシリウム・エスピー．のコロニーの本
発明酵素形成能を調べた結果、α−Ｌ−ラムノシダーゼ
生産レベルが特に高いことで顕著な二つの株が単離され
るに至った。これら二つの株はペニシリウム・エスピ
ー．ＤＳＭ６８２５およびＤＳＭ６８２６である。
発明酵素形成能を調べた結果、α−Ｌ−ラムノシダーゼ
生産レベルが特に高いことで顕著な二つの株が単離され
るに至った。これら二つの株はペニシリウム・エスピ
ー．ＤＳＭ６８２５およびＤＳＭ６８２６である。
【００３５】これらの株はブダペスト条約の規則に従っ
てDeutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellk
ulturen GmbH（ドイツ微生物および細胞培養コレクショ
ン）（ドイツ国、Mascheroder Weg 1B, 3400 Braunschw
eig）に１９９１年１１月２９日にペニシリウム・エス
ピー．ＤＳＭ６８２５および６８２６の番号で寄託され
た。
てDeutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellk
ulturen GmbH（ドイツ微生物および細胞培養コレクショ
ン）（ドイツ国、Mascheroder Weg 1B, 3400 Braunschw
eig）に１９９１年１１月２９日にペニシリウム・エス
ピー．ＤＳＭ６８２５および６８２６の番号で寄託され
た。
【００３６】関連の微生物はペニシリウム・エスピー．
に対して慣用される条件下に培養される。従って培養は
複合または規定培地で行われる。好ましくはその培地
は、酵母エキス、カザミノ酸、コーンスチープ、肉エキ
ス、ペプトン、カゼイン、ゼラチン、トリプトン、硝酸
塩、アンモニウムまたは尿素を窒素源として、そしてス
ターチ、デキストリン、スクロース、グルコース、グリ
セロールおよび麦芽エキスを炭素源として含有する。
に対して慣用される条件下に培養される。従って培養は
複合または規定培地で行われる。好ましくはその培地
は、酵母エキス、カザミノ酸、コーンスチープ、肉エキ
ス、ペプトン、カゼイン、ゼラチン、トリプトン、硝酸
塩、アンモニウムまたは尿素を窒素源として、そしてス
ターチ、デキストリン、スクロース、グルコース、グリ
セロールおよび麦芽エキスを炭素源として含有する。
【００３７】マグネシウム、カルシウム、ナトリウム、
カリウム、鉄、亜鉛、コバルトまたはホスフェートを更
なる成分として用いることができる。ラムノリピドまた
はそれらのアルキルエステル（粗製混合物または精製ラ
ムノリピド）を単独で、あるいは付加的Ｃ源と組み合わ
せてＣ源として用いることが特に適していることがわか
る。
カリウム、鉄、亜鉛、コバルトまたはホスフェートを更
なる成分として用いることができる。ラムノリピドまた
はそれらのアルキルエステル（粗製混合物または精製ラ
ムノリピド）を単独で、あるいは付加的Ｃ源と組み合わ
せてＣ源として用いることが特に適していることがわか
る。
【００３８】培養は７２〜１２０時間にわたり２７℃で
行われる。必要になることもあり得る本発明によるα−
Ｌ−ラムノシダーゼの単離は、常法により、例えば濾過
または遠心分離によりバイオマスを分離除去することで
行われ、α−Ｌ−ラムノシダーゼは大部分上清中に局在
する。
行われる。必要になることもあり得る本発明によるα−
Ｌ−ラムノシダーゼの単離は、常法により、例えば濾過
または遠心分離によりバイオマスを分離除去することで
行われ、α−Ｌ−ラムノシダーゼは大部分上清中に局在
する。
【００３９】その上清は、限外濾過により濃縮した後凍
結乾燥することができる。所望の酵素純度の程度に応じ
て更なる精製工程、例えば沈殿、陰イオン交換クロマト
グラフィー、クロマトフォーカシング、ＨＩＣクロマト
グラフィー（疎水性相互作用クロマトグラフィー）、排
除クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグ
ラフィーなどを行ってもよい。
結乾燥することができる。所望の酵素純度の程度に応じ
て更なる精製工程、例えば沈殿、陰イオン交換クロマト
グラフィー、クロマトフォーカシング、ＨＩＣクロマト
グラフィー（疎水性相互作用クロマトグラフィー）、排
除クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグ
ラフィーなどを行ってもよい。
【００４０】好ましくは、精製は濾過によりバイオマス
を分離除去後、限外濾過により残留上清中の酵素を濃縮
し、次いで陰イオン交換クロマトグラフィー、次いでク
ロマトフォーカシング、そして最後に排除クロマトグラ
フィーを行うことにより行われる。
を分離除去後、限外濾過により残留上清中の酵素を濃縮
し、次いで陰イオン交換クロマトグラフィー、次いでク
ロマトフォーカシング、そして最後に排除クロマトグラ
フィーを行うことにより行われる。
【００４１】本発明によるα−Ｌ−ラムノシダーゼは、
グリコシル化度に依存して６０〜１００kDの分子量、そ
して５.６〜５.８の等電点を有する。ｐ−ニトロフェニ
ル−α−Ｌ−ラムノピラノシドの切断に至適なpHは５.
０〜５.５であり、そして至適温度は５０〜５５℃であ
る。
グリコシル化度に依存して６０〜１００kDの分子量、そ
して５.６〜５.８の等電点を有する。ｐ−ニトロフェニ
ル−α−Ｌ−ラムノピラノシドの切断に至適なpHは５.
０〜５.５であり、そして至適温度は５０〜５５℃であ
る。
【００４２】ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２６
株からのα−Ｌ−ラムノシダーゼの、およびナリンギナ
ーゼのアミノ末端配列は、原則として、文献に知られる
エドマン法に従って決定される。このためには、アミノ
酸鎖を適切な条件下にフェニルイソチオシアネートと混
合する。その化合物は遊離アミノ−末端アミノ基に優先
的に結合する。無水酸の存在下に終端アミノ酸はカルバ
ミル誘導体として除去される。この化合物を調べてアミ
ノ末端アミノ酸を同定する。（この時点では最初のアミ
ノ酸を欠いている）アミノ酸鎖の残部は今度は改めてフ
ェニルイソチオシアネート処理に付して次のアミノ酸を
順次決定するなどすることができる。原則として、この
手順は順次、段階的に多回にわたり行うことができ、そ
れによってアミノ酸鎖の総アミノ酸頻度を導くことがで
きる。この場合には、これに加えて、気相シーケンサー
（Applied Biosystems社のタイプ477A）を用いてＮ−末
端アミノ酸配列決定を、またオンライン式アミノ酸アナ
ライザー（Applied Biosystems社のタイプ130A PTC）を
用いてアミノ酸分析を行う。それらの方法はFEBS Lette
rs, Vol. 292, pp. 405-409, 1991に公表されている。
株からのα−Ｌ−ラムノシダーゼの、およびナリンギナ
ーゼのアミノ末端配列は、原則として、文献に知られる
エドマン法に従って決定される。このためには、アミノ
酸鎖を適切な条件下にフェニルイソチオシアネートと混
合する。その化合物は遊離アミノ−末端アミノ基に優先
的に結合する。無水酸の存在下に終端アミノ酸はカルバ
ミル誘導体として除去される。この化合物を調べてアミ
ノ末端アミノ酸を同定する。（この時点では最初のアミ
ノ酸を欠いている）アミノ酸鎖の残部は今度は改めてフ
ェニルイソチオシアネート処理に付して次のアミノ酸を
順次決定するなどすることができる。原則として、この
手順は順次、段階的に多回にわたり行うことができ、そ
れによってアミノ酸鎖の総アミノ酸頻度を導くことがで
きる。この場合には、これに加えて、気相シーケンサー
（Applied Biosystems社のタイプ477A）を用いてＮ−末
端アミノ酸配列決定を、またオンライン式アミノ酸アナ
ライザー（Applied Biosystems社のタイプ130A PTC）を
用いてアミノ酸分析を行う。それらの方法はFEBS Lette
rs, Vol. 292, pp. 405-409, 1991に公表されている。
【００４３】α−Ｌ−ラムノシダーゼの次のアミノ−末
端成分配列を解明することができた： Ｄ−Ｔ−Ｎ−Ｄ−Ｑ−Ｔ−Ｓ−Ａ−Ｋ−Ｖ−Ｄ−Ｒ−Ｇ
−Ｔ−Ｆ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｌ または Ｆ−Ｆ−Ｇ−Ｓ−Ｘ−Ｑ−Ｓ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｖ
−Ｌ−Ｋ−Ｆ−Ｇ−Ｔ−Ｌ−Ｆ−Ｄ−Ｘ−Ａ
端成分配列を解明することができた： Ｄ−Ｔ−Ｎ−Ｄ−Ｑ−Ｔ−Ｓ−Ａ−Ｋ−Ｖ−Ｄ−Ｒ−Ｇ
−Ｔ−Ｆ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｌ または Ｆ−Ｆ−Ｇ−Ｓ−Ｘ−Ｑ−Ｓ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｖ
−Ｌ−Ｋ−Ｆ−Ｇ−Ｔ−Ｌ−Ｆ−Ｄ−Ｘ−Ａ
【００４４】本発明によるα−Ｌ−ラムノシダーゼは遊
離した形、または固定化された形で用いることができ、
また後者の場合は、現在用いられているすべての固定化
方法が適している。経済的理由から、例えばシリカゲル
を支持体として用いることができる。
離した形、または固定化された形で用いることができ、
また後者の場合は、現在用いられているすべての固定化
方法が適している。経済的理由から、例えばシリカゲル
を支持体として用いることができる。
【００４５】このα−Ｌ−ラムノシダーゼはラムノース
含有グリコシドの末端Ｌ−ラムノースとアグリコンとの
間の結合の切断を触媒し、従ってラムノースの製造に適
している。
含有グリコシドの末端Ｌ−ラムノースとアグリコンとの
間の結合の切断を触媒し、従ってラムノースの製造に適
している。
【００４６】その切断は緩衝され、または緩衝されてい
ない水性溶液中で行われる。水性溶液は例えば微生物の
培養液（緩衝は不要）または蒸留水である。後者の場合
には、ホスフェートまたはトリス（Tris）緩衝剤、好ま
しくは酢酸アンモニウム緩衝剤、による緩衝が必要であ
る（緩衝剤濃度：５〜１００mM、好ましくは１０〜５０
mM）。水性溶液のpHはpH３.５〜８、好ましくはpH５〜
６である。酵素活性に必要な温度は４℃〜６５℃、好ま
しくは４５℃〜５５℃である。反応時間は酵素および基
質の量に、またわずかにではあるが温度にも依存する。
４５℃〜５５℃の温度では、反応時間は２〜２４時間、
好ましくは５〜８時間である。高い温度では酵素が分解
しやすくなるので比較的短い反応時間とした方がよい。
混合物中に存在する基質量（＝ラムノリピドの量）は最
大で２００ｇ／リットルであり、そして酵素量は０.１
〜５０Ｕ／ｇ（ラムノリピド）、好ましくは１〜１０Ｕ
／ｇ、そして特に好ましくは５Ｕ／ｇ（ラムノリピド）
である。
ない水性溶液中で行われる。水性溶液は例えば微生物の
培養液（緩衝は不要）または蒸留水である。後者の場合
には、ホスフェートまたはトリス（Tris）緩衝剤、好ま
しくは酢酸アンモニウム緩衝剤、による緩衝が必要であ
る（緩衝剤濃度：５〜１００mM、好ましくは１０〜５０
mM）。水性溶液のpHはpH３.５〜８、好ましくはpH５〜
６である。酵素活性に必要な温度は４℃〜６５℃、好ま
しくは４５℃〜５５℃である。反応時間は酵素および基
質の量に、またわずかにではあるが温度にも依存する。
４５℃〜５５℃の温度では、反応時間は２〜２４時間、
好ましくは５〜８時間である。高い温度では酵素が分解
しやすくなるので比較的短い反応時間とした方がよい。
混合物中に存在する基質量（＝ラムノリピドの量）は最
大で２００ｇ／リットルであり、そして酵素量は０.１
〜５０Ｕ／ｇ（ラムノリピド）、好ましくは１〜１０Ｕ
／ｇ、そして特に好ましくは５Ｕ／ｇ（ラムノリピド）
である。
【００４７】反応完了後、遠心分離により脂肪相を分離
除去することにより、あるいは相分離が行われるまで傾
瀉することによりＬ−ラムノースを溶液から単離し、そ
して必要に応じて、水性相を次いで、例えば活性炭を用
いることにより澄明化する。澄明化とは濁り物質および
着色物質の除去を意味するものとして理解される。Ｌ−
ラムノースをできるだけ純粋な状態で取得したい場合に
はこの工程が推奨される。次に水性溶液を濃縮し、そし
てＬ−ラムノースを晶出させる。
除去することにより、あるいは相分離が行われるまで傾
瀉することによりＬ−ラムノースを溶液から単離し、そ
して必要に応じて、水性相を次いで、例えば活性炭を用
いることにより澄明化する。澄明化とは濁り物質および
着色物質の除去を意味するものとして理解される。Ｌ−
ラムノースをできるだけ純粋な状態で取得したい場合に
はこの工程が推奨される。次に水性溶液を濃縮し、そし
てＬ−ラムノースを晶出させる。
【００４８】実施例１ ナリンギナーゼおよびヘスペリジナーゼによるラムノリ
ピド１および３の切断 １０ｇのラムノリピド１または３を１００mlの酢酸アン
モニウム緩衝液（５０mM、pH５.５）または二回蒸留水
に乳化し、次に１５０Ｕのナリンギナーゼまたはヘスペ
リジナーゼ（ドイツのSigma社より）を添加する。撹拌
しながら反応を７０℃で行う。これらの条件下で得られ
るＶmax値を表１にまとめて示す。これらの条件下で
は、ナリンギナーゼは１０ｇの使用ラムノリピド３を４
時間で（ヘスペリジナーゼにあっては７時間で）２.５
ｇのラムノース（〜９８％収率）およびラムノリピド１
とに切断する。ラムノリピド１の切断は、多分比較的長
時間を要するうちに酵素が不活化してしまうためであろ
うか、認め得る程により緩慢に（表１参照）かつ不完全
に進行する。
ピド１および３の切断 １０ｇのラムノリピド１または３を１００mlの酢酸アン
モニウム緩衝液（５０mM、pH５.５）または二回蒸留水
に乳化し、次に１５０Ｕのナリンギナーゼまたはヘスペ
リジナーゼ（ドイツのSigma社より）を添加する。撹拌
しながら反応を７０℃で行う。これらの条件下で得られ
るＶmax値を表１にまとめて示す。これらの条件下で
は、ナリンギナーゼは１０ｇの使用ラムノリピド３を４
時間で（ヘスペリジナーゼにあっては７時間で）２.５
ｇのラムノース（〜９８％収率）およびラムノリピド１
とに切断する。ラムノリピド１の切断は、多分比較的長
時間を要するうちに酵素が不活化してしまうためであろ
うか、認め得る程により緩慢に（表１参照）かつ不完全
に進行する。
【００４９】反応は薄層クロマトグラフィーを用いてモ
ニターし、またラムノースはＨＰＬＣにより定量測定し
た。
ニターし、またラムノースはＨＰＬＣにより定量測定し
た。
【００５０】ＴＬＣ： 溶出液：CHCl3／CH3OH／HAc ６５：５：２ ＴＬＣプレート：Silica gel 60 F254 スプレー試薬：MeOH／HAc／濃H2SO4／アニスアルデヒド ８５：１０：５：１ 展開：１２０℃で５分間
【００５１】
【表１】
【００５２】ＨＰＬＣ： カラム：HPAP（100×7.8mm）Biorad プレカラム：Carbo P (30×4.6) Biorad 温度：８５℃ 溶出液：二回蒸留水 流速：０.４ml／分 負荷量：５μｌ 検出器：示差屈折計（Beckmann）
【００５３】ラムノースの仕上げ処理は文献（ＰＣＴ−
ＥＰ ９１−０１４２６）記載の常法に従って行われ
る。
ＥＰ ９１−０１４２６）記載の常法に従って行われ
る。
【００５４】実施例２ ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２５および／また
は６８２６由来α−Ｌ−ラムノシダーゼによるラムノリ
ピド１および３の切断 １０ｇのラムノリピド１または３を１００mlの酢酸アン
モニウム緩衝液（５０mM、pH５.０）または二回蒸留水
に乳化し、次に１５０Ｕの本発明酵素を添加する。撹拌
しながら反応を５０℃で行う。これらの条件下で得られ
るVmax値を表２にまとめて示す。これらの条件下では、
本発明によるα−Ｌ−ラムノシダーゼを１０ｇの使用ラ
ムノリピド１を約５〜８時間（ペニシリウム・エスピ
ー．ＤＳＭ６８２５由来α−Ｌ−ラムノシダーゼ：約８
時間；ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２６由来α
−Ｌ−ラムノシダーゼ：約５時間）で３.０５ｇのラム
ノース（〜９４％収率）と相当する脂肪酸とに切断す
る。ラムノリピド３の切断は、多分同じく、比較的長時
間を要するうちに酵素が活性化してしまうためであろう
か、認め得る程により緩慢に（表２参照）かつ不完全に
進行する。
は６８２６由来α−Ｌ−ラムノシダーゼによるラムノリ
ピド１および３の切断 １０ｇのラムノリピド１または３を１００mlの酢酸アン
モニウム緩衝液（５０mM、pH５.０）または二回蒸留水
に乳化し、次に１５０Ｕの本発明酵素を添加する。撹拌
しながら反応を５０℃で行う。これらの条件下で得られ
るVmax値を表２にまとめて示す。これらの条件下では、
本発明によるα−Ｌ−ラムノシダーゼを１０ｇの使用ラ
ムノリピド１を約５〜８時間（ペニシリウム・エスピ
ー．ＤＳＭ６８２５由来α−Ｌ−ラムノシダーゼ：約８
時間；ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２６由来α
−Ｌ−ラムノシダーゼ：約５時間）で３.０５ｇのラム
ノース（〜９４％収率）と相当する脂肪酸とに切断す
る。ラムノリピド３の切断は、多分同じく、比較的長時
間を要するうちに酵素が活性化してしまうためであろう
か、認め得る程により緩慢に（表２参照）かつ不完全に
進行する。
【００５５】
【表２】
【００５６】Ｌ−ラムノースはこの場合にも既知の方法
に従って単離され、さらに、切断された脂肪酸は酸性条
件下に抽出により単離することができる。
に従って単離され、さらに、切断された脂肪酸は酸性条
件下に抽出により単離することができる。
【００５７】実施例３ α−Ｌ−ラムノシダーゼ生産株のスクリーニング ラムノリピド２のメチルまたはtert−ブチルエステルを
唯一Ｃ源として含有する栄養培地で、現在用いられてい
る微生物学的方法（Drews, MikrobiologischesPraktiku
m（微生物学の実務）、45-84、Springer Verlag 1983）
を用いて、様々な土壌サンプルから微生物を濃縮し、そ
して純培養物を単離した。単離された約４００株のうち
の約３７株はラムノリピドを分解できた。しかしなが
ら、それら株のほんの一部においてしか、顕著なα−Ｌ
−ラムノシダーゼ活性を検出できなかった。この関連で
は、二つの株（ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２
５およびペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２６）が
特に良好な生産株であることがわかった。
唯一Ｃ源として含有する栄養培地で、現在用いられてい
る微生物学的方法（Drews, MikrobiologischesPraktiku
m（微生物学の実務）、45-84、Springer Verlag 1983）
を用いて、様々な土壌サンプルから微生物を濃縮し、そ
して純培養物を単離した。単離された約４００株のうち
の約３７株はラムノリピドを分解できた。しかしなが
ら、それら株のほんの一部においてしか、顕著なα−Ｌ
−ラムノシダーゼ活性を検出できなかった。この関連で
は、二つの株（ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２
５およびペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２６）が
特に良好な生産株であることがわかった。
【００５８】ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノピラ
ノシドがα−Ｌ−ラムノシダーゼ活性を検出するための
基質として用いられる。１０mgのこの基質を１０mlの酢
酸アンモニウム緩衝液（pH５.５、５０mM）に溶解す
る。１００μｌの培養濾液または細胞ライゼートを９０
０μｌのこの溶液に添加し、次いでその混合物を４０℃
でインキュベートする。０、３、６、９および１２分後
に２００μｌを取り出しそして８００μｌの２００mMボ
レート緩衝液（pH９）と混合する。ｐ−ニトロフェノー
ルの遊離を４１０nmで光度測定的にモニターし、そして
ナリンギナーゼを（Romero et al. Anal. Biochem. 149
566-571（1985）に従って）コントロールとして用い
た。
ノシドがα−Ｌ−ラムノシダーゼ活性を検出するための
基質として用いられる。１０mgのこの基質を１０mlの酢
酸アンモニウム緩衝液（pH５.５、５０mM）に溶解す
る。１００μｌの培養濾液または細胞ライゼートを９０
０μｌのこの溶液に添加し、次いでその混合物を４０℃
でインキュベートする。０、３、６、９および１２分後
に２００μｌを取り出しそして８００μｌの２００mMボ
レート緩衝液（pH９）と混合する。ｐ−ニトロフェノー
ルの遊離を４１０nmで光度測定的にモニターし、そして
ナリンギナーゼを（Romero et al. Anal. Biochem. 149
566-571（1985）に従って）コントロールとして用い
た。
【００５９】実施例４ ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２５株およびペニ
シリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２６株を用いたα−Ｌ
−ラムノシダーゼの生産 これら株をまずＨＡ培地（酵母エキス４ｇ／リットル、
麦芽エキス１０ｇ／リットル、グルコース４ｇ／リット
ル、寒天２０ｇ／リットル、pH６.０）含有寒天プレー
ト上に画線し、そしてそれらプレートを良好な胞子形成
が達成されるまで１０〜１４日間２５℃でインキュベー
トする。全面にわたり十分増殖した二つのプレートから
胞子懸濁液（５０ml ０.９％ＮａＣｌ；０.０５％トゥ
イーン（Tween）８０）を調製し次いで１０リットルの
生産用培地の接種に用いる。
シリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２６株を用いたα−Ｌ
−ラムノシダーゼの生産 これら株をまずＨＡ培地（酵母エキス４ｇ／リットル、
麦芽エキス１０ｇ／リットル、グルコース４ｇ／リット
ル、寒天２０ｇ／リットル、pH６.０）含有寒天プレー
ト上に画線し、そしてそれらプレートを良好な胞子形成
が達成されるまで１０〜１４日間２５℃でインキュベー
トする。全面にわたり十分増殖した二つのプレートから
胞子懸濁液（５０ml ０.９％ＮａＣｌ；０.０５％トゥ
イーン（Tween）８０）を調製し次いで１０リットルの
生産用培地の接種に用いる。
【００６０】次の栄養液を生産用培地として用いる：３
ｇ／リットルのラムノリピド１または２、またはラムノ
リピドのアルキルエステル、またはラムノリピド混合物
（例えばシュードモナス・エルギノーザ培養液からの濃
縮濾液）、１ｇ／リットルＫＨ2ＰＯ4、０.５ｇ／リッ
トル (ＮＨ4)2ＳＯ4、０.１ｇ／リットル ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ、０.１ｇ／リットル ＣａＣｌ2、０.１ｇ／リ
ットル カザミノ酸、pH５.５。培養は１０リットルパド
ルミキサー付反応器中、３００rpm、０.６vvm、２７℃
およびpH５.５で行う。培養期間は５〜１０日間であ
る。
ｇ／リットルのラムノリピド１または２、またはラムノ
リピドのアルキルエステル、またはラムノリピド混合物
（例えばシュードモナス・エルギノーザ培養液からの濃
縮濾液）、１ｇ／リットルＫＨ2ＰＯ4、０.５ｇ／リッ
トル (ＮＨ4)2ＳＯ4、０.１ｇ／リットル ＭｇＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ、０.１ｇ／リットル ＣａＣｌ2、０.１ｇ／リ
ットル カザミノ酸、pH５.５。培養は１０リットルパド
ルミキサー付反応器中、３００rpm、０.６vvm、２７℃
およびpH５.５で行う。培養期間は５〜１０日間であ
る。
【００６１】発酵が終了したら、細胞を濾別しそして培
養濾液を濾過（０.２２μｍ）してそれを滅菌状態にす
る。この培養濾液は大部分（９０％以上）のα−Ｌ−ラ
ムノシダーゼ活性（５０００Ｕ／リットル）を含み、ま
たそのまま、あるいは凍結乾燥または１０kD膜での限外
濾過による濃縮の後で、ラムノリピドの切断に用いるこ
とができる。
養濾液を濾過（０.２２μｍ）してそれを滅菌状態にす
る。この培養濾液は大部分（９０％以上）のα−Ｌ−ラ
ムノシダーゼ活性（５０００Ｕ／リットル）を含み、ま
たそのまま、あるいは凍結乾燥または１０kD膜での限外
濾過による濃縮の後で、ラムノリピドの切断に用いるこ
とができる。
【００６２】実施例５ ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２６由来α−Ｌ−
ラムノシダーゼの単離および特性評価 ５０Ｕ／mlの活性を有する濃縮液をα−Ｌ−ラムノシダ
ーゼの更なる精製のための出発材料として用いた。
ラムノシダーゼの単離および特性評価 ５０Ｕ／mlの活性を有する濃縮液をα−Ｌ−ラムノシダ
ーゼの更なる精製のための出発材料として用いた。
【００６３】２０mMトリス／ＨＣｌ（pH７.６）含有Sep
harose Ｑでのクロマトグラフィーを第一工程として行
う。溶出は０〜０.５Ｍ ＮａＣｌの勾配を用いて行わ
れ、また得られる収率は８０％の領域（精製ファクター
５に関連して）にあり、そしてその酵素は６２Ｕ／mg
（タンパク質）の比活性を有する。
harose Ｑでのクロマトグラフィーを第一工程として行
う。溶出は０〜０.５Ｍ ＮａＣｌの勾配を用いて行わ
れ、また得られる収率は８０％の領域（精製ファクター
５に関連して）にあり、そしてその酵素は６２Ｕ／mg
（タンパク質）の比活性を有する。
【００６４】この画分をMono P カラム（Pharmacia社）
での更なるクロマトグラフィー（２５mMイミダゾール／
ＨＣｌ〜ＰＢＥ７４、pH５.０、１：１２）にかける。
α−Ｌ−ラムノシダーゼは５.６〜５.８のpHで溶出され
る。収率は７０％のオーダーである。
での更なるクロマトグラフィー（２５mMイミダゾール／
ＨＣｌ〜ＰＢＥ７４、pH５.０、１：１２）にかける。
α−Ｌ−ラムノシダーゼは５.６〜５.８のpHで溶出され
る。収率は７０％のオーダーである。
【００６５】適宜に再緩衝を行った後、そのタンパク質
をSuperrose １２カラム（１×３０cm）でのクロマトグ
ラフィーにかける。１００mM ＮａＣｌ含有１００mM酢
酸アンモニウム（pH５.０）を緩衝液として用いる。Ｓ
ＤＳゲル電気泳動を用いたモニタリングは、酵素がグリ
コシル化されている度合に依存して、６０〜１００kdの
範囲にタンパク質帯を示す。
をSuperrose １２カラム（１×３０cm）でのクロマトグ
ラフィーにかける。１００mM ＮａＣｌ含有１００mM酢
酸アンモニウム（pH５.０）を緩衝液として用いる。Ｓ
ＤＳゲル電気泳動を用いたモニタリングは、酵素がグリ
コシル化されている度合に依存して、６０〜１００kdの
範囲にタンパク質帯を示す。
【００６６】下記表３にまとめて示される調査はこの精
製酵素を用いて行われた。
製酵素を用いて行われた。
【表３】
【００６７】実施例６ ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８２６由来α−Ｌ−
ラムノシダーゼの、およびナリンギナーゼのＮ−末端配
列の決定 実施例５に従って得られたペニシリウム・エスピー．Ｄ
ＳＭ６８２６由来酵素、および同じ方法により精製され
たペニシリウム・デカムベンス由来ナリンギナーゼ（粗
製酵素、Sigma No. N-1385）を再びアクリルアミドゲル
（１０％）で精製し、そしてそれらポリペプチドをエレ
クトロブロッティングにより移した後、ProBrotR膜（Ap
plied Biosystems社, Sequencers No. 42, １９９０年
４月）に移した。これらの条件下では、ナリンギナーゼ
は単一帯を生じたのに対しＤＳＭ６８２６由来精製酵素
は相互に極めて近接した二つの帯に分解することができ
た。それら三つのポリペプチド鎖のＮ−末端配列はAppl
ied Biosystems社の477a Peptide Sequencerを用いて測
定される。表４の結果は、ＤＳＭ６８２６株からの活性
調製物の両ポリペプチド鎖がナリンギナーゼ（Sigma N
o. N-1385）とは異なっていることをはっきりと実証し
ている。
ラムノシダーゼの、およびナリンギナーゼのＮ−末端配
列の決定 実施例５に従って得られたペニシリウム・エスピー．Ｄ
ＳＭ６８２６由来酵素、および同じ方法により精製され
たペニシリウム・デカムベンス由来ナリンギナーゼ（粗
製酵素、Sigma No. N-1385）を再びアクリルアミドゲル
（１０％）で精製し、そしてそれらポリペプチドをエレ
クトロブロッティングにより移した後、ProBrotR膜（Ap
plied Biosystems社, Sequencers No. 42, １９９０年
４月）に移した。これらの条件下では、ナリンギナーゼ
は単一帯を生じたのに対しＤＳＭ６８２６由来精製酵素
は相互に極めて近接した二つの帯に分解することができ
た。それら三つのポリペプチド鎖のＮ−末端配列はAppl
ied Biosystems社の477a Peptide Sequencerを用いて測
定される。表４の結果は、ＤＳＭ６８２６株からの活性
調製物の両ポリペプチド鎖がナリンギナーゼ（Sigma N
o. N-1385）とは異なっていることをはっきりと実証し
ている。
【００６８】
【表４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:80） (72)発明者 カルロ・ジヤーニ ドイツ連邦共和国デー−60596フランクフ ルト／マイン．ヘデリヒシユトラーセ69
Claims (13)
- 【請求項１】 ペニシリウム・エスピー．（Penicilliu
m sp.）ＤＳＭ６８２５および／または６８２６を発酵
させ、 その培養液からバイオマスを分離し、そしてその培養上
清を濃縮することにより取得され得るα−Ｌ−ラムノシ
ダーゼ。 - 【請求項２】 アミノ末端アミノ酸配列 Ｄ−Ｔ−Ｎ−Ｄ−Ｑ−Ｔ−Ｓ−Ａ−Ｋ−Ｖ−Ｄ−Ｒ−Ｇ
−Ｔ−Ｆ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ａ−Ａ−Ｒ−Ｌ または Ｆ−Ｆ−Ｇ−Ｓ−Ｘ−Ｑ−Ｓ−Ｌ−Ｙ−Ｌ−Ｋ−Ｌ−Ｖ
−Ｌ−Ｋ−Ｆ−Ｇ−Ｔ−Ｌ−Ｆ−Ｄ−Ｘ−Ａ を含み、そしてラムノース含有グリコシドの末端ラムノ
ースとアグリコンとの間の結合の切断を触媒する、６０
〜１００kdの分子量を有するα−Ｌ−ラムノシダーゼ。 - 【請求項３】 酵素がペニシリウム・エスピー．に由来
する請求項２記載のα−Ｌ−ラムノシダーゼ。 - 【請求項４】 クロマトフォーカシングにより確認され
る酵素の等電点（ＩＥＰ）が５.６〜５.８である請求項
１または２記載のα−Ｌ−ラムノシダーゼ。 - 【請求項５】 酵素がペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ
６８２５および／または６８２６に由来する請求項２〜
４のいずれかに記載のα−Ｌ−ラムノシダーゼ。 - 【請求項６】 アグリコンが脂肪酸である請求項２記載
のα−Ｌ−ラムノシダーゼ。 - 【請求項７】 α−Ｌ−ラムノシダーゼがラムノリピド
の切断を触媒する請求項１または２記載のα−Ｌ−ラム
ノシダーゼ。 - 【請求項８】 ペニシリウム・エスピー．を栄養培地中
で培養物中にα−Ｌ−ラムノシダーゼが蓄積するまで培
養し、次いでその培養液からバイオマスを分離し、そし
てこのようにして得られた培養上清を濃縮することより
成る請求項１記載のα−Ｌ−ラムノシダーゼの製造方
法。 - 【請求項９】 栄養培地がラムノリピドおよび／または
ラムノリピド誘導体を炭素源として含有する請求項８記
載の方法。 - 【請求項１０】 ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８
２５および／または６８２６が培養される請求項８記載
の方法。 - 【請求項１１】 Ｌ−ラムノース製造のための請求項１
または２記載のα−Ｌ−ラムノシダーゼの使用。 - 【請求項１２】 ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８
２５。 - 【請求項１３】 ペニシリウム・エスピー．ＤＳＭ６８
２６。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4239859 | 1992-11-27 | ||
| DE4239859:2 | 1992-11-27 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06209773A true JPH06209773A (ja) | 1994-08-02 |
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|---|---|---|---|
| JP5296361A Pending JPH06209773A (ja) | 1992-11-27 | 1993-11-26 | ラムノースを得るためのα−Ｌ−ラムノシダーゼ、その製造方法およびその使用 |
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| JP (1) | JPH06209773A (ja) |
| CZ (1) | CZ285149B6 (ja) |
| DE (1) | DE59310216D1 (ja) |
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| SG (1) | SG54274A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013529899A (ja) * | 2010-05-14 | 2013-07-25 | 株式会社ジーシーエイチアンドピー | ジンセノサイド成分を増加させた新規な加工人参または加工人参抽出物の製造方法 |
| US10709749B2 (en) | 2013-08-30 | 2020-07-14 | Green Cross Wellbeing Corporation | Composition for preventing and treating cancer-related fatigue, containing processed ginseng powder or processed ginseng extract having increased ginsenoside constituent |
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|---|---|---|---|---|
| EP0599159B1 (de) * | 1992-11-27 | 2001-09-19 | Aventis Research & Technologies GmbH & Co. KG | Heterogenes Proteingemisch mit alpha-L-rhamnosidase Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung. |
| WO1996006163A1 (en) * | 1994-08-18 | 1996-02-29 | Novo Nordisk A/S | Novel rhamnogalacturonan rhamnosidases |
| JP3833775B2 (ja) * | 1996-06-26 | 2006-10-18 | 株式会社林原生物化学研究所 | 酵素処理ヘスペリジンおよびその製造方法ならびに酵素処理ヘスペリジンの使用方法 |
| DE69821428T2 (de) * | 1997-03-24 | 2004-12-16 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Verfahren zur herstellung einer alpha-monoglucosylhesperidin-reichen substanz |
| DE10006147A1 (de) * | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Merck Patent Gmbh | Verfahren zur Herstellung von monoglycosidierten Flavonoiden |
| US20030157653A1 (en) * | 2000-02-11 | 2003-08-21 | Ohrem Hans Leonard | Method for producing monoglycosidated flavonoids |
| GB0108332D0 (en) * | 2001-04-03 | 2001-05-23 | Univ Durham | Lectin directed prodrug delivery system |
| CN101914451B (zh) * | 2010-07-08 | 2012-01-04 | 山东大学 | 产α-L-鼠李糖苷酶的链格孢菌株及其培养方法与应用 |
| CN104039329B (zh) * | 2012-01-19 | 2020-03-31 | 三得利控股株式会社 | 含去鼠李糖洋丁香酚苷的橄榄提取物 |
| CN104531573B (zh) * | 2014-12-17 | 2017-04-05 | 北京工商大学 | 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 |
| CN104762281B (zh) * | 2015-03-09 | 2017-11-17 | 南京林业大学 | 一种α‑鼠李糖苷酶及其制备方法和应用 |
| CN106191010A (zh) * | 2016-09-27 | 2016-12-07 | 郑州轻工业学院 | 一种鼠李糖苷酶及其在水解黄姜薯蓣皂苷制备薯蓣皂素中的应用 |
| CN111575304B (zh) * | 2020-05-29 | 2023-03-31 | 江西省科学院微生物研究所 | 一种α-L-鼠李糖苷酶突变体的编码基因及其表达载体 |
| CN111662831A (zh) * | 2020-06-12 | 2020-09-15 | 浙江工业大学 | 黑曲霉Rha-N1及其应用 |
| CN116004576B (zh) * | 2022-10-10 | 2025-03-07 | 山西大学 | α-L-鼠李糖苷酶BtRha78A突变体及其制备方法和应用 |
| CN119464254B (zh) * | 2025-01-15 | 2025-04-11 | 南京工业大学 | 一种α-L-鼠李糖苷酶基因及其在生产L-鼠李糖中的应用 |
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| JPS5820189A (ja) * | 1981-07-31 | 1983-02-05 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 耐熱性ヘスペリジナ−ゼａｈ−２の製造法 |
| JPS61146200A (ja) * | 1984-12-20 | 1986-07-03 | 呉羽化学工業株式会社 | アラビアゴムよりラムノ−スの高純度分離方法 |
| JPS62293A (ja) | 1985-06-26 | 1987-01-06 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | Ｌ−ラムノ−スの製造法 |
| JPS62126193A (ja) * | 1985-11-26 | 1987-06-08 | Towa Kasei Kogyo Kk | Ｌ−ラムノ−スの製造方法 |
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| US5008381A (en) * | 1987-11-03 | 1991-04-16 | Nestec S.A. | Selective cleavage of naringin |
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| US4971812A (en) * | 1989-08-31 | 1990-11-20 | National Science Council | Immobilized penicillium sp. naringnase and its use in removing naringin and limonin from fruit juice |
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| EP0599159B1 (de) * | 1992-11-27 | 2001-09-19 | Aventis Research & Technologies GmbH & Co. KG | Heterogenes Proteingemisch mit alpha-L-rhamnosidase Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung. |
-
1993
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- 1993-11-12 SG SG1996006989A patent/SG54274A1/en unknown
- 1993-11-24 US US08/156,718 patent/US5468625A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-25 CZ CZ932543A patent/CZ285149B6/cs not_active IP Right Cessation
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-
1995
- 1995-06-05 US US08/465,414 patent/US5641659A/en not_active Expired - Fee Related
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| US10709749B2 (en) | 2013-08-30 | 2020-07-14 | Green Cross Wellbeing Corporation | Composition for preventing and treating cancer-related fatigue, containing processed ginseng powder or processed ginseng extract having increased ginsenoside constituent |
| US11464821B2 (en) | 2013-08-30 | 2022-10-11 | Green Cross Wellbeing Corporation | Composition for reducing cancer cachexia or weight loss caused by anticancer drug therapy or radiation therapy comprising ginseng extract having increased ginsenoside Rg3 and Rh2 |
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| CZ254393A3 (en) | 1994-06-15 |
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