JPH06209775A - 温度感受性ポリメラーゼ阻害剤、それを含んでなる熱安定性ｄｎａポリメラーゼ組成物及び標的核酸の増幅方法 - Google Patents
温度感受性ポリメラーゼ阻害剤、それを含んでなる熱安定性ｄｎａポリメラーゼ組成物及び標的核酸の増幅方法Info
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- JPH06209775A JPH06209775A JP5274812A JP27481293A JPH06209775A JP H06209775 A JPH06209775 A JP H06209775A JP 5274812 A JP5274812 A JP 5274812A JP 27481293 A JP27481293 A JP 27481293A JP H06209775 A JPH06209775 A JP H06209775A
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- polymerase
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ポリメラーゼ連鎖反応方法において非特異的
生成物の形成を低減又は排除するために使用できる熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体、それを含んで
なる組成物及び該組成物を用いた核酸の増幅方法を提供
する。 【構成】 これらの抗体及び別の温度感受性阻害剤は、
一般的には85℃より低い所定の温度Ｔ1 でＤＮＡポリメ
ラーゼの酵素活性を阻害するのに有効である。阻害剤
は、一般的には40℃よりも高い温度Ｔ2 で不可逆的に不
活性化される。またＴ2 はＴ1 よりも高い。このような
阻害剤は、ＰＣＲに適する診断試験キットに、別個に又
はＤＮＡポリメラーゼとの混合物として供給できる。
生成物の形成を低減又は排除するために使用できる熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体、それを含んで
なる組成物及び該組成物を用いた核酸の増幅方法を提供
する。 【構成】 これらの抗体及び別の温度感受性阻害剤は、
一般的には85℃より低い所定の温度Ｔ1 でＤＮＡポリメ
ラーゼの酵素活性を阻害するのに有効である。阻害剤
は、一般的には40℃よりも高い温度Ｔ2 で不可逆的に不
活性化される。またＴ2 はＴ1 よりも高い。このような
阻害剤は、ＰＣＲに適する診断試験キットに、別個に又
はＤＮＡポリメラーゼとの混合物として供給できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ及
び温度感受性（temperature sensitive)であるＤＮＡポ
リメラーゼ阻害剤（inhibitor)を含んでなる組成物に関
する。また本発明は、診断試験キット及び該組成物を用
いた増幅方法に関する。一般的には、本発明はＰＣＲ及
び診断におけるその用途に関する。
び温度感受性（temperature sensitive)であるＤＮＡポ
リメラーゼ阻害剤（inhibitor)を含んでなる組成物に関
する。また本発明は、診断試験キット及び該組成物を用
いた増幅方法に関する。一般的には、本発明はＰＣＲ及
び診断におけるその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＰＣＲは当該技術分野における著しい進
歩であり、非常に低濃度の標的核酸の検出を可能にし
た。ＰＣＲについての詳細は、例えば、米国特許第 4,6
83,195号、同第 4,683,202号及び同第 4,965,188号明細
書に記載されている。
歩であり、非常に低濃度の標的核酸の検出を可能にし
た。ＰＣＲについての詳細は、例えば、米国特許第 4,6
83,195号、同第 4,683,202号及び同第 4,965,188号明細
書に記載されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】多くの増幅方法が、標
的ではない核酸の非特異的副生成物を提供する。しばし
ばプライマーによるミスプライミングによって非特異性
が生じ、それによってそれらが非標的核酸にアニールす
る。また多くのＰＣＲ方法がプライマー２量体もしくは
オリゴマー及び端と端で（ end-to-end ）結合した数種
のプライマー分子の配列を含む二本鎖副生成物を提供す
る。これらすべての望ましくない生成物は、標的核酸の
正確かつ鋭敏な検出に悪影響を及ぼす。
的ではない核酸の非特異的副生成物を提供する。しばし
ばプライマーによるミスプライミングによって非特異性
が生じ、それによってそれらが非標的核酸にアニールす
る。また多くのＰＣＲ方法がプライマー２量体もしくは
オリゴマー及び端と端で（ end-to-end ）結合した数種
のプライマー分子の配列を含む二本鎖副生成物を提供す
る。これらすべての望ましくない生成物は、標的核酸の
正確かつ鋭敏な検出に悪影響を及ぼす。
【０００４】望ましくない副生成物により引き起こされ
る課題は、標的核酸が非常に低濃度で、例えば、約1000
分子未満で存在する場合に特に深刻である。このような
少数の分子は、感染性疾患の初期段階で生じるか又は非
常に少量の被検体（例えば、法的調査に伴う状況で起こ
る可能性がある）により生じる。ＰＣＲの高い感度は、
或る反応で増幅された標的核酸が同じプライマーを用い
る次の反応へ移される場合に、後者の反応で偽陽性を生
じるという汚染を、方法に対して特に与えやすい。
る課題は、標的核酸が非常に低濃度で、例えば、約1000
分子未満で存在する場合に特に深刻である。このような
少数の分子は、感染性疾患の初期段階で生じるか又は非
常に少量の被検体（例えば、法的調査に伴う状況で起こ
る可能性がある）により生じる。ＰＣＲの高い感度は、
或る反応で増幅された標的核酸が同じプライマーを用い
る次の反応へ移される場合に、後者の反応で偽陽性を生
じるという汚染を、方法に対して特に与えやすい。
【０００５】ＰＣＲについての理想的な条件下、特にそ
の方法で使用される高温で、使用されるプライマーは標
的核酸のみに極めて特異的に結合するだろう。しかしな
がら、また反応混合物は所定時間（例えば、製造、輸送
もしくは顧客に使用される前の期間）低温で維持される
かもしれず、プライマーは非特異的核酸と望ましくなく
結合するかもしれない。このようなことが生じた場合に
は、非特異的プライマー伸長生成物及びプライマー二量
体が形成され、それらはＰＣＲサイクル中高温で標的核
酸と共に増幅されうる。これらの望ましくない生成物
は、幾らかの増幅された標的核酸を不明瞭にする（すな
わち、高いバックグラウンドを生じる）。プライマーは
標的核酸の増幅にあまり有効ではなく、従って、正確な
結果を得るためにはより高価な試薬を多量に必要とす
る。反応中に試薬が非特異的生成物を生成するために利
用されるために、その方法が標的核酸についてより低感
度になる傾向がある。
の方法で使用される高温で、使用されるプライマーは標
的核酸のみに極めて特異的に結合するだろう。しかしな
がら、また反応混合物は所定時間（例えば、製造、輸送
もしくは顧客に使用される前の期間）低温で維持される
かもしれず、プライマーは非特異的核酸と望ましくなく
結合するかもしれない。このようなことが生じた場合に
は、非特異的プライマー伸長生成物及びプライマー二量
体が形成され、それらはＰＣＲサイクル中高温で標的核
酸と共に増幅されうる。これらの望ましくない生成物
は、幾らかの増幅された標的核酸を不明瞭にする（すな
わち、高いバックグラウンドを生じる）。プライマーは
標的核酸の増幅にあまり有効ではなく、従って、正確な
結果を得るためにはより高価な試薬を多量に必要とす
る。反応中に試薬が非特異的生成物を生成するために利
用されるために、その方法が標的核酸についてより低感
度になる傾向がある。
【０００６】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、所定のＰ
ＣＲ段階で使用される高温におけるそれらの安定性によ
りＰＣＲで有利である。従って、ＰＣＲを実施する場
合、ほとんどの者が熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用
する。しかしながら、上記のように、非常に強力な性質
のＰＣＲは固有の課題、すなわち、非特異的核酸の増幅
及びプライマー二量体の形成という課題を有する。これ
らの課題は、比較的低温（すなわち、50℃未満）でも幾
らかの活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在
下で特に深刻である。ＰＣＲ、特に熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼの使用を伴うＰＣＲにおいて、非特異的生成物
及びプライマー二量体の形成を低減又は排除することは
望ましいであろう。
ＣＲ段階で使用される高温におけるそれらの安定性によ
りＰＣＲで有利である。従って、ＰＣＲを実施する場
合、ほとんどの者が熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用
する。しかしながら、上記のように、非常に強力な性質
のＰＣＲは固有の課題、すなわち、非特異的核酸の増幅
及びプライマー二量体の形成という課題を有する。これ
らの課題は、比較的低温（すなわち、50℃未満）でも幾
らかの活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在
下で特に深刻である。ＰＣＲ、特に熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼの使用を伴うＰＣＲにおいて、非特異的生成物
及びプライマー二量体の形成を低減又は排除することは
望ましいであろう。
【０００７】この課題は、ＰＣＲで使用される１つ以上
の試薬をカプセル化することによる、特願平5-109117号
明細書に記載されるような一様式で接せられてきた。カ
プセル化材料は、通常ＰＣＲで使用される温度で溶融し
て適切な時間でのみ反応混合物中に試薬を放出するよう
に工夫されている。カプセル化材料の使用は、特に大量
に場合に煩雑且つ経費がかかり、そして幾つかのＰＣＲ
試薬は受け入れられる程度の困難さでカプセル化される
にすぎない。従って、カプセル化を行うことなく当該技
術分野の課題を解決する必要がある。
の試薬をカプセル化することによる、特願平5-109117号
明細書に記載されるような一様式で接せられてきた。カ
プセル化材料は、通常ＰＣＲで使用される温度で溶融し
て適切な時間でのみ反応混合物中に試薬を放出するよう
に工夫されている。カプセル化材料の使用は、特に大量
に場合に煩雑且つ経費がかかり、そして幾つかのＰＣＲ
試薬は受け入れられる程度の困難さでカプセル化される
にすぎない。従って、カプセル化を行うことなく当該技
術分野の課題を解決する必要がある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記課題は、熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡポリメラーゼの酵素活性
が阻害されるような85℃より低い温度Ｔ1 でＤＮＡポリ
メラーゼを阻害する能力を有し、かつＴ1 よりも高くま
た40℃よりも高い温度Ｔ2 で不可逆的に不活性化される
ことによってＤＮＡポリメラーゼがその酵素活性を回復
する、ＤＮＡポリメラーゼの温度感受性阻害剤を含んで
なる組成物をもって解決される。
ＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡポリメラーゼの酵素活性
が阻害されるような85℃より低い温度Ｔ1 でＤＮＡポリ
メラーゼを阻害する能力を有し、かつＴ1 よりも高くま
た40℃よりも高い温度Ｔ2 で不可逆的に不活性化される
ことによってＤＮＡポリメラーゼがその酵素活性を回復
する、ＤＮＡポリメラーゼの温度感受性阻害剤を含んで
なる組成物をもって解決される。
【０００９】更に、標的核酸の増幅方法は、 Ａ．標的核酸を含有することが推測される被検体を、ポ
リメラーゼ連鎖反応試薬と、及びＤＮＡポリメラーゼの
酵素活性が阻害されるような85℃より低い温度Ｔ1 でＤ
ＮＡポリメラーゼを阻害する能力を有し、かつＴ1 より
も高くまた40℃よりも高い温度Ｔ2 で不可逆的に不活性
化されることによってＤＮＡポリメラーゼがその酵素活
性を回復する、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの温度感受
性阻害剤と接触せしめる段階、並びに Ｂ．得られた混合物を少なくとも温度Ｔ2 にしてＤＮＡ
ポリメラーゼ阻害剤を不活性化しそしてプライマー伸長
生成物を形成せしめる段階、を含んでなる。
リメラーゼ連鎖反応試薬と、及びＤＮＡポリメラーゼの
酵素活性が阻害されるような85℃より低い温度Ｔ1 でＤ
ＮＡポリメラーゼを阻害する能力を有し、かつＴ1 より
も高くまた40℃よりも高い温度Ｔ2 で不可逆的に不活性
化されることによってＤＮＡポリメラーゼがその酵素活
性を回復する、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの温度感受
性阻害剤と接触せしめる段階、並びに Ｂ．得られた混合物を少なくとも温度Ｔ2 にしてＤＮＡ
ポリメラーゼ阻害剤を不活性化しそしてプライマー伸長
生成物を形成せしめる段階、を含んでなる。
【００１０】また、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに特異
的なモノクローナル抗体が、本発明により提供される。
この抗体は、 ａ）ＤＮＡポリメラーゼとの会合定数が少なくとも１×
１０7 モル-1であり、 ｂ）ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性が阻害されるような
85℃より低い温度Ｔ1でＤＮＡポリメラーゼを阻害する
能力を有し、かつＴ1 よりも高くまた40℃よりも高い温
度Ｔ2 で不可逆的に不活性化されることによってＤＮＡ
ポリメラーゼがその酵素活性を回復し、そして ｃ）ＩｇＭもしくはＩｇＧクラスである。
的なモノクローナル抗体が、本発明により提供される。
この抗体は、 ａ）ＤＮＡポリメラーゼとの会合定数が少なくとも１×
１０7 モル-1であり、 ｂ）ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性が阻害されるような
85℃より低い温度Ｔ1でＤＮＡポリメラーゼを阻害する
能力を有し、かつＴ1 よりも高くまた40℃よりも高い温
度Ｔ2 で不可逆的に不活性化されることによってＤＮＡ
ポリメラーゼがその酵素活性を回復し、そして ｃ）ＩｇＭもしくはＩｇＧクラスである。
【００１１】
【具体的な態様】本発明は、試験被検体中の１つ以上の
標的核酸中に存在する１つ以上の特定の核酸配列の増幅
又は検出に向けられている。そのような被検体として
は、細胞もしくはウイルス材料、髪、体液、又は検出可
能である遺伝子ＤＮＡもしくはＲＮＡを含有する別の材
料が挙げられる。検出の主目的が事実上診断である場
合、また本発明は、クローニングＤＮＡもしくはメッセ
ンジャーＲＮＡの能率を改良するために、又は化学的合
成により得られた核酸の混合物から大量の所望の配列を
得るために使用できる。
標的核酸中に存在する１つ以上の特定の核酸配列の増幅
又は検出に向けられている。そのような被検体として
は、細胞もしくはウイルス材料、髪、体液、又は検出可
能である遺伝子ＤＮＡもしくはＲＮＡを含有する別の材
料が挙げられる。検出の主目的が事実上診断である場
合、また本発明は、クローニングＤＮＡもしくはメッセ
ンジャーＲＮＡの能率を改良するために、又は化学的合
成により得られた核酸の混合物から大量の所望の配列を
得るために使用できる。
【００１２】検出しようとする核酸は、プラスミド類並
びにいずれかの供給源（例えば、細菌、酵母、ウイル
ス、植物及び高等動物、ヒト）由来の天然産ＤＮＡもし
くはＲＮＡを包含する多様な供給源より得ることができ
る。それは、既知方法を用いて、血液、末梢血液単核細
胞（ＰＢＭＣ）、組織材料もしくは当該技術分野で既知
である別の供給源を包含する様々な組織から抽出可能で
ある。本発明は、ゲノムＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮ
Ａ、ウイルスＲＮＡ、又は細菌もしくはウイルス感染細
胞中に見いだされるＤＮＡもしくはＲＮＡ中に見いださ
れる核酸配列の増幅及び検出に特に有用である。
びにいずれかの供給源（例えば、細菌、酵母、ウイル
ス、植物及び高等動物、ヒト）由来の天然産ＤＮＡもし
くはＲＮＡを包含する多様な供給源より得ることができ
る。それは、既知方法を用いて、血液、末梢血液単核細
胞（ＰＢＭＣ）、組織材料もしくは当該技術分野で既知
である別の供給源を包含する様々な組織から抽出可能で
ある。本発明は、ゲノムＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮ
Ａ、ウイルスＲＮＡ、又は細菌もしくはウイルス感染細
胞中に見いだされるＤＮＡもしくはＲＮＡ中に見いださ
れる核酸配列の増幅及び検出に特に有用である。
【００１３】本明細書に記載された方法を用いて、感染
症、遺伝的障害もしくは細胞障害、例えば、癌に関連す
る特定の核酸配列を検出もしくは確認できる。またそれ
を用いて法的調査及びＤＮＡ分類ができる。本発明の目
的上、遺伝的疾患は、いずれかの生物体由来のゲノムＤ
ＮＡにおける特異的な欠失もしくは変異、例えば、鎌状
赤血球貧血、嚢胞性線維症、α−タラセミア、β−タラ
セミア及び当業者に容易に明らかである別のものを含
む。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は本発明で類別できる。
検出可能な細菌としては、限定されるものではないが、
ヒト血液中に見いだされる細菌、サルモネラ種、ストレ
プトコッカス種、クラミジア種、ゴノコッカル種（リン
菌種）、結核菌 (Mycobacterium tuberculosis) 、トリ
型結核菌複合体 (Mycobacterium avium complex)、在郷
軍人病菌（Legionella pneumophila) 、クロストリジウ
ム・ディフィシル（Clostridium difficile)、ボレリア
・バードレフェライ（Borreglia burgdorferei) 、カリ
ニ・ニューモシスティス（Pneumocystis carinii) 、マ
イコプラズマ（Mycoplasma) 、ヘモフィルス・インフル
エンザ（Haemophilus influenzae) 、シゲラ種及びリス
テリア種が挙げられる。検出可能なウイルスとしては、
限定されるものではないが、ヘルペス、ＥＢウイルス
（Epstein Barr virus) 、インフルエンザウイルス、サ
イトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、肝炎ウ
イルス並びにレトロウイルス、例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ、
ＨＩＶ−Ｉ及びＨＩＶ−IIが挙げられる。また原生動物
寄生体、酵母及びカビが検出可能である。
症、遺伝的障害もしくは細胞障害、例えば、癌に関連す
る特定の核酸配列を検出もしくは確認できる。またそれ
を用いて法的調査及びＤＮＡ分類ができる。本発明の目
的上、遺伝的疾患は、いずれかの生物体由来のゲノムＤ
ＮＡにおける特異的な欠失もしくは変異、例えば、鎌状
赤血球貧血、嚢胞性線維症、α−タラセミア、β−タラ
セミア及び当業者に容易に明らかである別のものを含
む。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は本発明で類別できる。
検出可能な細菌としては、限定されるものではないが、
ヒト血液中に見いだされる細菌、サルモネラ種、ストレ
プトコッカス種、クラミジア種、ゴノコッカル種（リン
菌種）、結核菌 (Mycobacterium tuberculosis) 、トリ
型結核菌複合体 (Mycobacterium avium complex)、在郷
軍人病菌（Legionella pneumophila) 、クロストリジウ
ム・ディフィシル（Clostridium difficile)、ボレリア
・バードレフェライ（Borreglia burgdorferei) 、カリ
ニ・ニューモシスティス（Pneumocystis carinii) 、マ
イコプラズマ（Mycoplasma) 、ヘモフィルス・インフル
エンザ（Haemophilus influenzae) 、シゲラ種及びリス
テリア種が挙げられる。検出可能なウイルスとしては、
限定されるものではないが、ヘルペス、ＥＢウイルス
（Epstein Barr virus) 、インフルエンザウイルス、サ
イトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、肝炎ウ
イルス並びにレトロウイルス、例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ、
ＨＩＶ−Ｉ及びＨＩＶ−IIが挙げられる。また原生動物
寄生体、酵母及びカビが検出可能である。
【００１４】「ＰＣＲ試薬」とは、いずれかのＰＣＲに
必須であるとみなされる試薬、すなわち、標的核酸につ
いての１つ以上のプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼ、ＤＮＡポリメラーゼコファクター並びに２つ以上
のデオキシリボヌクレオチド−５′−三リン酸を称す
る。各プライマーの正確なサイズは、予測される用途、
標的配列の複雑さ、反応温度及びプライマーの供給源に
依存して変化する。一般的には、本発明に使用されるプ
ライマーは12〜60個のヌクレオチドを有し、そして好ま
しくはそれらは18〜45個のヌクレオチドを有する。
必須であるとみなされる試薬、すなわち、標的核酸につ
いての１つ以上のプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼ、ＤＮＡポリメラーゼコファクター並びに２つ以上
のデオキシリボヌクレオチド−５′−三リン酸を称す
る。各プライマーの正確なサイズは、予測される用途、
標的配列の複雑さ、反応温度及びプライマーの供給源に
依存して変化する。一般的には、本発明に使用されるプ
ライマーは12〜60個のヌクレオチドを有し、そして好ま
しくはそれらは18〜45個のヌクレオチドを有する。
【００１５】本明細書で有用なプライマーは、数多くの
供給源より得るか、又は、例えば、ＡＢＩ ＤＮＡ合成
装置（Applied Biosystemsより入手可能）又はバイオサ
ーチ（Biosearch) 8600 シリーズもしくは 8800 シリー
ズ合成装置（Milligen-Biosearch, Inc.より入手可能）
及びそれらについての既知使用方法（例えば、米国特許
第 4,965,188号明細書に記載）を包含する既知技術及び
装置を用いて調製できる。また生物学的供給源より単離
した天然産プライマーが有用である（例えば、制限エン
ドヌクレアーゼ消化物）。本明細書で使用される「プラ
イマー」の語は、プライマーの混合物も称する。
供給源より得るか、又は、例えば、ＡＢＩ ＤＮＡ合成
装置（Applied Biosystemsより入手可能）又はバイオサ
ーチ（Biosearch) 8600 シリーズもしくは 8800 シリー
ズ合成装置（Milligen-Biosearch, Inc.より入手可能）
及びそれらについての既知使用方法（例えば、米国特許
第 4,965,188号明細書に記載）を包含する既知技術及び
装置を用いて調製できる。また生物学的供給源より単離
した天然産プライマーが有用である（例えば、制限エン
ドヌクレアーゼ消化物）。本明細書で使用される「プラ
イマー」の語は、プライマーの混合物も称する。
【００１６】ＤＮＡポリメラーゼは、それが熱に対して
安定でありそして高温、特にＤＮＡ鎖の変性に使用され
る高い温度で優先的に活性であることを意味する「熱安
定性」である。より詳細には、熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼは、本明細書に記載されるようなポリメラーゼ連鎖
反応で使用される高い温度で実質的に不活性化されな
い。
安定でありそして高温、特にＤＮＡ鎖の変性に使用され
る高い温度で優先的に活性であることを意味する「熱安
定性」である。より詳細には、熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼは、本明細書に記載されるようなポリメラーゼ連鎖
反応で使用される高い温度で実質的に不活性化されな
い。
【００１７】数多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが従
来技術文献に報告されており、それらは米国特許第 4,9
65,188号及び同第 4,889,818号明細書に詳細に記載され
たものを含む。特に有用なポリメラーゼは、各種サーマ
ス（Thermus)細菌種、例えば、サーマス・アクアティク
ス（Thermus aquaticus)、サーマス・サーモフィルス
（Thermus thermophilus) 、サーマス・フィリホルミス
（Thermus filiformis)もしくはサーマス・フラバス（T
hermus flavus) より得られるものである。別の有用な
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、サーモコッカス・リテ
ラリス（Thermococcus literalis) 、ピロコッカス・フ
リオサス（Pyrococcus furiosus)、サーモトガ・エスピ
ー（Thermotoga sp.) 及びWO-A-89/06691 に記載のもの
を包含する別の各種微生物供給源より得られる。幾つか
の有用なポリメラーゼが市販されている。数多くの、生
物から天然産ポリメラーゼを単離するための技術、及び
組換え技術を用いて遺伝子工学処理酵素を生成するため
の技術が既知である。
来技術文献に報告されており、それらは米国特許第 4,9
65,188号及び同第 4,889,818号明細書に詳細に記載され
たものを含む。特に有用なポリメラーゼは、各種サーマ
ス（Thermus)細菌種、例えば、サーマス・アクアティク
ス（Thermus aquaticus)、サーマス・サーモフィルス
（Thermus thermophilus) 、サーマス・フィリホルミス
（Thermus filiformis)もしくはサーマス・フラバス（T
hermus flavus) より得られるものである。別の有用な
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、サーモコッカス・リテ
ラリス（Thermococcus literalis) 、ピロコッカス・フ
リオサス（Pyrococcus furiosus)、サーモトガ・エスピ
ー（Thermotoga sp.) 及びWO-A-89/06691 に記載のもの
を包含する別の各種微生物供給源より得られる。幾つか
の有用なポリメラーゼが市販されている。数多くの、生
物から天然産ポリメラーゼを単離するための技術、及び
組換え技術を用いて遺伝子工学処理酵素を生成するため
の技術が既知である。
【００１８】ＤＮＡポリメラーゼコファクターとは、酵
素が活性について依存する非タンパク質化合物を意味す
る。従って、酵素はコファクターの存在なくしては触媒
的に不活性である。数多くのこのような材料が既知コフ
ァクターであり、それらとしてはマンガン及びマグネシ
ウム化合物を包含する。このような化合物は、二価カチ
オンが水性溶液中に放出されるような状態でマンガンも
しくはマグネシウムを含有する。有用なコファクターと
しては、限定されるものではないが、マンガン塩及びマ
グネシウム塩、例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩及び脂
肪酸塩（例えば、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプ
リン酸及びラウリン酸の塩）が挙げられる。より小さい
塩、すなわち、塩化物、硫酸塩及び酢酸塩が好ましい。
素が活性について依存する非タンパク質化合物を意味す
る。従って、酵素はコファクターの存在なくしては触媒
的に不活性である。数多くのこのような材料が既知コフ
ァクターであり、それらとしてはマンガン及びマグネシ
ウム化合物を包含する。このような化合物は、二価カチ
オンが水性溶液中に放出されるような状態でマンガンも
しくはマグネシウムを含有する。有用なコファクターと
しては、限定されるものではないが、マンガン塩及びマ
グネシウム塩、例えば、塩化物、硫酸塩、酢酸塩及び脂
肪酸塩（例えば、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプ
リン酸及びラウリン酸の塩）が挙げられる。より小さい
塩、すなわち、塩化物、硫酸塩及び酢酸塩が好ましい。
【００１９】マグネシウム塩、例えば、塩化マグネシウ
ム及び硫酸マグネシウムが本発明の実施に際して最も好
ましい。またＰＣＲに必要とされるものは、２つ以上の
デオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸、例えば、
dATP、dCTP、dGTP、dTTPもしくはdUTPである。また類似
体類、例えば、dITP及び７−ジアザ−dGTPが有用であ
る。通常、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPはまとめてdNTPと
称される。
ム及び硫酸マグネシウムが本発明の実施に際して最も好
ましい。またＰＣＲに必要とされるものは、２つ以上の
デオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸、例えば、
dATP、dCTP、dGTP、dTTPもしくはdUTPである。また類似
体類、例えば、dITP及び７−ジアザ−dGTPが有用であ
る。通常、dATP、dCTP、dGTP及びdTTPはまとめてdNTPと
称される。
【００２０】前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、本発
明の実施に際して、水溶性温度感受性阻害剤と組み合わ
せて使用される。この阻害剤は、一般的には85℃より低
い温度Ｔ1 でポリメラーゼに結合してポリメラーゼを不
活性化するように作用する。実際的には、Ｔ1 は55℃未
満である。
明の実施に際して、水溶性温度感受性阻害剤と組み合わ
せて使用される。この阻害剤は、一般的には85℃より低
い温度Ｔ1 でポリメラーゼに結合してポリメラーゼを不
活性化するように作用する。実際的には、Ｔ1 は55℃未
満である。
【００２１】しかしながら、都合のよいことに、一般的
には40℃よりも高い温度Ｔ2 で水溶性温度感受性阻害剤
はＤＮＡポリメラーゼより解離し、そしてＤＮＡポリメ
ラーゼを不活性化する能力がなくなる。好ましくはＴ2
がＴ1 よりも少なくとも５℃高い。本発明の非常に有用
な態様を下記実施例に示す。そこでは、Ｔ1 が一般的に
40℃〜約55℃であり、そしてＴ2 が一般的に75〜95℃で
ある。
には40℃よりも高い温度Ｔ2 で水溶性温度感受性阻害剤
はＤＮＡポリメラーゼより解離し、そしてＤＮＡポリメ
ラーゼを不活性化する能力がなくなる。好ましくはＴ2
がＴ1 よりも少なくとも５℃高い。本発明の非常に有用
な態様を下記実施例に示す。そこでは、Ｔ1 が一般的に
40℃〜約55℃であり、そしてＴ2 が一般的に75〜95℃で
ある。
【００２２】阻害剤は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと
複合体化して、ポリメラーゼにおいて前記温度依存性応
答を行ういずれかの生物学的もしくは化学的分子であり
うる。一般的には、ＤＮＡポリメラーゼ及び温度感受性
阻害剤の結合分子（もしくは複合体）は水溶性である。
阻害剤は、温度に応じてＤＮＡポリメラーゼを結合及び
放出するＤＮＡポリメラーゼ結合タンパク質でありう
る。特に有用な阻害剤は、言及した結合性及び放出性を
有するＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体（モノクロー
ナルもしくはポリクローナル）である。「抗体」の語
は、当業者が通常その語に含まれると理解される生物学
的分子を包含するが、それに加えて、それは遺伝学的に
調製されたそれらの等価物、及び化学的又は遺伝学的に
調製された抗体の断片（例えば、Fab 断片）を包含す
る。抗体（及びそれらの断片）は、本発明の実施に際し
て単独で又は混合物として使用できる。
複合体化して、ポリメラーゼにおいて前記温度依存性応
答を行ういずれかの生物学的もしくは化学的分子であり
うる。一般的には、ＤＮＡポリメラーゼ及び温度感受性
阻害剤の結合分子（もしくは複合体）は水溶性である。
阻害剤は、温度に応じてＤＮＡポリメラーゼを結合及び
放出するＤＮＡポリメラーゼ結合タンパク質でありう
る。特に有用な阻害剤は、言及した結合性及び放出性を
有するＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体（モノクロー
ナルもしくはポリクローナル）である。「抗体」の語
は、当業者が通常その語に含まれると理解される生物学
的分子を包含するが、それに加えて、それは遺伝学的に
調製されたそれらの等価物、及び化学的又は遺伝学的に
調製された抗体の断片（例えば、Fab 断片）を包含す
る。抗体（及びそれらの断片）は、本発明の実施に際し
て単独で又は混合物として使用できる。
【００２３】有用な抗体は伝統的なテクノロジーを用い
て調製できる。例えば、ポリクローナル抗体は、適当な
宿主（ホスト）哺乳動物を、ＤＮＡポリメラーゼ（天然
産のもしくは合成の等価物、又はタンパク質接合体）
で、適当なアジュバント（例えば、フロインド完全アジ
ュバント）と共に免疫化せしめることにより生成でき
る。ブースター注射は力価を増強させるために多様な間
隔で適用できる。一般的には、所定の時間間隔で血清試
料を採取し、そしてＤＮＡポリメラーゼ特異性について
試験した。十分な力価の所望の血清が、通常伝統的な手
段、例えば、イオン交換及びアフィニティークロマトグ
ラフフィー（例えば、プロテインＡもしくはプロテイン
Ｇマトリックスを用いる）を用いて精製される。
て調製できる。例えば、ポリクローナル抗体は、適当な
宿主（ホスト）哺乳動物を、ＤＮＡポリメラーゼ（天然
産のもしくは合成の等価物、又はタンパク質接合体）
で、適当なアジュバント（例えば、フロインド完全アジ
ュバント）と共に免疫化せしめることにより生成でき
る。ブースター注射は力価を増強させるために多様な間
隔で適用できる。一般的には、所定の時間間隔で血清試
料を採取し、そしてＤＮＡポリメラーゼ特異性について
試験した。十分な力価の所望の血清が、通常伝統的な手
段、例えば、イオン交換及びアフィニティークロマトグ
ラフフィー（例えば、プロテインＡもしくはプロテイン
Ｇマトリックスを用いる）を用いて精製される。
【００２４】より詳細には、モノクローナル抗体は、伝
統的な方法、例えば、Milstein他，Nature, 256, 495〜
497 ページ（1975）に記載のもの及びハイブリドーマセ
ルラインを用いてＤＮＡポリメラーゼ免疫化マウスもし
くはラットの免疫細胞から調製できる。その方法では、
宿主動物の抗体分泌性細胞をリンパ様組織（例えば、脾
臓）より単離し、そしてポリエチレングリコールの存在
下マウスミエローマ細胞（例えば、SP2/0-Ag14ネズミミ
エローマ細胞）と融合せしめ、選択培地で希釈し、そし
て組織培養ディッシュの複数のウェルに入れた。７〜14
日後、所望の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞が収穫
され使用又は凍結保存される。また培養上清を、所望の
抗体の存在について試験できる。十分な量の抗体を生成
するために、ハイブリドーマ細胞を静止培養で、中空フ
ァイバーバイオリアクターで、又はマウスの腹水に癌細
胞を移植せしめて培養できる。精製は、ポリクローナル
抗体について記載した方法と同様に実施できる。
統的な方法、例えば、Milstein他，Nature, 256, 495〜
497 ページ（1975）に記載のもの及びハイブリドーマセ
ルラインを用いてＤＮＡポリメラーゼ免疫化マウスもし
くはラットの免疫細胞から調製できる。その方法では、
宿主動物の抗体分泌性細胞をリンパ様組織（例えば、脾
臓）より単離し、そしてポリエチレングリコールの存在
下マウスミエローマ細胞（例えば、SP2/0-Ag14ネズミミ
エローマ細胞）と融合せしめ、選択培地で希釈し、そし
て組織培養ディッシュの複数のウェルに入れた。７〜14
日後、所望の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞が収穫
され使用又は凍結保存される。また培養上清を、所望の
抗体の存在について試験できる。十分な量の抗体を生成
するために、ハイブリドーマ細胞を静止培養で、中空フ
ァイバーバイオリアクターで、又はマウスの腹水に癌細
胞を移植せしめて培養できる。精製は、ポリクローナル
抗体について記載した方法と同様に実施できる。
【００２５】一般的には、モノクローナル抗体は、少な
くとも１×107 モル-1の会合定数を有すると定義される
ような、少なくとも１つの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
に対する親和性を有する。好ましくは、抗体がＩｇＧも
しくはＩｇＭクラスのどちらかのものである。最も好ま
しくは、それがＩｇＧクラスのものである。以下に列挙
した代表的な抗体は、本発明の実施に際して有用であ
る。
くとも１×107 モル-1の会合定数を有すると定義される
ような、少なくとも１つの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
に対する親和性を有する。好ましくは、抗体がＩｇＧも
しくはＩｇＭクラスのどちらかのものである。最も好ま
しくは、それがＩｇＧクラスのものである。以下に列挙
した代表的な抗体は、本発明の実施に際して有用であ
る。
【００２６】
【表１】
【００２７】クローン化抗体培養物のアイソタイプの検
出を、ヤギ抗マウスアイソタイプ特異的西洋ワサビペル
オキシダーゼ標識スコアニング試薬（Fisher Biotech,
Pittsburgh) を用いて標準ERISA プロトコールに従って
実施した。マイクロタイターウェルプレート（LINBRO
(商標) E.I.A. II plus もしくはNunc MaxiSorp (商
標) F96 ) を組換えサーマス・アクアティクス（Thermu
s aquaticus)ＤＮＡポリメラーゼ（２μｇ／mLを50μＬ
／プレートウェル）で被覆し、室温で１時間インキュベ
ーションし、ゼラチン（１％）及び TWEEN (商標) 20非
イオン界面活性剤（0.05％）を含むリン酸緩衝溶液（ 2
00μＬ／プレートウェル）と接触せしめ、そして必要と
される時まで凍結保存した。
出を、ヤギ抗マウスアイソタイプ特異的西洋ワサビペル
オキシダーゼ標識スコアニング試薬（Fisher Biotech,
Pittsburgh) を用いて標準ERISA プロトコールに従って
実施した。マイクロタイターウェルプレート（LINBRO
(商標) E.I.A. II plus もしくはNunc MaxiSorp (商
標) F96 ) を組換えサーマス・アクアティクス（Thermu
s aquaticus)ＤＮＡポリメラーゼ（２μｇ／mLを50μＬ
／プレートウェル）で被覆し、室温で１時間インキュベ
ーションし、ゼラチン（１％）及び TWEEN (商標) 20非
イオン界面活性剤（0.05％）を含むリン酸緩衝溶液（ 2
00μＬ／プレートウェル）と接触せしめ、そして必要と
される時まで凍結保存した。
【００２８】抗体についての初期スクリーニングのため
に、ハイブリドーマ培養上清（50μＬ／プレートウェ
ル）を添加し、続いて一定に振動を与えながら室温でイ
ンキュベーションすることにより、伝統的なELISA を行
った。すべてのインキュベーションに続いて、TITERTEK
(商標) 120マイクロタイタープレート洗浄器を用いて
TWEEN (商標) 20非イオン界面活性剤（0.05％）を含む
リン酸緩衝溶液で５回洗浄した。検出試薬（50μＬ／プ
レートウェル）は、ヤギ抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペル
オキシダーゼ接合体（Biorad, １％ゼラチン／リン酸緩
衝溶液への1:3000希釈液）を含むものであった。色素を
生成するために用いた基質（50μＬ／プレートウェル）
はＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（Kirkegaard & Perry
Laboratories, Gaithersburg, Maryland)であった。室
温で15分間インキュベーションして生成した色素シグナ
ルを、TITERTEK MULTISKAN (商標) MCC/340 Mark II プ
レートリーダーを用いて 414nmで評価した。
に、ハイブリドーマ培養上清（50μＬ／プレートウェ
ル）を添加し、続いて一定に振動を与えながら室温でイ
ンキュベーションすることにより、伝統的なELISA を行
った。すべてのインキュベーションに続いて、TITERTEK
(商標) 120マイクロタイタープレート洗浄器を用いて
TWEEN (商標) 20非イオン界面活性剤（0.05％）を含む
リン酸緩衝溶液で５回洗浄した。検出試薬（50μＬ／プ
レートウェル）は、ヤギ抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペル
オキシダーゼ接合体（Biorad, １％ゼラチン／リン酸緩
衝溶液への1:3000希釈液）を含むものであった。色素を
生成するために用いた基質（50μＬ／プレートウェル）
はＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（Kirkegaard & Perry
Laboratories, Gaithersburg, Maryland)であった。室
温で15分間インキュベーションして生成した色素シグナ
ルを、TITERTEK MULTISKAN (商標) MCC/340 Mark II プ
レートリーダーを用いて 414nmで評価した。
【００２９】これらの抗体の幾つかの親和定数（会合定
数）を、以下のようなELISA アッセイ方法を用いて求め
た。ゼラチン（１％）を含有するリン酸緩衝溶液に溶解
した可溶性抗体をまずELISA プレートに添加し、続いて
最終ＤＮＡポリメラーゼ濃度範囲が３×10-7モル〜３×
10-10 モルであるような希釈細胞培養上清（25μＬ）を
添加したことを除いて、競合ERISA を同様に実施した。
親和定数を算定するために、細胞培養上清をまずELISA
により滴定し、次いでそれを用いて吸光度が減少し始め
るまで希釈して、可溶性抗原を限定量の特異的抗体と混
合せしめたことを確かめた。既知濃度のサーマス・アク
アティクス（Thermus aquaticus)、サーマス・サーモフ
ィルス（Thermus thermophilus) 及びサーマス・フィリ
ホルミス（Thermus filiformis) を可溶性阻害剤として
使用した。最大吸光度の半分の吸光度が得られるＤＮＡ
ポリメラーゼ濃度として、親和定数を阻害曲線から算定
した。以下の第ＩＡ表は、第Ｉ表の数種のモノクローナ
ル抗体について求めた親和定数を示す。
数）を、以下のようなELISA アッセイ方法を用いて求め
た。ゼラチン（１％）を含有するリン酸緩衝溶液に溶解
した可溶性抗体をまずELISA プレートに添加し、続いて
最終ＤＮＡポリメラーゼ濃度範囲が３×10-7モル〜３×
10-10 モルであるような希釈細胞培養上清（25μＬ）を
添加したことを除いて、競合ERISA を同様に実施した。
親和定数を算定するために、細胞培養上清をまずELISA
により滴定し、次いでそれを用いて吸光度が減少し始め
るまで希釈して、可溶性抗原を限定量の特異的抗体と混
合せしめたことを確かめた。既知濃度のサーマス・アク
アティクス（Thermus aquaticus)、サーマス・サーモフ
ィルス（Thermus thermophilus) 及びサーマス・フィリ
ホルミス（Thermus filiformis) を可溶性阻害剤として
使用した。最大吸光度の半分の吸光度が得られるＤＮＡ
ポリメラーゼ濃度として、親和定数を阻害曲線から算定
した。以下の第ＩＡ表は、第Ｉ表の数種のモノクローナ
ル抗体について求めた親和定数を示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】ＴＰ１及びＴＰ６は、サーマス・アクアテ
ィクス（Thermus aquaticus)ＤＮＡポリメラーゼについ
て高い親和性を有するが、他の２つのＤＮＡポリメラー
ゼについてはほとんど親和性を有しないことが認められ
る。ＴＰ２、ＴＰ４、ＴＰ５及びＴＰ８は、サーマス・
アクアティクス（Thermus aquaticus)及びサーマス・サ
ーモフィルス（Thermus thermophilus) ＤＮＡポリメラ
ーゼについて高い親和性を有する。ＴＰ３は、サーマス
・アクアティクス（Thermus aquaticus)及びサーマス・
フィリホルミス（Thermus filiformis) ＤＮＡポリメラ
ーゼについて高い親和性を有する。ＴＰ７及びＴＰ９
は、３種すべてのＤＮＡポリメラーゼについて高い親和
性を有する。
ィクス（Thermus aquaticus)ＤＮＡポリメラーゼについ
て高い親和性を有するが、他の２つのＤＮＡポリメラー
ゼについてはほとんど親和性を有しないことが認められ
る。ＴＰ２、ＴＰ４、ＴＰ５及びＴＰ８は、サーマス・
アクアティクス（Thermus aquaticus)及びサーマス・サ
ーモフィルス（Thermus thermophilus) ＤＮＡポリメラ
ーゼについて高い親和性を有する。ＴＰ３は、サーマス
・アクアティクス（Thermus aquaticus)及びサーマス・
フィリホルミス（Thermus filiformis) ＤＮＡポリメラ
ーゼについて高い親和性を有する。ＴＰ７及びＴＰ９
は、３種すべてのＤＮＡポリメラーゼについて高い親和
性を有する。
【００３２】サーマス・アクアティクス（Thermus aqua
ticus)より得られるＤＮＡポリメラーゼに特異的である
２つの好ましいモノクローナル抗体は、American Type
Culture Collection (Rockville, Maryland)より入手可
能である、それぞれ、HB 11126及びHB 11127と本明細書
では同定（identify) される新規ハイブリドーマセルラ
インを用いて生成したＴＰ４及びＴＰ９と先に同定され
ているものである。
ticus)より得られるＤＮＡポリメラーゼに特異的である
２つの好ましいモノクローナル抗体は、American Type
Culture Collection (Rockville, Maryland)より入手可
能である、それぞれ、HB 11126及びHB 11127と本明細書
では同定（identify) される新規ハイブリドーマセルラ
インを用いて生成したＴＰ４及びＴＰ９と先に同定され
ているものである。
【００３３】また、ＤＮＡポリメラーゼについての有用
な温度感受性阻害剤として本明細書に記載された抗体
が、各種検出標識、例えば、アビジン、ビオチン、酵素
類、放射線同位体類、ルミノール及び当業者に既知の別
の部分と、伝統的な方法を用いて接合できる。得られた
標識抗体は、種々の免疫学的診断及び精製方法に使用で
きる。また、限定されるものではないが、マイクロタイ
タープレート、ポリマー及びガラス粒子、合成及び天然
繊維、磁気粒子、試験管、アフィニティークロマトグラ
フフィーマトリックス、並びにポリマー及びセルロース
フィルム及び紙を包含する種々の水不溶性もしくは水懸
濁性支持体に抗体を付着せしめることができる。付着
は、吸着又は種々共有結合技術を用いて達成できる。
な温度感受性阻害剤として本明細書に記載された抗体
が、各種検出標識、例えば、アビジン、ビオチン、酵素
類、放射線同位体類、ルミノール及び当業者に既知の別
の部分と、伝統的な方法を用いて接合できる。得られた
標識抗体は、種々の免疫学的診断及び精製方法に使用で
きる。また、限定されるものではないが、マイクロタイ
タープレート、ポリマー及びガラス粒子、合成及び天然
繊維、磁気粒子、試験管、アフィニティークロマトグラ
フフィーマトリックス、並びにポリマー及びセルロース
フィルム及び紙を包含する種々の水不溶性もしくは水懸
濁性支持体に抗体を付着せしめることができる。付着
は、吸着又は種々共有結合技術を用いて達成できる。
【００３４】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及び温度感受
性阻害剤の組成物は、すべて適当な緩衝剤中、プライマ
ー、ＤＮＡポリメラーゼコファクター及びデオキシリボ
ヌクレオチド−５′−三リン酸を包含する１つ以上の別
のＰＣＲ試薬との混合物として供給又は使用できる。従
って、一般的には組成物はpH 7.5〜9.5 の範囲内に維持
され、pH８〜９であることが好ましい。あるいは、熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼ及び温度感受性阻害剤は、ＰＣ
Ｒに必要とされる他の試薬と別個に供給できる。それら
は別個に添加されるか、又は使用直前に一緒に混合せし
めることができる。
性阻害剤の組成物は、すべて適当な緩衝剤中、プライマ
ー、ＤＮＡポリメラーゼコファクター及びデオキシリボ
ヌクレオチド−５′−三リン酸を包含する１つ以上の別
のＰＣＲ試薬との混合物として供給又は使用できる。従
って、一般的には組成物はpH 7.5〜9.5 の範囲内に維持
され、pH８〜９であることが好ましい。あるいは、熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼ及び温度感受性阻害剤は、ＰＣ
Ｒに必要とされる他の試薬と別個に供給できる。それら
は別個に添加されるか、又は使用直前に一緒に混合せし
めることができる。
【００３５】本明細書に記載されるＰＣＲ試薬は、所定
の方法に適するいずれかの濃度で提供され、そしてＰＣ
Ｒに使用される。一般的には、ＤＮＡポリメラーゼ及び
阻害剤の複合体の量は、少なくとも反応混合物 100μＬ
当たり酵素１単位で供給すれば十分であり、一度阻害剤
は効果的ではなくなる。好ましくは反応混合物 100μＬ
当たりポリメラーゼ１〜16単位がＰＣＲに必要であり、
そして所定の酵素の特定の活性に依存して、複合体の量
は当業者により容易に決定できる。「単位」の語は、本
明細書では、74℃で30分間に総ヌクレオチド（ｄＮＴ
Ｐ）10ナノモルが伸長核酸鎖に導入されるのに必要とさ
れる酵素活性の量として定義される。組成物中に存在す
る阻害剤の量は、一般的には、ＤＮＡポリメラーゼ１モ
ル当たり阻害剤25〜500 モルであり、ＤＮＡポリメラー
ゼ１モル当たり阻害剤50〜200 モルが好ましい。
の方法に適するいずれかの濃度で提供され、そしてＰＣ
Ｒに使用される。一般的には、ＤＮＡポリメラーゼ及び
阻害剤の複合体の量は、少なくとも反応混合物 100μＬ
当たり酵素１単位で供給すれば十分であり、一度阻害剤
は効果的ではなくなる。好ましくは反応混合物 100μＬ
当たりポリメラーゼ１〜16単位がＰＣＲに必要であり、
そして所定の酵素の特定の活性に依存して、複合体の量
は当業者により容易に決定できる。「単位」の語は、本
明細書では、74℃で30分間に総ヌクレオチド（ｄＮＴ
Ｐ）10ナノモルが伸長核酸鎖に導入されるのに必要とさ
れる酵素活性の量として定義される。組成物中に存在す
る阻害剤の量は、一般的には、ＤＮＡポリメラーゼ１モ
ル当たり阻害剤25〜500 モルであり、ＤＮＡポリメラー
ゼ１モル当たり阻害剤50〜200 モルが好ましい。
【００３６】増幅又は検出しようとする核酸は、通常二
本鎖の形状であるので、プライミングを実施する前に２
つの鎖を分離（すなわち、変性）しなければならない。
これは、伸長処理段階中に行うか、又はその後の別個の
段階とすることができる。変性は、熱処理単独で、又は
従来技術文献に記載されるようないずれかの適当な別の
物理的、化学的もしくは酵素的手段と組み合わせて用い
て達成できる。一般的には、最初の変性は、標的核酸を
含有することが疑われる被検体を適当な時間、例えば、
１秒間〜３分間、85〜100 ℃の第１温度で加熱すること
により実施される。またこの加熱でＤＮＡポリメラーゼ
阻害剤は不活性化される。
本鎖の形状であるので、プライミングを実施する前に２
つの鎖を分離（すなわち、変性）しなければならない。
これは、伸長処理段階中に行うか、又はその後の別個の
段階とすることができる。変性は、熱処理単独で、又は
従来技術文献に記載されるようないずれかの適当な別の
物理的、化学的もしくは酵素的手段と組み合わせて用い
て達成できる。一般的には、最初の変性は、標的核酸を
含有することが疑われる被検体を適当な時間、例えば、
１秒間〜３分間、85〜100 ℃の第１温度で加熱すること
により実施される。またこの加熱でＤＮＡポリメラーゼ
阻害剤は不活性化される。
【００３７】次いで変性鎖を、一般的には55〜70℃の範
囲内の温度まで冷却する。変性鎖を冷却するために必要
とされる時間は、ＰＣＲ方法に使用される装置の型に依
存して変化する。一旦変性された鎖を第２温度に冷却
し、プライマー伸長生成物の形成に有効であるようにす
るためにＰＣＲ試薬を含有する反応混合物を適当な温度
でインキュベーションする。一般的には、この温度は少
なくとも50℃であり、好ましくは65〜75℃の範囲内であ
る。インキュベーション時間は、インキュベーション温
度及び所望の伸長生成物の長さに依存して広範に変化で
きるが、好ましい態様では、１〜120 秒間である。
囲内の温度まで冷却する。変性鎖を冷却するために必要
とされる時間は、ＰＣＲ方法に使用される装置の型に依
存して変化する。一旦変性された鎖を第２温度に冷却
し、プライマー伸長生成物の形成に有効であるようにす
るためにＰＣＲ試薬を含有する反応混合物を適当な温度
でインキュベーションする。一般的には、この温度は少
なくとも50℃であり、好ましくは65〜75℃の範囲内であ
る。インキュベーション時間は、インキュベーション温
度及び所望の伸長生成物の長さに依存して広範に変化で
きるが、好ましい態様では、１〜120 秒間である。
【００３８】このように形成されたプライマー伸長生成
物は適当な方法で検出でき、あるいは、ハイブリッド生
成物として、もしくは一本鎖の検出のために又は更にＰ
ＣＲにかけるために変性されたものとして適当な方法で
検出できる。ハイブリッドプライマー伸長生成物を変性
する場合には、更に所望の回数プライミング、伸長及び
変性のサイクルを実施できる。一般的には、少なくとも
20回サイクルを循環させるが、20〜50回が好ましい。
物は適当な方法で検出でき、あるいは、ハイブリッド生
成物として、もしくは一本鎖の検出のために又は更にＰ
ＣＲにかけるために変性されたものとして適当な方法で
検出できる。ハイブリッドプライマー伸長生成物を変性
する場合には、更に所望の回数プライミング、伸長及び
変性のサイクルを実施できる。一般的には、少なくとも
20回サイクルを循環させるが、20〜50回が好ましい。
【００３９】アッセイ中の最終回の変性の後、最終プラ
イマー伸長生成物は下記のような既知方法を用いて検出
できる。あるいは、プライマー伸長生成物は、既知方
法、例えば、臭化エチジウム染色を伴うアガロースゲル
電気泳動を用いて未変性状態で検出できる。好ましくは
本発明の増幅方法は、反応混合物が所望の設定時間につ
いて温度を調整されたサイクルを循環するように、連続
自動方法で行われる。当業者が既知であるように、数多
くの器具がこの目的で開発されてきた。
イマー伸長生成物は下記のような既知方法を用いて検出
できる。あるいは、プライマー伸長生成物は、既知方
法、例えば、臭化エチジウム染色を伴うアガロースゲル
電気泳動を用いて未変性状態で検出できる。好ましくは
本発明の増幅方法は、反応混合物が所望の設定時間につ
いて温度を調整されたサイクルを循環するように、連続
自動方法で行われる。当業者が既知であるように、数多
くの器具がこの目的で開発されてきた。
【００４０】この目的で使用される或る器具が、幾らか
詳細に米国特許第 4,965,188号明細書及びEP-A-0 236 0
69に記載されており、それは、或る温度環境から別の調
整条件下への移動液を含む。別の器具は、液体手動シス
テムを用いることなく温度サイクリングを利用するもの
であり、それは米国特許第 4,965,188号明細書及びEP-A
-0 236 069に記載されている。一般的には、この器具
は、反応混合物を含有する多数の反応管を収容するため
の熱伝導性容器、加熱、冷却及び温度維持手段、並びに
増幅順序、温度変化及びタイミングを調節する信号を発
生させるための計算手段を含む。
詳細に米国特許第 4,965,188号明細書及びEP-A-0 236 0
69に記載されており、それは、或る温度環境から別の調
整条件下への移動液を含む。別の器具は、液体手動シス
テムを用いることなく温度サイクリングを利用するもの
であり、それは米国特許第 4,965,188号明細書及びEP-A
-0 236 069に記載されている。一般的には、この器具
は、反応混合物を含有する多数の反応管を収容するため
の熱伝導性容器、加熱、冷却及び温度維持手段、並びに
増幅順序、温度変化及びタイミングを調節する信号を発
生させるための計算手段を含む。
【００４１】使い捨て化学試験パックで増幅反応を行う
際に好ましい器具が、幾分詳細にEP-A-0 402 994に記載
されている。一般的には、この器具は、化学試験パック
を支持するための表面、試験パック中の隣接する部屋の
間を流体が移動するように反応パック上で作用する表面
上に支持された加圧器、並びに試験パックを横断して伸
びるような移動範囲で加圧を行うための手段を含む。
際に好ましい器具が、幾分詳細にEP-A-0 402 994に記載
されている。一般的には、この器具は、化学試験パック
を支持するための表面、試験パック中の隣接する部屋の
間を流体が移動するように反応パック上で作用する表面
上に支持された加圧器、並びに試験パックを横断して伸
びるような移動範囲で加圧を行うための手段を含む。
【００４２】本発明方法を使用して、有利に、感染因子
に存在する標的核酸を容易に検出又は確認できる。検出
は、多くの既知方法、例えば、米国特許第 4,965,188号
明細書に記載のもので達成できる。例えば、増幅した核
酸をサザンブロッティング方法（Southern blotting te
chniques) を用いて分析できる。あるいは、増幅は、放
射線同位体で標識したプライマーもしくはビオチニル化
プライマーを用いて実施でき、次いでそれを適当な方法
を用いて検出できる。特異的な配列のオリゴヌクレオチ
ドをドットブロット方法で使用して、核酸中の単一塩基
対変化を検出できる。
に存在する標的核酸を容易に検出又は確認できる。検出
は、多くの既知方法、例えば、米国特許第 4,965,188号
明細書に記載のもので達成できる。例えば、増幅した核
酸をサザンブロッティング方法（Southern blotting te
chniques) を用いて分析できる。あるいは、増幅は、放
射線同位体で標識したプライマーもしくはビオチニル化
プライマーを用いて実施でき、次いでそれを適当な方法
を用いて検出できる。特異的な配列のオリゴヌクレオチ
ドをドットブロット方法で使用して、核酸中の単一塩基
対変化を検出できる。
【００４３】或る好ましい態様では、一度目的とする標
的核酸を所望量生成し、そしてプライマー伸長生成物を
最終時に変性し、増幅した標的核酸を、検出用に標識さ
れており且つプライマー伸長生成物の１つと直接的又は
間接的にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオ
チドプローブを用いて検出する。標識を付着せしめる方
法及びプローブを調製する方法は、従来技術文献、例え
ば、Agrawal 他，Nucleic Acid Res.,14, 6227〜45ペー
ジ（1986）、ビオチン標識に関する米国特許第4,914,21
0号明細書、酵素標識に関する米国特許第 4,962,029号
明細書、並びにそこに記載された文献に記載されている
ように、当該技術分野で周知である。有用な標識には、
放射性同位体類、高電子密度試薬類、色原体類、発蛍光
団類、リン光部分、フェリチン及び別の磁気粒子（米国
特許第 4,795,698号及び同第 4,920,061号明細書参
照）、化学ルミネセンス部分、並びに酵素類（これが好
ましい）が挙げられる。有用な酵素としては、グルコー
スオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ類、ウリカーゼ、ア
ルカリ性ホスファターゼ及び当該技術分野で既知である
別のものが挙げられ、そして既知方法を用いてオリゴヌ
クレオチドに付着せしめることができる。このような酵
素についての基質及び色素生成性組成物は周知である。
的核酸を所望量生成し、そしてプライマー伸長生成物を
最終時に変性し、増幅した標的核酸を、検出用に標識さ
れており且つプライマー伸長生成物の１つと直接的又は
間接的にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオ
チドプローブを用いて検出する。標識を付着せしめる方
法及びプローブを調製する方法は、従来技術文献、例え
ば、Agrawal 他，Nucleic Acid Res.,14, 6227〜45ペー
ジ（1986）、ビオチン標識に関する米国特許第4,914,21
0号明細書、酵素標識に関する米国特許第 4,962,029号
明細書、並びにそこに記載された文献に記載されている
ように、当該技術分野で周知である。有用な標識には、
放射性同位体類、高電子密度試薬類、色原体類、発蛍光
団類、リン光部分、フェリチン及び別の磁気粒子（米国
特許第 4,795,698号及び同第 4,920,061号明細書参
照）、化学ルミネセンス部分、並びに酵素類（これが好
ましい）が挙げられる。有用な酵素としては、グルコー
スオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ類、ウリカーゼ、ア
ルカリ性ホスファターゼ及び当該技術分野で既知である
別のものが挙げられ、そして既知方法を用いてオリゴヌ
クレオチドに付着せしめることができる。このような酵
素についての基質及び色素生成性組成物は周知である。
【００４４】好ましい態様では、１つもしくは両方のプ
ライマーがビオチニル化され、そして増幅された核酸
が、検出可能に標識されたアビジンもしくはそれらの誘
導体を用いて検出される。例えば、アビジンが酵素と接
合せしめられるか、又は放射性部分を有することができ
る。増幅された生成物上のビオチンはアビジンと複合
し、そして適当な検出技術が使用される。
ライマーがビオチニル化され、そして増幅された核酸
が、検出可能に標識されたアビジンもしくはそれらの誘
導体を用いて検出される。例えば、アビジンが酵素と接
合せしめられるか、又は放射性部分を有することができ
る。増幅された生成物上のビオチンはアビジンと複合
し、そして適当な検出技術が使用される。
【００４５】本発明方法を適当な容器で実施することは
有用である。ほとんど加工していない容器は試験管、キ
ュベット、フラスコもしくはビーカーであるが、しかし
該方法を実施する際の自動処理を促進するためにより精
巧な容器が作られている（例えば、WO-A-91/12342 ）。
方法の実施中に所定の温度特性を提供するように構成さ
れたもの、例えば、キュベット及び化学試験パック（ま
たパウチとして既知である）は、米国特許第 4,902,624
号明細書及びEP-A-0 381 501に記載されている。このよ
うな試験パックは、各種試薬、緩衝剤及び増幅もしくは
検出方法の種々段階で有用である別の材料を含む複数の
反応室を有する。パックは、サイクル中適切に且つ迅速
に過熱冷却せしめて本発明の増幅方法の様々な段階を促
進できる。別の有用な容器を、本発明方法の自動化又は
単独使用に適するように作ることができる。
有用である。ほとんど加工していない容器は試験管、キ
ュベット、フラスコもしくはビーカーであるが、しかし
該方法を実施する際の自動処理を促進するためにより精
巧な容器が作られている（例えば、WO-A-91/12342 ）。
方法の実施中に所定の温度特性を提供するように構成さ
れたもの、例えば、キュベット及び化学試験パック（ま
たパウチとして既知である）は、米国特許第 4,902,624
号明細書及びEP-A-0 381 501に記載されている。このよ
うな試験パックは、各種試薬、緩衝剤及び増幅もしくは
検出方法の種々段階で有用である別の材料を含む複数の
反応室を有する。パックは、サイクル中適切に且つ迅速
に過熱冷却せしめて本発明の増幅方法の様々な段階を促
進できる。別の有用な容器を、本発明方法の自動化又は
単独使用に適するように作ることができる。
【００４６】検出しようとする増幅した生成物に関して
は、それを反応媒体中の別の材料から分離することは有
用であることが多い（しかし必須ではない）。これは、
該方法で複製されたプライマー伸長生成物が水不溶性化
せしめられそして試薬混合物から除去されるような、プ
ライマーもしくはプローブにおける水不溶性捕捉手段を
使用することを包含する多数の方法のいずれかにより行
われる。プライマーもしくはプローブを適当な方法で不
溶性材料に付着せしめることができるか、又はそれらを
捕捉可能であるように、すなわち、方法における幾つか
の時点で捕捉手段と反応性であるように設計することが
できる。
は、それを反応媒体中の別の材料から分離することは有
用であることが多い（しかし必須ではない）。これは、
該方法で複製されたプライマー伸長生成物が水不溶性化
せしめられそして試薬混合物から除去されるような、プ
ライマーもしくはプローブにおける水不溶性捕捉手段を
使用することを包含する多数の方法のいずれかにより行
われる。プライマーもしくはプローブを適当な方法で不
溶性材料に付着せしめることができるか、又はそれらを
捕捉可能であるように、すなわち、方法における幾つか
の時点で捕捉手段と反応性であるように設計することが
できる。
【００４７】また検出は、平らな支持体、例えば、前記
微孔質濾過膜上に又は薄いポリマーフィルム、フィルム
積層体、未コーティング紙もしくはポリマーコーティン
グ紙上に捕捉プローブを固定化することにより実施で
き、前記支持体の多くは当該技術分野で既知である。こ
のような材料について更に別のものがEP-A-0 408 738に
提供されている。
微孔質濾過膜上に又は薄いポリマーフィルム、フィルム
積層体、未コーティング紙もしくはポリマーコーティン
グ紙上に捕捉プローブを固定化することにより実施で
き、前記支持体の多くは当該技術分野で既知である。こ
のような材料について更に別のものがEP-A-0 408 738に
提供されている。
【００４８】この開示が、特許請求したＰＣＲにおける
組成物及び試験キットの使用に集中しているとはいえ、
本発明は核酸の酵素的複製についての別の方法、例え
ば、Kwoh他，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1974, 19
89に記載されている転写に基づく増幅技術、Wu他, Geno
mics 4:560, 1989及びBarringer 他, Gene 89:117, 199
0 に記載されている核酸リガーゼ技術、並びに核酸標的
にアニールしたDNA-RNA-DNA プローブのリボヌクレアー
ゼＨ開裂にも有用である。
組成物及び試験キットの使用に集中しているとはいえ、
本発明は核酸の酵素的複製についての別の方法、例え
ば、Kwoh他，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1974, 19
89に記載されている転写に基づく増幅技術、Wu他, Geno
mics 4:560, 1989及びBarringer 他, Gene 89:117, 199
0 に記載されている核酸リガーゼ技術、並びに核酸標的
にアニールしたDNA-RNA-DNA プローブのリボヌクレアー
ゼＨ開裂にも有用である。
【００４９】実施例についての材料及び方法：サーマス
・アクアティクス（Thermus aquaticus)由来の組換えＤ
ＮＡポリメラーゼを、約 250,000単位／タンパク質１mg
の活性を有するように、特願平3-280052号明細書に記載
されるように調製した。活性は、酵素を得るための供給
源及び方法に依存して変更できる。言及したＤＮＡポリ
メラーゼについて特異的な抗体は、モノクローナル抗体
の調製について先に記載した伝統的な方法を用いること
により得た。
・アクアティクス（Thermus aquaticus)由来の組換えＤ
ＮＡポリメラーゼを、約 250,000単位／タンパク質１mg
の活性を有するように、特願平3-280052号明細書に記載
されるように調製した。活性は、酵素を得るための供給
源及び方法に依存して変更できる。言及したＤＮＡポリ
メラーゼについて特異的な抗体は、モノクローナル抗体
の調製について先に記載した伝統的な方法を用いること
により得た。
【００５０】実施例３に使用したプライマーは、既知出
発材料及び方法を用いて、AppliedBiosystems Model 38
0B ＤＮＡ合成装置を用いて製造した。それらは以下の
配列を有した。 配列番号：１： 5′-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3 ′ 配列番号：２： 5′-X-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3 ′ 上記配列中、Ｘは、米国特許第 4,914,210号明細書の教
示を用いて２つのテトラエチレングリコールスペーサー
単位を介して配列に付着せしめたビオチン部分を表す。
発材料及び方法を用いて、AppliedBiosystems Model 38
0B ＤＮＡ合成装置を用いて製造した。それらは以下の
配列を有した。 配列番号：１： 5′-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3 ′ 配列番号：２： 5′-X-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3 ′ 上記配列中、Ｘは、米国特許第 4,914,210号明細書の教
示を用いて２つのテトラエチレングリコールスペーサー
単位を介して配列に付着せしめたビオチン部分を表す。
【００５１】ＨＵＴ／ＨＩＶ ＡＡＶ 78より単離した
ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡ由来の標的核酸は、Syracuse, NYの
SUNY Health Science CenterのDr. Bernard Poieszより
入手した。プライマーは、gag 領域の核酸配列に沿った
標的の二本鎖に相補的であった（ヌクレオチド1541〜16
55）。
ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡ由来の標的核酸は、Syracuse, NYの
SUNY Health Science CenterのDr. Bernard Poieszより
入手した。プライマーは、gag 領域の核酸配列に沿った
標的の二本鎖に相補的であった（ヌクレオチド1541〜16
55）。
【００５２】デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）
は、Sigma Chemical Co.より入手した。別の試薬及び材
料は、市販品であるか、又は容易に入手可能である材料
及び従来の方法を用いて調製することにより得られた。
は、Sigma Chemical Co.より入手した。別の試薬及び材
料は、市販品であるか、又は容易に入手可能である材料
及び従来の方法を用いて調製することにより得られた。
【００５３】実施例１ 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに
特異的な各種抗体の阻害活性の検出 サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus)由来の
ＤＮＡポリメラーゼに特異的な数種の抗体を、酵素の活
性を阻害するそれらの能力について評価した。抗体を試
験し、そして試験結果を下記第II表及び第III 表に列挙
する。
特異的な各種抗体の阻害活性の検出 サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus)由来の
ＤＮＡポリメラーゼに特異的な数種の抗体を、酵素の活
性を阻害するそれらの能力について評価した。抗体を試
験し、そして試験結果を下記第II表及び第III 表に列挙
する。
【００５４】ＤＮＡポリメラーゼ（50単位／mL，2.22ナ
ノモル）を、塩化マグネシウム（５ミリモル）、塩化カ
リウム（25ミリモル）、塩化ナトリウム（75ミリモ
ル）、２−メルカプトエタノール（ 0.5ミリモル）、ゼ
ラチン（ 0.5mg/mL ）、NONIDET（商標）Ｐ−40非イオ
ン性界面活性剤（0.25％，Shell Chemicals ）及びTWEE
N（商標）20非イオン性界面活性剤（0.25％，ICI Ameri
cas）を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン緩衝剤（17.5ミリモル，pH8.0 ）中で、抗体（37.5
μg/mL， 250ナノモル）と室温で10分間インキュベーシ
ョンすることによりアッセイした。次いで以下の物質：
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプ
ロパンスルホン酸緩衝剤（25ミリモル，pH9.8 ）、塩化
マグネシウム（10ミリモル）、塩化カリウム（50ミリモ
ル）、２−メルカプトエタノール（１ミリモル）、活性
化サケ精巣ＤＮＡ鋳型（0.29μg/μL ）、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各々 200マイクロモル）並びに 3
Ｈ−ｄＡＴＰ（ 100マイクロモル，0.02μCi／μL ）
を、ポリメリゼーションを開始するために最終容量50μ
Ｌとなるように添加した。得られた混合物（ＤＮＡポリ
メラーゼ0.89ナノモル及び抗体 100ナノモルを含有す
る）を37℃（Ｔ1 ）で 240分間インキュベーションし
た。
ノモル）を、塩化マグネシウム（５ミリモル）、塩化カ
リウム（25ミリモル）、塩化ナトリウム（75ミリモ
ル）、２−メルカプトエタノール（ 0.5ミリモル）、ゼ
ラチン（ 0.5mg/mL ）、NONIDET（商標）Ｐ−40非イオ
ン性界面活性剤（0.25％，Shell Chemicals ）及びTWEE
N（商標）20非イオン性界面活性剤（0.25％，ICI Ameri
cas）を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン緩衝剤（17.5ミリモル，pH8.0 ）中で、抗体（37.5
μg/mL， 250ナノモル）と室温で10分間インキュベーシ
ョンすることによりアッセイした。次いで以下の物質：
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプ
ロパンスルホン酸緩衝剤（25ミリモル，pH9.8 ）、塩化
マグネシウム（10ミリモル）、塩化カリウム（50ミリモ
ル）、２−メルカプトエタノール（１ミリモル）、活性
化サケ精巣ＤＮＡ鋳型（0.29μg/μL ）、ｄＣＴＰ、ｄ
ＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各々 200マイクロモル）並びに 3
Ｈ−ｄＡＴＰ（ 100マイクロモル，0.02μCi／μL ）
を、ポリメリゼーションを開始するために最終容量50μ
Ｌとなるように添加した。得られた混合物（ＤＮＡポリ
メラーゼ0.89ナノモル及び抗体 100ナノモルを含有す
る）を37℃（Ｔ1 ）で 240分間インキュベーションし
た。
【００５５】次いで、酸沈殿性物質に取り込まれた放射
能の量を測定し、そしてこれを、未希釈酵素１mLにより
これらの条件下で30分間にこの混合物に取り込まれた数
十のヌクレオチドに変換することにより、１mL当たりの
単位量（単位／mL）としてＤＮＡポリメラーゼの活性を
測定した。抗体（もしくは混合物）の阻害効果を、抗体
が存在せず且つＤＮＡポリメラーゼがその理論上の活性
を 100％有する場合の試験に関して「対照に対する％」
として測定した。試験の結果を下記第II表に示す。
能の量を測定し、そしてこれを、未希釈酵素１mLにより
これらの条件下で30分間にこの混合物に取り込まれた数
十のヌクレオチドに変換することにより、１mL当たりの
単位量（単位／mL）としてＤＮＡポリメラーゼの活性を
測定した。抗体（もしくは混合物）の阻害効果を、抗体
が存在せず且つＤＮＡポリメラーゼがその理論上の活性
を 100％有する場合の試験に関して「対照に対する％」
として測定した。試験の結果を下記第II表に示す。
【００５６】
【表３】
【００５７】*クレアチンキナーゼに特異的なラットモ
ノクローナル抗体，一般的に容易に入手可能であるHB94
21としてATCCに寄託されたハイブリドーマより調製し
た。** ラットkappa 鎖に特異的なマウスモノクローナル抗
体，一般的に容易に入手可能であるTIB169としてATCCに
寄託されたハイブリドーマより調製した。*** 陰性値は実験誤差の範囲内である。
ノクローナル抗体，一般的に容易に入手可能であるHB94
21としてATCCに寄託されたハイブリドーマより調製し
た。** ラットkappa 鎖に特異的なマウスモノクローナル抗
体，一般的に容易に入手可能であるTIB169としてATCCに
寄託されたハイブリドーマより調製した。*** 陰性値は実験誤差の範囲内である。
【００５８】これらのデータは、ＴＰ１〜ＴＰ５及びＴ
Ｐ７〜ＴＰ９と同定されるモノクローナル抗体（ＩｇＧ
型）がＤＮＡポリメラーゼを非常に有用に阻害すること
を示したことを示す。ＴＰ６と標識したＩｇＧモノクロ
ーナル抗体並びにＴＰ１０及びＴＰ１１と標識したＩｇ
Ｍモノクローナル抗体は、この特殊な実験では有効では
なかったが、しかし別の条件ではそれらが本発明に従う
より有効なものであることが見いだされるであろう。HB
9421及びTIB169は、ＤＮＡポリメラーゼに特異的ではな
く且つ実験においては「陰性対照」として提供されるＩ
ｇＧクラスのモノクローナル抗体である。ＴＰ１４はＴ
Ｐ１からＴＰ１１までを含む混合物であり、且つＤＮＡ
ポリメラーゼ活性を有効に阻害することを示した。
Ｐ７〜ＴＰ９と同定されるモノクローナル抗体（ＩｇＧ
型）がＤＮＡポリメラーゼを非常に有用に阻害すること
を示したことを示す。ＴＰ６と標識したＩｇＧモノクロ
ーナル抗体並びにＴＰ１０及びＴＰ１１と標識したＩｇ
Ｍモノクローナル抗体は、この特殊な実験では有効では
なかったが、しかし別の条件ではそれらが本発明に従う
より有効なものであることが見いだされるであろう。HB
9421及びTIB169は、ＤＮＡポリメラーゼに特異的ではな
く且つ実験においては「陰性対照」として提供されるＩ
ｇＧクラスのモノクローナル抗体である。ＴＰ１４はＴ
Ｐ１からＴＰ１１までを含む混合物であり、且つＤＮＡ
ポリメラーゼ活性を有効に阻害することを示した。
【００５９】それらが74℃（Ｔ2 ）で不活性化されるか
どうか調べるために、前記第II表に列挙された多数の抗
体を試験した。ＤＮＡポリメラーゼ（２単位／mL， 0.0
89ナノモル）を、総容量50μＬの、Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチル−１，３−アミノプロパンスルホン
酸緩衝剤（25ミリモル，pH8.9 ）、塩化マグネシウム
（10ミリモル）、塩化カリウム（50ミリモル）、２−メ
ルカプトエタノール（１ミリモル）、活性化サケ精巣Ｄ
ＮＡ鋳型（0.29μg/μL ）及び抗体（ 1.5μg/mL，10ナ
ノモル）と混合することによりアッセイした。最終容量
50μＬとなるように、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ
（各々 200マイクロモル）並びに 3Ｈ−ｄＡＴＰ（ 100
マイクロモル，0.02μCi／μL ）を添加して反応を開始
させた。得られた混合物を74℃で10分間インキュベーシ
ョンした。活性の量を測定した結果を下記第III 表に示
す。
どうか調べるために、前記第II表に列挙された多数の抗
体を試験した。ＤＮＡポリメラーゼ（２単位／mL， 0.0
89ナノモル）を、総容量50μＬの、Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチル−１，３−アミノプロパンスルホン
酸緩衝剤（25ミリモル，pH8.9 ）、塩化マグネシウム
（10ミリモル）、塩化カリウム（50ミリモル）、２−メ
ルカプトエタノール（１ミリモル）、活性化サケ精巣Ｄ
ＮＡ鋳型（0.29μg/μL ）及び抗体（ 1.5μg/mL，10ナ
ノモル）と混合することによりアッセイした。最終容量
50μＬとなるように、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ
（各々 200マイクロモル）並びに 3Ｈ−ｄＡＴＰ（ 100
マイクロモル，0.02μCi／μL ）を添加して反応を開始
させた。得られた混合物を74℃で10分間インキュベーシ
ョンした。活性の量を測定した結果を下記第III 表に示
す。
【００６０】
【表４】
【００６１】これらのデータは、ＴＰ１〜ＴＰ９と同定
されるモノクローナル抗体が74℃で10分間インキュベー
ションした後は少なくとも部分的に不活性化されたこと
を示す。より高いＴ2 温度、例えば、90〜95℃では、抗
体の不活性化は更に大きい。抗体を完全に不活性化する
別の条件は容易に見いだすことができるだろう。ＴＰ１
４と同定される混合物及びポリクローナル抗体（ＴＰ１
５及びＴＰ１６）は74℃では十分に不活性化されなかっ
たが、しかし受け入れられる程度まで存在する抗体を不
活性化する別の条件を容易に見いだすことができるだろ
う。
されるモノクローナル抗体が74℃で10分間インキュベー
ションした後は少なくとも部分的に不活性化されたこと
を示す。より高いＴ2 温度、例えば、90〜95℃では、抗
体の不活性化は更に大きい。抗体を完全に不活性化する
別の条件は容易に見いだすことができるだろう。ＴＰ１
４と同定される混合物及びポリクローナル抗体（ＴＰ１
５及びＴＰ１６）は74℃では十分に不活性化されなかっ
たが、しかし受け入れられる程度まで存在する抗体を不
活性化する別の条件を容易に見いだすことができるだろ
う。
【００６２】従って、ＴＰ１〜ＴＰ９と同定される抗体
及びＴＰ１４と同定される混合物が、少なくともある程
度までＤＮＡポリメラーゼと複合して低い温度（Ｔ1 ）
で酵素を不活性化し、そして高い温度（Ｔ2 ）でそれら
自身ある程度まで不活性化されることが見いだされた。
及びＴＰ１４と同定される混合物が、少なくともある程
度までＤＮＡポリメラーゼと複合して低い温度（Ｔ1 ）
で酵素を不活性化し、そして高い温度（Ｔ2 ）でそれら
自身ある程度まで不活性化されることが見いだされた。
【００６３】実施例２ 不活性化性抗体を用いたＰＣＲ
プロトコール 本例は、標的核酸、すなわち、ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡを検
出するためのＰＣＲ方法における実施例１に記載された
幾つかの抗体の使用について具体的に示すものである。
プロトコール 本例は、標的核酸、すなわち、ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡを検
出するためのＰＣＲ方法における実施例１に記載された
幾つかの抗体の使用について具体的に示すものである。
【００６４】得られたＰＣＲ反応混合物は、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（10ミリモル，pH
８）、塩化カリウム（50ミリモル）、塩化マグネシウム
（10ミリモル）、ゼラチン（ 0.1mg/mL ）、各々配列番
号：１及び配列番号：２として先に同定されたプライマ
ー（各々１マイクロモル）、ヒト胎盤ＤＮＡ（２μｇ）
サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus)より得
られたＤＮＡポリメラーゼ（32単位/200μL ， 7.1ナノ
モル）、及び抗体（24μｇ/200μL ， 800ナノモル）を
含有するものであった。標的核酸は 2,000コピー/200μ
L で存在した。
ドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（10ミリモル，pH
８）、塩化カリウム（50ミリモル）、塩化マグネシウム
（10ミリモル）、ゼラチン（ 0.1mg/mL ）、各々配列番
号：１及び配列番号：２として先に同定されたプライマ
ー（各々１マイクロモル）、ヒト胎盤ＤＮＡ（２μｇ）
サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus)より得
られたＤＮＡポリメラーゼ（32単位/200μL ， 7.1ナノ
モル）、及び抗体（24μｇ/200μL ， 800ナノモル）を
含有するものであった。標的核酸は 2,000コピー/200μ
L で存在した。
【００６５】ＤＮＡポリメラーゼ及び抗体を、残りの試
薬を添加する前に混合し、そして22℃（Ｔ1 ）で10分間
インキュベーションして酵素及び抗体の複合体を形成さ
せた。各ＰＣＲ混合物の或る試料（「ｉ」と同定され
る）は直ちに使用し、一方別の試料（「ｌ」と同定され
る）は使用する前に更に５時間室温でインキュベーショ
ンした。ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体は先の第Ｉ
表に同定されている。
薬を添加する前に混合し、そして22℃（Ｔ1 ）で10分間
インキュベーションして酵素及び抗体の複合体を形成さ
せた。各ＰＣＲ混合物の或る試料（「ｉ」と同定され
る）は直ちに使用し、一方別の試料（「ｌ」と同定され
る）は使用する前に更に５時間室温でインキュベーショ
ンした。ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体は先の第Ｉ
表に同定されている。
【００６６】ＰＣＲプロトコールは以下のものであり、
市販のPerkin Elmer Thermal Cycler を用いて 0.5mLの
ミクロ遠心管中で実施した。標的ＤＮＡを95℃（Ｔ2 ）
で約15秒間加熱することにより変性させた。65℃まで冷
却した後、プライマー伸長生成物を約40秒間で形成せし
め、続いて再び95℃で変性させた。プライマー伸長及び
変性のサイクルを35回実施した。
市販のPerkin Elmer Thermal Cycler を用いて 0.5mLの
ミクロ遠心管中で実施した。標的ＤＮＡを95℃（Ｔ2 ）
で約15秒間加熱することにより変性させた。65℃まで冷
却した後、プライマー伸長生成物を約40秒間で形成せし
め、続いて再び95℃で変性させた。プライマー伸長及び
変性のサイクルを35回実施した。
【００６７】ＰＣＲの結果を、従来の方法を用いて４％
アガロースゲル及び臭化エチジウム染色を使用して伝統
的なゲル電気泳動により検出した。これらの結果を図面
及び下記第IV表に示す。抗体は上記第II表に記載のもの
と同定される。また第IV表は、ポリマー粒子に付着せし
められた、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドから
成る捕捉プローブを用いて測定したＰＣＲの結果も示
す。
アガロースゲル及び臭化エチジウム染色を使用して伝統
的なゲル電気泳動により検出した。これらの結果を図面
及び下記第IV表に示す。抗体は上記第II表に記載のもの
と同定される。また第IV表は、ポリマー粒子に付着せし
められた、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドから
成る捕捉プローブを用いて測定したＰＣＲの結果も示
す。
【００６８】捕捉プローブを用いる検出を、３つの試験
ウェルの各々に未コーティングナイロン微孔質膜（Pall
Corp.市販の LOPRODYNE・商標）を有する、米国特許第
4,921,677号明細書に記載のものと同様の試験デバイス
を用いて実施した。ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡのgag 領域の配
列に相補的なオリゴヌクレオチドを、既知技術を用いて
ビーズに共有結合せしめてＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡについて
の捕捉プローブを形成させた、ポリ〔スチレン−コ−３
−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（モノマ
ーモル比 97.6:2.4 ）ビーズ（平均直径１μｍ）の被覆
物を、各膜上で乾燥させた。
ウェルの各々に未コーティングナイロン微孔質膜（Pall
Corp.市販の LOPRODYNE・商標）を有する、米国特許第
4,921,677号明細書に記載のものと同様の試験デバイス
を用いて実施した。ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡのgag 領域の配
列に相補的なオリゴヌクレオチドを、既知技術を用いて
ビーズに共有結合せしめてＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡについて
の捕捉プローブを形成させた、ポリ〔スチレン−コ−３
−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（モノマ
ーモル比 97.6:2.4 ）ビーズ（平均直径１μｍ）の被覆
物を、各膜上で乾燥させた。
【００６９】捕捉プローブオリゴヌクレオチドは以下の
配列を有した。 配列番号：３： 5′-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C-
3′ 非特異的バックグラウンドを検出するために、β−グロ
ビンＤＮＡの核酸配列についての捕捉プローブも、各膜
の別の位置に同様に被覆した。プローブは同じポリマー
粒子から調製し、それは下記配列を有するオリゴヌクレ
オチドから成るものであった。 配列番号：４： 5′-CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT C-3 ′
配列を有した。 配列番号：３： 5′-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C-
3′ 非特異的バックグラウンドを検出するために、β−グロ
ビンＤＮＡの核酸配列についての捕捉プローブも、各膜
の別の位置に同様に被覆した。プローブは同じポリマー
粒子から調製し、それは下記配列を有するオリゴヌクレ
オチドから成るものであった。 配列番号：４： 5′-CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT C-3 ′
【００７０】被覆したプローブを15〜30分間乾燥させ
た。ＰＣＲで増幅した核酸生成物を、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン緩衝剤（10ミリモル，pH８）、
塩化カリウム（50ミリモル）、ゼラチン（ 0.1mg/mL ）
及び塩化マグネシウム（10ミリモル）の溶液で１：20に
希釈し、95℃で５分間加熱して核酸鎖を変性し、そして
ピペットを用いて試験デバイスの各試験ウエルに添加し
た（ 100μＬ）。次いで試験デバイスを42℃で５分間イ
ンキュベーションして、増幅したＰＣＲ生成物を捕捉プ
ローブとハイブリダイザーションせしめた。55℃に温め
たリン酸ナトリウム（ 0.025モル, pH7.4 ）、塩化ナト
リウム（0.37モル）エチレンジアミン四酢酸（ 2.5ミリ
モル）、エチルマーキュリチオサリチル酸，ナトリウム
塩（0.25ミリモル）及びデシル硫酸ナトリウム（１％）
の溶液（ 250μＬ）で試験ウェルを洗浄した。次いで試
験ウェルに、塩化ナトリウム（ 0.075モル）、エチルマ
ーキュリチオサリチル酸，ナトリウム塩（0.25ミリモ
ル）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（0.01モル）及
びカゼイン（ 0.5％）を含有する３−モルホリノプロパ
ンスルホン酸緩衝剤（ 100ミリモル，pH 7.5）及びリン
酸ナトリウム（0.25モル）中にストレプトアビジン−西
洋ワサビペルオキシダーゼ接合体（ 312ng/L）を含む溶
液（50μＬ）を添加し、続いて室温で２分間インキュベ
ーションした。
た。ＰＣＲで増幅した核酸生成物を、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン緩衝剤（10ミリモル，pH８）、
塩化カリウム（50ミリモル）、ゼラチン（ 0.1mg/mL ）
及び塩化マグネシウム（10ミリモル）の溶液で１：20に
希釈し、95℃で５分間加熱して核酸鎖を変性し、そして
ピペットを用いて試験デバイスの各試験ウエルに添加し
た（ 100μＬ）。次いで試験デバイスを42℃で５分間イ
ンキュベーションして、増幅したＰＣＲ生成物を捕捉プ
ローブとハイブリダイザーションせしめた。55℃に温め
たリン酸ナトリウム（ 0.025モル, pH7.4 ）、塩化ナト
リウム（0.37モル）エチレンジアミン四酢酸（ 2.5ミリ
モル）、エチルマーキュリチオサリチル酸，ナトリウム
塩（0.25ミリモル）及びデシル硫酸ナトリウム（１％）
の溶液（ 250μＬ）で試験ウェルを洗浄した。次いで試
験ウェルに、塩化ナトリウム（ 0.075モル）、エチルマ
ーキュリチオサリチル酸，ナトリウム塩（0.25ミリモ
ル）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（0.01モル）及
びカゼイン（ 0.5％）を含有する３−モルホリノプロパ
ンスルホン酸緩衝剤（ 100ミリモル，pH 7.5）及びリン
酸ナトリウム（0.25モル）中にストレプトアビジン−西
洋ワサビペルオキシダーゼ接合体（ 312ng/L）を含む溶
液（50μＬ）を添加し、続いて室温で２分間インキュベ
ーションした。
【００７１】第２洗浄（55℃に温めたもの 250μＬ）に
続いて、トリアリールイミダゾールロイコ色素 4,5−ビ
ス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロ
キシ− 3,5−ジメトキシフェニル）イミダゾール（ 0.1
g/L ）、ポリビニルピロリドン（12.5g/L ）、ジエチル
エチレントリアミン五酢酸（0.01ミリモル）、４′−ヒ
ドロキシアセトアニリド（５ミリモル）、過酸化水素
（ 0.1％）及びリン酸ナトリウム（0.01モル，pH6.8 ）
の溶液（ 100μＬ）を各試験ウェルに添加し、続いて室
温で２分間インキュベーションした。アジ化ナトリウム
（ 0.1％）の溶液を添加して色素の生成を停止し、そし
て得られた色素シグナルをカラーチャート（濃度値０〜
10）と比較した。
続いて、トリアリールイミダゾールロイコ色素 4,5−ビ
ス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒドロ
キシ− 3,5−ジメトキシフェニル）イミダゾール（ 0.1
g/L ）、ポリビニルピロリドン（12.5g/L ）、ジエチル
エチレントリアミン五酢酸（0.01ミリモル）、４′−ヒ
ドロキシアセトアニリド（５ミリモル）、過酸化水素
（ 0.1％）及びリン酸ナトリウム（0.01モル，pH6.8 ）
の溶液（ 100μＬ）を各試験ウェルに添加し、続いて室
温で２分間インキュベーションした。アジ化ナトリウム
（ 0.1％）の溶液を添加して色素の生成を停止し、そし
て得られた色素シグナルをカラーチャート（濃度値０〜
10）と比較した。
【００７２】
【表５】
【００７３】
【表６】
【００７４】＋Ｔは、標的ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡが存在す
ることを表す。−Ｔは、標的ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡが存在
しないことを表す。＋Ａｂは、抗体が存在することを表
す。−Ａｂは、抗体が存在しないことを表す。* ゲル結果は、バンドについて０（バンドなし）〜５
（最高濃度）として定量した。** 捕捉プローブ結果は、可視色素シグナルについて０
（濃度なし）〜10（最高濃度）として定量した。
ることを表す。−Ｔは、標的ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡが存在
しないことを表す。＋Ａｂは、抗体が存在することを表
す。−Ａｂは、抗体が存在しないことを表す。* ゲル結果は、バンドについて０（バンドなし）〜５
（最高濃度）として定量した。** 捕捉プローブ結果は、可視色素シグナルについて０
（濃度なし）〜10（最高濃度）として定量した。
【００７５】第IV表及び図面に示した結果は、ＤＮＡポ
リメラーゼに特異的な抗体が存在しない場合には、プラ
イマー二量体及び非特異的生成物のみが標的ＤＮＡの不
存在下で生成されることを示す（「−Ｔ，−Ａｂ」、
「ｉ」及び「ｌ」の両方で標識された最初の２つのゲル
ストリップを参照されたい）。阻害性抗体の存在下で陰
性対照（標的核酸なし）を表す次の２つのゲルストリッ
プ中の、可視バンドのみがプライマーを使用していな
い。これらの試験は、抗体がＤＮＡポリメラーゼの活性
を有効に阻害し、且つ非特異的生成物の生成を防止する
ことを具体的に説明している。
リメラーゼに特異的な抗体が存在しない場合には、プラ
イマー二量体及び非特異的生成物のみが標的ＤＮＡの不
存在下で生成されることを示す（「−Ｔ，−Ａｂ」、
「ｉ」及び「ｌ」の両方で標識された最初の２つのゲル
ストリップを参照されたい）。阻害性抗体の存在下で陰
性対照（標的核酸なし）を表す次の２つのゲルストリッ
プ中の、可視バンドのみがプライマーを使用していな
い。これらの試験は、抗体がＤＮＡポリメラーゼの活性
を有効に阻害し、且つ非特異的生成物の生成を防止する
ことを具体的に説明している。
【００７６】抗体ＴＰ５、ＴＰ７、ＴＰ８、ＴＰ９及び
ＴＰ１４（混合物）は本発明の範囲内であり、ＰＣＲ混
合物が直ちに（ｉ）及び５時間インキュベーションした
後（ｌ）に使用される場合の両方で、標的核酸の生成の
みを許容した。特異的生成物の収量は抗体が異なると変
化し、それらの幾つかは若干の非特異的生成物の形成を
許した。しかしながら、当業者は、所定の標的核酸に対
する所定の抗体及びこのような生成物の形成を最低限に
するＰＣＲ条件を容易に適合できる。幾つかの抗体は直
ちにＰＣＲ試薬と混合せしめて使用した方が良いとはい
え、別のものは５時間インキュベーションした後でも有
用であった。この実施例で使用した条件下で良好な抗体
は、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体であることは明
らかであった。
ＴＰ１４（混合物）は本発明の範囲内であり、ＰＣＲ混
合物が直ちに（ｉ）及び５時間インキュベーションした
後（ｌ）に使用される場合の両方で、標的核酸の生成の
みを許容した。特異的生成物の収量は抗体が異なると変
化し、それらの幾つかは若干の非特異的生成物の形成を
許した。しかしながら、当業者は、所定の標的核酸に対
する所定の抗体及びこのような生成物の形成を最低限に
するＰＣＲ条件を容易に適合できる。幾つかの抗体は直
ちにＰＣＲ試薬と混合せしめて使用した方が良いとはい
え、別のものは５時間インキュベーションした後でも有
用であった。この実施例で使用した条件下で良好な抗体
は、ＩｇＧクラスのモノクローナル抗体であることは明
らかであった。
【００７７】ＴＰ１４及びＴＰ１５と標識された抗体は
ＤＮＡポリメラーゼに特異的なポリクローナル抗体であ
り、それらはこの実施例の条件下では良く働かなかった
が、しかし別の条件下で本発明を実施する際には有用で
あるだろう。
ＤＮＡポリメラーゼに特異的なポリクローナル抗体であ
り、それらはこの実施例の条件下では良く働かなかった
が、しかし別の条件下で本発明を実施する際には有用で
あるだろう。
【００７８】実施例３ 不活性化についての抗体の評価 本発明の実施に際して有用な抗体を不活性化するために
必要な条件は、以下のように決定した。サーマス・アク
アティクス（Thermus aquaticus)由来のＤＮＡポリメラ
ーゼを、ＤＮＡポリメラーゼが５単位／mL（ 0.222ナノ
モル）であり、そして抗体が3.75μg/mL（25ナノモル）
であったことを除いて、実施例１に先に記載したように
室温（Ｔ1 ）で各抗体とインキュベーションした。この
インキュベーション後、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ 2
7.78ミリモル，pH9.8 ）、塩化マグネシウム（ 11.11ミ
リモル）、塩化カリウム（ 55.56ミリモル）、２−メル
カプトエタノール（1.11ミリモル）及び活性化サケ精巣
ＤＮＡ鋳型（0.32μg/μL ）を添加して最終容量45μＬ
の溶液となるようにした（ＤＮＡポリメラーゼ 0.099ナ
ノモル及び抗体 11.11ナノモルを含有する）。この溶液
を Ericomp（商標）サーモサイクラー（ Ericomp, Inc.
より市販）で１分間85℃（Ｔ2 ）で加熱し、室温まで冷
却し、次いで氷上に少なくとも５分間置いた。次いでｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各々２ミリモル）並び
に 3Ｈ−ｄＡＴＰ（１ミリモル， 0.2μCi／μL ）の溶
液（５μＬ）を添加することにより反応を開始させた。
今やＤＮＡポリメラーゼ 0.089ナノモル及び抗体10ナノ
モルを有する得られた混合物を、74℃で10分間インキュ
ベーションした。
必要な条件は、以下のように決定した。サーマス・アク
アティクス（Thermus aquaticus)由来のＤＮＡポリメラ
ーゼを、ＤＮＡポリメラーゼが５単位／mL（ 0.222ナノ
モル）であり、そして抗体が3.75μg/mL（25ナノモル）
であったことを除いて、実施例１に先に記載したように
室温（Ｔ1 ）で各抗体とインキュベーションした。この
インキュベーション後、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸緩衝剤（ 2
7.78ミリモル，pH9.8 ）、塩化マグネシウム（ 11.11ミ
リモル）、塩化カリウム（ 55.56ミリモル）、２−メル
カプトエタノール（1.11ミリモル）及び活性化サケ精巣
ＤＮＡ鋳型（0.32μg/μL ）を添加して最終容量45μＬ
の溶液となるようにした（ＤＮＡポリメラーゼ 0.099ナ
ノモル及び抗体 11.11ナノモルを含有する）。この溶液
を Ericomp（商標）サーモサイクラー（ Ericomp, Inc.
より市販）で１分間85℃（Ｔ2 ）で加熱し、室温まで冷
却し、次いで氷上に少なくとも５分間置いた。次いでｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（各々２ミリモル）並び
に 3Ｈ−ｄＡＴＰ（１ミリモル， 0.2μCi／μL ）の溶
液（５μＬ）を添加することにより反応を開始させた。
今やＤＮＡポリメラーゼ 0.089ナノモル及び抗体10ナノ
モルを有する得られた混合物を、74℃で10分間インキュ
ベーションした。
【００７９】実施例１に先に記載したように、このイン
キュベーション後のＤＮＡポリメラーゼの活性を測定し
た。残りの抗体活性の阻害効果を、抗体が存在せず且つ
ＤＮＡポリメラーゼがその理論上の活性を 100％有する
場合の試験に関して「対照に対する％」として測定し
た。試験の結果を下記第Ｖ表に提供する。
キュベーション後のＤＮＡポリメラーゼの活性を測定し
た。残りの抗体活性の阻害効果を、抗体が存在せず且つ
ＤＮＡポリメラーゼがその理論上の活性を 100％有する
場合の試験に関して「対照に対する％」として測定し
た。試験の結果を下記第Ｖ表に提供する。
【００８０】
【表７】 * 100％の実験誤差の範囲内である。
【００８１】これらのデータは、ＤＮＡポリメラーゼが
85℃で１分間全く安定であることを示す（対照Ｃに対す
る対照Ａ）。更にデータは、既に満足なＤＮＡポリメラ
ーゼ活性の阻害剤であることを示した（前記第II表）抗
体の各々が、上記加熱温度で完全に又はほとんど完全に
不活性化され、それによってＤＮＡポリメラーゼがすっ
かり活性を取り戻すことを具体的に示している。これら
のデータは、これらの抗体が増幅方法、例えば、ＰＣＲ
についての有用なＤＮＡポリメラーゼ阻害剤であるとい
う本発明者らの結論を支持する。
85℃で１分間全く安定であることを示す（対照Ｃに対す
る対照Ａ）。更にデータは、既に満足なＤＮＡポリメラ
ーゼ活性の阻害剤であることを示した（前記第II表）抗
体の各々が、上記加熱温度で完全に又はほとんど完全に
不活性化され、それによってＤＮＡポリメラーゼがすっ
かり活性を取り戻すことを具体的に示している。これら
のデータは、これらの抗体が増幅方法、例えば、ＰＣＲ
についての有用なＤＮＡポリメラーゼ阻害剤であるとい
う本発明者らの結論を支持する。
【００８２】実施例４ 改良された感度を提供するため
のＰＣＲにおけるＤＮＡポリメラーゼに対する抗体の使
用 本例は、抗体が使用されていなかったＰＣＲ方法と比較
して、ＰＣＲ方法の感度を改良するために本明細書に記
載された抗体を使用した場合について具体的に示すもの
である。
のＰＣＲにおけるＤＮＡポリメラーゼに対する抗体の使
用 本例は、抗体が使用されていなかったＰＣＲ方法と比較
して、ＰＣＲ方法の感度を改良するために本明細書に記
載された抗体を使用した場合について具体的に示すもの
である。
【００８３】本明細書でＴＰ９と同定された抗体を下記
試験に使用した。Dr. Bernard Poieszより入手したヒト
患者試料を、標準的な方法により測定されるＨＩＶ−Ｉ
ＤＮＡ含有量について評価し、そして増幅する前の試
料中のコピーの総数として報告した。患者の試料を、電
気泳動ゲルマトリックス上で特定される２つの別個の試
験グループについて４つのカテゴリーに分類した。４つ
のカテゴリーは「陽性（高）」、「陽性（中）」、「陽
性（低）」及び「陰性」であった。
試験に使用した。Dr. Bernard Poieszより入手したヒト
患者試料を、標準的な方法により測定されるＨＩＶ−Ｉ
ＤＮＡ含有量について評価し、そして増幅する前の試
料中のコピーの総数として報告した。患者の試料を、電
気泳動ゲルマトリックス上で特定される２つの別個の試
験グループについて４つのカテゴリーに分類した。４つ
のカテゴリーは「陽性（高）」、「陽性（中）」、「陽
性（低）」及び「陰性」であった。
【００８４】アッセイを、EP-A-0 402 994に記載のもの
と類似の自蔵式試験デバイスで実施し、そして増幅後、
EP-A-0 408 738に記載の方法を用いて先に実施例２に記
載したようなゲル電気泳動を用いて又は捕捉プローブを
用いる使い捨て試験デバイスを用いて検出するために、
反応混合物をミクロ遠心管に移した。
と類似の自蔵式試験デバイスで実施し、そして増幅後、
EP-A-0 408 738に記載の方法を用いて先に実施例２に記
載したようなゲル電気泳動を用いて又は捕捉プローブを
用いる使い捨て試験デバイスを用いて検出するために、
反応混合物をミクロ遠心管に移した。
【００８５】増幅方法では、二組のプライマーを用いて
ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡのgag 及びenvの両領域の核酸配列
を検出したので、従って２種の別個の生成物が電気泳動
ゲル上に認められた。gag 領域についてのプライマーは
以下の配列番号：５及び配列番号：６で同定され、一方
env 領域についてのプライマーは以下の配列番号：７及
び配列番号：８で同定される。これらのプライマーは以
下の配列を有した。 配列番号：５： 5′-X-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA-3 ′ 配列番号：６： 5′-X-TTCCTGCTAT GTCACTTCCC CTTGGTTC-3 ′ 配列番号：７： 5′-X-TAGCACCCAC CAGGGCAAAG AGAAGAGT-3 ′ 配列番号：８： 5′-X-AGATGCTGTT GCGCCTCAAT AGCCCTCA-3 ′ これらの配列では、Ｘは、米国特許第 4,914,210号明細
書の教示を用いて２つのテトラエチレングリコールスペ
ーサー単位を介して配列に付着せしめたビオチン部分を
表す。プライマーは、市販の ABI 380B ＤＮＡ合成装置
及びApplied Biosystems１μモルCPG カラムで標準出発
材料及び方法を用いて合成した。
ＨＩＶ−Ｉ ＤＮＡのgag 及びenvの両領域の核酸配列
を検出したので、従って２種の別個の生成物が電気泳動
ゲル上に認められた。gag 領域についてのプライマーは
以下の配列番号：５及び配列番号：６で同定され、一方
env 領域についてのプライマーは以下の配列番号：７及
び配列番号：８で同定される。これらのプライマーは以
下の配列を有した。 配列番号：５： 5′-X-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA-3 ′ 配列番号：６： 5′-X-TTCCTGCTAT GTCACTTCCC CTTGGTTC-3 ′ 配列番号：７： 5′-X-TAGCACCCAC CAGGGCAAAG AGAAGAGT-3 ′ 配列番号：８： 5′-X-AGATGCTGTT GCGCCTCAAT AGCCCTCA-3 ′ これらの配列では、Ｘは、米国特許第 4,914,210号明細
書の教示を用いて２つのテトラエチレングリコールスペ
ーサー単位を介して配列に付着せしめたビオチン部分を
表す。プライマーは、市販の ABI 380B ＤＮＡ合成装置
及びApplied Biosystems１μモルCPG カラムで標準出発
材料及び方法を用いて合成した。
【００８６】ＰＣＲ反応混合物は、塩化カリウム（50ミ
リモル）、塩化マグネシウム（10ミリモル）、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（10ミリモ
ル）、ゼラチン（ 0.1mg/mL ）、エチレンジアミン四酢
酸（１ミリモル）、グリセロール（ 9.5 v/v％）、ｄＮ
ＴＰ類（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを
各々 1.5ミリモル）、上記４種のオリゴヌクレオチドプ
ライマー（各々１マイクロモル）、標的ＤＮＡを含有す
る患者試料（16.3μg/mL）、ＴＰ９抗体（ 0.107mg/mL
）並びにＤＮＡポリメラーゼ（サーマス・アクアティ
クス（Thermus aquaticus)由来， 160単位／mL）を含有
するものであった。
リモル）、塩化マグネシウム（10ミリモル）、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（10ミリモ
ル）、ゼラチン（ 0.1mg/mL ）、エチレンジアミン四酢
酸（１ミリモル）、グリセロール（ 9.5 v/v％）、ｄＮ
ＴＰ類（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを
各々 1.5ミリモル）、上記４種のオリゴヌクレオチドプ
ライマー（各々１マイクロモル）、標的ＤＮＡを含有す
る患者試料（16.3μg/mL）、ＴＰ９抗体（ 0.107mg/mL
）並びにＤＮＡポリメラーゼ（サーマス・アクアティ
クス（Thermus aquaticus)由来， 160単位／mL）を含有
するものであった。
【００８７】患者試料は、ＨＩＶ−Ｉに感染しているこ
とが既知であるか、又はそのウイルスに感染していない
と信じられる患者より得た。ＤＮＡは、末梢血液単核細
胞の標準フェノール／クロロホルム抽出を用いて患者試
料より得た。ＴＰ９抗体をＤＮＡポリメラーゼと混合
し、そして穏やかに攪拌しながら室温で10分間インキュ
ベーションした後、別の成分を添加してＰＣＲ反応混合
物を生成した。対照反応では、ＴＰ９を排除してトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（10ミリモ
ル）及びエチレンジアミン四酢酸（１ミリモル）の溶液
と置き換えた。
とが既知であるか、又はそのウイルスに感染していない
と信じられる患者より得た。ＤＮＡは、末梢血液単核細
胞の標準フェノール／クロロホルム抽出を用いて患者試
料より得た。ＴＰ９抗体をＤＮＡポリメラーゼと混合
し、そして穏やかに攪拌しながら室温で10分間インキュ
ベーションした後、別の成分を添加してＰＣＲ反応混合
物を生成した。対照反応では、ＴＰ９を排除してトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤（10ミリモ
ル）及びエチレンジアミン四酢酸（１ミリモル）の溶液
と置き換えた。
【００８８】ＰＣＲ反応混合物の試料（ 200μＬ）を前
記試験パックの反応室に入れ、そしてEP-A-0 402 994に
記載されているサーモサイクラー及び以下のプロトコー
ルを用いてＰＣＲ増幅を実施した。90℃で 120秒間予備
加熱、並びに下記段階を40サイクル：92℃で30秒間、及
び70℃で80秒間。
記試験パックの反応室に入れ、そしてEP-A-0 402 994に
記載されているサーモサイクラー及び以下のプロトコー
ルを用いてＰＣＲ増幅を実施した。90℃で 120秒間予備
加熱、並びに下記段階を40サイクル：92℃で30秒間、及
び70℃で80秒間。
【００８９】試料の半分については、試薬室に試料を置
いた直後に増幅を実施した。残りの試料については、試
験パックを室温で２時間静置した後で増幅を実施した。
増幅した後、試薬室中の流体をミクロ遠心管に入れ、そ
して臭化エチジウムで染色した４％アガロースゲル上で
のサイズ分離と、及び捕捉プローブを用いた検出系（前
記実施例２に記載したものと類似の系）との両方によ
り、ＰＣＲ生成物を分析した。
いた直後に増幅を実施した。残りの試料については、試
験パックを室温で２時間静置した後で増幅を実施した。
増幅した後、試薬室中の流体をミクロ遠心管に入れ、そ
して臭化エチジウムで染色した４％アガロースゲル上で
のサイズ分離と、及び捕捉プローブを用いた検出系（前
記実施例２に記載したものと類似の系）との両方によ
り、ＰＣＲ生成物を分析した。
【００９０】ゲル上に認められた結果は、ＴＰ９の存在
下で形成されたプライマー／二量体の量が著しく低減さ
れたことを示した。また抗体の使用は増幅効率を増強し
た。特に、増幅を延長した場合に、抗体の使用は増幅効
率を増強した。抗体が存在しない場合には、増幅は延長
した試料において可能ではなかった。捕捉プローブ試験
の結果を下記第VI表に示す。
下で形成されたプライマー／二量体の量が著しく低減さ
れたことを示した。また抗体の使用は増幅効率を増強し
た。特に、増幅を延長した場合に、抗体の使用は増幅効
率を増強した。抗体が存在しない場合には、増幅は延長
した試料において可能ではなかった。捕捉プローブ試験
の結果を下記第VI表に示す。
【００９１】
【表８】
【００９２】*「Ｉ」は、不確定結果を表す。１つのプ
ライマーセットは陽性であったが、別のプライマーセッ
トは陰性であったことを意味する。捕捉プローブを用い
た結果は、ゲル／臭化エチジウム染色実験で観察された
ものと一致した。
ライマーセットは陽性であったが、別のプライマーセッ
トは陰性であったことを意味する。捕捉プローブを用い
た結果は、ゲル／臭化エチジウム染色実験で観察された
ものと一致した。
【００９３】実施例５ 種々熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼを用いたＰＣＲにおける阻害性抗体の使用 本発明の実施を更に具体的に説明するために、本発明者
らは、各々サーマス・フィリホルミス（Thermus filifo
rmis) 、サーマス・フラバス（Thermus flavus) 及びサ
ーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus) より
単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに結合して阻害
する所定の抗体もしくは抗体混合物が、また特許請求し
た発明の実施に際して有用であることを示す幾つかの実
験を設定及び実施した。これらの実験は先に実施例２に
記載したように実施した。
ゼを用いたＰＣＲにおける阻害性抗体の使用 本発明の実施を更に具体的に説明するために、本発明者
らは、各々サーマス・フィリホルミス（Thermus filifo
rmis) 、サーマス・フラバス（Thermus flavus) 及びサ
ーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus) より
単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに結合して阻害
する所定の抗体もしくは抗体混合物が、また特許請求し
た発明の実施に際して有用であることを示す幾つかの実
験を設定及び実施した。これらの実験は先に実施例２に
記載したように実施した。
【００９４】サーマス・フィリホルミス（Thermus fili
formis) 由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いた第
１実験では、異なる試験において標的ＨＩＶ−Ｉ ＤＮ
Ａを100又は10,000コピーで存在させたことを除いて、
本実験で用いたＰＣＲ反応混合物は実施例２に記載した
ものと類似のものであった。本明細書ではＴＰ９と同定
される阻害抗体は、ＤＮＡポリメラーゼに対するモル比
100：１で存在させた。
formis) 由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いた第
１実験では、異なる試験において標的ＨＩＶ−Ｉ ＤＮ
Ａを100又は10,000コピーで存在させたことを除いて、
本実験で用いたＰＣＲ反応混合物は実施例２に記載した
ものと類似のものであった。本明細書ではＴＰ９と同定
される阻害抗体は、ＤＮＡポリメラーゼに対するモル比
100：１で存在させた。
【００９５】サーマス・フィリホルミス（Thermus fili
formis) 由来のＤＮＡポリメラーゼ及び抗体ＴＰ９を混
合し、その後残りのＰＣＲ試薬を添加し、そして22℃
（Ｔ1）で10分間インキュベーションして酵素と抗体の
複合体を形成せしめた。各ＰＣＲ混合物の試料の１つを
直ちに使用し、一方別の試料は使用する前に更に５時間
室温でインキュベーションした。対照試験は混合物中に
抗体を全く含めないで同様に実施した。
formis) 由来のＤＮＡポリメラーゼ及び抗体ＴＰ９を混
合し、その後残りのＰＣＲ試薬を添加し、そして22℃
（Ｔ1）で10分間インキュベーションして酵素と抗体の
複合体を形成せしめた。各ＰＣＲ混合物の試料の１つを
直ちに使用し、一方別の試料は使用する前に更に５時間
室温でインキュベーションした。対照試験は混合物中に
抗体を全く含めないで同様に実施した。
【００９６】市販のPerkin Elmer Thermal Cycler Mode
l PE 9600 を用いて実施例２に記載の通りにＰＣＲを実
施した。標的ＤＮＡを変性し、そして95℃（Ｔ2 ）で約
３分間加熱することにより阻害抗体を不活性化した。典
型的なＰＣＲサイクルは、95℃で15秒間変性せしめる段
階、55℃で30秒間プライマーをアニーリングせしめる段
階、及び70℃で30秒間プライマーを伸長せしめる段階を
含むものであった。全部で35回サイクルを実施した。
l PE 9600 を用いて実施例２に記載の通りにＰＣＲを実
施した。標的ＤＮＡを変性し、そして95℃（Ｔ2 ）で約
３分間加熱することにより阻害抗体を不活性化した。典
型的なＰＣＲサイクルは、95℃で15秒間変性せしめる段
階、55℃で30秒間プライマーをアニーリングせしめる段
階、及び70℃で30秒間プライマーを伸長せしめる段階を
含むものであった。全部で35回サイクルを実施した。
【００９７】ＰＣＲの結果を、従来の方法に従って４％
アガロースゲル及び臭化エチジウム染色を使用して伝統
的なゲル電気泳動により検出した。阻害抗体ＴＰ９が、
ＰＣＲの前のあまり過酷でない条件下で結合したプライ
マーの酵素的伸長を効果的に防止したことは、結果より
明らかであった。標的核酸の増幅は正常に実施された。
従って抗体は、サーマス・フィリホルミス（Thermus fi
liformis) 由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対して
温度感受性阻害剤として作用した。
アガロースゲル及び臭化エチジウム染色を使用して伝統
的なゲル電気泳動により検出した。阻害抗体ＴＰ９が、
ＰＣＲの前のあまり過酷でない条件下で結合したプライ
マーの酵素的伸長を効果的に防止したことは、結果より
明らかであった。標的核酸の増幅は正常に実施された。
従って抗体は、サーマス・フィリホルミス（Thermus fi
liformis) 由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対して
温度感受性阻害剤として作用した。
【００９８】第２実験は、本明細書でＴＰ１〜ＴＰ１１
と同定される11種のモノクローナル抗体の混合物を使用
したことを除いて上記と同様に実施した。この混合物は
ＴＰ１４と同定される。各抗体を等量で混合物中に存在
させた。抗体混合物対ＤＮＡポリメラーゼ 100：１及び
126：１という２つのモル比で混合物を用いて、ＰＣＲ
におけるサーマス・フラバス（Thermus flavus) 由来の
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害した。
と同定される11種のモノクローナル抗体の混合物を使用
したことを除いて上記と同様に実施した。この混合物は
ＴＰ１４と同定される。各抗体を等量で混合物中に存在
させた。抗体混合物対ＤＮＡポリメラーゼ 100：１及び
126：１という２つのモル比で混合物を用いて、ＰＣＲ
におけるサーマス・フラバス（Thermus flavus) 由来の
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害した。
【００９９】サーマス・フラバス（Thermus flavus) 由
来のＤＮＡポリメラーゼ及び抗体混合物を混合し、その
後残りのＰＣＲ試薬を添加し、そして22℃（Ｔ1 ）で10
分間インキュベーションして酵素と抗体の複合体を形成
せしめた。各ＰＣＲ混合物の試料の１つを直ちに使用
し、一方別の試料は使用する前に更に７時間室温でイン
キュベーションした。対照試験は混合物中に抗体を全く
含めないで同様に実施した。ＰＣＲを、前記第１実験に
記載の通り35回実施した。
来のＤＮＡポリメラーゼ及び抗体混合物を混合し、その
後残りのＰＣＲ試薬を添加し、そして22℃（Ｔ1 ）で10
分間インキュベーションして酵素と抗体の複合体を形成
せしめた。各ＰＣＲ混合物の試料の１つを直ちに使用
し、一方別の試料は使用する前に更に７時間室温でイン
キュベーションした。対照試験は混合物中に抗体を全く
含めないで同様に実施した。ＰＣＲを、前記第１実験に
記載の通り35回実施した。
【０１００】ＰＣＲの結果を、従来の方法に従って４％
アガロースゲル及び臭化エチジウム染色を使用して伝統
的なゲル電気泳動により検出した。阻害抗体が、ＰＣＲ
の前のあまり過酷でない条件下で結合したプライマーの
酵素的伸長を効果的に防止したことは、結果より明らか
であった。標的核酸の増幅は正常に実施された。従って
抗体は、サーマス・フラバス（Thermus flavus) 由来の
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対して温度感受性阻害剤
として作用した。
アガロースゲル及び臭化エチジウム染色を使用して伝統
的なゲル電気泳動により検出した。阻害抗体が、ＰＣＲ
の前のあまり過酷でない条件下で結合したプライマーの
酵素的伸長を効果的に防止したことは、結果より明らか
であった。標的核酸の増幅は正常に実施された。従って
抗体は、サーマス・フラバス（Thermus flavus) 由来の
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対して温度感受性阻害剤
として作用した。
【０１０１】第３実験は、抗体混合物対ＤＮＡポリメラ
ーゼ 100：１及び 278：１という２つのモル比でサーマ
ス・サーモフィルス（Thermus thermophilus) 由来の熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害するように、抗
体の混合物ＴＰ１４を用いて第２実験と同様に実施し
た。
ーゼ 100：１及び 278：１という２つのモル比でサーマ
ス・サーモフィルス（Thermus thermophilus) 由来の熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害するように、抗
体の混合物ＴＰ１４を用いて第２実験と同様に実施し
た。
【０１０２】サーマス・サーモフィルス（Thermus ther
mophilus) 由来のＤＮＡポリメラーゼ及び抗体混合物を
混合し、その後残りのＰＣＲ試薬を添加し、そして22℃
（Ｔ1 ）で10分間インキュベーションして酵素と抗体の
複合体を形成せしめた。各ＰＣＲ混合物の試料の１つを
直ちに使用し、一方別の試料は使用する前に更に７時間
室温でインキュベーションした。対照試験は混合物中に
抗体を全く含めないで同様に実施した。ＰＣＲを、前記
の通り35回実施した。
mophilus) 由来のＤＮＡポリメラーゼ及び抗体混合物を
混合し、その後残りのＰＣＲ試薬を添加し、そして22℃
（Ｔ1 ）で10分間インキュベーションして酵素と抗体の
複合体を形成せしめた。各ＰＣＲ混合物の試料の１つを
直ちに使用し、一方別の試料は使用する前に更に７時間
室温でインキュベーションした。対照試験は混合物中に
抗体を全く含めないで同様に実施した。ＰＣＲを、前記
の通り35回実施した。
【０１０３】ＰＣＲの結果を、従来の方法に従って４％
アガロースゲル及び臭化エチジウム染色を使用して伝統
的なゲル電気泳動により検出した。阻害抗体が、ＰＣＲ
の前のあまり過酷でない条件下で結合したプライマーの
酵素的伸長を効果的に防止したことは、結果より明らか
であった。標的核酸の増幅は正常に実施された。従って
抗体は、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermoph
ilus) 由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対して温度
感受性阻害剤として作用した。
アガロースゲル及び臭化エチジウム染色を使用して伝統
的なゲル電気泳動により検出した。阻害抗体が、ＰＣＲ
の前のあまり過酷でない条件下で結合したプライマーの
酵素的伸長を効果的に防止したことは、結果より明らか
であった。標的核酸の増幅は正常に実施された。従って
抗体は、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermoph
ilus) 由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対して温度
感受性阻害剤として作用した。
【０１０４】第４実験は、抗体対ＤＮＡポリメラーゼ
２：１、10：１及び 100：１という３つのモル比でサー
マス・サーモフィルス（Thermus thermophilus) 由来の
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害するように、
本明細書で同定されたポリクローナル抗体ＴＰ１５を用
いて上記と同様に実施した。
２：１、10：１及び 100：１という３つのモル比でサー
マス・サーモフィルス（Thermus thermophilus) 由来の
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害するように、
本明細書で同定されたポリクローナル抗体ＴＰ１５を用
いて上記と同様に実施した。
【０１０５】サーマス・サーモフィルス（Thermus ther
mophilus) 由来のＤＮＡポリメラーゼ及び抗体を混合
し、その後残りのＰＣＲ試薬を添加し、そして22℃（Ｔ
1 ）で10分間インキュベーションして酵素と抗体の複合
体を形成せしめた。各ＰＣＲ混合物の試料の１つを直ち
に使用し、一方別の試料は使用する前に更に７時間室温
でインキュベーションした。対照試験は混合物中に抗体
を全く含めないで同様に実施した。ＰＣＲを、前記の通
り35回実施した。
mophilus) 由来のＤＮＡポリメラーゼ及び抗体を混合
し、その後残りのＰＣＲ試薬を添加し、そして22℃（Ｔ
1 ）で10分間インキュベーションして酵素と抗体の複合
体を形成せしめた。各ＰＣＲ混合物の試料の１つを直ち
に使用し、一方別の試料は使用する前に更に７時間室温
でインキュベーションした。対照試験は混合物中に抗体
を全く含めないで同様に実施した。ＰＣＲを、前記の通
り35回実施した。
【０１０６】ＰＣＲの結果を、従来の方法に従って４％
アガロースゲル及び臭化エチジウム染色を使用して伝統
的なゲル電気泳動により検出した。阻害抗体が、ＰＣＲ
の前のあまり過酷でない条件下で結合したプライマーの
酵素的伸長を効果的に防止したことは、結果より明らか
であった。標的核酸の増幅は正常に実施された。従って
抗体は、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermoph
ilus) 由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対して温度
感受性阻害剤として作用した。
アガロースゲル及び臭化エチジウム染色を使用して伝統
的なゲル電気泳動により検出した。阻害抗体が、ＰＣＲ
の前のあまり過酷でない条件下で結合したプライマーの
酵素的伸長を効果的に防止したことは、結果より明らか
であった。標的核酸の増幅は正常に実施された。従って
抗体は、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermoph
ilus) 由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対して温度
感受性阻害剤として作用した。
【０１０７】第５実験は、抗体対ＤＮＡポリメラーゼ
１：１のモル比でサーマス・フラバス（Thermus flavu
s) 由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害す
るように、本明細書で同定されたポリクローナル抗体Ｔ
Ｐ１５を用いて上記と同様に実施した。
１：１のモル比でサーマス・フラバス（Thermus flavu
s) 由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害す
るように、本明細書で同定されたポリクローナル抗体Ｔ
Ｐ１５を用いて上記と同様に実施した。
【０１０８】サーマス・フラバス（Thermus flavus) 由
来のＤＮＡポリメラーゼ及び抗体を混合し、その後残り
のＰＣＲ試薬を添加し、そして22℃（Ｔ1 ）で10分間イ
ンキュベーションして酵素と抗体の複合体を形成せしめ
た。各ＰＣＲ混合物の試料の１つを直ちに使用し、一方
別の試料は使用する前に更に７時間室温でインキュベー
ションした。対照試験は混合物中に抗体を全く含めない
で同様に実施した。ＰＣＲを、前記の通り35回実施し
た。
来のＤＮＡポリメラーゼ及び抗体を混合し、その後残り
のＰＣＲ試薬を添加し、そして22℃（Ｔ1 ）で10分間イ
ンキュベーションして酵素と抗体の複合体を形成せしめ
た。各ＰＣＲ混合物の試料の１つを直ちに使用し、一方
別の試料は使用する前に更に７時間室温でインキュベー
ションした。対照試験は混合物中に抗体を全く含めない
で同様に実施した。ＰＣＲを、前記の通り35回実施し
た。
【０１０９】ＰＣＲの結果を、従来の方法に従って４％
アガロースゲル及び臭化エチジウム染色を使用して伝統
的なゲル電気泳動により検出した。阻害抗体が、ＰＣＲ
の前のあまり過酷でない条件下で結合したプライマーの
酵素的伸長を効果的に防止したことは、結果より明らか
であった。標的核酸の増幅は正常に実施された。従って
抗体は、サーマス・フラバス（Thermus flavus) 由来の
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対して温度感受性阻害剤
として作用した。
アガロースゲル及び臭化エチジウム染色を使用して伝統
的なゲル電気泳動により検出した。阻害抗体が、ＰＣＲ
の前のあまり過酷でない条件下で結合したプライマーの
酵素的伸長を効果的に防止したことは、結果より明らか
であった。標的核酸の増幅は正常に実施された。従って
抗体は、サーマス・フラバス（Thermus flavus) 由来の
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対して温度感受性阻害剤
として作用した。
【０１１０】
【発明の効果】本発明は、反応を行うことが所望される
時までＰＣＲに使用されるＤＮＡポリメラーゼを不活性
化せしめることにより非標的核酸の増幅という課題を解
決する。プライマー二量体の形成も著しく低減される。
更に、カプセル化ＰＣＲ試薬の使用に伴う欠点（従来の
技術方法を越える進歩にもかかわらず存在する）が排除
される。
時までＰＣＲに使用されるＤＮＡポリメラーゼを不活性
化せしめることにより非標的核酸の増幅という課題を解
決する。プライマー二量体の形成も著しく低減される。
更に、カプセル化ＰＣＲ試薬の使用に伴う欠点（従来の
技術方法を越える進歩にもかかわらず存在する）が排除
される。
【０１１１】これらの利点は、熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼを該ＤＮＡポリメラーゼの温度感受性阻害剤と混合
せしめることにより達成される。この阻害剤は、85℃よ
り低い温度Ｔ1 でポリメラーゼを不活性化するが（すな
わち、それがポリメラーゼの酵素活性を喪失させる）、
しかしそれ自身、Ｔ1 よりも高くまた40℃よりも高い第
２温度Ｔ2 でポリメラーゼ不活性化についての能力が不
可逆的に無効になる。換言すれば、Ｔ2 を越えると、阻
害剤はＤＮＡポリメラーゼを阻害するというその能力を
不可逆的に喪失し、そしてＤＮＡポリメラーゼはその酵
素活性を回復する。阻害剤はそのより高い温度で不活性
化される。
ーゼを該ＤＮＡポリメラーゼの温度感受性阻害剤と混合
せしめることにより達成される。この阻害剤は、85℃よ
り低い温度Ｔ1 でポリメラーゼを不活性化するが（すな
わち、それがポリメラーゼの酵素活性を喪失させる）、
しかしそれ自身、Ｔ1 よりも高くまた40℃よりも高い第
２温度Ｔ2 でポリメラーゼ不活性化についての能力が不
可逆的に無効になる。換言すれば、Ｔ2 を越えると、阻
害剤はＤＮＡポリメラーゼを阻害するというその能力を
不可逆的に喪失し、そしてＤＮＡポリメラーゼはその酵
素活性を回復する。阻害剤はそのより高い温度で不活性
化される。
【０１１２】従って、所定の阻害剤により、Ｔ1 以下に
ＤＮＡポリメラーゼの温度を維持することによりＰＣＲ
を調節でき、次いで少なくともＴ2 まで反応混合物の温
度を上昇せしめることにより反応を進行することができ
る。これは非常に有効かつ便利なＰＣＲ調節手段であ
る。
ＤＮＡポリメラーゼの温度を維持することによりＰＣＲ
を調節でき、次いで少なくともＴ2 まで反応混合物の温
度を上昇せしめることにより反応を進行することができ
る。これは非常に有効かつ便利なＰＣＲ調節手段であ
る。
【０１１３】
配列番号：１ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT
【０１１４】配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC
【０１１５】配列番号：３ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C
【０１１６】配列番号：４ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT C
【０１１７】配列番号：５ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA
【０１１８】配列番号：６ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTCCTGCTAT GTCACTTCCC CTTGGTTC
【０１１９】配列番号：７ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TAGCACCCAC CAGGGCAAAG AGAAGAGT
【０１２０】配列番号：８ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AGATGCTGTT GCGCCTCAAT AGCCCTCA
【図１】この図面は、より詳細には前記実施例２に記載
されているゲル電気泳動の結果の写真画像である。
されているゲル電気泳動の結果の写真画像である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 7823−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ケネス ジョージ クリスティ，ジュニア アメリカ合衆国，ニューヨーク 14514, ノース チリ，アイバ マエ ドライブ 16 (72)発明者 セオドア ウォルター エスダース アメリカ合衆国，ニューヨーク 14580, ウェブスター，シュガー クリーク トレ イル 741 (72)発明者 ジョン リンフォース ダイス アメリカ合衆国，ニューヨーク 14613, ロチェスター，レイクビュー パーク 30
Claims (3)
- 【請求項１】 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮ
Ａポリメラーゼの酵素活性が阻害されるような85℃より
低い温度Ｔ1 でＤＮＡポリメラーゼを阻害する能力を有
し、かつＴ1 よりも高くまた40℃よりも高い温度Ｔ2 で
不可逆的に不活性化されることによってＤＮＡポリメラ
ーゼがその酵素活性を回復する、ＤＮＡポリメラーゼの
温度感受性阻害剤を含んでなる組成物。 - 【請求項２】 Ａ．標的核酸を含有することが推測され
る被検体を、ポリメラーゼ連鎖反応試薬と、及びＤＮＡ
ポリメラーゼの酵素活性が阻害されるような85℃より低
い温度Ｔ1 でＤＮＡポリメラーゼを阻害する能力を有
し、かつＴ1 よりも高くまた40℃よりも高い温度Ｔ2 で
不可逆的に不活性化されることによってＤＮＡポリメラ
ーゼがその酵素活性を回復する、熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼの温度感受性阻害剤と接触せしめる段階、並びに Ｂ．得られた混合物を少なくとも温度Ｔ2 にしてＤＮＡ
ポリメラーゼ阻害剤を不活性化しそしてプライマー伸長
生成物を形成せしめる段階、を含んでなる標的核酸の増
幅方法。 - 【請求項３】 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な
モノクローナル抗体であって、 ａ）ＤＮＡポリメラーゼとの会合定数が少なくとも１×
１０7 モル-1であり、 ｂ）ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性が阻害されるような
85℃より低い温度Ｔ1でＤＮＡポリメラーゼを阻害する
能力を有し、かつＴ1 よりも高くまた40℃よりも高い温
度Ｔ2 で不可逆的に不活性化されることによってＤＮＡ
ポリメラーゼがその酵素活性を回復し、そして ｃ）ＩｇＭもしくはＩｇＧクラスである抗体。
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