JPH10276776A

JPH10276776A - 可逆的に不活化された耐熱性ｄｎａポリメラーゼ

Info

Publication number: JPH10276776A
Application number: JP9088143A
Authority: JP
Inventors: Yusuke Komatsubara; 裕介小松原; Fumikiyo Kawakami; 川上　　文清; Yoshihisa Kawamura; 川村　　良久
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1997-04-07
Publication date: 1998-10-20

Abstract

(57)【要約】【課題】非特異的な増幅によるバックグラウンド（非
特異的バンド）の発生や、プライマー２量体の形成とい
う、ＰＣＲにおける問題点を解消する。【解決手段】ジカルボン酸無水物によって修飾され
た、可逆的に不活化された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼお
よび該酵素を使用するＰＣＲ増幅法ならびにそのための
核酸合成用試薬、核酸増幅用試薬ならびに該核酸増幅用
試薬を含む核酸検出用試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、可逆的に不活化さ
れた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、さらに、詳細にはジカ
ルボン酸無水物によって修飾されることにより、可逆的
に不活化された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび該酵素
を用いた核酸の増幅方法ならびにそのための試薬に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）等の核酸を増幅する技術に用いる耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼに関する研究が多くなされている。ＰＣＲ反応
に用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼは、主としてサ
−マス・サ−モフィラス(Thermusthermophilus)由来の
ＤＮＡポリメラ−ゼ(Tthポリメラ−ゼ) や、サ−マス・
アクアチカス(Thermus aquaticus) 由来のＤＮＡポリメ
ラ−ゼ(Taqポリメラ−ゼ)などが用いられてきた。ま
た、超好熱始原菌由来のＤＮＡポリメラーゼ、たとえば
パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus) 由
来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Pfu ポリメラーゼ、WO
92/9689 、特開平 5-328969 号公報）、サーモコッカス
・リトラリス(Thermococcus litoralis)由来の耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラ−ゼ(Tliポリメラーゼ、特開平 6-7160 号
公報）、パイロコッカス(Pyrococcus) sp.ＫＯＤ１由来
の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(KODポリメラーゼ）などが
知られている。

【０００３】しかしながら、これらの耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼを用いた多くの核酸増幅方法は、非特異的な増
幅によるバックグラウンド（非特異的バンド）の発生
や、プライマー２量体の形成という問題を持っている。
これらの増幅反応は、多くの場合、反応液を調製し、反
応温度がプライマーのアニーリング温度に達するまで
に、非特異的部位にプライマーがアニーリングし（ミス
プライミング）、ＤＮＡポリメラーゼによる合成がスタ
ートしてしまうことが原因であるといわれている。

【０００４】このような問題を克服するために、ＤＮＡ
合成に必須な成分の１つ（ＤＮＡポリメラーゼや、マグ
ネシウムなど）をアニーリング温度に達した後に反応液
に加える方法（ホットスタートＰＣＲ法、Chou et al.,
Nucleic Acids Res, Vol.20p.1717-1723 (1992))が開
発された。しかしながら、この方法では反応装置にセッ
トした反応チューブのふたを開け、そこに試薬を加える
という非常に煩わしい操作が必要であり、また、クロス
コンタミネーションの原因となるという欠点もあった。

【０００５】最近、このホットスタートＰＣＲ法をより
容易に行うための試薬がいくつか開発されている。例え
ば、高温で融解し、液状になるワックス（商品名 Ampli
-Waxパーキンエルマー社製）やＤＮＡポリメラーゼに対
する抗体（Tth start 、Taqstart クローンテック社
製）を使用する。ワックスを用いた方法では、このワッ
クスで層を形成し、下層にプライマー、ｄＮＴＰを含ん
だ液、上層にＤＮＡポリメラーゼ、鋳型ＤＮＡを含んだ
液を入れて反応をスタートさせれば、高温になるまで両
者を分離でき、ミスプライミングによるバックグラウン
ドが低減できる。また、抗体を用いた方法では、抗体に
よってポリメラーゼ活性が抑えられるので、抗体が失活
する温度（通常、70℃以下、特開平 6-209775 号公報参
照）に達するまでＤＮＡ合成反応が起こらないために、
ワックスを用いた場合と同様、バックグラウンドが低減
できる。しかしながら、ワックスを用いた方法ではワッ
クス層を形成させるための煩雑な操作が必要である。ま
た抗体を用いる場合、一般的に抗体は非常に高価であ
り、工業的に利用するには問題があった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】さらに、最近、高温に
よりポリメラーゼ活性がリリースされるＤＮＡポリメラ
ーゼが開発された（商品名 AmpliTaq Goldパーキンエル
マー社製）。この酵素を用いた場合、上述のようなワッ
クスや抗体を用いることになしにホットスタートが行え
る。しかしながら、この酵素は効率的にＰＣＲを行うた
めに、９２℃〜９５℃で９分〜１２分の熱処理時間を必
要とする。一般的に、９０℃以上の高温でＤＮＡを長時
間処理すると脱プリンなどの分解が起こり、特に長いタ
ーゲットの場合、増幅効率が充分でないなどの問題があ
る。そこで、これらの問題を解決するような新規な耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼが待ち望まれていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】そこで、発明者らは非特
異的副産物やプライマー２量体等が増幅されるとのＰＣ
Ｒにおける問題を克服し、ＰＣＲの精度と感度を高める
ために、改良された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを見い出
すべく、鋭意検討した結果、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
をジカルボン酸無水物によって修飾することにより、ポ
リメラーゼ活性が可逆的に不活化（すなわち、化学修飾
後の相対活性が非修飾酵素に対して、０〜２５％に低下
するが、熱処理を行った後の相対活性の回復が、５０〜
１００％であることをいう）されることを見い出した。
さらに、該酵素を用いてＰＣＲを行うことにより、バッ
クグラウンドが少なく、しかも長いターゲットＤＮＡの
増幅が可能であることを見い出し、本発明を完成するに
至った。

【０００８】すなわち本発明はジカルボン酸無水物によ
って修飾された、可逆的に不活化された耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼである。

【０００９】本発明はＤＮＡを鋳型とし、プライマーお
よびｄＮＴＰの存在下に上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
を反応させて、プライマーを伸長して、ＤＮＡを合成す
ることを特徴とする核酸合成方法である。

【００１０】本発明は、（１）２本鎖ＤＮＡは必要によ
り、１本鎖ＤＮＡとし、該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、
少なくとも２つのプライマーおよびｄＮＴＰの存在下に
請求項１〜４のいずれか１項記載の耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼを反応させて、鎖伸長を行なって２本鎖ＤＮＡを
得た後、（２）鎖分離を行ない、次いで、（３）分離さ
れた１本鎖ＤＮＡを鋳型として、少なくとも２つのプラ
イマーおよびｄＮＴＰの存在下に上記耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼを反応させ、さらに、上記工程（１）〜（３）
を繰り返すことを特徴とする核酸の増幅方法である。

【００１１】本発明はプライマー、ｄＮＴＰおよび上記
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有する核酸合成用試薬で
ある。

【００１２】本発明はプライマー、ｄＮＴＰおよび上記
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有する核酸合成用試薬お
よび検出プローブを含有する核酸検出用試薬である。

【００１３】

【発明の実施態様】本発明に用いる耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼとは、いわゆる熱安定性が７０〜１００℃である
ＤＮＡポリメラーゼであり、ＰＣＲに使用されうる熱安
定性を有していれば、何ら限定されるものではない。こ
のような酵素としては、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔａｑポ
リメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラー
ゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、サーモトガ・マリチマ由来の
ＤＮＡポリメラーゼ、モルモシポ・アフリカヌス由来の
ＤＮＡポリメラーゼなどが例示される。また、これらの
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは天然微生物等が産生するも
のに限らず、遺伝子組換技術により産生したものも含
む。さらに、天然微生物等から採取した酵素をコードす
る遺伝子を改変した遺伝子から産生された耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼ、例えばΔＴｔｈ、ΔＴａｑなども包含す
る。これらの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、通常、可逆
的に不活化されていない。可逆的に不活性化されていな
いとは、室温時での相対活性および熱処理後の相対活性
がほとんど変化しないことを意味する。

【００１４】本発明に用いられるジカルボン酸無水物は
特に限定されないが、無水シトラコン酸、２−メチルマ
レイン酸無水物、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、
無水シスアコニチン酸等の無水マレイン酸類、テトラフ
ルオロコハク酸無水物、無水エキソース３，６−エンド
キソ−△−テトラヒドロフタール酸、無水エキソーシス
３，６−エンドキソヘキサヒドロフタール酸等の無水コ
ハク酸類などが挙げられる。ジカルボン酸無水物として
は、特にコハク酸無水物、マレイン酸無水物またはこれ
らの誘導体、例えば２−メチルマレイン酸無水物、２，
３−ジメチルマレイン酸無水物またはテトラフルオロコ
ハク酸無水物が好ましい。

【００１５】本発明の可逆的に不活化された耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを製造する方法としては、まず、耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼを含む溶液を、ｐＨ８．５〜１０の
炭酸ナトリウム緩衝液などの緩衝液に対して透析を行っ
て、濃縮液を得る。この酵素液に上記酸無水物を含む溶
液を加え、４〜４０℃、好ましくは室温で、５分〜１時
間反応させる。また、反応中にｐＨが低下することがあ
るので、随時、水酸化ナトリウム等を添加し、ｐＨを維
持することが好ましい。

【００１６】本発明により得たジカルボン酸無水物によ
って修飾された、可逆的に不活化された耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼは、化学修飾後の相対活性が非修飾酵素に比
べて、０〜２５％の相対活性を有するが、９２℃にて５
〜１０分間、熱処理を行い、相対活性の回復を確認した
ところ、非修飾酵素に比べて、約５０〜１００％の活性
を維持する。

【００１７】本発明ではＤＮＡを鋳型とし、プライマー
およびｄＮＴＰの存在下に上記可逆的に不活化された耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させて、プライマーを伸
長して、ＤＮＡを合成する。プライマーとは、鋳型に対
して相補的な配列を有する、約１５〜３０個のオリゴヌ
クレオチドである。反応条件としては、約ｐＨ８．０〜
９．０（室温での値）において、約８５〜９５℃にて加
熱する。また、使用する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに応
じて、必要な緩衝液、金属イオンおよび他の試薬類、例
えばＢＳＡ、界面活性剤、硫酸アンモニウム等の塩類を
添加する。

【００１８】本発明は、（１）２本鎖ＤＮＡは必要によ
り、１本鎖ＤＮＡとし、該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、
少なくとも２つのプライマーおよびｄＮＴＰの存在下
に、上記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させて、鎖伸
長を行なって２本鎖ＤＮＡを得た後、（２）鎖分離を行
ない、次いで、（３）分離された１本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、少なくとも２つのプライマーおよびｄＮＴＰの存
在下に、上記可逆的に不活性化された耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼを反応させ、さらに、上記工程（１）〜（３）
を繰り返すことにより、核酸を増幅する方法である。

【００１９】本発明の核酸合成用試薬は、プライマー、
ｄＮＴＰおよび上記可逆的に不活性化された耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを含有する。必要により緩衝液、金属イ
オンおよび他の試薬類、例えばＢＳＡ、界面活性剤、硫
酸アンモニウム等の塩類を含有する。

【００２０】本発明の核酸検出用試薬は、プライマー、
ｄＮＴＰおよび上記可逆的に不活性化された耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを含有する核酸合成用試薬および検出プ
ローブを含有する。検出用プローブとは、検出しようと
する核酸の塩基配列と相補的な配列または相同な配列を
有する約１５〜１００個のオリゴヌクレオチドである。
核酸を検出する方法は、本願発明の可逆的に不活性化さ
れた耐熱性ＤＮＡポリメラーを用いて増幅した核酸に、
検出プローブを反応させ、ハイブリダイズした検出プロ
ーブまたはハイブリダイズしない検出プローブを測定す
る。検出プローブには、標識物質、例えば酵素、蛍光物
質または放射性物質または該標識物質を有する物質と反
応しうる試薬、例えばビオチン、アビジンなどが結合し
ていてもよい。これらの標識物質の検出は従来から公知
である方法に従う。

【００２１】本発明の可逆的に不活性化された耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを行った場合、化学
修飾されていないＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを
行った場合に比べて、プライマーダイマーが少ないとい
う長所を有する。また、本発明と同様に熱処理によって
活性が回復する酵素であるＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ
を使用した場合、９４℃、１分間処理しただけでは増幅
産物が確認できなかったのに対して、本発明の可逆的に
不活性化された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いると、
１分間の処理でも充分な増幅産物が得られる。また、９
分間処理した場合でも、本発明の可逆的に不活性化され
た耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いる方が、増幅産物が
多い。また、本発明の可逆的に不活性化された耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った場合、目的と
する長鎖の核酸増幅が可能である。

【００２２】

【実施例】次に実施例を用いて本発明を説明するが、こ
れら実施例は本発明を何ら限定するものではない。

【００２３】参考例１Ｔｔｈポリメラーゼの精製サーマスサーモフィラスＨＢ８の染色体ＤＮＡを次の
方法で分離した。まず、同菌株を１５０ｍｌの１．５％
ポリペプトン、１．５％酵母エキス、０．２％ＮａＣｌ
（ｐＨ７．５）よりなる液体培地で７０℃一晩振盪培養
後、遠心分離（８０００ｒｐｍ，１０分）により集菌し
た。１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤ
ＴＡを含んだ溶液２４ｍｌに懸濁させ、３ｍｌのリゾチ
ーム溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を加えて、その後、１０％
ＳＤＳ溶液を６ｍｌ加えた。３０ｍｌのフェノールを加
えて、ゆるやかに撹拌混合し、１０，０００ｒｐｍ、１
５分間の遠心分離で水層と溶媒層に分け、水層を分取し
た。この操作を再び、行ない、この水層に２倍量のエタ
ノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり撹拌しなが
ら、ＤＮＡをガラス棒にまきつかせて分離した。これを
１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ
を含んだ溶液（以下ＴＥと記載）で溶解した。これを等
量のクロロホルム・フェノール溶液で処理後、遠心によ
り水層を分取し、２倍量のエタノールを加えて、上記の
方法でもう一度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥで溶解し
た。

【００２４】上記工程で得たＤＮＡ１μｇを制限酵素Ｈ
ｉｎｄIII （東洋紡製）５ユニットで３７℃、１５分反
応させ、限定分解を行った後、制限酵素ＨｉｎｄIII に
て完全に切断したｐＵＣ１９０．５μｇとＴ４−ＤＮ
Ａリガーゼ（東洋紡製）１ユニットで１６℃、１２時間
反応させＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡは、大腸菌
ＪＭ１０９のコンピテントセルを用いて形質転換した。
使用したＤＮＡ１μｇ当り約１×１０⁶個の形質転換体
のコロニーが得られた。得られたコロニーは５０μｇ／
ｍｌアンピシリン入りＬ培地（１％ポリペプトン、０．
５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、０．２５ｍ
ＭＩＰＴＧ）で３７℃で１８時間培養し、菌体を破砕
し、７５℃、３０分処理した液を用いて、下記精製工程
記載の活性測定方法に従い耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活
性を測定した。

【００２５】約３，０００個のコロニーの耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼ活性を測定したところ、２個の耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼ活性を有するコロニーを得た。これらの
保有するプラスミドには、内部にＨｉｎｄIII サイトを
１ケ所含む約６ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片が存在してお
り、このプラスミドをｐＵＰＬ０とした。

【００２６】次いで、ｐＵＰＬ０よりＨｉｎｄIII にて
約２．８ｋｂｐおよび３．２ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片を
切り出し、それぞれｐＵＣ１９へ導入して、ｐＵＰＬ０
１及びｐＵＰＬ０２を構築した。それぞれをエシェリシ
アコリーＪＭ１０９に形質転換し、この形質転換体を
培養後、上記方法により耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性
を測定したところ、活性は認められなかった。次にｐ
ＵＰＬ０２をＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII 処理して得られる
１．４ｋｂｐの断片をｐＵＣ１９に導入し、ｐＵＰＬ０
３を構築した。

【００２７】更に、ｐＵＰＬ０１をＨｉｎｄIII 処理し
て得られる３．２ｋｂｐの断片をｐＵＰＬ０３のＨｉｎ
ｄIII サイトに導入し、ｐＵＰＬ１を構築した。このｐ
ＵＰＬ１でエシェリシアコリーＪＭ１０９を形質転換
した菌株（大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＰＬ１））の耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼの生産性はサーマスサーモフィラ
スＨＢ８の約２倍であった。

【００２８】得られた大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＰＬ１）
を用いて、以下の操作により培養、精製を行い、２０
０，０００ユニット／ｍｌのＴｔｈＤＮＡポリメラー
ゼを含む溶液２ｍｌを得た。まず、滅菌処理した１００
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＴＢ培地（ColdSpri
ng Habour Laboratory, Molecular Cloning, ｐ．Ａ．
２に記載）６Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに分注し
た（このジャーファーメンター２基を使用した）。この
培地に予め１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだ５
０ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％イ
ーストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、ギブ
コ社製）で３０℃１６時間培養した大腸菌ＪＭ１０９
（ｐＵＰＬ１）（５００ｍｌ坂口フラスコ使用）を接種
し、３５℃で１２時間、通気攪拌培養した。培養液より
菌体を遠心分離により回収し、４００ｍｌの破砕緩衝液
（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、８０ｍ
ＭＫＣｌ、５ｍＭ２−メルカプトエタノール、１ｍ
ＭＥＤＴＡ）に懸濁後、超音波処理によって菌体を破
砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８５℃にて
３０分処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去し
た。さらにポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫
安分画、ヘパリンセファロースクロマトグラフィー（フ
ァルマシア社製）を行い、最後に形状緩衝液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ塩化カリ
ウム、１ｍＭジチオスレイトール、５０％グリセリン）
に置換した。

【００２９】上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性
は、以下の操作で測定した。また、酵素活性が高い場合
には、保存緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｐｈ
８．５）、５０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭジチオスレイ
トール、５０％グリセリン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、
０．１％ノニデットＰ４０）でサンプルを希釈して測定
を行った。

【００３０】（試薬）Ａ．６７０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）１６６ｍＭ硫酸アンモニウム６７ｍＭ塩化マグネシウム１０ｍＭ２−メルカプトエタノールＢ．１μg/μl 活性化仔牛胸腺ＤＮＡＣ．２ｍＭｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ/ ｐｍｏｌ[³
Ｈ］ｄＴＴＰ）Ｄ．２０％トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸を
含む）Ｅ．１μg/μl キャリアー仔牛胸腺ＤＮＡ

【００３１】（方法）Ａ液、Ｂ液、Ｃ液各５μｌおよび
滅菌水３０μｌをエッペンドルフチューブに加えて撹拌
混合した後、菌体破砕液、あるいは上記熱処理液５μｌ
を加え、７５℃で１０分間反応する。その後氷冷しＥ液
５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加え、更に１０分間氷冷す
る。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフ
ィルター）で濾過し、Ｄ液および冷エタノールで充分洗
浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカ
ウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへの
ヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位
は、この条件下で３０分間当り１０ｎｍｏｌのヌクレオ
チドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。

【００３２】実施例１Ｔｔｈポリメラーゼの化学修飾
（その１）参考例１で得たＴｔｈポリメラーゼを以下の操作で化学
修飾した。すなわち、酵素液５ｍｌを炭酸ナトリウム緩
衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．３）、１０
０ｍＭＮａＣｌ）に対して透析を行った。５００ｍｌ
の緩衝液を６時間ごとに３回交換した。また、この操作
により液量は１０．５ｍｌになった。この酵素液５ｍｌ
に１Ｍの２，３−ジメチル無水マレイン酸溶液（アルド
リッチ製）（溶媒はＮ−メチル−２−ピロリドン（ナカ
ライテスク製））２０μｌを徐々に攪拌しながら加え
た。次いで室温で５分間放置した（この化学修飾物を酵
素Ａとする）。

【００３３】実施例２Ｔｔｈポリメラーゼの化学修飾
（その２）１Ｍの２，３−ジメチル無水マレイン酸溶液（アルドリ
ッチ製）１００μｌを用い、０．５ＮＮａＯＨにてｐ
Ｈが８．５以下にならないように調整した以外は、実施
例１と同様の操作にて化学修飾Ｔｔｈポリメラーゼを得
た（この化学修飾物を酵素Ｂとする）。

【００３４】実施例３化学修飾物の活性確認実施例１および２で得た化学修飾Ｔｔｈポリメラーゼの
活性を参考例１に示した方法にて確認した。対照とし
て、実施例１で得た炭酸ナトリウム緩衝液に置換された
だけのＴｔｈポリメラーゼを用いた（この酵素を非修飾
Ｔｔｈとする）。また、活性測定の際、酵素液を保存緩
衝液で１０００倍に希釈した。この結果、非修飾Ｔｔｈ
ポリメラーゼに対して、酵素Ａは１５％、酵素Ｂは７％
に活性が低下していた（図１参照）。

【００３５】実施例４化学修飾物の活性回復の確認実施例１および２で得た酵素Ａ、Ｂ及び非修飾Ｔｔｈを
保存緩衝液に対して透析を行った。５００ｍｌの緩衝液
を６時間ごとに３回交換した。また、この操作により液
量はそれぞれ３ｍｌになった。次にそれぞれの酵素をｐ
Ｈの異なる３種類の緩衝液中で熱処理を行い、活性の回
復を確認した。ｐＨ８．０、ｐＨ８．３及びｐＨ８．８
（室温でのｐＨ）の緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、８０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネ
シウム、０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．１％コール
酸ナトリウム、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）１
００μｌに保存緩衝液で１００倍希釈した酵素を５μｌ
加えて９２℃で処理した。０分、５分、１０分後に２．
５μｌずつサンプリングし、参考例１記載の方法にて活
性を測定した。その結果を図２に示す。図２に示したよ
うに、化学修飾を行った酵素Ａ、酵素Ｂは熱処理を行う
ことによって、活性が回復した。それに対して化学修飾
処理を行っていない酵素はほとんど変化なかった。

【００３６】実施例５化学修飾されたＴｔｈポリメラ
ーゼを用いたＰＣＲ実施例１および２で得た化学修飾ＤＮＡポリメラーゼを
用いて、ＰＣＲを行った。すなわち５０μｌの反応液
（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、８０ｍ
Ｍ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、
０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．１％コール酸ナトリウ
ム、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．２ｍＭ
ｄＮＴＰ、１００ｎｇのヒト胎盤由来のゲノムＤＮＡ
（クローンテック社製）、１０ピコモルの配列表１、２
記載のプライマー）に酵素Ａまたは酵素Ｂを２．５単位
加えてＰＣＲ反応を行った。酵素活性は実施例４記載の
ｐＨ８．０の緩衝液中で８０℃、３０分処理した後、参
考例１記載の方法にて測定し求めた。サーマルサイクラ
ーはパーキンエルマー社製のモデルＰＪ２０００を用い
た。また、反応条件は９４℃で１分処理した後、９４
℃、３０秒間→５５℃、１分間→７２℃、１分間を３０
サイクル行った。

【００３７】比較として、非修飾Ｔｔｈポリメラーゼ、
Ｔｔｈｓｔａｒｔ（Ｔｔｈ抗体、クローンテック製）
と混合したＴｔｈポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑＧ
ｏｌｄ（パーキンエルマー製）も同様にしてＰＣＲ反応
を行った。ただし、反応液組成はそれぞれの取り扱い説
明書に従った。また、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄは９
４℃の処理を１分間と９分間行った。反応終了後、５μ
ｌの反応液についてアガロースゲル電気泳動を行い、約
０．４ｋｂのターゲットの増幅を確認した。

【００３８】図３にアガロースゲル電気泳動の結果を示
した。この結果、化学修飾を行った酵素Ａ、Ｂを用いて
ＰＣＲを行った場合、非修飾Ｔｔｈポリメラーゼを用い
てＰＣＲを行ったものに比べてプライマーダイマーが少
なかった。またＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄでは９４
℃，１分処理しただけでは増幅産物が確認できなかっ
た。また９分処理した場合の増幅産物の量は、酵素Ａ、
Ｂの場合より少なかった。

【００３９】実施例６化学修飾されたＴｔｈポリメラ
ーゼを用いたロングＰＣＲ実施例１および２で得た化学修飾ＤＮＡポリメラーゼを
用いて、ＰＣＲを行った。すなわち５０μｌの反応液
（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、８０ｍ
Ｍ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、
０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．１％コール酸ナトリウ
ム、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．２ｍＭ
ｄＮＴＰ、１００ngのヒト胎盤由来のゲノムＤＮＡ（ク
ローンテック社製）、１０ピコモルの配列表３、４記載
のプライマー、０．１５単位のＰｆｕＤＮＡポリメラ
ーゼ（ストラタジーン社製））に酵素Ａまたは酵素Ｂを
２．５単位加えてＰＣＲ反応を行った。サーマルサイク
ラーはパーキンエルマー社製のモデルＰＪ２０００を用
いた。また反応条件は９４℃で１分処理した後、９４
℃、３０秒間→６８℃、６分間を３０サイクル行った。

【００４０】比較として、非修飾Ｔｔｈポリメラーゼも
同様にしてＰＣＲ反応を行った。反応終了後、５μｌの
反応液についてアガロースゲル電気泳動を行い、約８．
５ｋｂのターゲットの増幅を確認した。図３にアガロー
スゲル電気泳動の結果を示した。この結果、化学修飾を
行った酵素Ａ、Ｂを用いてＰＣＲを行った場合、目的と
する８．５ｋｂのターゲットの増幅が確認できた。非修
飾Ｔｔｈポリメラーゼを用いてＰＣＲを行ったものはタ
ーゲットの増幅が確認できなかった。

【００４１】

【発明の効果】本発明の可逆的に不活化された耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼを使用することにより、煩雑な操作を
必要とせず、また、高価な抗体を用いることなく、効率
的に核酸を増幅することが可能となる。また、本発明の
可逆的に不活化された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用
することにより、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
って、少量の標的核酸の増幅および検出が可能になる。
さらに、非特異的副産物やプライマー２量体等が増幅さ
れることが生じない。

【００４２】

【配列表】

配列番号１配列の長さ：20 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ GAAGAGCCAA GGACAGGTAC 20

【００４３】配列番号２配列の長さ:21 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ GGAAAATAGA CCAATAGGCA G 21

【００４４】配列番号３配列の長さ:35 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ TGATAGGCAC TGACTCTCTG TCCCTTGGGC TGTTT 35

【００４５】配列番号４配列の長さ:35 配列の型：核酸（ＤＮＡ）鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ ACATGATTAG CAAAAGGGCC TAGCTTGGAC TCAGA 35

【図面の簡単な説明】

【図１】化学修飾されたＤＮＡポリメラーゼの活性低下
を示す図である。

【図２】化学修飾されたＤＮＡポリメラーゼの活性回復
を示す図である。

【図３】化学修飾されたＤＮＡポリメラーゼを用いたＰ
ＣＲの結果を示す電気泳動による図に代わる写真であ
る。

【図４】化学修飾されたＤＮＡポリメラーゼを用いたＰ
ＣＲの結果を示す電気泳動による図に代わる写真であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ジカルボン酸無水物によって修飾され
た、可逆的に不活化された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】ジカルボン酸無水物がコハク酸無水物、
マレイン酸無水物またはこれらの誘導体である請求項１
記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】コハク酸無水物またはマレイン酸無水物
の誘導体が、２−メチルマレイン酸無水物、１，２−ジ
メチルマレイン酸無水物またはテトラフルオロコハク酸
無水物である請求項２記載の耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ。
【請求項４】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｔｈポ
リメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラー
ゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼまたはこ
れらの変異されたＤＮＡポリメラーゼである請求項１記
載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】ＤＮＡを鋳型とし、プライマーおよびｄ
ＮＴＰの存在下に請求項１〜４のいずれか１項記載の耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させて、プライマーを伸
長して、ＤＮＡを合成することを特徴とする核酸合成方
法。
【請求項６】（１）２本鎖ＤＮＡは必要により、１本
鎖ＤＮＡとし、該１本鎖ＤＮＡを鋳型として、少なくと
も２つのプライマーおよびｄＮＴＰの存在下に請求項１
〜４のいずれか１項記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを
反応させて、鎖伸長を行なって２本鎖ＤＮＡを得た後、
（２）鎖分離を行ない、次いで、（３）分離された１本
鎖ＤＮＡを鋳型として、少なくとも２つのプライマーお
よびｄＮＴＰの存在下に請求項１〜４のいずれか１項記
載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを反応させ、さらに、上
記工程（１）〜（３）を繰り返すことを特徴とする核酸
の増幅方法。
【請求項７】プライマー、ｄＮＴＰおよび請求項１〜
４のいずれか１項記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含
有する核酸合成用試薬。
【請求項８】プライマー、ｄＮＴＰおよび請求項１〜
４のいずれか１項記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含
有する核酸合成用試薬および検出プローブを含有する核
酸検出用試薬。