JPH06211897A - 免疫グロブリンの精製方法 - Google Patents
免疫グロブリンの精製方法Info
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- JPH06211897A JPH06211897A JP5006962A JP696293A JPH06211897A JP H06211897 A JPH06211897 A JP H06211897A JP 5006962 A JP5006962 A JP 5006962A JP 696293 A JP696293 A JP 696293A JP H06211897 A JPH06211897 A JP H06211897A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】二価反応性を有する免疫グロブリンを、前処理
せずに簡便な操作で短時間に効率よく高純度に一度に大
量に精製する方法を提供する。 【構成】二価反応性を有する免疫グロブリンを、ＴＳＫ
ｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷ（東ソー株式会社製）を用
いたＨＰＬＣ（東ソー株式会社製）にかけ、硫酸アンモ
ニウム含む溶液を用いて、分離溶出させる。
せずに簡便な操作で短時間に効率よく高純度に一度に大
量に精製する方法を提供する。 【構成】二価反応性を有する免疫グロブリンを、ＴＳＫ
ｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷ（東ソー株式会社製）を用
いたＨＰＬＣ（東ソー株式会社製）にかけ、硫酸アンモ
ニウム含む溶液を用いて、分離溶出させる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、２種類の異なる抗原特
異性を有する免疫グロブリン（以下、二価反応性を有す
る免疫グロブリンとする）の精製法に関する。さらに詳
しくは、二価反応性を有する免疫グロブリンを含む試料
を、疎水作用を利用したクロマトグラフィにかけること
により、効率よく短時間に簡便にしかも純度良く該物質
を精製する方法に関するものである。
異性を有する免疫グロブリン（以下、二価反応性を有す
る免疫グロブリンとする）の精製法に関する。さらに詳
しくは、二価反応性を有する免疫グロブリンを含む試料
を、疎水作用を利用したクロマトグラフィにかけること
により、効率よく短時間に簡便にしかも純度良く該物質
を精製する方法に関するものである。
【０００２】二価反応性を有する免疫グロブリンは、現
在臨床検査試薬あるいは治療薬として研究されており、
将来非常に期待されているタンパク質である。このよう
に臨床的に多くの分野で応用されうる二価反応性を有す
る免疫グロブリンの高度な精製方法は、特に切望される
ものである。
在臨床検査試薬あるいは治療薬として研究されており、
将来非常に期待されているタンパク質である。このよう
に臨床的に多くの分野で応用されうる二価反応性を有す
る免疫グロブリンの高度な精製方法は、特に切望される
ものである。
【０００３】
【従来の技術】二価反応性を有する免疫グロブリンの精
製方法はいくつか知られている。なかでも代表的な例
は、試料溶液中のタンパク質の分子量の大小の違いを利
用して分離するゲル濾過法である。この方法はその原理
から分子量が大きく違うタンパク質では非常に簡便に分
離できるが、同等の分子量を有するタンパク質ではそれ
らを分離することは不可能である。Ｆ（ａｂ´）2型の
二価反応性を有する免疫グロブリンの分子量は約１１０
万であり、当然一価反応性を有するＦ（ａｂ´）2型と
の分離はゲル濾過法では可能である。
製方法はいくつか知られている。なかでも代表的な例
は、試料溶液中のタンパク質の分子量の大小の違いを利
用して分離するゲル濾過法である。この方法はその原理
から分子量が大きく違うタンパク質では非常に簡便に分
離できるが、同等の分子量を有するタンパク質ではそれ
らを分離することは不可能である。Ｆ（ａｂ´）2型の
二価反応性を有する免疫グロブリンの分子量は約１１０
万であり、当然一価反応性を有するＦ（ａｂ´）2型と
の分離はゲル濾過法では可能である。
【０００４】またハイブリド−マ２種類をさらに融合さ
せて得られるハイブリッドハイブリド−マ（クアドロ−
マ）から分泌されるＩｇＧ型の二価反応性を有する免疫
グロブリンはＨ鎖、Ｌ鎖の組み合わせから１０種類にの
ぼり、その中から目的とする二価反応性を有する免疫グ
ロブリンを選択的に精製分離することは非常に困難であ
る。
せて得られるハイブリッドハイブリド−マ（クアドロ−
マ）から分泌されるＩｇＧ型の二価反応性を有する免疫
グロブリンはＨ鎖、Ｌ鎖の組み合わせから１０種類にの
ぼり、その中から目的とする二価反応性を有する免疫グ
ロブリンを選択的に精製分離することは非常に困難であ
る。
【０００５】その他にイオン交換クロマトグラフィを利
用する精製法が知られている。詳しくは、二価反応性を
有する免疫グロブリンを含む試料溶液を塩濃度の低い緩
衝液に透析し、カチオン交換樹脂（スルホプロピル（Ｓ
Ｐ），カルボキシメチル（ＣＭ）基を有する樹脂）、ま
たはアニオン交換樹脂（ジエチルアミノエチル（ＤＥＡ
Ｅ），クオ−タナリィアミノエチル（ＱＡＥ）基を有す
る樹脂）のカラムに吸着させ、塩濃度を徐々に上げた
り、一度に上げたりすることにより、吸着した二価反応
性を有する免疫グロブリンを選択的に溶出させ分離精製
する方法である。
用する精製法が知られている。詳しくは、二価反応性を
有する免疫グロブリンを含む試料溶液を塩濃度の低い緩
衝液に透析し、カチオン交換樹脂（スルホプロピル（Ｓ
Ｐ），カルボキシメチル（ＣＭ）基を有する樹脂）、ま
たはアニオン交換樹脂（ジエチルアミノエチル（ＤＥＡ
Ｅ），クオ−タナリィアミノエチル（ＱＡＥ）基を有す
る樹脂）のカラムに吸着させ、塩濃度を徐々に上げた
り、一度に上げたりすることにより、吸着した二価反応
性を有する免疫グロブリンを選択的に溶出させ分離精製
する方法である。
【０００６】この方法では多くのＦ（ａｂ´）2型の免
疫グロブリンは、開始緩衝液で溶出してしまい、選択的
にＦ（ａｂ´）2型の二価反応性を有する免疫グロブリ
ンを得ることは困難であり、収量の低下は免れない。ま
たカラムにかける前処理として開始緩衝液に透析する操
作は煩雑であり、長時間おこなわなければならないなど
の不都合が生じる。
疫グロブリンは、開始緩衝液で溶出してしまい、選択的
にＦ（ａｂ´）2型の二価反応性を有する免疫グロブリ
ンを得ることは困難であり、収量の低下は免れない。ま
たカラムにかける前処理として開始緩衝液に透析する操
作は煩雑であり、長時間おこなわなければならないなど
の不都合が生じる。
【０００７】最近ヒドロキシアパタイトゲルを用いて、
ハイブリッドハイブリド−マから分泌される二価反応性
を有する免疫グロブリンを選択的に精製する方法が報告
されている（Ｔａｄａ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａ，８，７３−８３，１９８９）。しかしヒド
ロキシアパタイトカラムは、高価であり、また耐圧や容
易に劣化する問題などからスケ−ルアップには不向きで
ある。
ハイブリッドハイブリド−マから分泌される二価反応性
を有する免疫グロブリンを選択的に精製する方法が報告
されている（Ｔａｄａ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａ，８，７３−８３，１９８９）。しかしヒド
ロキシアパタイトカラムは、高価であり、また耐圧や容
易に劣化する問題などからスケ−ルアップには不向きで
ある。
【０００８】一方、二価反応性を有する免疫グロブリン
に対する親和性をもつタンパク質や二価反応性を有する
免疫グロブリンの抗原特異性をうまく利用した精製方法
（アフィニティークロマトグラフィー）も考えられる。
二価反応性を有する免疫グロブリンの定常領域に特異性
を持つ抗体（ポリクロ−ナル抗体、モノクロ−ナル抗
体）や抗原自体を不溶性の支持体に固定化し二価反応性
を有する免疫グロブリンを特異的にかつ可逆的に吸着さ
せた後、ジオキサン（１０％）などの有機溶媒、プロピ
オン酸（ｐＨ＝２．５，１Ｍ）、塩酸（ｐＨ＝2.5 ）な
どの酸性の容液、エチレングリコ−ル（５０％）、カオ
トロピックイオン（Ｉ-，ＣＦ3ＣＯＯ-，ＳＣＮ-，ＣＣ
ｌ3ＣＯＯ-、ｐＨ＝７．０〜８．０，３Ｍ）等で二価反
応性を有する免疫グロブリンとそれに対する抗体あるい
は抗原との相互作用を減少させることにより、または尿
素（ｐＨ＝７．０，８Ｍ）、塩酸グアニジン（ｐＨ＝
３．１，６Ｍ）等のタンパク変性剤により二価反応性を
有する免疫グロブリンを遊離させ溶出させる。これを２
種類のそれぞれの抗原を固定化したカラムを使うことで
目的とする二価反応性を有する免疫グロブリンを得るこ
とが可能であろう。
に対する親和性をもつタンパク質や二価反応性を有する
免疫グロブリンの抗原特異性をうまく利用した精製方法
（アフィニティークロマトグラフィー）も考えられる。
二価反応性を有する免疫グロブリンの定常領域に特異性
を持つ抗体（ポリクロ−ナル抗体、モノクロ−ナル抗
体）や抗原自体を不溶性の支持体に固定化し二価反応性
を有する免疫グロブリンを特異的にかつ可逆的に吸着さ
せた後、ジオキサン（１０％）などの有機溶媒、プロピ
オン酸（ｐＨ＝２．５，１Ｍ）、塩酸（ｐＨ＝2.5 ）な
どの酸性の容液、エチレングリコ−ル（５０％）、カオ
トロピックイオン（Ｉ-，ＣＦ3ＣＯＯ-，ＳＣＮ-，ＣＣ
ｌ3ＣＯＯ-、ｐＨ＝７．０〜８．０，３Ｍ）等で二価反
応性を有する免疫グロブリンとそれに対する抗体あるい
は抗原との相互作用を減少させることにより、または尿
素（ｐＨ＝７．０，８Ｍ）、塩酸グアニジン（ｐＨ＝
３．１，６Ｍ）等のタンパク変性剤により二価反応性を
有する免疫グロブリンを遊離させ溶出させる。これを２
種類のそれぞれの抗原を固定化したカラムを使うことで
目的とする二価反応性を有する免疫グロブリンを得るこ
とが可能であろう。
【０００９】しかしながら、一般的に抗体の活性や収率
の低下は免れ得ないものである。また担体の劣化も早
く、再現性やコストの面でも不利である。当然、大量精
製へのステップアップでも不利である。更に現在、抗体
（免疫グロブリンＧクラス）の精製に多用されている比
較的安価なリコンビナントのプロテインＡやプロテイン
ＧにはＦ（ａｂ´）2型の二価反応性を有する免疫グロ
ブリンはほとんど吸着しないので利用することができな
い。
の低下は免れ得ないものである。また担体の劣化も早
く、再現性やコストの面でも不利である。当然、大量精
製へのステップアップでも不利である。更に現在、抗体
（免疫グロブリンＧクラス）の精製に多用されている比
較的安価なリコンビナントのプロテインＡやプロテイン
ＧにはＦ（ａｂ´）2型の二価反応性を有する免疫グロ
ブリンはほとんど吸着しないので利用することができな
い。
【００１０】大量に高純度な二価反応性を有する免疫グ
ロブリンを得ようとする際に後者の精製方法を使用する
には上述したようにコスト的な問題が大きいので、通
常、大量分取するには前者のイオン交換クロマトグラフ
ィを用いた非特異的な精製方法が用いられる。
ロブリンを得ようとする際に後者の精製方法を使用する
には上述したようにコスト的な問題が大きいので、通
常、大量分取するには前者のイオン交換クロマトグラフ
ィを用いた非特異的な精製方法が用いられる。
【００１１】しかしながら前者のイオン交換クロマトグ
ラフィを用いた精製方法で行う場合、前処理として塩濃
度の低い開始緩衝液に透析し、脱塩する操作を必ず行わ
なければならない。よって、タンパク質試料を稀薄溶液
というタンパク質にとっては非常に不安定な条件にさら
すことになる。試料によっては非可逆的に沈殿してしま
うため、クロマトグラフィーの開始緩衝液を高い塩濃度
で始めなければならないという、不都合を生じる場合も
ある。
ラフィを用いた精製方法で行う場合、前処理として塩濃
度の低い開始緩衝液に透析し、脱塩する操作を必ず行わ
なければならない。よって、タンパク質試料を稀薄溶液
というタンパク質にとっては非常に不安定な条件にさら
すことになる。試料によっては非可逆的に沈殿してしま
うため、クロマトグラフィーの開始緩衝液を高い塩濃度
で始めなければならないという、不都合を生じる場合も
ある。
【００１２】また二価反応性を有する免疫グロブリンを
選択的に分離精製することも難しく、１ステップで有効
に精製するには不向きである。つまり、イオン交換クロ
マトグラフィーとアフィニティークロマトグラフィー、
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの組み合わ
せによる精製方法となる。
選択的に分離精製することも難しく、１ステップで有効
に精製するには不向きである。つまり、イオン交換クロ
マトグラフィーとアフィニティークロマトグラフィー、
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの組み合わ
せによる精製方法となる。
【００１３】二価反応性を有する免疫グロブリン産生株
のハイブリッドハイブリド−マを培養したカルチャ−メ
デウムでは濃縮操作が困難である。特に添加されている
フェノ−ルレッド等のｐＨ指示薬の除去は難しく、簡便
で有効な硫酸アンモニウムによる塩析法や限外瀘過膜法
でも十分に除くことができない。これは二価反応性を有
する免疫グロブリンの分離精製に最後まで大きく影響し
ている。またｐＨ指示薬は充填剤に一度吸着するとなか
なか溶離できず、しばしば充填剤の劣化を早めることも
認められている。
のハイブリッドハイブリド−マを培養したカルチャ−メ
デウムでは濃縮操作が困難である。特に添加されている
フェノ−ルレッド等のｐＨ指示薬の除去は難しく、簡便
で有効な硫酸アンモニウムによる塩析法や限外瀘過膜法
でも十分に除くことができない。これは二価反応性を有
する免疫グロブリンの分離精製に最後まで大きく影響し
ている。またｐＨ指示薬は充填剤に一度吸着するとなか
なか溶離できず、しばしば充填剤の劣化を早めることも
認められている。
【００１４】近い将来ヒト型二価反応性を有する免疫グ
ロブリンの大量培養法が確立し、二価反応性を有する免
疫グロブリンを特に癌などの新生生物やウイルス感染細
胞に対する薬剤あるいは薬剤のキャリア−として、治療
面で応用されることが期待されるが、その時は精製法も
製造工程の中で非常に重要なウェイトを占めることは明
らかであり、その方法の開発は欠くことはできない。
ロブリンの大量培養法が確立し、二価反応性を有する免
疫グロブリンを特に癌などの新生生物やウイルス感染細
胞に対する薬剤あるいは薬剤のキャリア−として、治療
面で応用されることが期待されるが、その時は精製法も
製造工程の中で非常に重要なウェイトを占めることは明
らかであり、その方法の開発は欠くことはできない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
精製方法より大幅に利用価値のある二価反応性を有する
免疫グロブリンを精製する方法を提供するものである。
精製方法より大幅に利用価値のある二価反応性を有する
免疫グロブリンを精製する方法を提供するものである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
関し鋭意検討した結果本発明に到達した。すなわち本発
明は、二価反応性を有する免疫グロブリンを含有する試
料を、疎水性相互作用クロマトグラフィ−にかけて、目
的とする免疫グロブリンを選択的に分離溶出させること
を特徴とする、免疫グロブリンの精製方法である。以
下、本発明をさらに詳細に説明する。
関し鋭意検討した結果本発明に到達した。すなわち本発
明は、二価反応性を有する免疫グロブリンを含有する試
料を、疎水性相互作用クロマトグラフィ−にかけて、目
的とする免疫グロブリンを選択的に分離溶出させること
を特徴とする、免疫グロブリンの精製方法である。以
下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１７】本発明では、精製される二価反応性を有す
る免疫グロブリンを製造する方法には特に限定はなく、
例えば化学的に合成して得られたもの、２種類以上のハ
イブリド−マを融合して得られたもの、遺伝子工学的に
調製されて得られたものなどがあげられる。このような
二価反応性を有する免疫グロブリンには、種々の不純
物、例えば通常の一価の反応性を有する免疫グロブリン
などが含まれているが、本発明では、その様な不純物を
疎水相互作用を利用したクロマトグラフィを用いて除去
するものである。
る免疫グロブリンを製造する方法には特に限定はなく、
例えば化学的に合成して得られたもの、２種類以上のハ
イブリド−マを融合して得られたもの、遺伝子工学的に
調製されて得られたものなどがあげられる。このような
二価反応性を有する免疫グロブリンには、種々の不純
物、例えば通常の一価の反応性を有する免疫グロブリン
などが含まれているが、本発明では、その様な不純物を
疎水相互作用を利用したクロマトグラフィを用いて除去
するものである。
【００１８】ここで使用される疎水相互作用を利用した
クロマトグラフィとしては、とくに限定はないが、好ま
しくは、担体としては非多孔性樹脂、セファロース、親
水性ポリマー系樹脂からなるものであり、官能基として
はオリゴエチレングリコール基、ブチル基、フェニル
基、オクチル基、ネオベンジル基などをもつものが好ま
しい。具体的には、ＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ−５Ｐ
Ｗ、Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ、Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲなどが
上げられる。
クロマトグラフィとしては、とくに限定はないが、好ま
しくは、担体としては非多孔性樹脂、セファロース、親
水性ポリマー系樹脂からなるものであり、官能基として
はオリゴエチレングリコール基、ブチル基、フェニル
基、オクチル基、ネオベンジル基などをもつものが好ま
しい。具体的には、ＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ−５Ｐ
Ｗ、Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ、Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲなどが
上げられる。
【００１９】二価反応性を有する免疫グロブリンを含む
試料に、塩を含む緩衝液あるいは塩をそのまま添加し、
塩溶液中でカラムに吸着させ、徐々にあるいは一度に塩
濃度を下げて、二価反応性を有する免疫グロブリンを選
択的に充填剤より分離溶出させることにより精製が行わ
れる。ここで使用される塩は一般に用いられるものでよ
いが、好ましくは硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、
リン酸カリウム、またはリン酸ナトリウムなどがあげら
れる。
試料に、塩を含む緩衝液あるいは塩をそのまま添加し、
塩溶液中でカラムに吸着させ、徐々にあるいは一度に塩
濃度を下げて、二価反応性を有する免疫グロブリンを選
択的に充填剤より分離溶出させることにより精製が行わ
れる。ここで使用される塩は一般に用いられるものでよ
いが、好ましくは硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、
リン酸カリウム、またはリン酸ナトリウムなどがあげら
れる。
【００２０】
【発明の効果】以上の説明から明らかなように本発明に
よれば、従来法に比べてより簡便な操作で短時間に、前
処理せずかつ効率よく高純度にしかも一度に大量に二価
反応性を有する免疫グロブリンを精製することが可能で
ある。
よれば、従来法に比べてより簡便な操作で短時間に、前
処理せずかつ効率よく高純度にしかも一度に大量に二価
反応性を有する免疫グロブリンを精製することが可能で
ある。
【００２１】
【実施例】以下、その条件等、実施例を挙げて詳細に説
明する。しかし、これら実施例のみに本発明は限定され
るものではない。
明する。しかし、これら実施例のみに本発明は限定され
るものではない。
【００２２】実施例１ （１）２種類のマウスモノクロ−ナル抗体から二価反応
性を有する免疫グロブリンの化学的合成 ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対するモノクロー
ナル抗体（以下ＴＳ０７と省略する，ＩｇＧ１）を０．
１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．７）に充分透析し、０．
１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．７）にて調製したブタ・
ペプシンをＴＳ０７に対して１％（ｗ／ｗ）となるよう
添加した。３７℃、２時間限定加水分解し、ＴＳ０７の
Ｆ（ａｂ´）2成分を得た。同様にアルカリフォスファ
タ−ゼに対するモノクロ−ナル抗体（以下ＡＰ０５と省
略、ＩｇＧ１）をブタ・ペプシンにて限定加水分解し、
ＡＰ０５のＦ（ａｂ´）2を得た。
性を有する免疫グロブリンの化学的合成 ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対するモノクロー
ナル抗体（以下ＴＳ０７と省略する，ＩｇＧ１）を０．
１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．７）に充分透析し、０．
１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．７）にて調製したブタ・
ペプシンをＴＳ０７に対して１％（ｗ／ｗ）となるよう
添加した。３７℃、２時間限定加水分解し、ＴＳ０７の
Ｆ（ａｂ´）2成分を得た。同様にアルカリフォスファ
タ−ゼに対するモノクロ−ナル抗体（以下ＡＰ０５と省
略、ＩｇＧ１）をブタ・ペプシンにて限定加水分解し、
ＡＰ０５のＦ（ａｂ´）2を得た。
【００２３】ＡＰ０５のＦ（ａｂ´）2を１００ｍＭ塩
化ナトリウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）
にて１ｍｇ／ｍｌに調製した。その溶液に１０ｍＭ β
−メルカプトエタノ−ルを添加してＦ（ａｂ´）2のＨ
鎖間のジスルフィド結合を還元した。目的とするＡＰ０
５のＦａｂ´をゲル濾過クロマトグラフィ−にて還元
剤、未還元Ｆ（ａｂ´）2と分離して得た。Ｆａｂ´
は、抗原結合部位が１か所であり、一価の抗体である。
すぐさまその溶液に５０ｍＭになるように５、５´−ジ
チオビス（２−ニトロベンゼン酸）（以下ＤＴＮＢと省
略）を添加し、Ｆａｂ´のスルフィド基にＴＮＢを化学
結合させた。余分なＤＴＮＢはゲル濾過クロマトグラフ
ィ−にて除き、Ｆａｂ´−ＴＮＢを調製した。
化ナトリウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）
にて１ｍｇ／ｍｌに調製した。その溶液に１０ｍＭ β
−メルカプトエタノ−ルを添加してＦ（ａｂ´）2のＨ
鎖間のジスルフィド結合を還元した。目的とするＡＰ０
５のＦａｂ´をゲル濾過クロマトグラフィ−にて還元
剤、未還元Ｆ（ａｂ´）2と分離して得た。Ｆａｂ´
は、抗原結合部位が１か所であり、一価の抗体である。
すぐさまその溶液に５０ｍＭになるように５、５´−ジ
チオビス（２−ニトロベンゼン酸）（以下ＤＴＮＢと省
略）を添加し、Ｆａｂ´のスルフィド基にＴＮＢを化学
結合させた。余分なＤＴＮＢはゲル濾過クロマトグラフ
ィ−にて除き、Ｆａｂ´−ＴＮＢを調製した。
【００２４】一方、ＴＳ０７のＦ（ａｂ´）2も同様に
β−メルカプトエタノ−ルにてＨ鎖間のジスルフィド結
合を還元した。過剰のβ−メルカプトエタノ−ルをゲル
濾過クロマトグラフィ−にて分離し、余分な還元剤を除
去後、ただちに等モルのＡＰ０５のＦａｂ´−ＴＮＢを
加えた。１Ｍに調製したトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン（ｐＨ８．０）（以下Ｔｒｉｓと省略）を１
／２０容量加え、４℃にて一昼夜反応させた。
β−メルカプトエタノ−ルにてＨ鎖間のジスルフィド結
合を還元した。過剰のβ−メルカプトエタノ−ルをゲル
濾過クロマトグラフィ−にて分離し、余分な還元剤を除
去後、ただちに等モルのＡＰ０５のＦａｂ´−ＴＮＢを
加えた。１Ｍに調製したトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン（ｐＨ８．０）（以下Ｔｒｉｓと省略）を１
／２０容量加え、４℃にて一昼夜反応させた。
【００２５】（２）二価反応性を有する免疫グロブリン
の精製 （１）にて反応させた溶液に粉末硫酸アンモニウムを
１．５Ｍになるように加え、良く撹拌し溶解させた。反
応液は、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含むＰＢＳで平衡
化しておいたＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷ（７．
５ｍｍＩ．Ｄ．×７５ｍｍ，東ソー株式会社製）を用い
たＨＰＬＣ（東ソー株式会社製）にアプライした。５０
ｍｌの１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含むＰＢＳでカラム
を洗浄し、吸着しない成分を溶出させた。
の精製 （１）にて反応させた溶液に粉末硫酸アンモニウムを
１．５Ｍになるように加え、良く撹拌し溶解させた。反
応液は、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含むＰＢＳで平衡
化しておいたＴＳＫｇｅｌ Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷ（７．
５ｍｍＩ．Ｄ．×７５ｍｍ，東ソー株式会社製）を用い
たＨＰＬＣ（東ソー株式会社製）にアプライした。５０
ｍｌの１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含むＰＢＳでカラム
を洗浄し、吸着しない成分を溶出させた。
【００２６】洗浄後ただちに硫酸アンモニウム濃度を
１．５Ｍから０ＭのＰＢＳへの直線勾配で硫酸アンモニ
ウム濃度を３０分間かけて下げた。結果を図１に示す。
図中、横軸は溶出時間で、縦軸が２８０ｎｍの吸光度を
示す。図１のクロマトグラフから主なピ−クは３つ観測
された。溶出時間の早いピ−クから、ピ−ク１、２、３
とした。この時の流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎで、検出波
長は２８０ｎｍであった。溶出液は、０．５ｍｌ／ｔｕ
ｂｅでフラクションコレクターにより分画した。
１．５Ｍから０ＭのＰＢＳへの直線勾配で硫酸アンモニ
ウム濃度を３０分間かけて下げた。結果を図１に示す。
図中、横軸は溶出時間で、縦軸が２８０ｎｍの吸光度を
示す。図１のクロマトグラフから主なピ−クは３つ観測
された。溶出時間の早いピ−クから、ピ−ク１、２、３
とした。この時の流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎで、検出波
長は２８０ｎｍであった。溶出液は、０．５ｍｌ／ｔｕ
ｂｅでフラクションコレクターにより分画した。
【００２７】（３）アルカリフォスファタ−ゼに対する
抗原特異性の有無の検査 未処理マイクロタイタ−プレ−ト（９６ウエル・ヌンク
プレ−ト、インタ−メッド社製）の各ウエルに、（２）
で分画した試料をそれぞれＰＢＳで１０倍してそれぞれ
５０μｌ加えて、４℃一夜インキュベ−トした。各ウエ
ルの溶液を除去し、ＰＢＳに０．４％ツイ−ン（ｔｗｅ
ｅｎ）−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗
浄した後、０．１％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ）
を溶解したＰＢＳ溶液３００μｌを各ウエルに加えて、
４℃でブロッキング処理しそのまま保存した。
抗原特異性の有無の検査 未処理マイクロタイタ−プレ−ト（９６ウエル・ヌンク
プレ−ト、インタ−メッド社製）の各ウエルに、（２）
で分画した試料をそれぞれＰＢＳで１０倍してそれぞれ
５０μｌ加えて、４℃一夜インキュベ−トした。各ウエ
ルの溶液を除去し、ＰＢＳに０．４％ツイ−ン（ｔｗｅ
ｅｎ）−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗
浄した後、０．１％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ）
を溶解したＰＢＳ溶液３００μｌを各ウエルに加えて、
４℃でブロッキング処理しそのまま保存した。
【００２８】マイクロタイタ−プレ−トを室温にもど
し、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、ＰＢＳで５μｇ／ｍ
ｌとしたアルカリフォスファタ−ゼ（以下ＡＬＰと省略
する）の溶液５０μｌ加えた。この状態で３７℃で９０
分間放置した。５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）−１
０ｍＭ塩化マグネシウムにて３ｍｇ／ｍｌに調製したパ
ラニトロフェニルフォスフェ−ト（ＰＮＰＰ）を、各ウ
エルにそれぞれ１００μｌずつ添加した。室温で３０分
間呈色反応させた後、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を１
００μｌ加えて酵素反応を停止させた。
し、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、ＰＢＳで５μｇ／ｍ
ｌとしたアルカリフォスファタ−ゼ（以下ＡＬＰと省略
する）の溶液５０μｌ加えた。この状態で３７℃で９０
分間放置した。５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）−１
０ｍＭ塩化マグネシウムにて３ｍｇ／ｍｌに調製したパ
ラニトロフェニルフォスフェ−ト（ＰＮＰＰ）を、各ウ
エルにそれぞれ１００μｌずつ添加した。室温で３０分
間呈色反応させた後、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液を１
００μｌ加えて酵素反応を停止させた。
【００２９】上記マイクロタイタ−プレ−トを各ウエル
について、波長４０５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光
強度を自動マイクロタイタ−プレ−トリ−ダ−（東ソ−
株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測定した結果を
図２の黒丸に示す。図中、左軸に呈色反応の４０５ｎｍ
での吸光度を、フラクションナンバ−を横軸にとり、そ
れぞれの分画の抗体力価を示した。アルカリフォスファ
タ−ゼ活性を有する画分は、ピ−ク１とピ−ク２に認め
られた。
について、波長４０５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光
強度を自動マイクロタイタ−プレ−トリ−ダ−（東ソ−
株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測定した結果を
図２の黒丸に示す。図中、左軸に呈色反応の４０５ｎｍ
での吸光度を、フラクションナンバ−を横軸にとり、そ
れぞれの分画の抗体力価を示した。アルカリフォスファ
タ−ゼ活性を有する画分は、ピ−ク１とピ−ク２に認め
られた。
【００３０】（４）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対
する抗原特異性の有無の検査 未処理マイクロタイタ−プレ−ト（９６ウエル・ヌンク
プレ−ト、インタ−メッド社製）の各ウエルに０．１Ｍ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解した１００
μＩＵ／ｍｌのＴＳＨの溶液５０μｌを加えて、４℃一
夜インキュベ−トした。各ウエルの溶液を除去し、ＰＢ
Ｓに０．４％ツイ−ン（ｔｗｅｅｎ）−２０を含んだ溶
液（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、０．１％ウシ
血清アルブミン（以下ＢＳＡ）を溶解したＰＢＳ溶液３
００μｌを各ウエルに加えて、４℃でブロッキング処理
しそのまま保存した。
する抗原特異性の有無の検査 未処理マイクロタイタ−プレ−ト（９６ウエル・ヌンク
プレ−ト、インタ−メッド社製）の各ウエルに０．１Ｍ
炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解した１００
μＩＵ／ｍｌのＴＳＨの溶液５０μｌを加えて、４℃一
夜インキュベ−トした。各ウエルの溶液を除去し、ＰＢ
Ｓに０．４％ツイ−ン（ｔｗｅｅｎ）−２０を含んだ溶
液（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、０．１％ウシ
血清アルブミン（以下ＢＳＡ）を溶解したＰＢＳ溶液３
００μｌを各ウエルに加えて、４℃でブロッキング処理
しそのまま保存した。
【００３１】マイクロタイタ−プレ−トを室温にもど
し、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、（２）で分画したそ
れぞれの試料をＰＢＳで１０倍して各ウエルにそれぞれ
５０μｌ加えた。この状態で３７℃で９０分間放置し
た。つぎにペルオキシダ−ゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ
（Ｆ（ａｂ´）2特異的；タゴ社製）抗体をＰＢＳ−Ｔ
溶液で５０００倍に希釈し、各ウエルにそれぞれ５０μ
ｌずつ添加した。そのまま室温で９０分間インキュベ−
トした後、溶液を除去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄し
た。それに、０．３ｍｇ／ｍｌの２，２−アジノジ−
（３−エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム
塩（ＡＢＴＳ）及び０．０１％過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を
含有する０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．１）から成
る基質溶液を各ウエルに１００μｌ添加し、室温で３０
分間呈色反応させた後、２００ｍＭシュウ酸溶液を１０
０μｌ加えて酵素反応を停止させた。
し、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、（２）で分画したそ
れぞれの試料をＰＢＳで１０倍して各ウエルにそれぞれ
５０μｌ加えた。この状態で３７℃で９０分間放置し
た。つぎにペルオキシダ−ゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ
（Ｆ（ａｂ´）2特異的；タゴ社製）抗体をＰＢＳ−Ｔ
溶液で５０００倍に希釈し、各ウエルにそれぞれ５０μ
ｌずつ添加した。そのまま室温で９０分間インキュベ−
トした後、溶液を除去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄し
た。それに、０．３ｍｇ／ｍｌの２，２−アジノジ−
（３−エチルベンズチアゾリン硫酸）−ジアンモニウム
塩（ＡＢＴＳ）及び０．０１％過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）を
含有する０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．１）から成
る基質溶液を各ウエルに１００μｌ添加し、室温で３０
分間呈色反応させた後、２００ｍＭシュウ酸溶液を１０
０μｌ加えて酵素反応を停止させた。
【００３２】上記マイクロタイタ−プレ−トを各ウエル
について、波長４１５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光
強度を自動マイクロタイタ−プレ−トリ−ダ−（東ソ−
株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測定した結果を
図２の白丸に示す。図中、右軸に呈色反応の４１５ｎｍ
での吸光度を、フラクションナンバ−を横軸にとり、そ
れぞれの分画の抗体力価を示した。甲状腺刺激ホルモン
に対する抗体価が認められる画分は、ピ−ク２とピ−ク
３であった。
について、波長４１５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光
強度を自動マイクロタイタ−プレ−トリ−ダ−（東ソ−
株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測定した結果を
図２の白丸に示す。図中、右軸に呈色反応の４１５ｎｍ
での吸光度を、フラクションナンバ−を横軸にとり、そ
れぞれの分画の抗体力価を示した。甲状腺刺激ホルモン
に対する抗体価が認められる画分は、ピ−ク２とピ−ク
３であった。
【００３３】（５）ＴＳＨとＡＬＰの両方に対する抗原
特異性（二価反応性）の有無の検査未処理マイクロタイ
タ−プレ−ト（９６ウエル・ヌンクプレ−ト、インタ−
メッド社製）の各ウエルに０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９．６）に溶解した１００μＩＵ／ｍｌのＴＳ
Ｈの溶液５０μｌを加えて、４℃一夜インキュベ−トし
た。各ウエルの溶液を除去し、ＰＢＳに０．４％ツイ−
ン（ｔｗｅｅｎ）−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−
Ｔ）で３回洗浄した後、０．１％ウシ血清アルブミン
（以下ＢＳＡ）を溶解したＰＢＳ溶液３００μｌを各ウ
エルに加えて、４℃でブロッキング処理しそのまま保存
した。
特異性（二価反応性）の有無の検査未処理マイクロタイ
タ−プレ−ト（９６ウエル・ヌンクプレ−ト、インタ−
メッド社製）の各ウエルに０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９．６）に溶解した１００μＩＵ／ｍｌのＴＳ
Ｈの溶液５０μｌを加えて、４℃一夜インキュベ−トし
た。各ウエルの溶液を除去し、ＰＢＳに０．４％ツイ−
ン（ｔｗｅｅｎ）−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−
Ｔ）で３回洗浄した後、０．１％ウシ血清アルブミン
（以下ＢＳＡ）を溶解したＰＢＳ溶液３００μｌを各ウ
エルに加えて、４℃でブロッキング処理しそのまま保存
した。
【００３４】マイクロタイタ−プレ−トを室温にもど
し、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、（２）で分画したそ
れぞれのピ−クの試料をＰＢＳで１０倍して各ウエルに
それぞれ５０μｌ加えた。この状態で３７℃で９０分間
放置した。つぎにＰＢＳに溶解した５０μｇ／ｍｌのＡ
ＬＰの溶液１００μｌを加えて、３７℃で９０分間イン
キュベ−トした。ＰＢＳにて洗浄後、５０ｍＭ炭酸緩衝
液（ｐＨ９．８）−１０ｍＭ塩化マグネシウムにて３ｍ
ｇ／ｍｌに調製したパラニトロフェニルフォスフェ−ト
（ＰＮＰＰ）を、各ウエルにそれぞれ１００μｌずつ添
加した。室温で３０分間呈色反応させた後、１Ｎの水酸
化ナトリウム溶液を１００μｌ加えて酵素反応を停止さ
せた。
し、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、（２）で分画したそ
れぞれのピ−クの試料をＰＢＳで１０倍して各ウエルに
それぞれ５０μｌ加えた。この状態で３７℃で９０分間
放置した。つぎにＰＢＳに溶解した５０μｇ／ｍｌのＡ
ＬＰの溶液１００μｌを加えて、３７℃で９０分間イン
キュベ−トした。ＰＢＳにて洗浄後、５０ｍＭ炭酸緩衝
液（ｐＨ９．８）−１０ｍＭ塩化マグネシウムにて３ｍ
ｇ／ｍｌに調製したパラニトロフェニルフォスフェ−ト
（ＰＮＰＰ）を、各ウエルにそれぞれ１００μｌずつ添
加した。室温で３０分間呈色反応させた後、１Ｎの水酸
化ナトリウム溶液を１００μｌ加えて酵素反応を停止さ
せた。
【００３５】上記マイクロタイタ−プレ−トを各ウエル
について、波長４０５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光
強度を自動マイクロタイタ−プレ−トリ−ダ−（東ソ−
株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測定した結果を
図３に示す。図中、呈色反応の４０５ｎｍでの吸光度を
縦軸に、フラクションナンバ−を横軸にとり、それぞれ
の分画の抗体力価を示した。アルカリフォスファタ−ゼ
活性を示す画分は、ピ−ク２のみであり、つまりＴＳＨ
とＡＬＰの両方に抗原特異性を有することから、このピ
−クが二価反応性を有する免疫グロブリンであることが
示された。以上のことから、疎水性相互作用ＨＰＬＣを
用いることにより、１ステップで有効に二価反応性を有
する免疫グロブリンを精製することができることが示さ
れた。
について、波長４０５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光
強度を自動マイクロタイタ−プレ−トリ−ダ−（東ソ−
株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測定した結果を
図３に示す。図中、呈色反応の４０５ｎｍでの吸光度を
縦軸に、フラクションナンバ−を横軸にとり、それぞれ
の分画の抗体力価を示した。アルカリフォスファタ−ゼ
活性を示す画分は、ピ−ク２のみであり、つまりＴＳＨ
とＡＬＰの両方に抗原特異性を有することから、このピ
−クが二価反応性を有する免疫グロブリンであることが
示された。以上のことから、疎水性相互作用ＨＰＬＣを
用いることにより、１ステップで有効に二価反応性を有
する免疫グロブリンを精製することができることが示さ
れた。
【図１】実施例１の（２）における疎水相互作用クロマ
トグラフィのエリ−ションパタ−ンを示す図である。
トグラフィのエリ−ションパタ−ンを示す図である。
【図２】実施例１の（３），（４）におけるアルカリフ
ォスファタ−ゼと甲状腺刺激ホルモンに対する抗体価を
示す図である。
ォスファタ−ゼと甲状腺刺激ホルモンに対する抗体価を
示す図である。
【図３】実施例１の（５）におけるアルカリフォスファ
タ−ゼと甲状腺刺激ホルモンに対する二価抗原特異性を
示す図である。
タ−ゼと甲状腺刺激ホルモンに対する二価抗原特異性を
示す図である。
Claims (4)
- 【請求項１】２種類の異なる抗原特異性を有する免疫グ
ロブリンを含有する試料を、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィ−にかけて、目的とする免疫グロブリンを選択的
に分離溶出させることを特徴とする、免疫グロブリンの
精製方法。 - 【請求項２】請求項１に記載の方法において、クロマト
グラフィ−用充填剤が、非多孔性樹脂、セファロースま
たは親水性ポリマ−系樹脂を担体とするものである方
法。 - 【請求項３】請求項１または２に記載の方法において、
２種類の異なる抗原特異性を有する免疫グロブリンが、
化学的に合成して得られたもの、２種類以上のハイブリ
ド−マを融合して得られたもの、遺伝子工学的に調製さ
れて得られたもののいずれかである方法。 - 【請求項４】請求項１から３のいずれかの項に記載の方
法において、使用する塩が硫酸アンモニウム、硫酸ナト
リウム、リン酸カリウム、またはリン酸ナトリウムのい
ずれかである方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5006962A JPH06211897A (ja) | 1993-01-19 | 1993-01-19 | 免疫グロブリンの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5006962A JPH06211897A (ja) | 1993-01-19 | 1993-01-19 | 免疫グロブリンの精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06211897A true JPH06211897A (ja) | 1994-08-02 |
Family
ID=11652843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5006962A Pending JPH06211897A (ja) | 1993-01-19 | 1993-01-19 | 免疫グロブリンの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06211897A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018510868A (ja) * | 2015-03-13 | 2018-04-19 | ノビミューン エスアー | 二重特異性抗体を精製する方法 |
-
1993
- 1993-01-19 JP JP5006962A patent/JPH06211897A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018510868A (ja) * | 2015-03-13 | 2018-04-19 | ノビミューン エスアー | 二重特異性抗体を精製する方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040309 |