JPH06220090A - ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【目的】従来のＶＩＰアナログに比べ、生物学的活性が
高く、安定性に優れたＶＩＰアナログを提供する。 【構成】 His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr- R1- R2-Tyr-T
hr- R3-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu- Ala- R4- R5-Lys-Tyr-L
eu- R6- R7- R8- R9-R10- X ［ R1 は Glyを意味し、 R
2 は Asn を意味し、 R3 は Lys を意味し、 R4 は A
la を意味し、 R5 は Lys を意味し、 R6 は Lys ま
たは Gln を意味し、 R7 は Lys を意味し、 R8 は A
la を意味し、 R9 は Leu を意味し、 R10は Lysまた
は Arg を意味し、 X はホモセリン（ホモセリンラク
トンも含む、「Hse 」 と略す）］によって示されるポ
リペプチド。
高く、安定性に優れたＶＩＰアナログを提供する。 【構成】 His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr- R1- R2-Tyr-T
hr- R3-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu- Ala- R4- R5-Lys-Tyr-L
eu- R6- R7- R8- R9-R10- X ［ R1 は Glyを意味し、 R
2 は Asn を意味し、 R3 は Lys を意味し、 R4 は A
la を意味し、 R5 は Lys を意味し、 R6 は Lys ま
たは Gln を意味し、 R7 は Lys を意味し、 R8 は A
la を意味し、 R9 は Leu を意味し、 R10は Lysまた
は Arg を意味し、 X はホモセリン（ホモセリンラク
トンも含む、「Hse 」 と略す）］によって示されるポ
リペプチド。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、強い平滑筋弛緩作用を
有し、しかも安定性並びに持続性に優れた新規なポリペ
プチド及びその用途に係わる。本発明物質は医薬品成分
として殊に喘息等の予防および治療に用いることができ
る。
有し、しかも安定性並びに持続性に優れた新規なポリペ
プチド及びその用途に係わる。本発明物質は医薬品成分
として殊に喘息等の予防および治療に用いることができ
る。
【０００２】
【従来技術】平滑筋弛緩作用を有するポリペプチドは数
多く発見されているが、ＶＩＰ（Vasoactive Intestina
l Polypeptide ）は、Said 及び Mutt により1970年に
ブタ十二指腸よりセクレチンを精製抽出する段階の副分
画から精製された28個のアミノ酸からなるペプチドホル
モンである。ＶＩＰのアミノ酸配列は1974年に明らかに
され、セクレチン、グルカゴン等と類似していることか
らグルカゴン−セクレチンファミリ−に属するペプチド
ホルモンであるとされるに至っている。ＶＩＰは、消化
管以外の神経系にも広く存在が認められており、その生
物学的作用は多彩で、強い血管拡張・血圧降下作用、平
滑筋弛緩作用、腸液分泌促進作用、膵液・胆汁分泌促進
作用、胃酸分泌抑制作用、グリコ−ゲン分解作用、種々
の下垂体ホルモン分泌促進作用や生殖器の血流調節作
用、気管支拡張作用等が明らかにされている。これらの
種々多様な作用の中でも、特に、ＶＩＰの気管支並びに
海面体小柱の平滑筋弛緩作用は、気管支喘息やインポテ
ンツの治療に応用できると期待されている。
多く発見されているが、ＶＩＰ（Vasoactive Intestina
l Polypeptide ）は、Said 及び Mutt により1970年に
ブタ十二指腸よりセクレチンを精製抽出する段階の副分
画から精製された28個のアミノ酸からなるペプチドホル
モンである。ＶＩＰのアミノ酸配列は1974年に明らかに
され、セクレチン、グルカゴン等と類似していることか
らグルカゴン−セクレチンファミリ−に属するペプチド
ホルモンであるとされるに至っている。ＶＩＰは、消化
管以外の神経系にも広く存在が認められており、その生
物学的作用は多彩で、強い血管拡張・血圧降下作用、平
滑筋弛緩作用、腸液分泌促進作用、膵液・胆汁分泌促進
作用、胃酸分泌抑制作用、グリコ−ゲン分解作用、種々
の下垂体ホルモン分泌促進作用や生殖器の血流調節作
用、気管支拡張作用等が明らかにされている。これらの
種々多様な作用の中でも、特に、ＶＩＰの気管支並びに
海面体小柱の平滑筋弛緩作用は、気管支喘息やインポテ
ンツの治療に応用できると期待されている。
【０００３】しかし、ＶＩＰを動物の臓器から分離精製
したり、化学合成により製造する場合、安定供給、製造
効率、純度、製造価格等の点で問題がある。また、ＶＩ
Ｐは物理化学的に不安定で、さらに、生体内に存在する
酵素によって分解されやすいという問題点があるので、
ＶＩＰを単独で医薬品として実用化することは困難であ
ると考えられている。これらの問題点を解決すべく、Ｖ
ＩＰと同等以上の生物学的活性を有するＶＩＰアナロ
グ、ＶＩＰより安定性の高いＶＩＰアナログおよびそれ
らの化学合成による製造方法に関する研究が活発に行わ
れている。以下に、現在までに報告されているＶＩＰア
ナログの構造と生物学的活性の関係について概説する。
したり、化学合成により製造する場合、安定供給、製造
効率、純度、製造価格等の点で問題がある。また、ＶＩ
Ｐは物理化学的に不安定で、さらに、生体内に存在する
酵素によって分解されやすいという問題点があるので、
ＶＩＰを単独で医薬品として実用化することは困難であ
ると考えられている。これらの問題点を解決すべく、Ｖ
ＩＰと同等以上の生物学的活性を有するＶＩＰアナロ
グ、ＶＩＰより安定性の高いＶＩＰアナログおよびそれ
らの化学合成による製造方法に関する研究が活発に行わ
れている。以下に、現在までに報告されているＶＩＰア
ナログの構造と生物学的活性の関係について概説する。
【０００４】ＶＩＰの17位はメチオニンであるが、これ
をノルロイシンに変換したポリペプチドは、ＶＩＰと同
様な生物学的活性を有している（特開昭62-246595 ）。
ＶＩＰの 8位のアスパラギン酸をグルタミン酸に変換し
たものは、ＶＩＰとほぼ同様な生物学的活性を有してい
る（Chem.Pharm. Bull., 28, 2265-2269(1980)）。ＶＩ
ＰのＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸を１つもしくは２
つ削ったペプチドでは生物学的活性が大幅に減少する
（J. Biol.Chem., 266, 6389-6392(1991) ）が、Ｃ末端
に塩基性のアミノ酸を付加すると生物学的活性が3-4 倍
増加する（特開昭 62-246595）。また、ＶＩＰのＮ末端
をアセチル化し、17位のメチオニンをノルロイシンに変
換したアナログをリーディング化合物として、さらに数
カ所のアミノ酸の変換を行ったＶＩＰアナログには優れ
た生物活性が示されている（特開平3-38600 ）。
をノルロイシンに変換したポリペプチドは、ＶＩＰと同
様な生物学的活性を有している（特開昭62-246595 ）。
ＶＩＰの 8位のアスパラギン酸をグルタミン酸に変換し
たものは、ＶＩＰとほぼ同様な生物学的活性を有してい
る（Chem.Pharm. Bull., 28, 2265-2269(1980)）。ＶＩ
ＰのＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸を１つもしくは２
つ削ったペプチドでは生物学的活性が大幅に減少する
（J. Biol.Chem., 266, 6389-6392(1991) ）が、Ｃ末端
に塩基性のアミノ酸を付加すると生物学的活性が3-4 倍
増加する（特開昭 62-246595）。また、ＶＩＰのＮ末端
をアセチル化し、17位のメチオニンをノルロイシンに変
換したアナログをリーディング化合物として、さらに数
カ所のアミノ酸の変換を行ったＶＩＰアナログには優れ
た生物活性が示されている（特開平3-38600 ）。
【０００５】しかし、これらの化学合成によるＶＩＰア
ナログは、その構造中に天然には存在しないアミノ酸を
含んでいたり、余分にアミノ酸が付加されていたり、Ｎ
末端がアセチル化されていたりするために、製造効率、
純度、製造価格等の点で問題があると予想されるばかり
でなく、人体に適用した場合、抗原性等の不都合な作用
が発現する可能性がある。また、その構造中に、天然に
は存在しないアミノ酸を含むＶＩＰアナログやＮ末端が
アセチル化されているＶＩＰアナログは、遺伝子組換え
技術により製造することは事実上不可能であると考えら
れる。また、生物学的作用の強度もさらに改善される必
要があると考えられる。
ナログは、その構造中に天然には存在しないアミノ酸を
含んでいたり、余分にアミノ酸が付加されていたり、Ｎ
末端がアセチル化されていたりするために、製造効率、
純度、製造価格等の点で問題があると予想されるばかり
でなく、人体に適用した場合、抗原性等の不都合な作用
が発現する可能性がある。また、その構造中に、天然に
は存在しないアミノ酸を含むＶＩＰアナログやＮ末端が
アセチル化されているＶＩＰアナログは、遺伝子組換え
技術により製造することは事実上不可能であると考えら
れる。また、生物学的作用の強度もさらに改善される必
要があると考えられる。
【０００６】ＶＩＰアナログを高純度かつ安価に工業的
生産するためには遺伝子組換え技術による製造方法が適
していると考えられる。ＶＩＰは、Ｃ末端がアミド化さ
れており、構造のほぼ全体がヘリックス構造を形成して
おり、これらが生物学的活性の発現に重要な役割を担っ
ていると指摘されている（Biochemistry, 28, 2399-240
9 (1989)）。そして、これらのことは、ＶＩＰあるいは
そのアナログを遺伝子組換え技術で製造する場合に配慮
すべき課題と考えられる。一般的に、Ｃ末端がアミド化
されているポリペプチドあるいはタンパク質を遺伝子組
換え技術により製造する場合、最終的にアミド化酵素等
で処理して目的物質に変換する必要がある。このような
アミド化処理は、製造コストを増大させるばかりでな
く、目的物質の純度低下の原因になる。
生産するためには遺伝子組換え技術による製造方法が適
していると考えられる。ＶＩＰは、Ｃ末端がアミド化さ
れており、構造のほぼ全体がヘリックス構造を形成して
おり、これらが生物学的活性の発現に重要な役割を担っ
ていると指摘されている（Biochemistry, 28, 2399-240
9 (1989)）。そして、これらのことは、ＶＩＰあるいは
そのアナログを遺伝子組換え技術で製造する場合に配慮
すべき課題と考えられる。一般的に、Ｃ末端がアミド化
されているポリペプチドあるいはタンパク質を遺伝子組
換え技術により製造する場合、最終的にアミド化酵素等
で処理して目的物質に変換する必要がある。このような
アミド化処理は、製造コストを増大させるばかりでな
く、目的物質の純度低下の原因になる。
【０００７】本発明者等は、既に、ＶＩＰのＣ末端がア
ミド化されておらず、ホモセリンになっているアナログ
にはＶＩＰと同等以上の生物学的活性があることを発見
している（特願平 2-408425 ）。この発見は、ＶＩＰの
生物学的活性の発現にはＣ末端がアミド化されている必
要があるという従来の知見と異なるばかりか、遺伝子組
換え技術により、アミド化処理工程なしで直接的にＶＩ
Ｐアナログを製造するための基礎的知見をもたらした点
で極めて重要である。また、さらに、本発明者等は、既
に、モチリンをはじめとする種々のポリペプチドでは、
通常の医薬品保存条件下で、その構造中のアスパラギン
(Asn) またはアスパラギン酸(Asp) の部位でのβ転移反
応のために構造が変化し、純度低下の原因になっている
ことを明らかにしている（特願平 4-38338）。この知見
に基づけば、天然のＶＩＰの 3位、 8位、 9位および24
位に存在するアスパラギン(Asn) あるいはアスパラギン
酸(Asp) を、他の適当なアミノ酸に変換することによ
り、より安定性の高いＶＩＰアナログを発見できる可能
性がある。
ミド化されておらず、ホモセリンになっているアナログ
にはＶＩＰと同等以上の生物学的活性があることを発見
している（特願平 2-408425 ）。この発見は、ＶＩＰの
生物学的活性の発現にはＣ末端がアミド化されている必
要があるという従来の知見と異なるばかりか、遺伝子組
換え技術により、アミド化処理工程なしで直接的にＶＩ
Ｐアナログを製造するための基礎的知見をもたらした点
で極めて重要である。また、さらに、本発明者等は、既
に、モチリンをはじめとする種々のポリペプチドでは、
通常の医薬品保存条件下で、その構造中のアスパラギン
(Asn) またはアスパラギン酸(Asp) の部位でのβ転移反
応のために構造が変化し、純度低下の原因になっている
ことを明らかにしている（特願平 4-38338）。この知見
に基づけば、天然のＶＩＰの 3位、 8位、 9位および24
位に存在するアスパラギン(Asn) あるいはアスパラギン
酸(Asp) を、他の適当なアミノ酸に変換することによ
り、より安定性の高いＶＩＰアナログを発見できる可能
性がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題及び発明の目的】天然の
ＶＩＰは、通常の医薬品保存条件下では非常に不安定で
あり、さらに生体に投与した場合、タンパク質分解酵素
等により簡単に分解されてしまう。また、天然のＶＩＰ
を医薬品として用いる場合には、ＶＩＰが生体内で分解
されやすいので高用量を投与する必要があり、作用持続
時間も短いという欠点がある。これらの欠点をある程度
克服したと考えられる化学合成による公知のＶＩＰアナ
ログも製造コストや純度の点で問題があり、生物学的活
性強度もさらに改善される必要がある。本発明は、従来
技術におけるこのような解決困難な問題点をふまえてな
されたものであり、従来のＶＩＰ類に比べて、安定性に
優れ、また天然のＶＩＰに比べて生物学的活性を数十倍
以上と驚異的に高め、さらに遺伝子組換え技術により大
量生産できるようにデザインしたポリペプチドを提供す
ることにある。さらに、本発明のもう一つの重要な目的
は、非常に効率的かつ廉価に提供できる、前記のＶＩＰ
様活性を有するポリペプチドを有効成分とする医薬品
を、主として気管支拡張剤あるいはインポテンツ治療剤
として提供することにある。
ＶＩＰは、通常の医薬品保存条件下では非常に不安定で
あり、さらに生体に投与した場合、タンパク質分解酵素
等により簡単に分解されてしまう。また、天然のＶＩＰ
を医薬品として用いる場合には、ＶＩＰが生体内で分解
されやすいので高用量を投与する必要があり、作用持続
時間も短いという欠点がある。これらの欠点をある程度
克服したと考えられる化学合成による公知のＶＩＰアナ
ログも製造コストや純度の点で問題があり、生物学的活
性強度もさらに改善される必要がある。本発明は、従来
技術におけるこのような解決困難な問題点をふまえてな
されたものであり、従来のＶＩＰ類に比べて、安定性に
優れ、また天然のＶＩＰに比べて生物学的活性を数十倍
以上と驚異的に高め、さらに遺伝子組換え技術により大
量生産できるようにデザインしたポリペプチドを提供す
ることにある。さらに、本発明のもう一つの重要な目的
は、非常に効率的かつ廉価に提供できる、前記のＶＩＰ
様活性を有するポリペプチドを有効成分とする医薬品
を、主として気管支拡張剤あるいはインポテンツ治療剤
として提供することにある。
【０００９】
【課題を解決し、目的を達成する手段及び作用】本発明
者等は、鋭意検討を重ねた結果、天然のＶＩＰの構造中
に存在する 8位のアスパラギン酸 (Asp)をグリシン (Gl
y)に、24位のアスパラギン (Asn)をリジン (Lys)、もし
くはグルタミン (Gln)に変換することによって、高い生
物学的活性を保持したまま安定性が増大すことを見い出
した。また、さらに、24位以降に塩基性のアミノ酸であ
るリジン (Lys)もしくはアルギニンン (Arg)等を適当に
配置し、Ｃ末端をホモセリンで置換することにより、天
然のＶＩＰよりも数十倍高い生物学的活性を有するＶＩ
Ｐアナログを発見し、これによって基本的に本発明を完
成するに至った。本発明者等らが発見したこれらのＶＩ
Ｐアナログには天然に存在しないアミノ酸は含まれてお
らず、また、Ｎ末端のアセチル化等の化学的修飾が全く
施されていないので、化学合成法のみならず遺伝子組換
え技術によっても容易に大量生産することができる。本
発明は、一般式（Ｉ） His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr- R1- R2-Tyr-Thr- R3-Le
u-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala- R4- R5-Lys-Tyr-Leu- R6- R7-
R8- R9-R10- X ［式中 R1 は Asp または Gly を意味し、 R2 は Asn
または Gln を意味し、 R3 は Arg または Lys を
意味し、 R4 は Val または Ala または Lys を意味
し、 R5 は Lys または Leu を意味し、 R6 は Asnま
たは Glnまたは Lys を意味し、 R7 は Ser または L
ys または Ala を意味し、 R8は Ile または Ala
または Leu を意味し、 R9 はLeu または Lys を意味
し、 R10は Asn または Lys またはArg を意味し、 X
はホモセリン（ホモセリンラクトンも含む、「Hse 」
と略す）］によって示されることを特徴とするポリペ
プチド。または、上記一般式（Ｉ）において、［式中 R
1 は Gly を意味し、 R2 はAsn を意味し、 R3 は Ly
s を意味し、 R4 は Alaを意味し、 R5 は Lysを意味
し、 R6 は Lys または Gln を意味し、 R7 は Lys
を意味し、 R8 は Ala を意味し、 R9 は Leu を意
味し、 R10は Lys または Arg を意味し、 X はホモ
セリン（ホモセリンラクトンも含む、「Hse 」 と略
す）］によって示されることを特徴とするポリペプチド
にて各種の課題が解決される。これらのポリペプチド
は、気管支平滑筋等の弛緩作用を有している。
者等は、鋭意検討を重ねた結果、天然のＶＩＰの構造中
に存在する 8位のアスパラギン酸 (Asp)をグリシン (Gl
y)に、24位のアスパラギン (Asn)をリジン (Lys)、もし
くはグルタミン (Gln)に変換することによって、高い生
物学的活性を保持したまま安定性が増大すことを見い出
した。また、さらに、24位以降に塩基性のアミノ酸であ
るリジン (Lys)もしくはアルギニンン (Arg)等を適当に
配置し、Ｃ末端をホモセリンで置換することにより、天
然のＶＩＰよりも数十倍高い生物学的活性を有するＶＩ
Ｐアナログを発見し、これによって基本的に本発明を完
成するに至った。本発明者等らが発見したこれらのＶＩ
Ｐアナログには天然に存在しないアミノ酸は含まれてお
らず、また、Ｎ末端のアセチル化等の化学的修飾が全く
施されていないので、化学合成法のみならず遺伝子組換
え技術によっても容易に大量生産することができる。本
発明は、一般式（Ｉ） His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr- R1- R2-Tyr-Thr- R3-Le
u-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala- R4- R5-Lys-Tyr-Leu- R6- R7-
R8- R9-R10- X ［式中 R1 は Asp または Gly を意味し、 R2 は Asn
または Gln を意味し、 R3 は Arg または Lys を
意味し、 R4 は Val または Ala または Lys を意味
し、 R5 は Lys または Leu を意味し、 R6 は Asnま
たは Glnまたは Lys を意味し、 R7 は Ser または L
ys または Ala を意味し、 R8は Ile または Ala
または Leu を意味し、 R9 はLeu または Lys を意味
し、 R10は Asn または Lys またはArg を意味し、 X
はホモセリン（ホモセリンラクトンも含む、「Hse 」
と略す）］によって示されることを特徴とするポリペ
プチド。または、上記一般式（Ｉ）において、［式中 R
1 は Gly を意味し、 R2 はAsn を意味し、 R3 は Ly
s を意味し、 R4 は Alaを意味し、 R5 は Lysを意味
し、 R6 は Lys または Gln を意味し、 R7 は Lys
を意味し、 R8 は Ala を意味し、 R9 は Leu を意
味し、 R10は Lys または Arg を意味し、 X はホモ
セリン（ホモセリンラクトンも含む、「Hse 」 と略
す）］によって示されることを特徴とするポリペプチド
にて各種の課題が解決される。これらのポリペプチド
は、気管支平滑筋等の弛緩作用を有している。
【００１０】
【実施例等】次に、製造例、生物学的活性試験例、安定
性試験例をあげて本発明をさらに詳細に説明する。
性試験例をあげて本発明をさらに詳細に説明する。
【製造例】Ｃ末端にホモセリンを有する各種ＶＩＰ様生
理活性ポリペプチドの合成は、ペプチド合成機で合成終
了後、通常の脱保護基、脱樹脂によってＣ末端にホモセ
リン(Hse) を与える N-Boc-O-benzyl-L-homoseryl-4-(o
xymethyl)phenylacetic acid を化学合成し、市販のam
inomethylated polystyrene ・HCL 樹脂を用いてアプラ
イドバイオシステムズ社のペプチドシンセサイザー431A
にて行った。合成したペプチドは、トリフルオロメタン
スルホン酸法にて脱保護基、脱樹脂を行ない、ウォータ
ーズ社製のマイクロボンダスフェアの C-18 カラム(19m
mx15cm) を用いてHPLCにて以下の条件下で精製した。 溶出液：0.012N塩酸中15％から50％のアセトニトリルの
直線勾配、35分間 流速 ：7.0ml/min HPLCによるメインピーク部分を回収して凍結乾燥した。
以上の過程でペプチドサンプルのＣ末端は、ホモセリン
またはホモセリンラクトンとなっていた。精製後のポリ
ペプチドをアプライドバイオシステムズ社のペプチドシ
ークエンサーにて調べた。サンプルは、Ｃ末端のホモセ
リンを含めて正しく化学合成されていることが確認され
た。また、各種の配列を有する各々のＶＩＰアナログも
同様にして合成並びに精製を行った。本発明品をヒトあ
るいは動物に投与する場合、吸入、注射、経皮、粘膜
（鼻腔、目、直腸等）、経口等の方法が可能であり、目
的とする投与方法に応じて都合の良い製剤を、一般的に
知られている製剤調製法により製造することができる。
主な製剤としては、注射剤、坐剤、吸入剤、カプセル
剤、錠剤、粉剤、目薬等があげられるが、この限りでは
ない。
理活性ポリペプチドの合成は、ペプチド合成機で合成終
了後、通常の脱保護基、脱樹脂によってＣ末端にホモセ
リン(Hse) を与える N-Boc-O-benzyl-L-homoseryl-4-(o
xymethyl)phenylacetic acid を化学合成し、市販のam
inomethylated polystyrene ・HCL 樹脂を用いてアプラ
イドバイオシステムズ社のペプチドシンセサイザー431A
にて行った。合成したペプチドは、トリフルオロメタン
スルホン酸法にて脱保護基、脱樹脂を行ない、ウォータ
ーズ社製のマイクロボンダスフェアの C-18 カラム(19m
mx15cm) を用いてHPLCにて以下の条件下で精製した。 溶出液：0.012N塩酸中15％から50％のアセトニトリルの
直線勾配、35分間 流速 ：7.0ml/min HPLCによるメインピーク部分を回収して凍結乾燥した。
以上の過程でペプチドサンプルのＣ末端は、ホモセリン
またはホモセリンラクトンとなっていた。精製後のポリ
ペプチドをアプライドバイオシステムズ社のペプチドシ
ークエンサーにて調べた。サンプルは、Ｃ末端のホモセ
リンを含めて正しく化学合成されていることが確認され
た。また、各種の配列を有する各々のＶＩＰアナログも
同様にして合成並びに精製を行った。本発明品をヒトあ
るいは動物に投与する場合、吸入、注射、経皮、粘膜
（鼻腔、目、直腸等）、経口等の方法が可能であり、目
的とする投与方法に応じて都合の良い製剤を、一般的に
知られている製剤調製法により製造することができる。
主な製剤としては、注射剤、坐剤、吸入剤、カプセル
剤、錠剤、粉剤、目薬等があげられるが、この限りでは
ない。
【００１１】
【生物学的活性試験例（気管支収縮抑制活性の測定）】
上記製造例で得られた各種ＶＩＰアナログを被験物質と
して、（株）ペプチド研究所から購入したＶＩＰを比較
対照物質としてコンツェトレスラー（Konzett-Rossler
）法に準じてヒスタミンに対する気管支収縮抑制率を
評価した。また、特開平3-38600 記載のアミノ酸配列を
もとにＮ末端をアセチル化していないペプチドを合成し
同様に比較した。まず、ウレタン麻酔したモルモットに
被験薬物を気道カニューレのラインを通して直接滴下投
与後、肺に到達させるために 1分間立てかけた。被験薬
物投与 1.5分後にサクシニルコリンクロライドを静脈内
投与して自発呼吸を抑制させ、その30秒後に、ヒスタミ
ン（0.5 μｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、被験薬物の気管
支収縮抑制作用（ＩＤ50：ヒスタミンによる収縮を 50%
抑制する投与量）をコンツェトレスラー法に準じて評価
した。
上記製造例で得られた各種ＶＩＰアナログを被験物質と
して、（株）ペプチド研究所から購入したＶＩＰを比較
対照物質としてコンツェトレスラー（Konzett-Rossler
）法に準じてヒスタミンに対する気管支収縮抑制率を
評価した。また、特開平3-38600 記載のアミノ酸配列を
もとにＮ末端をアセチル化していないペプチドを合成し
同様に比較した。まず、ウレタン麻酔したモルモットに
被験薬物を気道カニューレのラインを通して直接滴下投
与後、肺に到達させるために 1分間立てかけた。被験薬
物投与 1.5分後にサクシニルコリンクロライドを静脈内
投与して自発呼吸を抑制させ、その30秒後に、ヒスタミ
ン（0.5 μｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、被験薬物の気管
支収縮抑制作用（ＩＤ50：ヒスタミンによる収縮を 50%
抑制する投与量）をコンツェトレスラー法に準じて評価
した。
【００１２】
【表１】
【００１３】表１から明らかなように、本発明により得
られたＣ末端にホモセリンを有するＶＩＰアナログは、
天然のＶＩＰに比べ、数倍以上強力な気管支弛緩作用を
有していた。また、式 His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-G
ly-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu- Ala-Ala-Ly
s-Lys-Tyr-Leu- R6-Lys-Ala-Leu- R10 - X［式中 R6 は
Lys または Gln を意味し、 R10は Lys または Arg
を意味し、 X はホモセリン（ホモセリンラクトンも
含む、「Hse 」 と略す）］によって示されるポリペプ
チドにおいては、天然のＶＩＰに比べ、 100倍以上強力
な気管支弛緩作用を有していた。なお、特開平3-38600
記載のアミノ酸配列をもとに合成したＮ末端をアセチル
化していないペプチドは、本発明物質の一部である上記
式で示されるペプチドに比べ、その気管支弛緩作用は数
分の１程度であった。
られたＣ末端にホモセリンを有するＶＩＰアナログは、
天然のＶＩＰに比べ、数倍以上強力な気管支弛緩作用を
有していた。また、式 His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-G
ly-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu- Ala-Ala-Ly
s-Lys-Tyr-Leu- R6-Lys-Ala-Leu- R10 - X［式中 R6 は
Lys または Gln を意味し、 R10は Lys または Arg
を意味し、 X はホモセリン（ホモセリンラクトンも
含む、「Hse 」 と略す）］によって示されるポリペプ
チドにおいては、天然のＶＩＰに比べ、 100倍以上強力
な気管支弛緩作用を有していた。なお、特開平3-38600
記載のアミノ酸配列をもとに合成したＮ末端をアセチル
化していないペプチドは、本発明物質の一部である上記
式で示されるペプチドに比べ、その気管支弛緩作用は数
分の１程度であった。
【００１４】
【安定性試験例】各種のＶＩＰアナログを 0.1-1.0mg/m
l の濃度になるようにリン酸緩衝液に無菌的に溶解し、
ガラスバイアルに充填した後密封した。これらバイアル
充填した溶液を 60 ℃の恒温槽中に保存し、 HPLC 法に
よりＶＩＰアナログの経時変化を追跡した。各種ＶＩＰ
アナログ溶液を 60 ℃の恒温槽中に10日間保存した時の
試験結果を、インタクトなＶＩＰアナログの残存活性と
して表１にまとめて示した。試験の結果、β転移反応が
起こりやすいアスパラギン(Asn) またはアスパラギン酸
(Asp) のうち、特に、 8位のアスパラギン酸(Asp) の位
置をグリシン(Gly)に変換し、さらに24位のアスパラギ
ン(Asn) の位置をリジン(Lys) またはグルタミン(Gl n)
に変換したペプチドは、天然型ＶＩＰに比べて、安定性
が大幅に向上していることが明らかになった。
l の濃度になるようにリン酸緩衝液に無菌的に溶解し、
ガラスバイアルに充填した後密封した。これらバイアル
充填した溶液を 60 ℃の恒温槽中に保存し、 HPLC 法に
よりＶＩＰアナログの経時変化を追跡した。各種ＶＩＰ
アナログ溶液を 60 ℃の恒温槽中に10日間保存した時の
試験結果を、インタクトなＶＩＰアナログの残存活性と
して表１にまとめて示した。試験の結果、β転移反応が
起こりやすいアスパラギン(Asn) またはアスパラギン酸
(Asp) のうち、特に、 8位のアスパラギン酸(Asp) の位
置をグリシン(Gly)に変換し、さらに24位のアスパラギ
ン(Asn) の位置をリジン(Lys) またはグルタミン(Gl n)
に変換したペプチドは、天然型ＶＩＰに比べて、安定性
が大幅に向上していることが明らかになった。
【００１５】
【発明の効果】本発明によるポリペプチドは、天然型Ｖ
ＩＰの数十倍以上の気管支平滑筋弛緩作用等の生物学的
活性を有し、その持続時間も従来のＶＩＰに比べて非常
に長く、安定性も大幅に改善されている。本発明による
Ｃ末端にホモセリン（ホモセリンラクトンも含む）をも
ちＶＩＰ様活性を有するポリペプチドは、本発明者等が
すでに開発した方法を応用して大腸菌等を宿主とした遺
伝子組換え技術により工業的ベ−スで廉価に製造するこ
とができる。従って、本発明による上記の気管支平滑筋
等の弛緩活性を有する生理活性ポリペプチドは、微量で
有効な喘息等の予防・治療薬として用いることができ
る。
ＩＰの数十倍以上の気管支平滑筋弛緩作用等の生物学的
活性を有し、その持続時間も従来のＶＩＰに比べて非常
に長く、安定性も大幅に改善されている。本発明による
Ｃ末端にホモセリン（ホモセリンラクトンも含む）をも
ちＶＩＰ様活性を有するポリペプチドは、本発明者等が
すでに開発した方法を応用して大腸菌等を宿主とした遺
伝子組換え技術により工業的ベ−スで廉価に製造するこ
とができる。従って、本発明による上記の気管支平滑筋
等の弛緩活性を有する生理活性ポリペプチドは、微量で
有効な喘息等の予防・治療薬として用いることができ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三 谷 隆 彦 名古屋市東区東外堀町35番地 株式会社三 和化学研究所内 (72)発明者 平 出 欽 也 名古屋市東区東外堀町35番地 株式会社三 和化学研究所内 (72)発明者 澤 井 喜 一 名古屋市東区東外堀町35番地 株式会社三 和化学研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 一般式（Ｉ） His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr- R1- R2-Tyr-Thr- R3-Le
u-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala- R4- R5-Lys-Tyr-Leu- R6- R7-
R8- R9-R10- X ［式中 R1 は Asp または Gly を意味し、 R2 は Asn
または Gln を意味し、 R3 は Arg または Lys を
意味し、 R4 は Val または Ala またはLys を意味
し、 R5 は Lys または Leu を意味し、 R6 は Asnま
たは Glnまたは Lys を意味し、 R7 は Ser または L
ys または Ala を意味し、 R8 は Ile または Ala
または Leu を意味し、 R9 はLeu または Lys を意味
し、 R10は Asn または Lys またはArg を意味し、 X
はホモセリン（ホモセリンラクトンも含む、「Hse 」
と略す）］によって示されることを特徴とするポリペ
プチド。 - 【請求項２】 一般式（Ｉ） His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr- R1- R2-Tyr-Thr- R3-Le
u-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala- R4- R5-Lys-Tyr-Leu- R6- R7-
R8- R9-R10- X ［式中 R1 は Gly を意味し、 R2 は Asn を意味し、
R3 は Lys を意味し、 R4 は Ala を意味し、 R5 は
Lys を意味し、 R6 は Lys または Glnを意味し、 R
7 は Lys を意味し、 R8 は Ala を意味し、 R9 は L
eu を意味し、 R10は Lys または Arg を意味し、 X
はホモセリン（ホモセリンラクトンも含む、「Hse 」
と略す）］によって示されることを特徴とする請求項
１に記載のポリペプチド。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5009468A JPH06220090A (ja) | 1993-01-22 | 1993-01-22 | ポリペプチド |
| EP94100793A EP0613904A3 (en) | 1993-01-22 | 1994-01-20 | Analogs of the vasoactive, intestinal peptide for the treatment of diseases of the smooth muscles and / or asthma. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5009468A JPH06220090A (ja) | 1993-01-22 | 1993-01-22 | ポリペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06220090A true JPH06220090A (ja) | 1994-08-09 |
Family
ID=11721110
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5009468A Pending JPH06220090A (ja) | 1993-01-22 | 1993-01-22 | ポリペプチド |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0613904A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06220090A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07173197A (ja) * | 1993-12-20 | 1995-07-11 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | ポリペプチド修飾化合物及びその用途 |
| CA2196308C (en) * | 1995-06-09 | 2000-10-17 | Kazuhisa Kashimoto | Peptide, bronchodilator and blood flow ameliorant |
| AU2249701A (en) | 1999-11-12 | 2001-06-06 | David Bernstein | Methods for treating cardiac arrest or pulmonary hypertension and compositions for use therein comprising vasoactive intestinal polypeptide and cardiac device for electrical and chemical regulation and methods of use |
| WO2002043746A2 (en) | 2000-11-28 | 2002-06-06 | Mondobiotech Sa | Compounds with the biological activity of vasoactive intestinal peptide for the treatment of pulmonary and arteriolar hypertension |
| JP2005535607A (ja) | 2002-06-10 | 2005-11-24 | モンドバイオテック・ラボラトリーズ・アンスタルト | サルコイドーシスを治療するための血管作動性腸管ペプチドの生物活性をもつ化合物の使用 |
| CN100381462C (zh) | 2002-11-27 | 2008-04-16 | 伊藤火腿株式会社 | 肽及含有所述肽的药物组合物 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4605641A (en) * | 1984-10-09 | 1986-08-12 | Hoffmann-La Roche Inc. | Synthetic vasoactive intestinal peptide analogs |
| US5141924A (en) * | 1989-06-30 | 1992-08-25 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Synthetic vasoactive intestinal peptide analogs |
| DK0463450T3 (da) * | 1990-06-26 | 1994-06-27 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co | Vasoaktive intestinale polypeptid-analoger og udnyttelsen heraf |
-
1993
- 1993-01-22 JP JP5009468A patent/JPH06220090A/ja active Pending
-
1994
- 1994-01-20 EP EP94100793A patent/EP0613904A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0613904A2 (en) | 1994-09-07 |
| EP0613904A3 (en) | 1995-07-19 |
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