JPH083196A - カルシトニン誘導体及びその用途 - Google Patents
カルシトニン誘導体及びその用途Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 カルシトニン誘導体及びその用途を提供す
る。 【構成】 天然型ウナギ・カルシトニンの C 末端アミ
ノ酸残基であるプロリン・アミド残基 (Pro-NH2) がホ
モセリン・アミド残基 (Hse-NH2) に代替された誘導体
である。 【効果】 天然型のものよりも活性において著しく優れ
ており、遺伝子工学的手法を用いることにより廉価に且
つ大量に生産することが可能であり、従ってカルシウム
代謝系疾患の予防及び治療剤の有効成分として用いるの
に適している。
る。 【構成】 天然型ウナギ・カルシトニンの C 末端アミ
ノ酸残基であるプロリン・アミド残基 (Pro-NH2) がホ
モセリン・アミド残基 (Hse-NH2) に代替された誘導体
である。 【効果】 天然型のものよりも活性において著しく優れ
ており、遺伝子工学的手法を用いることにより廉価に且
つ大量に生産することが可能であり、従ってカルシウム
代謝系疾患の予防及び治療剤の有効成分として用いるの
に適している。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なカルシトニン誘導
体及びその用途に係る。本発明による誘導体はカルシウ
ム代謝系疾患の予防及び治療に、例えば骨粗鬆症におけ
る疼痛の軽減や骨量減少の抑制、骨形成不全症における
骨折の予防、高カルシウム血症及び骨ページェット病
(Paget's disease) の治療に用いることができる。
体及びその用途に係る。本発明による誘導体はカルシウ
ム代謝系疾患の予防及び治療に、例えば骨粗鬆症におけ
る疼痛の軽減や骨量減少の抑制、骨形成不全症における
骨折の予防、高カルシウム血症及び骨ページェット病
(Paget's disease) の治療に用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】カルシトニンは、1961 年に D.H. Copp
等によりヒトの頸部静脈血中から、血中のカルシウム濃
度を低下させる作用を有するペプチド・ホルモンとして
初めて発見された物質である。このヒト・カルシトニン
のアミノ酸構造は下記の通りであり (配列番号 2 に相
当)、 32 個のアミノ 酸から構成されている。
等によりヒトの頸部静脈血中から、血中のカルシウム濃
度を低下させる作用を有するペプチド・ホルモンとして
初めて発見された物質である。このヒト・カルシトニン
のアミノ酸構造は下記の通りであり (配列番号 2 に相
当)、 32 個のアミノ 酸から構成されている。
【０００３】 5 10 15 Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn- 20 25 30 Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro・NH2 (上記のアミノ酸配列中において、Pro・NH2 はアミド化
されたプロリン残基を意味し、1 位と 7 位の Cys はジ
スルフィド結合している)
されたプロリン残基を意味し、1 位と 7 位の Cys はジ
スルフィド結合している)
【０００４】その後にサケ、ウナギ、ニワトリ、ブタ、
ラット、ヒツジ、ウシ、エイ等の生物からヒト・カルシ
トニンと同様の生理活性を有するペプチド・ホルモンが
抽出され、これらの天然型カルシトニンのアミノ酸構造
が決定された。これらのカルシトニン類に共通の構造的
な特徴は、何れも 32 個のアミノ酸から構成され、1 位
と 7 位の Cys がジスルフィド結合して環状を呈してお
り、C末端がアミド化されたプロリン残基である点であ
るが、すべてのカルシトニン類において共通するアミノ
酸は第 1、4 - 7、28 及び 32 番目のアミノ酸 (計 7
個) のみであり、生理活性の発現には、全天然型カルシ
トニン類に共通する構造である C 末端のプロリン・ア
ミドが必須であると考えられてきた [J.T. Potts,Jr. e
t al. "Calicum, Parathyroid Hormone and the Calcit
onins", page 121,printed by Excerpta Medica, Amste
rdam (1971); P. Sieber "Calcitonin1969", page 28,
Proc. 2nd Symp., printed by Medical Books, London
(1970); W. Rittel et al. "Experientia", Vol. 32, p
age 246 (1976)]。尚、カルシトニン類の生理活性作用
としては血中カルシウム濃度の低下 [P.F.Hirsch et a
l. "Science", Vol. 146, page 412 (1963)]、摂食抑制
作用 [W.J.Freed et al. "Science", Vol. 206, page 8
50 (1979)]、胃酸分泌抑制作用 [R.D. Hesch et al. "H
orm. Metab. Res.", Vol. 3, page 140 (1971)] 等が知
られている。
ラット、ヒツジ、ウシ、エイ等の生物からヒト・カルシ
トニンと同様の生理活性を有するペプチド・ホルモンが
抽出され、これらの天然型カルシトニンのアミノ酸構造
が決定された。これらのカルシトニン類に共通の構造的
な特徴は、何れも 32 個のアミノ酸から構成され、1 位
と 7 位の Cys がジスルフィド結合して環状を呈してお
り、C末端がアミド化されたプロリン残基である点であ
るが、すべてのカルシトニン類において共通するアミノ
酸は第 1、4 - 7、28 及び 32 番目のアミノ酸 (計 7
個) のみであり、生理活性の発現には、全天然型カルシ
トニン類に共通する構造である C 末端のプロリン・ア
ミドが必須であると考えられてきた [J.T. Potts,Jr. e
t al. "Calicum, Parathyroid Hormone and the Calcit
onins", page 121,printed by Excerpta Medica, Amste
rdam (1971); P. Sieber "Calcitonin1969", page 28,
Proc. 2nd Symp., printed by Medical Books, London
(1970); W. Rittel et al. "Experientia", Vol. 32, p
age 246 (1976)]。尚、カルシトニン類の生理活性作用
としては血中カルシウム濃度の低下 [P.F.Hirsch et a
l. "Science", Vol. 146, page 412 (1963)]、摂食抑制
作用 [W.J.Freed et al. "Science", Vol. 206, page 8
50 (1979)]、胃酸分泌抑制作用 [R.D. Hesch et al. "H
orm. Metab. Res.", Vol. 3, page 140 (1971)] 等が知
られている。
【０００５】カルシトニン類を得るためには、先ず生物
試料からの抽出が試みられ、次いで化学合成法が採用さ
れてきた。これらの取得法の内で前者は原料面からの制
約があり且つ精製操作が面倒である点に課題があり、一
方後者はカルシトニン類が何れも 32 個のアミノ酸から
構成されているために操作が面倒であり且つ合成自体や
精製に長時間を要し、従って廉価に且つ大量にカルシト
ニン類を提供することは極めて困難であった。尚、近年
に至り遺伝子工学が著しく進歩し、この手法を利用した
製法、即ちDNA シンセサイザーを用いることにより少量
のカルシトニン類をコードする DNAフラグメント及びそ
の相補鎖 DNA フラグメントを合成し、これらを合体し
て二本鎖フラグメントを得、これを精製してベクターに
組込み、この遺伝子組換えベクターにより大腸菌を形質
転換させ、当該形質転換体を培養してカルシトニン類を
産生させ、これからカルシトニン類を分離・精製して取
得する方法が提案されている。しかしながら、この場合
に C 末端がアミド化していて所望の生理 活性を有する
ものは大腸菌では産生できないので、産生したポリペプ
チドを分離・精製する際に C 末端のアミド化処理を行
なう必要性があるが、この処理に一般に用いられる C
末端アミド化酵素が高価であり且つ当該処理には特殊な
技術と熟練とが要求され、従ってこの方法も試薬コスト
及び収率の面から有利な方法とは云えないのが実状であ
る。
試料からの抽出が試みられ、次いで化学合成法が採用さ
れてきた。これらの取得法の内で前者は原料面からの制
約があり且つ精製操作が面倒である点に課題があり、一
方後者はカルシトニン類が何れも 32 個のアミノ酸から
構成されているために操作が面倒であり且つ合成自体や
精製に長時間を要し、従って廉価に且つ大量にカルシト
ニン類を提供することは極めて困難であった。尚、近年
に至り遺伝子工学が著しく進歩し、この手法を利用した
製法、即ちDNA シンセサイザーを用いることにより少量
のカルシトニン類をコードする DNAフラグメント及びそ
の相補鎖 DNA フラグメントを合成し、これらを合体し
て二本鎖フラグメントを得、これを精製してベクターに
組込み、この遺伝子組換えベクターにより大腸菌を形質
転換させ、当該形質転換体を培養してカルシトニン類を
産生させ、これからカルシトニン類を分離・精製して取
得する方法が提案されている。しかしながら、この場合
に C 末端がアミド化していて所望の生理 活性を有する
ものは大腸菌では産生できないので、産生したポリペプ
チドを分離・精製する際に C 末端のアミド化処理を行
なう必要性があるが、この処理に一般に用いられる C
末端アミド化酵素が高価であり且つ当該処理には特殊な
技術と熟練とが要求され、従ってこの方法も試薬コスト
及び収率の面から有利な方法とは云えないのが実状であ
る。
【０００６】そこで、本出願人会社の研究者等は遺伝子
組換え技術を利用する方法に関して研究を重ね、その結
果天然型カルシトニン [但し、アミノ酸配列中にメチオ
ニン(Met) 残基を有している場合には、これを他のアミ
ノ酸残基、例えばバリン(Val) 残基に置き換えたもの]
の C 末端におけるプロリン残基の後に更にメチオニン
残基を配したアミノ酸配列を有するポリペプチドを合成
し、この合成ポリペプチドをブロムシアンにて処理すれ
ば、ポリペプチドはメチオニン部分で切断されると共に
当該メチオニン残基はホモセリン又はホモセリン・ラク
トン残基に変化し、当該 C 末端ホモセリン又はホモセ
リン ・ラクトン残基については高価な C 末端アミド化
酵素を使用しなくとも、酸処理 (例えば 0.1N HCl 中に
おいて、30℃ で 3 時間) を施した後に凍結乾燥させる
ことにより C 末端を全てラクトン型に変換し、更にア
ンモニアにて処理することにより容易にアミド化し得る
ことを見い出した (特開平 4 - 59795)。この公開公報
に開示されているカルシトニン・アナログは、本出願人
会社の研究者がペプチドホルモンの一種であるモチリン
・アナログに関して既に提案した方法 (特開平 3 - 800
96 参照) と同様に、N 末端側のリーダー・ペプチドに
相当する DNA フラグメントを配し、又 C 末端側には、
必要に応じスペーサ・ペプチドをコードする DNA フラ
グメントを介して複数個のカルシトニン・アナログに相
当する遺伝子をタンデムに結合し、このようにして得た
二本鎖 DNA フラグメントをプラスミド等のベクターに
組込み、この遺伝子組換えベクターにて微生物、例えば
大腸菌を形質転換させ、この形質転換体を培養すること
により融合蛋白乃至封入体として産生させ、ブロムシア
ンにて処理することにより Met 部分で切断して個々の
フラグメントに分離させると共に各フラグメントの C
末端をHse 又は Hse-ラクトン残基に変化させ、次いで
酸処理を行った後にアンモニアにて処理するか、第 1
級脂肪族アミンと反応させれば、カルシトニン・アナロ
グが得られ、従って廉価に且つ大量に生産する途が開か
れるに至った。
組換え技術を利用する方法に関して研究を重ね、その結
果天然型カルシトニン [但し、アミノ酸配列中にメチオ
ニン(Met) 残基を有している場合には、これを他のアミ
ノ酸残基、例えばバリン(Val) 残基に置き換えたもの]
の C 末端におけるプロリン残基の後に更にメチオニン
残基を配したアミノ酸配列を有するポリペプチドを合成
し、この合成ポリペプチドをブロムシアンにて処理すれ
ば、ポリペプチドはメチオニン部分で切断されると共に
当該メチオニン残基はホモセリン又はホモセリン・ラク
トン残基に変化し、当該 C 末端ホモセリン又はホモセ
リン ・ラクトン残基については高価な C 末端アミド化
酵素を使用しなくとも、酸処理 (例えば 0.1N HCl 中に
おいて、30℃ で 3 時間) を施した後に凍結乾燥させる
ことにより C 末端を全てラクトン型に変換し、更にア
ンモニアにて処理することにより容易にアミド化し得る
ことを見い出した (特開平 4 - 59795)。この公開公報
に開示されているカルシトニン・アナログは、本出願人
会社の研究者がペプチドホルモンの一種であるモチリン
・アナログに関して既に提案した方法 (特開平 3 - 800
96 参照) と同様に、N 末端側のリーダー・ペプチドに
相当する DNA フラグメントを配し、又 C 末端側には、
必要に応じスペーサ・ペプチドをコードする DNA フラ
グメントを介して複数個のカルシトニン・アナログに相
当する遺伝子をタンデムに結合し、このようにして得た
二本鎖 DNA フラグメントをプラスミド等のベクターに
組込み、この遺伝子組換えベクターにて微生物、例えば
大腸菌を形質転換させ、この形質転換体を培養すること
により融合蛋白乃至封入体として産生させ、ブロムシア
ンにて処理することにより Met 部分で切断して個々の
フラグメントに分離させると共に各フラグメントの C
末端をHse 又は Hse-ラクトン残基に変化させ、次いで
酸処理を行った後にアンモニアにて処理するか、第 1
級脂肪族アミンと反応させれば、カルシトニン・アナロ
グが得られ、従って廉価に且つ大量に生産する途が開か
れるに至った。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題乃至発明の目的】しかし
ながら、上記の特開平 4 - 59795 に開示されているカ
ルシトニン・アナログ、例えばサケ I カルシトニン-Hs
e33・NH2 の生理活性は天然型サケ I カルシトニンと同
程度である。従って、本発明の主たる目的は、上記の公
開公報に開示されている発明と同様に生産性において優
れており且つ基本となった天然型カルシトニンよりも生
理活性において著しく優れたカルシトニン誘導体を提供
することにある。本発明の附随的な、但し重要な目的
は、このようなカルシトニン誘導体を有効成分とする、
カルシウム代謝系疾患の予防及び治療剤を提供すること
にある。
ながら、上記の特開平 4 - 59795 に開示されているカ
ルシトニン・アナログ、例えばサケ I カルシトニン-Hs
e33・NH2 の生理活性は天然型サケ I カルシトニンと同
程度である。従って、本発明の主たる目的は、上記の公
開公報に開示されている発明と同様に生産性において優
れており且つ基本となった天然型カルシトニンよりも生
理活性において著しく優れたカルシトニン誘導体を提供
することにある。本発明の附随的な、但し重要な目的
は、このようなカルシトニン誘導体を有効成分とする、
カルシウム代謝系疾患の予防及び治療剤を提供すること
にある。
【０００８】
【課題を解決し目的を達成する手段及び作用】本発明者
等は、上記の目的を達成するために鋭意検討を重ねた結
果、意外にも、天然型カルシトニン類において共通して
おり且つ生理活性の発現に関して必須構造の 1 つであ
ると考えられてきた C 末端のプロリン・アミドをホモ
セリン・アミドに代替することにより、生理活性に著し
い増強がもたらされることが判明し、斯くて本発明を完
成するに至った。
等は、上記の目的を達成するために鋭意検討を重ねた結
果、意外にも、天然型カルシトニン類において共通して
おり且つ生理活性の発現に関して必須構造の 1 つであ
ると考えられてきた C 末端のプロリン・アミドをホモ
セリン・アミドに代替することにより、生理活性に著し
い増強がもたらされることが判明し、斯くて本発明を完
成するに至った。
【０００９】従って、本発明によるカルシトニン誘導体
は、アミノ酸配列 (配列番号 1 に相当) が 5 10 15 Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His- 20 25 30 Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Hse・NH2 (上記の配列中において、Hse・NH2 はアミド化されたホ
モセリン残基を意味し、第 1 番目と第 7 番目のアミノ
酸残基である Cys はジスルフィド結合している)である
ことを特徴としている。
は、アミノ酸配列 (配列番号 1 に相当) が 5 10 15 Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His- 20 25 30 Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Hse・NH2 (上記の配列中において、Hse・NH2 はアミド化されたホ
モセリン残基を意味し、第 1 番目と第 7 番目のアミノ
酸残基である Cys はジスルフィド結合している)である
ことを特徴としている。
【００１０】本発明によるカルシウム代謝系疾患の予防
及び治療剤は、上記のアミノ酸配列を有するカルシトニ
ン誘導体を有効成分としていることを特徴としている。
及び治療剤は、上記のアミノ酸配列を有するカルシトニ
ン誘導体を有効成分としていることを特徴としている。
【００１１】本発明によるカルシトニン誘導体は、上記
のアミノ酸配列において、第 32 番目のアミノ酸が Hse
であるポリペプチドをペプチド・シンセサイザーにて
合成し、次いでフェリシアン化カリウムにて第 1 番目
と第 7 番目のアミノ酸残基である Cys のチオール基を
酸化してジスルフィド結合とし、更に酸処理により得ら
れる C 末端がホモセリン・ラクトンであるペプチドを
更にアンモニアにて処理することにより C 末端をアミ
ド化することにより調製することができる。尚、大量生
産の場合には、既述のモチリン・アナログに関連する手
法 (特開平 3- 80096 公報参照) と同様に、カルシトニ
ンの全配列をコードする DNA に対して N 末端側にリー
ダー・ペプチドに相当する DNA を配し、又 C 末端側に
は、必要に応じスペーサ・ペプチドをコードする DNA
フラグメントを介して複数個のカルシトニン・アナログ
に相当する遺伝子をタンデムに結合し、このようにして
得た二本鎖 DNA フラグメントをプラスミド等のベクタ
ーに組込み、この遺伝子組換えベクターにて微生物、例
えば大腸菌を形質転換させ、この形質転換体を培養する
ことにより融合蛋白乃至封入体として産生させ、ブロム
シアンにて処理することにより Met 部分で切断して個
々のフラグメントに分離させると共に各フラグメントの
C 末端を Hse 又は Hse-ラクトン残基に変化させ、そ
の後は上記のようにフェリシアン化カリウム、酸及びア
ンモニアによる処理を施すことにより得られる。
のアミノ酸配列において、第 32 番目のアミノ酸が Hse
であるポリペプチドをペプチド・シンセサイザーにて
合成し、次いでフェリシアン化カリウムにて第 1 番目
と第 7 番目のアミノ酸残基である Cys のチオール基を
酸化してジスルフィド結合とし、更に酸処理により得ら
れる C 末端がホモセリン・ラクトンであるペプチドを
更にアンモニアにて処理することにより C 末端をアミ
ド化することにより調製することができる。尚、大量生
産の場合には、既述のモチリン・アナログに関連する手
法 (特開平 3- 80096 公報参照) と同様に、カルシトニ
ンの全配列をコードする DNA に対して N 末端側にリー
ダー・ペプチドに相当する DNA を配し、又 C 末端側に
は、必要に応じスペーサ・ペプチドをコードする DNA
フラグメントを介して複数個のカルシトニン・アナログ
に相当する遺伝子をタンデムに結合し、このようにして
得た二本鎖 DNA フラグメントをプラスミド等のベクタ
ーに組込み、この遺伝子組換えベクターにて微生物、例
えば大腸菌を形質転換させ、この形質転換体を培養する
ことにより融合蛋白乃至封入体として産生させ、ブロム
シアンにて処理することにより Met 部分で切断して個
々のフラグメントに分離させると共に各フラグメントの
C 末端を Hse 又は Hse-ラクトン残基に変化させ、そ
の後は上記のようにフェリシアン化カリウム、酸及びア
ンモニアによる処理を施すことにより得られる。
【００１２】
【実施例等】次に製造例、比較製造例、生理活性試験例
及び製剤例により本発明を更に詳細に説明する。比較製造例 (天然型ウナギ・カルシトニンの合成) 下記のアミノ酸配列 (配列番号 : 3 に相当) を有する
ポリペプチドを、アプライド・バイオシステムズ社製の
ペプチド・シンセサイザー 431A にて合成し、トリフル
オロメタンスルホン酸法により脱保護、脱樹脂を行っ
た。尚、合成には、合成終了後の脱保護、脱樹脂によっ
て C 末端にアミドをもたらすベンズヒドリルアミンレ
ジンが用いられた。 Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His- Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro・NH2 合成したポリペプチドの精製は、ウォーターズ社製の
μ-ボンダスフェアーC-18 カラム (19 x 150mm) を用
い、下記の条件で HPLC により行い、その後に凍結乾燥
させた。 溶出液 : 0.012N 塩酸中 20 - 40% のアセトニトリル
直線勾配、45 分間 流速 : 7.0 ml/min 検出波長 : 220nm 得られた凍結乾燥ポリペプチドの内で 60mg を採取して
0.05% 酢酸溶液 60mlに溶解させ、3M アンモニア水に
て pH を 8.5 に調整した後に、0.1M フェリシアン化カ
リウム溶液 1.8ml を添加して室温で 30 分間攪拌する
ことにより第 1番目と第 7 番目のアミノ酸残基である
Cys のチオール基を酸化してをジスルフィド結合とし
た。上記の反応溶液に 50% 酢酸溶液を添加して pH を
5.0 とし、Sephadex G-15 により余剰のフェリシアン化
カリウムを除去した後に、溶出液を凍結乾燥させた。こ
の凍結乾燥品につき、ウォーターズ社製の μ-ボンダス
フェアー C-18 カラム (19 x 150mm) を用い、上記と同
一の条件で HPLC により精製を行うことにより所望の天
然型ウナギ・カルシトニンを得た。このポリペプチドの
同定を FAB-MS 分析により行った処、正しく合成されて
いることが確認された。
及び製剤例により本発明を更に詳細に説明する。比較製造例 (天然型ウナギ・カルシトニンの合成) 下記のアミノ酸配列 (配列番号 : 3 に相当) を有する
ポリペプチドを、アプライド・バイオシステムズ社製の
ペプチド・シンセサイザー 431A にて合成し、トリフル
オロメタンスルホン酸法により脱保護、脱樹脂を行っ
た。尚、合成には、合成終了後の脱保護、脱樹脂によっ
て C 末端にアミドをもたらすベンズヒドリルアミンレ
ジンが用いられた。 Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His- Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro・NH2 合成したポリペプチドの精製は、ウォーターズ社製の
μ-ボンダスフェアーC-18 カラム (19 x 150mm) を用
い、下記の条件で HPLC により行い、その後に凍結乾燥
させた。 溶出液 : 0.012N 塩酸中 20 - 40% のアセトニトリル
直線勾配、45 分間 流速 : 7.0 ml/min 検出波長 : 220nm 得られた凍結乾燥ポリペプチドの内で 60mg を採取して
0.05% 酢酸溶液 60mlに溶解させ、3M アンモニア水に
て pH を 8.5 に調整した後に、0.1M フェリシアン化カ
リウム溶液 1.8ml を添加して室温で 30 分間攪拌する
ことにより第 1番目と第 7 番目のアミノ酸残基である
Cys のチオール基を酸化してをジスルフィド結合とし
た。上記の反応溶液に 50% 酢酸溶液を添加して pH を
5.0 とし、Sephadex G-15 により余剰のフェリシアン化
カリウムを除去した後に、溶出液を凍結乾燥させた。こ
の凍結乾燥品につき、ウォーターズ社製の μ-ボンダス
フェアー C-18 カラム (19 x 150mm) を用い、上記と同
一の条件で HPLC により精製を行うことにより所望の天
然型ウナギ・カルシトニンを得た。このポリペプチドの
同定を FAB-MS 分析により行った処、正しく合成されて
いることが確認された。
【００１３】製造例 ([Hse32-NH2]-ウナギ・カルシトニ
ンの合成) 下記のアミノ酸配列 (配列番号 4 に相当) を有するポ
リペプチドを、アプライド・バイオシステムズ社製のペ
プチド・シンセサイザー 431A にて合成し、トリフルオ
ロメタンスルホン酸法により脱保護・脱樹脂を行った。
尚、合成にはaminomethylated polystyrene・HCl 樹脂
が用いられ、又ホモセリン (Hse) としては N-Boc-O-be
nzyl-L-homoseryl-4-(oxymethyl)phenylacetic acid が
用いられた (Boc : tert-butyloxycarbonyl)。 Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His- Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Hse 合成したポリペプチドの精製は、ウォーターズ社製の
μ-ボンダスフェアーC-18 カラム (19 x 150mm) を用
い、下記の条件で HPLC により行い、その後に凍結乾燥
させた。 溶出液 : 0.012N 塩酸中 20 - 40% のアセトニトリル
直線勾配、45 分間 流速 : 7.0 ml/min 検出波長 : 220nm 得られた凍結乾燥ポリペプチドの内で 60mg を採取して
0.05% 酢酸溶液 60mlに溶解させ、3M アンモニア水に
て pH を 8.5 に調整した後に、0.1M フェリシアン化カ
リウム溶液 1.8ml を添加して室温で 30 分間攪拌する
ことにより第 1番目と第 7 番目のアミノ酸残基である
Cys のチオール基を酸化してをジスルフィド結合とし
た。上記の反応溶液に 50% 酢酸溶液を添加して pH を
5.0 とし、Sephadex G-15 により余剰のフェリシアン化
カリウムを除去した後に、溶出液を凍結乾燥させた。こ
の凍結乾燥品につき、ウォーターズ社製の μ-ボンダス
フェアー C-18 カラム (19 x 150mm) を用い、上記と同
一の条件で HPLC により精製を行い、次いで0.1N HCl
において 30℃ で 3 時間処理した後に凍結乾燥させる
ことにより C末端 の Hse をラクトン型になした。更
に、この凍結乾燥品 1mg 当りアンモニア (Aldrich
製、2.0M solution inmethyl alcohol) を 0.5ml 添加
し、37℃ において 1 時間攪拌することによりC 末端を
アミド化し、次いで減圧乾燥させることにより所望の
[Hse・ラクトン32-NH2]-ウナギ・カルシトニンを得た。
このポリペプチドの同定を FAB-MS 分析により行った
処、正しく合成されていることが確認された。
ンの合成) 下記のアミノ酸配列 (配列番号 4 に相当) を有するポ
リペプチドを、アプライド・バイオシステムズ社製のペ
プチド・シンセサイザー 431A にて合成し、トリフルオ
ロメタンスルホン酸法により脱保護・脱樹脂を行った。
尚、合成にはaminomethylated polystyrene・HCl 樹脂
が用いられ、又ホモセリン (Hse) としては N-Boc-O-be
nzyl-L-homoseryl-4-(oxymethyl)phenylacetic acid が
用いられた (Boc : tert-butyloxycarbonyl)。 Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His- Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Hse 合成したポリペプチドの精製は、ウォーターズ社製の
μ-ボンダスフェアーC-18 カラム (19 x 150mm) を用
い、下記の条件で HPLC により行い、その後に凍結乾燥
させた。 溶出液 : 0.012N 塩酸中 20 - 40% のアセトニトリル
直線勾配、45 分間 流速 : 7.0 ml/min 検出波長 : 220nm 得られた凍結乾燥ポリペプチドの内で 60mg を採取して
0.05% 酢酸溶液 60mlに溶解させ、3M アンモニア水に
て pH を 8.5 に調整した後に、0.1M フェリシアン化カ
リウム溶液 1.8ml を添加して室温で 30 分間攪拌する
ことにより第 1番目と第 7 番目のアミノ酸残基である
Cys のチオール基を酸化してをジスルフィド結合とし
た。上記の反応溶液に 50% 酢酸溶液を添加して pH を
5.0 とし、Sephadex G-15 により余剰のフェリシアン化
カリウムを除去した後に、溶出液を凍結乾燥させた。こ
の凍結乾燥品につき、ウォーターズ社製の μ-ボンダス
フェアー C-18 カラム (19 x 150mm) を用い、上記と同
一の条件で HPLC により精製を行い、次いで0.1N HCl
において 30℃ で 3 時間処理した後に凍結乾燥させる
ことにより C末端 の Hse をラクトン型になした。更
に、この凍結乾燥品 1mg 当りアンモニア (Aldrich
製、2.0M solution inmethyl alcohol) を 0.5ml 添加
し、37℃ において 1 時間攪拌することによりC 末端を
アミド化し、次いで減圧乾燥させることにより所望の
[Hse・ラクトン32-NH2]-ウナギ・カルシトニンを得た。
このポリペプチドの同定を FAB-MS 分析により行った
処、正しく合成されていることが確認された。
【００１４】薬理試験例 (生理活性の測定) 製造例及び比較製造例により得られたポリペプチドを
0.1% 牛血清アルブミン(BSA) 含有 1% 酢酸ナトリウム
緩衝液 (pH 4) に溶解させ、予め前日より絶食させてお
いた Wister 系雄性ラット (6 週齢) の頸静脈より投与
し、1 時間後の血清カルシウム濃度を OCPC 法 (和光純
薬株式会社製の「カルシウム C-テストワコー」を使用)
にて測定した。カルシトニン活性は、標準品としての
ウナギ・カルシトニン (Peninsula Lab. Inc. 製、Lot
No. 015405, 4500 IU/mg) を用いて、2-2 平行用量検定
により活性単位を求め、ポリペプチド 1mg 当りのユニ
ット数を比活性として算出した。結果は下記の表 1 に
示される通りであり、本発明によるカルシトニン誘導体
([Hse32-NH2]-ウナギ・カルシトニン) は、天然型ウナ
ギ・カルシトニン、即ち第 32 番目のアミノ酸が Pro-N
H2 であるものと比較して生理活性の著しく高いことが
判明した。
0.1% 牛血清アルブミン(BSA) 含有 1% 酢酸ナトリウム
緩衝液 (pH 4) に溶解させ、予め前日より絶食させてお
いた Wister 系雄性ラット (6 週齢) の頸静脈より投与
し、1 時間後の血清カルシウム濃度を OCPC 法 (和光純
薬株式会社製の「カルシウム C-テストワコー」を使用)
にて測定した。カルシトニン活性は、標準品としての
ウナギ・カルシトニン (Peninsula Lab. Inc. 製、Lot
No. 015405, 4500 IU/mg) を用いて、2-2 平行用量検定
により活性単位を求め、ポリペプチド 1mg 当りのユニ
ット数を比活性として算出した。結果は下記の表 1 に
示される通りであり、本発明によるカルシトニン誘導体
([Hse32-NH2]-ウナギ・カルシトニン) は、天然型ウナ
ギ・カルシトニン、即ち第 32 番目のアミノ酸が Pro-N
H2 であるものと比較して生理活性の著しく高いことが
判明した。
【００１５】
【表１】
【００１６】製剤例 製造例 によるカルシトニン誘導体 (100IU) に、ペプチ
ド・ホルモン系製剤に汎用される添加剤及び安定化剤を
加えて溶解し、凍結乾燥した。この凍結乾燥製剤は用時
には生理食塩水に溶解せしめられる。尚、使用されるカ
ルヒトニン誘導体の活性単位は 10 - 200IU 程度の範囲
内で設定することができ、添加剤及び安定化剤としては
血清アルブミン等のペプチド、蛋白等を使用することが
できる。
ド・ホルモン系製剤に汎用される添加剤及び安定化剤を
加えて溶解し、凍結乾燥した。この凍結乾燥製剤は用時
には生理食塩水に溶解せしめられる。尚、使用されるカ
ルヒトニン誘導体の活性単位は 10 - 200IU 程度の範囲
内で設定することができ、添加剤及び安定化剤としては
血清アルブミン等のペプチド、蛋白等を使用することが
できる。
【００１７】
【発明の効果】本発明によるカルシトニン誘導体である
[Hse32-NH2]-ウナギ・カルシトニンは、天然型ウナギ
・カルシトニン、即ち第 32 番目のアミノ酸がアミド化
プロリン (Pro-NH2) であるものと比較して生理活性が
著しく高く、又遺伝子工学的手法を用いれば廉価に且つ
大量に製造することができる。従って、本発明はカルシ
ウム代謝系疾患の予防及び治療剤の有効成分として利用
する上で極めて優れている。
[Hse32-NH2]-ウナギ・カルシトニンは、天然型ウナギ
・カルシトニン、即ち第 32 番目のアミノ酸がアミド化
プロリン (Pro-NH2) であるものと比較して生理活性が
著しく高く、又遺伝子工学的手法を用いれば廉価に且つ
大量に製造することができる。従って、本発明はカルシ
ウム代謝系疾患の予防及び治療剤の有効成分として利用
する上で極めて優れている。
【配列表】配列番号 : 1 配列の長さ : 32 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 両形態 配列の種類 : ペプチド 配列 Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His- 5 10 15 Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Xaa 20 25 30 Xaa : ホモセリン・ラクトン・アミド (Hse・lactone-NH2) 配列番号 : 2 配列の長さ : 32 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 両形態 配列の種類 : ペプチド 配列 Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn- 5 10 15 Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro・NH2 20 25 30 配列番号 : 3 配列の長さ : 32 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : ペプチド 配列 Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His- 5 10 15 Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro・NH2 20 25 30 配列番号 : 4 配列の長さ : 32 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : ペプチド 配列 Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His- 5 10 15 Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Xaa 20 25 30 Xaa : ホモセリン (Hse)
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 富谷 昇 愛知県名古屋市東区東外堀町35番地 株式 会社三和化学研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 アミノ酸配列 (配列番号 1 に相当) が 5 10 15 Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His- 20 25 30 Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Hse・NH2 (上記の配列中において、Hse・NH2 はアミド化されたホ
モセリン残基を意味し、第 1 番目と第 7 番目のアミノ
酸残基である Cys はジスルフィド結合している)である
ことを特徴とする、カルシトニン誘導体。 - 【請求項２】 請求項 1 に記載のカルシトニン誘導体
を有効成分としていることを特徴とする、カルシウム代
謝系疾患の予防及び治療剤。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6138618A JPH083196A (ja) | 1994-06-21 | 1994-06-21 | カルシトニン誘導体及びその用途 |
| EP95109138A EP0694561A1 (en) | 1994-06-21 | 1995-06-13 | Calcitonin analogue and use thereof |
| US08/490,669 US5536812A (en) | 1994-06-21 | 1995-06-15 | Calcitonin analogue and use thereof |
| CN95107036A CN1120549A (zh) | 1994-06-21 | 1995-06-20 | 降钙素类似物及其应用 |
| KR1019950016580A KR960000921A (ko) | 1994-06-21 | 1995-06-21 | 칼시토닌 유도체 및 그 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6138618A JPH083196A (ja) | 1994-06-21 | 1994-06-21 | カルシトニン誘導体及びその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH083196A true JPH083196A (ja) | 1996-01-09 |
Family
ID=15226293
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6138618A Pending JPH083196A (ja) | 1994-06-21 | 1994-06-21 | カルシトニン誘導体及びその用途 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5536812A (ja) |
| EP (1) | EP0694561A1 (ja) |
| JP (1) | JPH083196A (ja) |
| KR (1) | KR960000921A (ja) |
| CN (1) | CN1120549A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021032701A (ja) * | 2019-08-23 | 2021-03-01 | 株式会社島津製作所 | 分析用試料の調製方法、分析方法および分析用試料の調製用キット |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6085599A (en) * | 1995-04-26 | 2000-07-11 | Feller; Murray F. | Magnetic flow sensor |
| CN1064051C (zh) * | 1997-04-30 | 2001-04-04 | 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 | 不含二硫键的鲑鱼和鳗鱼降钙素类似物及其制备方法 |
| AU4401097A (en) * | 1997-09-18 | 1999-04-05 | Hyundai Pharm. Ind. Co., Ltd. | Amino acid derivatives |
| US6417249B1 (en) | 1997-10-31 | 2002-07-09 | Hewlett-Packard Company | Ink-jet printing ink compositions having superior smear-fastness |
| US5948978A (en) * | 1998-07-14 | 1999-09-07 | Feller; Murray F. | Induction heated mass flow sensor |
| US6508134B1 (en) | 1999-09-01 | 2003-01-21 | Murray F. Feller | Transit-time flow sensor-frequency mode |
| EP2389388B1 (en) * | 2009-01-22 | 2017-03-08 | KeyBioscience AG | Treatment for obesity |
| EP2762150A1 (en) | 2009-03-12 | 2014-08-06 | Nordic Bioscience A/S | Treatment of Diabetes and Metabolic Syndrome |
| BR112014010701A2 (pt) | 2011-11-02 | 2020-06-23 | Keybioscience Ag | Uso de um peptídeo |
| US9533022B2 (en) | 2011-11-02 | 2017-01-03 | KeyBioscience A/S | Peptide analogs for treating diseases and disorders |
| CN106880834A (zh) * | 2017-02-17 | 2017-06-23 | 云南同方科技有限公司 | 一种用于缓解高血压症状的植物精油复合物及制备方法 |
| CN106880835A (zh) * | 2017-02-17 | 2017-06-23 | 云南同方科技有限公司 | 用于缓解高血压症状的植物精油复合物制备及应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4652627A (en) * | 1985-08-16 | 1987-03-24 | Kempe Tomas G | Calcitonin analogs with C-terminal D-amino acid substituents |
| JP2753274B2 (ja) | 1988-08-24 | 1998-05-18 | 株式会社三和化学研究所 | モチリン様ポリペプチドの製法並びにそのための組換えｄｎａ及び発現用プラスミド |
| BR8907788A (pt) * | 1988-11-22 | 1991-08-27 | Jarmo Uotila | Dispositivo e rede para reduzir e/ou parar o movimento de um veiculo terrestre |
| JPH0722517B2 (ja) | 1989-08-24 | 1995-03-15 | 株式会社三和化学研究所 | モチリン様ポリペプチドの製法並びにそのための組換えｄｎａ及び発現用プラスミド |
| US5175146A (en) * | 1989-12-05 | 1992-12-29 | Vical, Inc. | Synthetic calcitonin peptides |
| JPH0459795A (ja) | 1990-06-26 | 1992-02-26 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | カルシトニン様活性を有するポリペプチド誘導体及びその用途 |
-
1994
- 1994-06-21 JP JP6138618A patent/JPH083196A/ja active Pending
-
1995
- 1995-06-13 EP EP95109138A patent/EP0694561A1/en not_active Withdrawn
- 1995-06-15 US US08/490,669 patent/US5536812A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-20 CN CN95107036A patent/CN1120549A/zh active Pending
- 1995-06-21 KR KR1019950016580A patent/KR960000921A/ko not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021032701A (ja) * | 2019-08-23 | 2021-03-01 | 株式会社島津製作所 | 分析用試料の調製方法、分析方法および分析用試料の調製用キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0694561A1 (en) | 1996-01-31 |
| CN1120549A (zh) | 1996-04-17 |
| US5536812A (en) | 1996-07-16 |
| KR960000921A (ko) | 1996-01-25 |
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