JP2000512137A - レプチン（ｏｂタンパク質）のフラグメント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 実質的にエネルギー利用を調節する、体重を調節するペプチドまたはその機能的誘導体、類似体または変異体、このような化合物を含有する医薬組成物、このような化合物の調製法およびこのような化合物の医薬における使用。

Description

【発明の詳細な説明】 レプチン（ｏｂタンパク質）のフラグメント 本発明は新規化合物、特に新規ペプチド、このような化合物を含有する医薬組 成物およびこのような化合物の医療における使用に関する。 体内における食物摂取対エネルギー出力のエネルギーバランスの生理学的調節 のメカニズムは、長年にわたって議論の対象であった。最近のネイチャーにおけ る開示において、Ｙ．Zhangら［Nature、３７２、４２５−４３１、１９９４］ はエネルギーバランス調節において重要な役割を果たす分子の一つはｏｂタンパ ク質であることを示唆している。Zhangらはさらに、マウスおよびヒトの両方の ｏｂ遺伝子タンパク質またはレプチンのクローニングおよび配列化を報告してい る。 ヒトレプチン（またはヒトｏｂタンパク質）の構造およびその動物の体重調節 における使用が英国特許出願公開番号ＧＢ２２９２３８２に開示されている。こ の出願はまた、体重の調節が可能といわれているレプチンの特定のフラグメント を開示している。 Collinsら［Nature、第３８０巻、６７７ページ、１９９６］はレプチンの減 量性はエネルギー利用の向上ならびに食物摂取の減少により説明できると開示し ている。 本発明者らは、意外にも、エネルギー利用を向上させることにより実質的に体 重を調節することが証明されるレプチンのある種の新規フラグメントを見いだし た。これらのフラグメントはしたがって栄養障害および代謝障害、特に肥満およ び糖尿病の治療において特に有用であると考えられる。 したがって、第一の態様において、本発明は実質的にエネルギー利用を調節す る手段の、体重を調節するペプチドまたはその機能的誘導体、類似体または変異 体を提供する。 好ましくは、体重の調節とは減量のことである。 好ましくは、エネルギー利用の調節はエネルギー利用の向上による。 好ましくは、ペプチドはｏｂタンパク質、特にヒトｏｂタンパク質、またはそ の機能的誘導体、類似体または変異株のフラグメントである。 以下、タンパク質フラグメント（またはペプチド）は、ヒトｏｂタンパク質の アミノ酸配列を参照して、以下のような略号を用いて言及する：「１ないし６個 のアミノ酸残基からなるタンパク質フラグメント」は「ｏｂ１−６」と略記する 。 個々のペプチドは、ｏｂ２１−２６（ＭＶＰＩＱＫ）、ｏｂ２７−３２（ＶＱ ＤＤＴＫ）、ｏｂ３３−３６（ＴＬＩＫ）、ｏｂ３７−４１（ＴＩＶＴＲ）、ｏ ｂ４２−５４（ＩＮＤＩＳＨＴＱＳＶＳＳＫ）、ｏｂ５５−５６（ＱＫ）、ｏｂ ５７−７４（ＶＴＧＬＤＦＩＰＧＬＨＰＩＬＴＬＳＫ）、ｏｂ９３−１０５（Ｎ ＶＩＱＩＳＮＤＬＥＮＬＲ）、ｏｂ１０６−１１５（ＤＬＬＨＶＬＡＦＳＫ）、 ｏｂ１１６−１４９（ＳＣＨＬＰＷＡＳＧＬＥＴＬＤＳＬＧＧＶＬＥＡＳＧＹＳ ＴＥＶＶＡＬＳＲ）およびｏｂ１５０−１６７（ＬＱＧＳＬＱＤＭＬＷＱＬＤＬ ＳＰＧＣ）、特にｏｂ５７−７４（ＶＴＧＬＤＦＩＰＧＬＨＰＩＬＴＬＳＫ）を 包含する。 適当には、本発明はいずれかの１またはそれ以上の前記した個々のペプチドか ら形成されるペプチドを包含する。 好ましくは、本発明は前記した個々のペプチドのいずれかの２つの連続した要 素から形成されるペプチドを包含する。 すでに記載したように、本発明はさらに、本明細書において記載したペプチド の機能的誘導体、類似体および変異株にも及ぶ。 機能的誘導体は、本明細書において記載したペプチドの塩および溶媒和物を包 含し、さらに、タンパク質の物理学的性質、例えば安定性、または治療的性質、 例えば薬物動態学的性質を向上させるような基または部分の結合により化学的に 修飾された本発明のペプチドも包含する。 機能的類似体は、本明細書に記載のペプチドの１またはそれ以上のアミノ酸が 別のアミノ酸と置換している機能的類似ペプチドを包含する。 別のアミノ酸は、ｏｂタンパク質におけるアミノ酸に対して代替的立体化学的 性質を有するアミノ酸を包含する。 機能的類似体はさらに、本明細書において記載するペプチドの小分子アゴニス ト またはアンタゴニストを包含する。このような化合物はの公知操作、例えばＧＢ ２２９２３８２に開示されている操作にしたがって調製し、試験することができ る。 塩は医薬上許容される塩、特に医薬上許容される酸付加塩を包含する。 ペプチドの酸付加塩は、親化合物および過剰量の酸、例えば塩酸、臭化水素酸 、硫酸、リン酸、酢酸、マレイン酸、琥珀酸またはメタンスルホン酸から、適当 な溶媒中、標準的方法を用いて調製される。酢酸塩の形態が特に有用である。化 合物の中には許容できる内部塩または両性イオンを形成するものもある。カチオ ン性塩は親化合物を過剰のアルカリ性試薬、例えば適当なカチオンを含む水酸化 物、炭酸塩またはアルコキシドで処理することにより調製される。Na⁺、Ｋ⁺、Ca²⁺ およびＮＨ₄ ⁺などのカチオンは医薬上許容される塩中に存在するカチオンの例 である。 溶媒和物は、医薬上許容される溶媒和物、例えば水和物を包含する。 本発明は、ペプチドおよび非ペプチド化合物の両方を包含すると理解される。 加えて、本発明は特定のペプチドｏｂ２１−２６、ｏｂ２７−３２、ｏｂ３３ −３６、ｏｂ３７−４、ｏｂ４２−５４、ｏｂ５５−５６、ｏｂ５７−７４、ｏ ｂ９３−１０５、ｏｂ１０６−１１５、ｏｂ１１６−１４９およびｏｂ１５０− １６７、特にｏｂ５７−７４のサブフラグメント;または前記ペプチドの１また はそれ以上、特にいずれかの２つの連続する成分から形成されるペプチド:また はその機能的誘導体、類似体または変異株を包含する。 適当なペプチドまたはサブフラグメントは少なくとも４個のアミノ酸を有する 。 本発明のペプチドは、適当には、通常の消化法の使用、合成技術または標準的 発現法の使用により調製される。 このように、さらに別の態様において、本発明はペプチド、またはその機能的 誘導体の製法であって、以下の工程： ペプチド、特に、ｏｂタンパク質、特にヒトｏｂタンパク質を少なくとも２つ のペプチドフラグメントに加水分解し； そのペプチドフラグメントを分離し； その後、所望によりその機能的誘導体を調製してもよい ことからなる方法を提供する。 タンパク質の加水分解は、例えばトリプシンを用いた酵素消化により行うのが 適当である。 必要なペプチドの分離は通常適当なクロマトグラフィー手段、例えばカラムク ロマトグラフィーの使用により行う。 ｏｂタンパク質の処理に関する反応条件は、これらが必要とされる生成物の安 定性と相応するものとして、用いた特定の試薬により決定され、例えば、トリプ シンが試薬である場合、反応は通常２５−４０℃の温度範囲内および７−９のｐ Ｈ範囲内で、好ましくは３７℃、ｐＨ７.４で行う。 記載したように、本発明のペプチドはさらに通常の合成法、例えば液相または 固相ペプチド合成の使用により調製される。 したがって、本発明は、実質的にエネルギー利用を調節する手段である、体重 を調節する合成ペプチドまたはその機能的誘導体、類似体または変異体を提供す る。 本明細書において記載するいずれのペプチドも合成ペプチドとして本発明の一 部を形成する。 本発明に関連するタンパク質のペプチド結合単位は標準的ペプチド合成技術に より、ペプチド合成器［Atherton，E.およびSheppard，R.C.(編)（１９８９）So lid Phase Peptide Synthesis:Apractical approach（LRL Press，Oxford）］を 用いて、続いて直接ジスルフィドまたはアミド結合形成に適した操作にしたがっ て調製できる。 周知のペプチド合成法は、Aliら、J.Med.Chem.、２９：９８４（１９８６）お よびJ.Med.Chem.、３０：２２９１（１９８７）に記載されており、それを出典 明示により本発明の一部とする。好ましくは、ペプチドはMerrifieldの固相技術 ［J.Am.Chem.Soc.、８５：２１４９（１９６４）］により調製される。しかしな がら、ジ−、トリ−、テトラ−またはペンタ−ペプチドフラグメントが固相合成 により調製され、液相合成により結合されるかまたはさらに修飾される収斂合成 におけるように、固相および液相合成の組み合わせも用いられる。 合成中、側鎖官能基（例えば、−ＮＨ₂、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ）はカ ップリング反応中保護される。通常、α−アミノ基は一時的にフルオレニルメト キシ カルボニル（Fmoc）として保護されるが、他の易酸性または易塩基性保護基、例 えばｔ−ブトキシカルボニル（Boc）を用いることができる。リシンのアミノ側 鎖基はｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルまたはp−クロロベ ンジルオキシカルボニル（ＺまたはCl-Ｚ）として保護される。アセトアミドメ チル、トリチル、ｔ−ブチル、Ｓ−ｔ−ブチルまたはパラ−メチルベンジル（ｐ -MBz）保護をシステインについて用いる。ヒドロキシ基はブチルまたはベンジル エーテルとして保護し、カルボキシル基はブチル、ベンジル（Bz）またはシクロ ヘキシルエステルとして保護する。 ペプチドは、Ｃ−末端またはＮ−末端のいずれか、好ましくは前者から合成で きる。カップリングの前に、（適宜保護されたアミノ酸の）アルファーカルボキ シル基を活性化する。当業者は、多くの方法で保護された基を活性化できる。例 えば、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、２−(１Ｈ-ベン ゾトリアゾール−１−イル)−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサ フルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ｐ−ニトロフェニルエステル（pNp）、ヒ ドロキシベンゾトリアゾールエステル（ＨＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ ミジルエステル（ＯＳｕ）の混成無水物または対称無水物を用いてもよい。 ペプチドの液相合成は、アミド結合を形成する常法を用いて行う。典型的には 、遊離カルボキシル基を有する保護したBoc−アミノ酸を適当なカルボジイミド カップリング剤、例えばＮ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を 用いて、所望により１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）およびジメ チルアミノピリジン（ＤＭＡＰ)の存在下で遊離アミノ基を有する保護されたア ミノ酸と結合させる。 液相合成において、カップリング反応は好ましくは低温（例えば、−２０℃） で、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチル ピロリドン（ＮＭＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）アセトニトリル（ＡＣＮ ）またはジオキサンなどの溶媒中で行う。 固相法を用いる場合、ペプチドをカルボキシ末端から出発して、ペプチドのア ミノ末端へ向かって連続的に構築する。固相合成は保護されたアミノ酸のＣ末端 を、 ４−（２',４'−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル）−フェノキシ樹脂 ［リンクアミド樹脂、H.Rink、Tetrahedron Letters、２８、３７８７（１９８ ７）］、４-ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂［ワン樹脂、S.S.Wang、JAC S、９５、１３２８（１９７３）］または４−ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸 樹脂などの適当な樹脂に共有結合させることにより開始する。 固相合成においては、第一アミノ酸残基を不溶性ポリマーに結合させるのが一 般的である。例えば、２種の通常用いられるポリマーは、ポリスチレン（ジビニ ルベンゼンと１％架橋）および１％架橋したポリアクリルアミドである。これら のポリマーは、標的ペプチドの第一アミノ酸（すなわちカルボキシ末端）に結合 する反応性基、例えば−ＯＨ、−ＮＨ₂および−ＣＨ₂Ｃｌを含むような官能基導 入されている。第一アミノ酸とポリマー間の結合の選択は、ペプチドのカルボキ シ末端により支配される。例えば、Ｃ−末端にカルボキシル基を有するペプチド は、エステル結合により結合し、カルボキシアミドで終わるペプチドについては アミド結合を有する。 第一の保護されたアミノ酸が望ましい樹脂と結合したら、アミノ保護基を、ピ ペリジンなどの第二アミンでの処理により除去し、次の（保護された）アミノ酸 の遊離カルボキシルをこのアミノ基と結合させる。このプロセスは、中間体の単 離を行わず連続して、目的とするペプチドが形成されるまで行う。完成されたペ プチドを次にいずれかの順で脱ブロックおよび／または樹脂からの開裂に付す。 カップリング反応についての好ましい溶媒は、これに限定されないが、ジクロ ロメタン（ＤＣＭ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびＮ−メチルピロリ ドン（ＮＭＰ）を包含する。所望の配列が合成された後、ペプチドを脱保護し、 トリフルオロ酢酸またはトリフルオロメタンスルホン酸を用いて樹脂から開裂さ せる。 支持樹脂からのペプチドの開裂についての好ましい方法は、樹脂に支持される ペプチドをトリフルオロ酢酸で適当なカチオンおよびカルボニウムイオンスカベ ンジャー、例えばフェノール、アニソール、チオアニソール、エタンジチオール 、水またはエチルメチルスルフィドの存在下で処理することである。 本発明の化合物を得るために、合成ペプチドを当業界で周知の方法を用いて環 化 ／カップリングする。 例えば、共にシステイン残基を含有する２つの線状ペプチドのジスルフィド結 合によるカップリングは、一方の鎖上の遊離チオールと他方の鎖上の適宜活性化 されたシステイン誘導体との反応により選択的に達成される。置換可能な保護基 として特に有用である基はＳ−（カルボメトキシ−スルフェニル）誘導体である 。この方法は、例えば、両方の線状ペプチドのシステイン残基をアセトアミドメ チル（Acm）基で保護することである。一方の鎖を酢酸水銀（II）で処理し、続 いてベータメルカプトエタノールで処理して、アセトアミドメチル保護基を除去 する。第二の鎖をカルボメトキシスルフェニルクロリドで処理して、活性化種を 得る。２つのペプチドをｐＨが約７ないし８の希水溶液中で攪拌すると、カルボ メトキシスルフェニル基の置換と鎖間ジスルフィドの形成が起こる。 分子内ジスルフィドを形成しようとするならば、対応する線状ペプチドを完全 に脱保護し、ジメルカプタンとして生成することができる。ジメルカプタンをジ スルフィドに変換できる当業界で公知のいずれの酸化剤を用いてもよい。このよ うな試薬の例は、アルカリ金属フェリシアン化物（例えば、フェリシアン化カリ ウムまたはナトリウム）、酸素、ジョードメタンまたはヨウ素である。反応は適 当な不活性溶媒、例えば水性メタノールまたは水中、約０ないし４０℃の温度で 、高希釈下で行われる。ｐＨは通常約７ないし８に維持する。ペプチドが依然と して支持樹脂に結合しているか、または他の官能基が依然として保護されたまま でペプチドに対して環化を行ってもよいが、好ましくは保護基を除去した遊離ペ プチドに対して行う。 ２つのジスルフィドが２つの線状ペプチド間に形成されることになっている場 合には、２種のシステインチオール保護基、例えばAcmおよびトリチルを用いる ことができる。各ペプチドは、結合させる一対のシステインがトリチル基で、他 の一対がAcmで保護されるように配置された各種の一方を含有する。トリチル基 を各ペプチドから独立して除去し、一方のペプチド上のチオールを２,２'−ジピ リジルジスルフィドで活性化し、ついで他のモノチオールペプチドを添加するこ とによりカップリングさせてビス（Ｓ−アセトアミド−メチル）ジスルフィド結 合ペプチドを得ることのできる、２つの別個のモノチオール誘導体を得る。第二 のジスルフィドは、 この生成物をKamber［B.Kamber、Helv.Chim.Acta、５４、９２７（１９７１）］ およびKamberら［B.Kamberら、Helv.Chim.Acta、６３、８９９、（１９８０）］ により記載されたような直接的ヨウ素酸化により得ることができる。 ペプチド鎖は、さらに−ＮＨ(ＣＨ₂)_nＣＯ−などの結合基を用いてカップリン グできる。これは対応するアミノ酸（ＮＨ₂(ＣＨ₂)_nＣＯＯＨ）のＮ^a−Fmoc誘導 体を用い、これを通常の固相合成中に成長するペプチド鎖中に組み込むことによ り最も容易に達成される。グルタミン酸などの酸性アミノ酸の側鎖カルボキシル およびリシンなどの塩基性アミノ酸の側鎖アミノを用いてペプチド鎖をカップリ ングするのに同様の方法を用いることができる。この場合、以下のＮ⁶−ｇグル タミルリシン誘導体などの化合物を通常の固相合成中に成長するペプチド鎖中に 組み込んでもよい。成長するペプチド鎖へのカップリングはグルタミン酸残基のカルボキシルを介し てなされ、リシンのアミノ基上のFmoc基の除去は別のアミノ酸を添加するための 出発点を供給する。 別法として、Ｎ^a−トリチル保護基をグルタミン酸残基上に用いることができ 、カップリング後、これを８０％酢酸で除去し、無水酢酸でＮ−アセチル化する 。さ らなるカップリングを前記のようにして進行させることができる。 アミノ保護基を無水酢酸で除去してプロテイン化した遊離アミノをアセチル化 することによりＮ−末端Ｎ−アセチル基を導入することができる。Ｃ−末端カル ボキシアミド基は、Rinkアミド樹脂などの適当な固相合成樹脂を使用することに より得られる。 記載したように、本発明のペプチドはさらに組換えＤＮＡ技術を用いてポリペ プチド配列をコードするＤＮＡの発現により調製される。 したがって、本発明は、実質的にエネルギー利用を調節する手段である、体重 を調節する組換えペプチドまたはその機能的誘導体、類似体または変異体にも及 ぶ。 本明細書において記載するいずれのペプチドも組換えペプチドとして本発明の 一部を形成する。 さらなる態様において、本発明は、本発明に係る化合物の製法であって、組換 え宿主細胞にて該化合物をコードするＤＮＡを発現し、産物を回収することから なる方法を提供する。 該化合物をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリマーも本発明の一部 を形成する。 本発明の方法は、Maniatisら、Molecular Cloning−A Laboratory Manual;Col d Spring Harbor，１９８２およびＤＮＡ Cloning、第I、IIおよびIII巻(D.M.Gl over編、IRL Press Ltd)に記載されているような通常の組換え技術により行われ る。 特に、該方法は： i）宿主細胞において，該化合物をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮ Ａポリマーの発現能を有する複製可能な発現ベクターを調製し； ii）宿主細胞を該ベクターで形質転換し； iii）該形質転換された宿主細胞を該ＤＮＡの発現を可能とする条件下で培養 して該化合物を産生し；および iv）該化合物を回収する 工程からなる。 本発明はさらに適当なモノ−、ジ−またはオリゴマーヌクレオチド単位の縮合 に よりＤＮＡポリマーを調製する方法も提供する。 調製は化学的、酵素的または２つの方法の組み合わせにより、適宜インビトロ またはインビボで行う。このように、ＤＮＡポリマーは、適当なＤＮＡフラグメ ントの酵素的処理により、例えばD.M.Robertsら、Biochemistry、１９８５、２ ４、５０９０−５０９８に記載されているような常法により調製される。 ＤＮＡフラグメントは、必要なヌクレオチド配列を含有するＤＮＡを適当な制 限酵素で消化するか、化学合成によるか、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型上で酵素重合 に付すか、またはこれらの方法の組み合わせにより得られる。ＤＮＡフラグメン トの全合成を用いることが好ましいであろう。 制限酵素での消化は、適当な緩衝液中、２０−７０℃の温度で、好ましくは５ ０ｍｌ以下の体積で、０.１−１０ｍｇのＤＮＡを用いて行われる。 ＤＮＡの酵素重合は、インビトロで、必要ならばヌクレオチド三リン酸ｄＡＴ Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含有する適当な緩衝液中、１０−３７ ℃の温度で、５０ｍｌ以下の体積中でＤＮＡポリメラーゼＩ（Klenowフラグメン ト）などのＤＮＡポリメラーゼを用いて実施することができる。 ＤＮＡフラグメントの酵素ライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどの適当 なＤＮＡリガーゼを用いて適当な緩衝液中、４℃ないし常温で５０ｍｌ以下の体 積で実施することができる。 ＤＮＡポリマーまたはフラグメントの化学合成は、通常のホスホトリエステル 、ホスファイトまたはホスホルアミジト化学反応により、「Chemical and Enzyma tic Synthesis of Protein Fragments−A Laboratory Manual」（H.G.Gassenおよ びA.Lang編）、Verlag Chemie，Weinheim（１９８２）または他の科学出版物、 例えば，M.J.Gait、H.W.D.Matthes、M.Singh、B.S.SproatおよびR.C.Titmas、Nu cleic Acids Research、１９８２、１０、６２４３；B.S.SproatおよびＷ.Bannw arth、Tetrahedron Letters、１９８３、２４、５７７１；M.D.Matteucciおよび M.H.Caruthers、Tetrahedron Letters、１９８０、２１、７１９；M.D.Matteucc iおよびM.H.Caruthers、Journal of the American Chemical Society、１９８１ 、１０３、３１８５；S.P.Adamsら、Joumal of the American Chemical Society、１９８３、１０５、６６１；N.D.Sinha、J.Biernat、J.McMannusおよ びH.Koester、Nucleic Acids Research、１９８４、１２、４５３９;およびH.D. Matthesら、EMBO Journal、１９８４、３、８０１］に記載されているような固 相技術を用いて行われる。好ましくは、自動化ＤＮＡ合成器を採用する。 ＤＮＡポリマーは、好ましくは、該化合物をコードするＤＮＡ配列を一緒に含 む２またはそれ以上のＤＮＡ分子のライゲーションにより調製する。 ＤＮＡ分子は、必要なコーディング配列を有するベクターの適当な制限酵素で の消化により得られる。 ＤＮＡ分子の正確な構造およびこれを得る方法は、望ましい生成物の構造に依 存する。該化合物をコードするＤＮＡ分子の構築についての適当な方法のデザイ ンは、当業者にとっては慣例的なことである。 組換え宿主において該化合物をコードするＤＮＡポリマーの発現は、宿主細胞 中でＤＮＡポリマーを発現できる複製可能な発現ベクターにより行われる。発現 ベクターは新規であり、さらに本発明の一部を形成する。 複製可能な発現ベクターは、本発明にしたがって、宿主細胞と適合できるベク ターを開裂させて無傷なレプリコンを有する線状ＤＮＡセグメントを得、その線 状セグメントを該線状セグメントと一緒になって該化合物をコードする１または それ以上のＤＮＡ分子とライゲーション条件下で結合させることにより調製され る。 線状セグメントと１以上のＤＮＡ分子のライゲーションは、所望により同時に または連続して行われる。 このように、ＤＮＡポリマーは所望により予め形成されていてもよくまたはベ クターの構築中に形成されてもよい。 ベクターの選択は、いくらかは、イー・コリ（E.Coli）などの原核細胞、ある いはマウスＣ１２７、マウス骨髄腫、チャイニーズ・ハムスター卵巣、真菌、例 えば線状真菌もしくは単細胞酵母またはショウジョウバエなどの昆虫細胞などの 真核細胞である宿主細胞により決定されるであろう。宿主細胞はさらにトランス ジェニック動物におけるものであってもよい。適当なベクターは、プラスミド、 バクテリオファージ、コスミッドおよび例えばバクロウイルスまたはワクシニア 由来の組換え ウイルスを包含する。 複製可能な発現ベクターの調製は、ＤＮＡを適当な制限酵素、重合およびライ ゲーションに付して、例えばManiatisら（前掲）に記載されている操作により慣 用的に実施することができる。重合およびライゲーションはＤＮＡポリマーの調 製に関して前記されているようにして行う。制限酵素での消化は、適当な緩衝液 中、２０−７０℃の温度で、５０ｍｌ以下の体積で、０.１−１０ｍｇのＤＮＡ を用いて行われる。 組換え宿主細胞は、本発明にしたがって、宿主細胞を本発明の複製可能な発現 ベクターで形質転換条件下で形質転換することにより調製される。適当な形質転 換条件は通常のものであり、例えば、Maniatisら（前掲）または「ＤＮＡ Cloni ng」第II巻、D.M.Glover編、IRL Press Ltd．１９８５に記載されている。 形質転換条件の選択は、宿主細胞により決定される。したがって、イー・コリ などの細菌宿主はCaCl₂の溶液で処理するか［Cohenら、Proc.Nat.Acad.Sci.、１ ９７３、６９、２１１０］、またはRbCl、MnCl₂、酢酸カリウムおよびグリセロ ールの混合物を含む溶液で処理し、次に３−［Ｎ-モルホリノ］−プロパン−ス ルホン酸、RbClおよびグリセロールで処理してもよい。培養物中の哺乳動物細胞 は細胞上へのベクターＤＮＡのカルシウム共沈降により形質転換される。 本発明はさらに、本発明の化合物を含むベクターにも及ぶ。 本発明はさらに、本発明の複製可能な発現ベクターで形質転換された宿主細胞 にも及ぶ。 形質転換された宿主細胞の、ＤＮＡポリマーの発現が可能な条件下での培養は 、一般に、例えばManiatisらおよび「ＤＮＡ Cloning」（前掲）に記載されてい るように実施する。このように、好ましくは細胞に栄養を供給し、４５℃より低 い温度で培養する。 発現産物を宿主細胞に応じて常法により回収する。かくして、宿主細胞が細菌 、例えばイー・コリである場合、これを物理的、化学的または酵素的に溶解し、 タンパク産物を得られた溶菌液から単離する。産物が細菌細胞から分泌される場 合、これは周辺腔または栄養培地から回収される。宿主細胞が哺乳動物である場 合、産物 を栄養培地から単離する。 ＤＮＡポリマーは、例えばウシ乳頭腫ウイルスベクターまたはチャイニーズハ ムスター卵巣細胞において増幅されたベクターを発現する安定な形質転換哺乳類 細胞系を単離するために設計されたベクターにて組み立てられる［ＤＮＡ Cloni ng第II巻、D.M.Glover編、IRL Press１９８５；Kaufman，R.J.ら、Molecular an d Cellular Biology，５、１７５０−１７５９、１９８５;Pavlakis G.N.および Hamer，D.H.、Proceedings of the National Academy of Sciences（ＵＳＡ）、 ８０、３９７−４０１、１９８３；Goeddel，D.V.ら、ヨーロッパ特許出願第０ ０９３６１９（１９８３）］。 必要ならば前記した方法を用いて調製したペプチドを種々の技術により精製す ることができる。好ましい具体例は、ゲル濾過、クロマトグラフィー、逆相ＨＰ ＬＣおよび結晶化を包含し、特にクロマトグラフィーが用いられる。ついで、精 製された生成物を、純度について、ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、アミノ酸配列決定 および高速原子衝撃および／または電子噴射質量分析を用いて分析できる。 本明細書において記載したタンパク質の機能的誘導体、類似体および変異体は 本明細書において記載した方法と同様の慣用的方法を用いて調製される。 記載したように、本発明の化合物は有用な医薬的性質を有することが指摘され ている。したがって、活性治療物質として使用する化合物も提供される。 特に、本発明の化合物はエネルギー利用の向上により実質的に体重調節能を有 すると考えられ、したがって栄養障害および代謝障害、特に肥満および糖尿病の 治療において有用である。 本発明はさらに、栄養障害および代謝障害の治療法であって、有効で、医薬上 許容され、非毒性量の本発明の化合物を投与することからなる方法を提供する。 したがって、本発明はさらには、本発明の化合物と医薬上許容される担体とを 含んでなる医薬組成物を提供する。 使用に際して、活性化合物を通常ヒトまたや獣医学的医薬担体、希釈剤および ／または賦形剤と合わせた医薬組成物の形態で用いるが、組成物の厳密な形態は 投与方法に依存する。活性化合物は、例えば経口投与について、錠剤、カプセル 、ロゼ ンジまたはシロップの形態であり；吸入に関して、嗅剤、エアゾルまたは噴霧可 能な溶液の形態であり；非経口投与に関して滅菌溶液の形態であり；局所投与に ついて、クリーム、ローション、リニメント、ゲル、軟膏またはスプレーの形態 である。非経口投与経路は、静脈内、筋肉内、皮下、経皮および腹膜組織内投与 を包含する。 さらに、皮下移植ポンプまたは放出制御装置、経皮貼付剤における使用および 鼻腔内投与に適した微粉末としての使用に適した前記誘導体の処方も包含される 。 本発明の化合物の投与に関する投与量範囲は、治療すべき症状において所望の 効果をもたらすものであり、投与量は年齢、病態の程度または重度、あれば禁忌 により変わるであろう。投与量は、０.００１ｍｇ／ｋｇ／日ないし５０ｍｇ／ ｋｇ／日間で変わり得るが、好ましくは０.０１ないし１.０ｍｇ／ｋｇ／日であ る。 固体経口投与形態は、例えば、ラクトース、微結晶セルロース、リン酸二カル シウム、マンニトール、炭酸マグネシウム、グリシン、デキストロース、シュー クロース、デンプン、マンニトール、ソルビトールおよび炭酸カルシウムなどの 希釈剤；例えば、液体グルコース、シロップ、アカシア、ゼラチン、デンプン漿 剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸塩、およびプレゼラ チン化デンプンなどの結合剤；例えば、デンプン、アルギン酸、微結晶セルロー ス、ペクチン、架橋ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウムお よびナトリウムカルボキシメチルセルロースなどの崩壊剤；タルクおよびシリカ などの滑動剤；例えばステアリン酸およびステアリン酸マグネシウムなどの滑沢 剤；例えば、ソルビン酸およびパラヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルな どの保存料、または例えばラウリル硫酸ナトリウムなどの医薬上許容される湿潤 剤を含有してもよい。 カプセルは、通常、ゼラチンの外皮を他の成分、例えばグリセロール、ソルビ トール、界面活性剤、半透明増量剤、保存料、甘味料、矯味矯臭剤および着色料 などと合わせて含んでなる。カプセルの内容物は、希釈剤、滑沢剤および崩壊剤 を包含する。錠剤は、圧縮された粉末または顆粒からなり、被覆されていてもい なくてもよく、患者に投与される前に溶解、分散または発泡させるか、または飲 み込んだ直後、あるいは例えば酸不溶性コーティングを有する錠剤の場合にはも っと後のいずれかに胃腸管内で溶解または分散されるようにデザインされていて もよい。錠剤は、通 常、希釈剤、結合剤、崩壊剤、滑動剤、滑沢剤などの賦形剤を含有し、着色剤お よび矯味矯臭剤を含有してもよい。発泡性錠剤は、炭酸塩または炭酸水素塩と一 緒に酸を含有する。錠剤のコーディングは、天然または合成樹脂、ガム、不溶性 充填剤、ショ糖、可塑剤、多価アルコールおよびワックスからなり、さらに着色 剤および矯味矯臭剤を含有してもよい。ロゼンジおよびパスティルは口中で溶解 することを意図する。ロゼンジは成型または圧縮され、通常、矯味矯臭基剤が配 合されていてもよい。パスティルはゼラチンおよびグリセロールまたはアカシア およびシュークロースの基剤から成型される。これらは保存料ならびに着色料お よび矯味矯臭剤を含有してもよい。 フィルムコーティング樹脂は、セルロース誘導体、ゼイン、ビニルポリマーお よびアクリル酸樹脂を包含し、コーティング組成物は通常可塑剤、例えばヒマシ 油またはグリセリントリアセタートを包含する。腸溶性コーティング樹脂は、酢 酸フタル酸セルロースおよびメタクリル酸のコポリマーを包含する。 経口投与に適した固体組成物は、混合、充填、造粒、打錠などの常法により得 られる。繰り返し混合操作を用いて、活性物質を多量の充填剤を用いるこれらの 組成物全体に分散させることができる。 経口投与に適した液体組成物は、例えばエリキシル、混合物、濃縮溶液、懸濁 液、乳剤またはリンクタス剤などの形態であってもよい。これらは、使用前に水 または他の適当なビヒクルで復元する乾燥製品としてもよい。このような液体組 成物は、通常の賦形剤、例えば、シュークロース、ソルビトール、ゼラチン、メ チルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセル ロース、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、アカシア、カラギナン、シリ カ、ステアリン酸アルミニウムゲルなどの沈殿防止剤；レシチン、アカシア、ソ ルビタンモノオレアートなどの乳化剤；食用油、油性エステル、例えばグリセロ ールのエステル、エタノール、グリセロールを包含する水性または非水性ビヒク ル；例えばアルカリ金属のクエン酸塩およびリン酸塩などの緩衝剤；例えば安息 香酸ナトリウム、ソルビン酸、パラヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルな どの保存料、および所望により、通常の矯味矯臭剤および着色料を包含する。 組成物は、例えば圧縮錠剤または遅延放出性カプセルの形態で皮下に埋め込ん でもよい。 別法として、注射に適した組成物は、溶液、懸濁液または乳液、あるいは使用 前に適当なビヒクル中に溶解または懸濁させる乾燥粉末の形態であってもよい。 流体単位投与形態は、化合物および発熱物質不含滅菌ビヒクルを用いて調製す る。化合物は、用いるビヒクルおよび濃度に応じて、ビヒクル中に溶解または懸 濁させるかのいずれかとすることができる。溶液は、あらゆる形態の非経口投与 に関して用いられ、特に静脈内感染に用いられる。溶液の調製においては、化合 物をビヒクルに溶かし、その溶液を、適当な滅菌バイアルまたはアンプル中に充 填し、密封する前に必要ならば塩化ナトリウムの添加により等張にし、無菌技術 を用いて滅菌フィルターを介する濾過により滅菌することができる。別法として 、溶液安定性が適当ならば、密封容器中の溶液はオートクレーブ処理により滅菌 できる。有利には、緩衝剤、可溶化剤、安定剤、保存料または殺菌剤、懸濁化剤 または乳化剤および／または局部麻酔剤などの添加物をビヒクル中に溶解しても よい。 使用前に適当なビヒクル中に溶解または懸濁する乾燥粉末は、滅菌領域中で無 菌技術を用いて滅菌容器中にあらかじめ滅菌した医薬物質と他の成分を充填する ことにより調製される。別法として、医薬物質および他の成分を水性ビヒクル中 に溶解してもよく、溶液を濾過により滅菌し、滅菌領域中で無菌技術を用いて、 適当な溶液中に分配する。生成物を次に凍結乾燥し、容器を無菌密封する。 滅菌化合物を滅菌ビヒクル中に溶解するかわりに懸濁し、滅菌を濾過により行 うことができない以外は実質的に同様にして筋肉内、皮下または経皮注射に適し た非経口用懸濁液を調製する。化合物は滅菌状態で単離されるか、あるいは別法 として例えばガンマ線照射により単離後に滅菌してもよい。有利には、懸濁化剤 、例えばポリビニルピロリドンは化合物の均質な分配を促進するため組成物中に 配合される。 さらに別の態様において、栄養障害および代謝障害の治療法であって、患者に 有効で、非毒性量の本発明の化合物を投与することからなる方法が提供される。 本発明はさらに、肥満および糖尿病などの栄養および代謝障害の治療用医薬の 製造に関する本発明の化合物の使用を提供する。 本発明の化合物を本発明にしたがって投与した場合に、予期しない毒性は考え られない。 以下の実施例で本発明の化合物を説明する。 実施例 薬理学的方法: 本発明の化合物の活性を以下に示す方法にしたがって評価す る。 ＳＤラットの食物摂取におけるレプチンフラグメントの効果 手術 ラットを麻酔の約１時間前にSynulox（０.１ｍｌ／１００ｇ）で予め処理し、 次にDomitor（０.０４ｍｌ／１００ｇ ｉ.ｍ.）およびサブリマーゼ（０.９ｍ ｌ／ｌ００ｇ ｉ.ｐ.）で麻酔する。各ラットに滅菌条件下で側脳室中にカニュ ーレを埋込む。ついで、AntisedanおよびNubain（５０％ｖ／ｖ：５０％ｖ／ｖ ０.０２ｍｌ／１００ｇ）Ｉ.Ｐ.を用いて麻酔を回復させる。手術後、各ラット に０.０５ｍｌZenecarpを投与する。 実験操作: 実験１：手術後に、各動物の体重を全行程を通して毎日モニターした。 カニューレが側脳室中にあることを確認するために、アンジオテンシンII（１ ００ｎｇ／５μｌ）をｉｃｖ注射し、水の摂取を注射後５分間モニターした。 ２４時間の食物摂取を手術後５および６日に測定した。第６日に、動物を体重 に応じて３つの群（ａ、ｂおよびｃ、一群当たりラット８匹）に分け、次に一夜 断食した。実験の日（第７日）にラットを以下のようにｉｃｖ注射した： ａ群−ビヒクル（ＰＢＳ、リン酸緩衝溶液、５μｌ／ラット）； ｂ群−ヒトレプチン（１１.5μｇ／５μｌ）；および ｃ群−レプチントリプシン消化物（３０ｐｇ／５μｌ） ｉｃｖ注射操作の完了直後に、既知量の毎日の必要量より多い食物をラットに 供給した。食物摂取量および体重を２４時間後に測定した。得られた結果を表１ に示す。 実験２：別の群の動物を前記と全く同じようにして調製したが、一夜断食後の 実験日に数群のラットを以下のように注射した： ａ群−ビヒクル（ＰＢＳ５μｌ／ラット）； ｂ群−ヒトレプチン（８.７５μｇ／５μｌ）； ｃ群−ネズミレプチン（１０μｇ／５μｌ） ｄ群−ｏｂ５７−７４、配列ＶＴＧＬＤＦＩＰＧＬＨＰＩＬＴＬＳＫ（３.３ ３μｇ／５μｌ）； 再び、予め秤量した毎日の必要量より過剰の食物を注射後に再投与し；体重の 変化および消費された食物量を２４時間後に記録した。得られた結果を表２に示 す。 結果： 表１ 大脳室内投与されたヒトレプチンおよびそのフラグメントのＳＤラット における体重および食物摂取に対する影響 ＊Ｐ＜０.０５ ２４時間食物摂取 体重変化 （ｇ） （ｇ／２４時） ビヒクル ３６.６８±２.５ ３１.４４±１.２ （５μｌ／ラット、ｎ＝８） ヒト−レプチン ３０.６２±１.５＊ ２２.８８±２.０５＊ （１１．５μｇ／ラット、ｎ＝８） ヒト−レプチントリプシン ３４.６ ±１.９９ ２３.８８±１.２＊ 消化物（３０μｇ／ラット、ｎ＝８） 表２ 大脳室内投与されたヒトレプチン（ｈ−レプチン）、ネズミレプチン（ ｍ−レプチン）およびそのレプチンフラグメント５７−７４（ＶＴＧＬＤＦＩＰ ＧＬＨＰＩＬＴＬＳＫ)のＳＤラットにおける体重の変化および食物摂取に対す る影響 ＊Ｐ＜０．０５ ２４時間食物摂取 体重変化 （ｇ） （ｇ／２４時） ビヒクル ３２.１６±０.８ ３０.５５±０.６７ （５μｌ／ラット、ｎ＝８） ｈ−レプチン ３３.７ ±１.６ ２４.５ ±３.７ （８．７５μｇ／ラット、ｎ＝８） ｍ−レプチン ３１.３ ±１.７ ２３.７ ±２.１８＊ （１０μｇ／ラット、ｎ＝８） レプチンフラグメント５７−７４ ３３.６ ±０.９ ２６.８ ±１.２＊ （３．３３μｇ／ラット、ｎ＝８）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 ９７０３４９３．８ (32)優先日 平成９年２月20日(1997．2．20) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 アーチ，ジョナサン・ロバート・サンダー ス イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 カミレリ，パトリック イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 ネビル，ウィリアム・アーサー イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的にエネルギー利用を調節する手段である、体重を調節するペプチド またはその機能的誘導体、類似体または変異体。 ２．実質的にエネルギー利用を調節する手段である、体重を減少させるペプチ ドまたはその機能的誘導体、類似体または変異体。 ３．ペプチドがｏｂタンパク質のフラグメント、またはその機能的誘導体、類 似体または変異体である請求項１または２記載のペプチド。 ４．ｏｂ２１−２６、ｏｂ２７−３２、ｏｂ３３−３６、ｏｂ３７−４１、ｏ ｂ４２−５４、ｏｂ５５−５６、ｏｂ５７−７４、ｏｂ９３−１０５、ｏｂ１０ ６−１１５、ｏｂ１１６−１４９およびｏｂ１５０−１６７のヒトｏｂタンパク 質のフラグメントから選択される請求項１ないし３のいずれか１つに記載のペプ チド。 ５.ペプチドがアミノ酸配列ＶＴＧＬＤＦＩＰＧＬＨＰＩＬＴＬＳＫを有する 請求項１ないし４のいずれか１つに記載のペプチド。 ６.請求項４に記載の１またはそれ以上のペプチドから形成される請求項１記 載のペプチド。 ７.請求項４に記載のペプチドの２つの連続する要素から形成される請求項１ 記載のペプチド。 ８.請求項１ないし７のいずれか１つに記載のペプチドである合成または組換 えペプチド。 ９.請求項１ないし７のいずれか１つに記載のペプチドをコードするヌクレオ チド配列。 １０.請求項１ないし７のいずれか１つに記載のペプチドをコードするヌクレ オチド配列を含むベクター。 １１．請求項９に記載の複製可能な発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 １２．請求項１に記載のペプチド、またはその機能的誘導体の製法であって、 ペプチドを加水分解して少なくとも２つのペプチドフラグメントにし； そのペプチドフラグメントを分離し； 所望によりその後その機能的誘導体を調製する 工程からなる方法。 １３．請求項１ないし７のいずれか１つに記載のペプチドの製法であって、 組換え宿主細胞において該ペプチドをコードするＤＮＡを発現し、産物を回収す ることからなる方法。 １４． i）必要なペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリマーを宿 主細胞において発現できる複製可能な発現ベクターを調製し； ii）該ベクターで宿主細胞を形質転換し； iii）該ＤＮＡポリマーを発現できる条件下でその形質転換された宿主細胞を 培養してペプチドを産生し； iv）そのペプチドを回収する 工程からなる請求項１３記載の方法。 １５．請求項１に記載の化合物と医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組 成物。 １６．活性な治療物質として用いる請求項１記載の化合物。 １７．栄養障害および代謝障害の治療において用いる請求項１５記載の化合物 。 １８．栄養障害および代謝障害の治療法であって、有効で、医薬上許容される 、非毒性な量の請求項１に記載の化合物を投与することからなる方法。 １９.栄養障害および代謝障害の治療用医薬の製造用のための請求項１に記載 の化合物の使用。