JPH0623346A - Ｄｎａの生物学的活性を不活性化する方法 - Google Patents

Ｄｎａの生物学的活性を不活性化する方法

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JPH0623346A JP3111816A JP11181691A JPH0623346A JP H0623346 A JPH0623346 A JP H0623346A JP 3111816 A JP3111816 A JP 3111816A JP 11181691 A JP11181691 A JP 11181691A JP H0623346 A JPH0623346 A JP H0623346A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 低コストでかつ安定な化合物を使用してＤＮ
Ａの生物学的活性を不活性化する方法を提供する。 【構成】 少なくとも０．２ｍＭの濃度のクエン酸、乳
酸、酢酸、リン酸またはギ酸の存在下で、６０〜１００
℃の温度及び最大４、好ましくは３のｐＨでＤＮＡ、哺
乳動物細胞または微生物、特に組み換えＤＮＡを加熱す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡ、特に組み換え
ＤＮＡの生物活性を不活性化する方法、及び好ましく
は、例えば、ＣＨＯ−、ＣＯＳ−及びハイブリドーマ細
胞等の哺乳動物細胞、例えば、大腸菌及び枯草菌等の細
菌細胞または酵母を同時死滅させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】組み換えＤＮＡを含む微生物の研究にお
いて、生きている生物のみならず活性な核酸をも含有す
る廃棄物質が発生する。この廃棄物質は、バイオマスが
浄水プラントに通される前に、それぞれの安全要求性に
従って不活性化されなければならない。
【０００３】多くの微生物及び細胞培養物は８０℃に加
熱することによって死滅させ得るがＤＮＡはそのような
処理では破壊されない。ドイツ連邦共和国の生物学的安
全に関する中央委員会（ＺＫＢＳ）によって承認されて
いる公知の殺菌法及び不活性化法（例えば、１２１℃で
２０分間蒸気殺菌する方法）は、非常に費用が掛かり、
工業的スケールで使用する場合のコストは甚大である。
【０００４】これらＺＫＢＳ公認の処理方法では、ＤＮ
Ａは５００塩基対より短いユニットに崩壊される。この
サイズのユニットはもはや生物学的活性はなく、いかな
る危険も引き起こすことなく廃水中に投棄され得る。該
不活性化は、バイオイマスを精製プラントで処理する前
に行わなければならないので、例えば、該精製プラント
が活性スラッジ法を利用するものである場合に、活性ス
ラッジの微生物に有害かまたは致命的である物質を使用
することは不可能である。
【０００５】更に、該物質が無毒であるか、または該物
質が該活性スラッジ中の微生物によって崩壊されること
によって無害化され得ることが望ましく、そして、醗酵
設備及び精製設備の壁や他の表面に悪影響を及ぼさない
物質が使用されることが望ましい。ドイツ特許出願 DE
OS 3733921は、ＤＮＡ、特に組み換えＤＮＡの不活性化
法を記載しており、その方法は、１〜３の炭素原子を有
する過カルボン酸またはその塩、過酸化アルカリ、また
は過硫酸水素アルカリをＤＮＡ含有バイオイマスに加
え、該混合物を６０〜１００℃で２０〜６０分間、好ま
しくはｐＨ６〜１１で加熱するというものである。
【０００６】しかしながら、例えば、過酢酸等の過カル
ボン酸は比較的不安定である。ＤＮＡ鎖をフェノール含
有シラン溶液中１００℃で４０分間加熱すると、非常に
小さいサイズに崩壊することが知られている（Meth. En
zymol. B XII, 97頁）。Meth. Enzymol. A XII,222〜22
3 頁は、９８％ギ酸で３０℃、１７時間処理するＤＮＡ
のアプリン酸への崩壊について記載している。
【０００７】
【発明の内容】本発明者らは、一定のｐＨと濃度で使用
した場合に、保存安定性があり生物学的崩壊能を有する
幾つかの酸が、ＤＮＡを不活性化し細胞を死滅させる能
力を有し、その処理が比較的低温で行えるという驚くべ
きことを見出した。従って、本発明の主題は、過カルボ
ン酸を除く少なくとも０．２ｍＭの濃度の酸の存在下
で、６０〜１００℃の温度及び最大値４、好ましくは３
のｐＨで、ＤＮＡを加熱することを特徴とする、ＤＮ
Ａ、特に組み換えＤＮＡの生物学的活性を不活性化する
方法にある。
【０００８】該方法はバイオマスまたは単離したＤＮＡ
の如きものについて行うことができる。例えば、バイオ
マスはＣＨＯ、大腸菌及び枯草菌等の微生物または細胞
培養物を含有する培地であってもよい。好ましくは、該
方法は１〜５００mM、例えば、２〜１００mM、特に２．
３〜５０mMまたは１０〜５０mMの濃度の酸の存在下で行
われる。
【０００９】本発明の方法は、ｐＨ１〜３、特に好まし
くはｐＨ２〜３で通常行われる。哺乳動物細胞は、好ま
しくは、少なくとも１００ｍＭの濃度で、かつ、最大ｐ
Ｈ３、好ましくは、２．５で処理される。微生物の場合
は、好ましくは、少なくとも４００ｍＭの濃度で、か
つ、最大ｐＨ値３で処理される。酸としては、例えば、
ギ酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、例えば、モノ
‐、ジ‐、トリクロロ酢酸等のハロゲン化有機酸、シュ
ウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石
酸、乳酸、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、サリチル
酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、フッ化水素酸、ヨウ化
水素酸、過塩素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、ホウ
酸、リン酸等の無機酸、及び硫酸水素ナトリウム、亜硫
酸水素ナトリウム等の酸性塩、並びにそれらの適当な混
合物が挙げられる。好ましくは、クエン酸、乳酸、酢
酸、リン酸またはギ酸が使用される。
【００１０】該混合物の加熱は５００塩基対を超える鎖
長のＤＮＡが電気泳動で検出されなくなるまで行われ
る。通例、この電気泳動は１０〜７０分、特に２０〜６
０分を要する。全ＤＮＡが崩壊したかどうかをチェック
するために該混合物から一部を取り出し、アガロース電
気泳動を行う。分子量によって分離するカラムクロマト
グラフィーを行えば、該溶液中にまだ存在するフラグメ
ントが明らかになる。
【００１１】本発明の方法の主要な利点は、細菌細胞ま
たは哺乳動物細胞由来のλ‐ＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの
如き通常の二本鎖ＤＮＡのみならず、「スーパーコイル
プラスミドＤＮＡ」も確実に不活性化され得るというこ
とである。
【００１２】
【実施例】実施例１ ５μg のＤＮＡを含有するサンプルの水溶液（１０μ）
を１．５mlのエッペンドルフ管（Eppendorf vessel）に
加えた。これに種々の濃度で調製した酸溶液（１０μl
）を加え、得られた反応混合液（最終的な量は２０μl
）を次の表１に示した条件でインキュベートした。イ
ンキュベート終了時点で５μl の１ＭトリスｐＨ８．５
を加えて中和した。
【００１３】該酸処理後、１０μl のＤＮＡ溶液を採
り、２０％フィコール（ファルマシアファインケミカル
社製）、０．０５％ブロモフェノールブルー、２０mMＥ
ＤＴＡからなる市販の緩衝液５μl と混合し、アガロー
ス電気泳動プレート（アガロース濃度１〜２％）に用い
た。電気泳動用緩衝液は４０mMトリスアセテートｐＨ
７．８及び１mMＥＤＴＡからなるものを使用した。該電
気泳動は３０〜５０ボルト／cmで行った。
【００１４】ＤＮＡ鎖長スタンダード（ＤＮＡ length
standard）は、ＢｓｔＥIIまたはＨｉｎｄIII で消化し
たλ‐ＤＮＡ及びＨｉｎｆＩまたはＢｓｔＮ１で消化し
たプラスミドｐＢＲ３２２であり、以下の長さを有する
フラグメントであった。 λ‐ＤＮＡ／ＨｉｎｄIII ： 27491, 9416, 6557, 436
1, 2322, 2027, 564,125 ｐＢＲ３２２／ＢｓｔＮ１： 1857, 1060, 929, 383, 1
21, 13 結果を表１に示した。
【００１５】 表１ ＤＮＡ 酸 濃度 pH 温度 時間*1 結果 又は細胞 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ λ‐ＤＮＡ*2 クエン酸 3mM 3.1 70℃ 10- 全DNA が 500bp＞に 30分 崩壊 λ‐ＤＮＡ*2 クエン酸 200mM 1.9 70℃ 10分 同上 λ‐ＤＮＡ*2 クエン酸 10mM 2.8 70℃ 60分 同上 λ‐ＤＮＡ*2 クエン酸 1mM 3.6 70℃ 60分 同上 λ‐ＤＮＡ*2 クエン酸 2,3mM 3.1 60℃ 60分 同上 ＣＨＯ−細胞*3 クエン酸 50mM 2.3 70℃ 60分 同上 ＣＨＯ−細胞*3 クエン酸 100mM 2.1 70℃ 60分 同上 ＣＨＯ−細胞*3 クエン酸 200mM 1.9 70℃ 60分 同上 ＣＨＯ−細胞*3 クエン酸 500mM 1.7 70℃ 60分 同上 大腸菌ＨＢ１０１ クエン酸 100mM 2.1 70℃ 60分 生存細胞なし*4 大腸菌ＨＢ１０１ クエン酸 200mM 1.9 70℃ 60分 同上 大腸菌ＨＢ１０１ クエン酸 400mM 1.8 70℃ 60分 生存細胞なし*4全DN A が 500bp＞に崩壊 大腸菌ＨＢ１０１ クエン酸 800mM 1.5 70℃ 60分 同上 大腸菌ＨＢ１０１ クエン酸 1000mM 1.4 70℃ 60分 同上 プラスミドＤＮＡ*5 ギ酸 10mM 3.6 70℃ 60分 全DNA が 500bp＞に 崩壊 プラスミドＤＮＡ*5 ギ酸 1mM 4.0 70℃ 60分 同上 プラスミドＤＮＡ*5 H3PO4 3mM 2.9 70℃ 60分 同上 プラスミドＤＮＡ*5 H3PO4 0.3mM 3.8 70℃ 60分 同上 プラスミドＤＮＡ*5 HCl 10mM 2.3 70℃ 60分 同上 プラスミドＤＮＡ*5 HCl 1mM 3.3 70℃ 60分 同上 プラスミドＤＮＡ*5 クエン酸 2,3mM 3.1 60℃ 60分 同上 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ *1 インキュベーション時間 *2 ４８．５００Ｂｐベーリンガーマンハイム *3 ９６％生存 *4 アガー（Ager）プレート上でのインキュベーション
及び３７℃、７日以上の液体培養によった。 *5 ｐＢＲ３２２（スーパーコイル４．３００ｂｐ）実施例２ ｐＢＲ３２２（スーパーコイルＤＮＡ）を使用して、表
２に示した種々の酸濃度で実施例１と同様に行った。
【００１６】反応混合物は７０℃で６０分間インキュベ
ートした。 表２ レーン 酸 濃度 pH ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １ クエン酸 10 mM 2.8 ２ クエン酸 1 mM 3.6 ３ クエン酸 0.1mM 4.3 ４ 酢酸 10 mM 3.6 ５ 酢酸 1 mM 4.1 ６ 酢酸 0.1mM 4.4 ７ 塩酸 10 mM 2.3 ８ 塩酸 1 mM 3.3 ９ 塩酸 0.1mM 4.1 10 リン酸 3 mM 2.4 11 リン酸 0.3mM 3.1 12 リン酸 0.03mM 4.0 13 未添加 14 鎖長スタンダードｐＢＲ３２２／ＢｓｔＮ１ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 表２の実験の電気泳動像を第１図に示す。第１図は、本
発明のＤＮＡのインキュベーション（レーン１，２，
４，５，７，８及び１０）により、ＤＮＡが３００ｂｐ
より小さいフラグメントに崩壊したことを示している。
【００１７】実施例３ λファージＤＮＡを使用して、表３に示した異なる濃度
の種々の酸で実施例１と同様に行った。反応混合物は７
０℃で６０分間インキュベートした。 表３ レーン 酸 濃度 pH ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １ クエン酸 10 mM 2.8 ２ クエン酸 1 mM 3.6 ３ クエン酸 0.1mM 4.3 ４ 酢酸 10 mM 3.6 ５ 酢酸 1 mM 4.1 ６ 酢酸 0.1mM 4.4 ７ 塩酸 10 mM 2.3 ８ 塩酸 1 mM 3.3 ９ 塩酸 0.1mM 4.1 10 リン酸 3 mM 2.4 11 リン酸 0.3mM 3.1 12 リン酸 0.03mM 4.0 13 未添加 14 鎖長スタンダードｐＢＲ３２２／ＢｓｔＮ１ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 結果を第２図に示した。第２図は、本発明のλファージ
ＤＮＡの処理（レーン１，２，４，５，７，８，１０及
び１１）により、該ＤＮＡが確実に断片化されたことを
示している。
【００１８】実施例４ 組み換えＣＨＯ−細胞の酸による処理 組み換えＣＨＯ−細胞の懸濁培養液（３×１０6 個／m
l；生存率９６％）から一部（細胞１×１０7 個を含
有）を採り、クエン酸を加えた。最終容量は１mlであっ
た。クエン酸の濃度は４００，２００，１００，５０，
２０，１０mMであった。対照として水を加えたサンプル
を調製した。インキュベーションは７０℃で６０分間行
った（表４を参照）。
【００１９】最後に、該反応混合液に１ＭトリスｐＨ
８．５を加えてｐＨを７にした後、プロテイナーゼＫ
（最終濃度：０．４mg／ml）と６０分間インキュベート
し、フェノール／クロロホルム（１：１）で２回抽出し
た。水性残渣をセファデックス‐Ｇ２５カラムで脱塩
し、９０倍に濃縮して、その１０μl （懸濁培養液の２
００μl 分に相当する）をアガロースゲル‐電気泳動
（１．８％アガロース）を使用して試験した。
【００２０】結果を第３図に示した。第３図は、本発明
による生存ＣＨＯ−細胞の処理（レーン１〜６）で、該
ＤＮＡが凡そ１２５塩基対のフラグメントに強力に変性
され崩壊されたことを示している（レーン１〜４）。 表４ レーン 細胞 酸 インキュベーション 溶液全体のpH ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １ ＣＨＯ−細胞 400mM クエン酸 70℃／60分 2.1 ２ ＣＨＯ−細胞 200mM クエン酸 70℃／60分 2.3 ３ ＣＨＯ−細胞 100mM クエン酸 70℃／60分 2.6 ４ ＣＨＯ−細胞 50mM クエン酸 70℃／60分 3.0 ５ ＣＨＯ−細胞 20mM クエン酸 70℃／60分 3.7 ６ ＣＨＯ−細胞 10mM クエン酸 70℃／60分 4.2 ７ ＣＨＯ−細胞 クエン酸未添加 70℃／60分 6.6 ８ ＣＨＯ−細胞 未反応細胞 ９ 鎖長スタンダードλ‐ＤＮＡ／ＨｉｎｄIII ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━実施例５ 大腸菌（ＨＢ１０１株）及び枯草菌（ＡＴＣ
Ｃ６６３３）の処理 細菌培養液各１mlに濃度の異なるクエン酸溶液各１mlを
混合し、最終濃度をそれぞれ０．２Ｍ；０．４Ｍ；０．
８Ｍ；１．０Ｍとした。対照として、クエン酸の代わり
に水１mlを加えたサンプルを１つ調製した。
【００２１】全てのサンプルを７０℃で１時間インキュ
ベートした。最後に該サンプルを１２．０００ｘｇで５
分間遠心分離し、細胞膜を破って閉ざされていたＤＮＡ
を開放するために沈澱物を３７℃で１時間、プロテイナ
ーゼＫ（最終濃度１００μg／ml）で消化した。後の分
析を妨害するであろう細胞膜片を分離するために、塩化
ナトリウム（最終濃度：０．７Ｍ）及びセチルトリメチ
ルアンモニウム・ブロミド（ハイデルベルグ，セルバ社
製，注文 No.16530 ）（最終濃度：１％）を該サンプル
に加え、次いで、６５℃で１０分間インキュベートし、
最後に１／１容量のクロロホルム／イソアミルアルコー
ル（２４：１）で抽出した。ＤＮＡを含む水相をフェノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２
４：１）で抽出して精製し、水性残渣をアガロース電気
泳動によって試験した。電気泳動は、細菌培養液０．４
mlに相当する精製ＤＮＡ溶液１０μl を使用して行っ
た。
【００２２】結果を第４図の電気泳動像に示した。第４
図は、本発明による細菌処理後、凡そ１００ｂｐのＤＮ
Ａフラグメントしか検出されないことを示している。 表５ レーン 細菌 酸 pH ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １ 大腸菌 0.2 M クエン酸 1.9 ２ 大腸菌 0.4 M クエン酸 1.8 ３ 大腸菌 0.8 M クエン酸 1.5 ４ 大腸菌 1.0 M クエン酸 1.4 ５ 大腸菌 クエン酸未添加 ６ 枯草菌 0.2 M クエン酸 1.9 ７ 枯草菌 0.4 M クエン酸 1.8 ８ 枯草菌 0.8 M クエン酸 1.5 ９ 枯草菌 1.0 M クエン酸 1.4 10 枯草菌 クエン酸未添加 11 無 12 鎖長スタンダードλ‐ＤＮＡ／ＨｉｎｄIII 13 鎖長スタンダードｐＢＲ３２２／ＢｓｔＮ１ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図は、ｐＢＲ３２２を異なる濃度の種々の
酸で処理したＤＮＡ溶液の電気泳動像である。上端の数
字はレーンの番号を表し、右端の数字は塩基対の数を表
す。
【図２】第２図は、λファージＤＮＡを異なる濃度の種
々の酸で処理したＤＮＡ溶液の電気泳動像である。上端
の数字はレーンの番号を表し、右端の数字は塩基対の数
を表す。
【図３】第３図は、組み換えＣＨＯ−細胞の懸濁培養液
を異なる濃度のクエン酸で処理したＤＮＡ溶液の電気泳
動像である。上端の数字はレーンの番号を表し、右端の
数字は塩基対の数を表す。
【図４】第４図は、大腸菌または枯草菌培養液を異なる
濃度のクエン酸で処理したＤＮＡ溶液の電気泳動像であ
る。上端の数字はレーンの番号を表し、右端の数字は塩
基対の数を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゲオルク バーデル ドイツ連邦共和国 デー7951 ビルケンハ ルトアム シュレーゲルベルク 16 (72)発明者 ヴォルフガンク ベルトールト ドイツ連邦共和国 デー7950 ビベラッハ １フリートリッヒ エーベルト シュト ラーセ 32 (72)発明者 ロルフ ギュンター ヴェルナー ドイツ連邦共和国 デー7950 ビベラッハ １フーゴ ヘーリング シュトラーセ 72

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 過カルボン酸以外の少なくとも０．２ｍ
    Ｍの濃度の酸の存在下で、６０〜１００℃の温度及び最
    大４のｐＨで、ＤＮＡを加熱することを特徴とする、Ｄ
    ＮＡの生物学的活性を不活性化する方法。
  2. 【請求項２】 酸が生物学的崩壊能を有することを特徴
    とする、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 クエン酸、乳酸、酢酸、リン酸またはギ
    酸を使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 細胞培養物及び微生物を同時に死滅させ
    る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
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