JPH06237796A - アルカリ性フォスファターゼの検出方法 - Google Patents
アルカリ性フォスファターゼの検出方法Info
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- JPH06237796A JPH06237796A JP2884293A JP2884293A JPH06237796A JP H06237796 A JPH06237796 A JP H06237796A JP 2884293 A JP2884293 A JP 2884293A JP 2884293 A JP2884293 A JP 2884293A JP H06237796 A JPH06237796 A JP H06237796A
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- glycerol
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 臨床診断等の分野で広く使用されている酵
素、ＡＬＰを、蛍光測定に比較して高感度で検出し得る
化学発光検出を提供する。 【構成】 ＡＬＰにＮＡＤＰもしくはグリセロール−３
−リン酸を接触させてＮＡＤもしくはグリセロールを生
成させ、さらにグリセロールもしくはＮＡＤをグリセロ
ールデヒドルゲナーゼの存在下で接触させデヒドロキシ
アセトンを生成させ、さらにルシゲニンを接触させて光
を生じさせ、その光を定量測定することによるＡＬＰの
検出。
素、ＡＬＰを、蛍光測定に比較して高感度で検出し得る
化学発光検出を提供する。 【構成】 ＡＬＰにＮＡＤＰもしくはグリセロール−３
−リン酸を接触させてＮＡＤもしくはグリセロールを生
成させ、さらにグリセロールもしくはＮＡＤをグリセロ
ールデヒドルゲナーゼの存在下で接触させデヒドロキシ
アセトンを生成させ、さらにルシゲニンを接触させて光
を生じさせ、その光を定量測定することによるＡＬＰの
検出。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、例えばＥＩＡ（エンザ
イムイムノアッセイ）等の、酵素を指標として試料中の
特定物質を測定する方法において頻繁に利用されるアル
カリ性フォスファターゼ（ＡＬＰ、ＥＣ．１．３．１）
の発光法による検出方法を提供するものである。また、
例えばＥＩＡ等の手法においては、検出されるべきＡＬ
Ｐの量はすなわち試料中の特定物質の量に相関してい
る。従って本発明は更に、ＡＬＰの発光法による検出工
程を含む試料中の特定物質の検出方法をも提供するもの
である。そして本発明は、上記の検出方法を実施するた
めの検出キットを提供するものである。
イムイムノアッセイ）等の、酵素を指標として試料中の
特定物質を測定する方法において頻繁に利用されるアル
カリ性フォスファターゼ（ＡＬＰ、ＥＣ．１．３．１）
の発光法による検出方法を提供するものである。また、
例えばＥＩＡ等の手法においては、検出されるべきＡＬ
Ｐの量はすなわち試料中の特定物質の量に相関してい
る。従って本発明は更に、ＡＬＰの発光法による検出工
程を含む試料中の特定物質の検出方法をも提供するもの
である。そして本発明は、上記の検出方法を実施するた
めの検出キットを提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＥＩＡ等の酵素を指標として試料中の特
定物質を検出する方法においては、安定性が良い、比活
性が高い、ターンオーバー数が高い（検出感度が高い）
といった理由からＡＬＰが頻繁に使用されている。ＡＬ
Ｐの検出は、従来パラニトロフェニルフォスフェート等
を使用する比色方法（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｚ
ｙｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ、１９７６年、ｐ１５１−１６０、Ｍａｒｃｅｌｌ
Ｄｅｃｋｋｅｒ Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）、４−メチルウン
ベリフェリルフォスフェートを使用する蛍光方法（前記
文献参照）等により行われている。
定物質を検出する方法においては、安定性が良い、比活
性が高い、ターンオーバー数が高い（検出感度が高い）
といった理由からＡＬＰが頻繁に使用されている。ＡＬ
Ｐの検出は、従来パラニトロフェニルフォスフェート等
を使用する比色方法（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｚ
ｙｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ、１９７６年、ｐ１５１−１６０、Ｍａｒｃｅｌｌ
Ｄｅｃｋｋｅｒ Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．）、４−メチルウン
ベリフェリルフォスフェートを使用する蛍光方法（前記
文献参照）等により行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ＥＩＡにおいては、い
かに微量の標識酵素（例えばＡＬＰ）を検出しうるか、
すなわち高い検出感度を有するかが非常に重要である。
近年臨床診断の分野においては生体試料中の各種微量成
分の測定、定量がイムノアッセイの手法を用いることに
より実現されるにつれ様々な疾患との関連が明らかにな
り、また疾患の診断、治療における指標のひとつとして
欠くことができなくなってきた。より高感度のＥＩＡの
手法を提供することは、測定時間の短縮、測定に必要な
生体試料の量の低減、さらには未知のより微量な成分の
測定を可能にするものである。
かに微量の標識酵素（例えばＡＬＰ）を検出しうるか、
すなわち高い検出感度を有するかが非常に重要である。
近年臨床診断の分野においては生体試料中の各種微量成
分の測定、定量がイムノアッセイの手法を用いることに
より実現されるにつれ様々な疾患との関連が明らかにな
り、また疾患の診断、治療における指標のひとつとして
欠くことができなくなってきた。より高感度のＥＩＡの
手法を提供することは、測定時間の短縮、測定に必要な
生体試料の量の低減、さらには未知のより微量な成分の
測定を可能にするものである。
【０００４】ＡＬＰのような酵素を検出する方法におい
ては、一般的に蛍光法では比色法の１００倍程度の感度
を達成することが可能であり、更に発光法では蛍光法の
１００倍程度の感度を達成することが可能であるといわ
れている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．３，３１
６−３２２，１９８９年，Ｉ．Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎと
Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ）。従ってより高感度にＡＬＰを
検出するためには、比色法よりは蛍光法、発光法が好ま
しいがその中でもさらにより高感度な検出方法が望まれ
ているのである。
ては、一般的に蛍光法では比色法の１００倍程度の感度
を達成することが可能であり、更に発光法では蛍光法の
１００倍程度の感度を達成することが可能であるといわ
れている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．３，３１
６−３２２，１９８９年，Ｉ．Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎと
Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ）。従ってより高感度にＡＬＰを
検出するためには、比色法よりは蛍光法、発光法が好ま
しいがその中でもさらにより高感度な検出方法が望まれ
ているのである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】このような状況に鑑み
て、本発明者らは、より高感度にＡＬＰを検出しうる方
法について鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに
至った。
て、本発明者らは、より高感度にＡＬＰを検出しうる方
法について鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに
至った。
【０００６】即ち本発明は、検出されるべきアルカリ性
フォスファターゼ（ＡＬＰ）にグリセロール−３−リン
酸を接触させてグリセロールを生成させる工程、生成し
たグリセロールにニコチンアミノアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤ）をグリセロールデヒドルゲナーゼの存在下
で接触させデヒドロキシアセトンを生成する工程、生成
したデヒドロキシアセトンにルシゲニンを接触させて光
を生じさせる工程、及び生じた光を定量測定する工程も
しくは、検出されるべきＡＬＰにニコチンアミノアデニ
ンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を接触させてニコ
チンアミノアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を生成さ
せる工程、生成したニコチンアミノアデニンジヌクレオ
チドにグリセロールをグリセロールデヒドルゲナーゼの
存在下で接触させデヒドロキシアセトンを生成する工
程、生成したデヒドロキシアセトンにルシゲニンを接触
させて光を生じさせる工程、及び生じた光を定量測定す
る工程からなるＡＬＰの検出方法を提供するものであ
る。
フォスファターゼ（ＡＬＰ）にグリセロール−３−リン
酸を接触させてグリセロールを生成させる工程、生成し
たグリセロールにニコチンアミノアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤ）をグリセロールデヒドルゲナーゼの存在下
で接触させデヒドロキシアセトンを生成する工程、生成
したデヒドロキシアセトンにルシゲニンを接触させて光
を生じさせる工程、及び生じた光を定量測定する工程も
しくは、検出されるべきＡＬＰにニコチンアミノアデニ
ンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を接触させてニコ
チンアミノアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を生成さ
せる工程、生成したニコチンアミノアデニンジヌクレオ
チドにグリセロールをグリセロールデヒドルゲナーゼの
存在下で接触させデヒドロキシアセトンを生成する工
程、生成したデヒドロキシアセトンにルシゲニンを接触
させて光を生じさせる工程、及び生じた光を定量測定す
る工程からなるＡＬＰの検出方法を提供するものであ
る。
【０００７】また前述した様に、ＡＬＰの検出は例えば
血液等の試料中の特定タンパク質（特定抗原）や特定の
塩基配列を有するＤＮＡの検出といった、試料中の特定
物質の検出のための操作の一部分として実施されること
がある。
血液等の試料中の特定タンパク質（特定抗原）や特定の
塩基配列を有するＤＮＡの検出といった、試料中の特定
物質の検出のための操作の一部分として実施されること
がある。
【０００８】従って本発明は、少なくとも特定物質、特
定物質に対して親和性を有する物質及び検出されるべき
ＡＬＰからなる複合体を形成させる工程、複合体を形成
していない検出されるべきＡＬＰを分離する工程、複合
体を形成しているか又は複合体を形成していないＡＬＰ
のいずれか一方あるいは両方にグリセロール−３−リン
酸を接触させてグリセロールを生成させる工程、生成し
たグリセロールにニコチンアミノアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤ）をグリセロールデヒドルゲナーゼの存在下
で接触させデヒドロキシアセトンを生成する工程、生成
したデヒドロキシアセトンにルシゲニンを接触させて光
を生じさせる工程、及び生じた光を定量測定する工程も
しくは、少なくとも特定物質、特定物質に対して親和性
を有する物質及び検出されるべきＡＬＰからなる複合体
を形成させる工程、複合体を形成していない検出される
べきＡＬＰを分離する工程、複合体を形成しているか又
は複合体を形成していないＡＬＰのいずれか一方あるい
は両方にニコチンアミノアデニンジヌクレオチドリン酸
（ＮＡＤＰ）を接触させてニコチンアミノアデニンジヌ
クレオチド（ＮＡＤ）を生成させる工程、生成したニコ
チンアミノアデニンジヌクレオチドにグリセロールをグ
リセロールデヒドルゲナーゼの存在下で接触させデヒド
ロキシアセトンを生成する工程、生成したデヒドロキシ
アセトンにルシゲニンを接触させて光を生じさせる工
程、及び生じた光を定量測定する工程からなる特定物質
の検出方法を提供するものである。
定物質に対して親和性を有する物質及び検出されるべき
ＡＬＰからなる複合体を形成させる工程、複合体を形成
していない検出されるべきＡＬＰを分離する工程、複合
体を形成しているか又は複合体を形成していないＡＬＰ
のいずれか一方あるいは両方にグリセロール−３−リン
酸を接触させてグリセロールを生成させる工程、生成し
たグリセロールにニコチンアミノアデニンジヌクレオチ
ド（ＮＡＤ）をグリセロールデヒドルゲナーゼの存在下
で接触させデヒドロキシアセトンを生成する工程、生成
したデヒドロキシアセトンにルシゲニンを接触させて光
を生じさせる工程、及び生じた光を定量測定する工程も
しくは、少なくとも特定物質、特定物質に対して親和性
を有する物質及び検出されるべきＡＬＰからなる複合体
を形成させる工程、複合体を形成していない検出される
べきＡＬＰを分離する工程、複合体を形成しているか又
は複合体を形成していないＡＬＰのいずれか一方あるい
は両方にニコチンアミノアデニンジヌクレオチドリン酸
（ＮＡＤＰ）を接触させてニコチンアミノアデニンジヌ
クレオチド（ＮＡＤ）を生成させる工程、生成したニコ
チンアミノアデニンジヌクレオチドにグリセロールをグ
リセロールデヒドルゲナーゼの存在下で接触させデヒド
ロキシアセトンを生成する工程、生成したデヒドロキシ
アセトンにルシゲニンを接触させて光を生じさせる工
程、及び生じた光を定量測定する工程からなる特定物質
の検出方法を提供するものである。
【０００９】更に本発明は、特定物質又は特定物質に対
して親和性を有する物質との結合において特定物質と同
等の能力を有する物質と検出されるべきＡＬＰから形成
される既知量の複合体を特定物質に対して親和性を有す
る物質に対して競合的に結合させる工程、特定物質に対
して親和性を有する物質と結合しなかった、特定物質又
は特定物質に対して親和性を有する物質との結合におい
て特定物質と同等の能力を有する物質と検出されるべき
ＡＬＰから形成された複合体を分離する工程、特定物質
に対して親和性を有する物質を含む複合体中のＡＬＰ又
は分離された複合体中のＡＬＰのいずれか一方又は両方
にグリセロール−３−リン酸を接触させてグリセロール
を生成させる工程、生成したグリセロールにニコチンア
ミノアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）をグリセロール
デヒドルゲナーゼの存在下で接触させデヒドロキシアセ
トンを生成する工程、生成したデヒドロキシアセトンに
ルシゲニンを接触させて光を生じさせる工程、及び生じ
た光を定量測定する工程又は、特定物質又は特定物質に
対して親和性を有する物質との結合において特定物質と
同等の能力を有する物質と検出されるべきＡＬＰから形
成される既知量の複合体を特定物質に対して親和性を有
する物質に対して競合的に結合させる工程、特定物質に
対して親和性を有する物質と結合しなかった、特定物質
又は特定物質に対して親和性を有する物質との結合にお
いて特定物質と同等の能力を有する物質と検出されるべ
きＡＬＰから形成された複合体を分離する工程、特定物
質に対して親和性を有する物質を含む複合体中のＡＬＰ
又は分離された複合体中のＡＬＰのいずれか一方又は両
方にニコチンアミノアデニンジヌクレオチドリン酸（Ｎ
ＡＤＰ）を接触させてニコチンアミノアデニンジヌクレ
オチド（ＮＡＤ）を生成させる工程、生成したニコチン
アミノアデニンジヌクレオチドにグリセロールをグリセ
ロールデヒドルゲナーゼの存在下で接触させデヒドロキ
シアセトンを生成する工程、生成したデヒドロキシアセ
トンにルシゲニンを接触させて光を生じさせる工程、及
び生じた光を定量測定する工程からなる特定物質の検出
方法を提供するものである。以下、本発明を詳細に説明
する。
して親和性を有する物質との結合において特定物質と同
等の能力を有する物質と検出されるべきＡＬＰから形成
される既知量の複合体を特定物質に対して親和性を有す
る物質に対して競合的に結合させる工程、特定物質に対
して親和性を有する物質と結合しなかった、特定物質又
は特定物質に対して親和性を有する物質との結合におい
て特定物質と同等の能力を有する物質と検出されるべき
ＡＬＰから形成された複合体を分離する工程、特定物質
に対して親和性を有する物質を含む複合体中のＡＬＰ又
は分離された複合体中のＡＬＰのいずれか一方又は両方
にグリセロール−３−リン酸を接触させてグリセロール
を生成させる工程、生成したグリセロールにニコチンア
ミノアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）をグリセロール
デヒドルゲナーゼの存在下で接触させデヒドロキシアセ
トンを生成する工程、生成したデヒドロキシアセトンに
ルシゲニンを接触させて光を生じさせる工程、及び生じ
た光を定量測定する工程又は、特定物質又は特定物質に
対して親和性を有する物質との結合において特定物質と
同等の能力を有する物質と検出されるべきＡＬＰから形
成される既知量の複合体を特定物質に対して親和性を有
する物質に対して競合的に結合させる工程、特定物質に
対して親和性を有する物質と結合しなかった、特定物質
又は特定物質に対して親和性を有する物質との結合にお
いて特定物質と同等の能力を有する物質と検出されるべ
きＡＬＰから形成された複合体を分離する工程、特定物
質に対して親和性を有する物質を含む複合体中のＡＬＰ
又は分離された複合体中のＡＬＰのいずれか一方又は両
方にニコチンアミノアデニンジヌクレオチドリン酸（Ｎ
ＡＤＰ）を接触させてニコチンアミノアデニンジヌクレ
オチド（ＮＡＤ）を生成させる工程、生成したニコチン
アミノアデニンジヌクレオチドにグリセロールをグリセ
ロールデヒドルゲナーゼの存在下で接触させデヒドロキ
シアセトンを生成する工程、生成したデヒドロキシアセ
トンにルシゲニンを接触させて光を生じさせる工程、及
び生じた光を定量測定する工程からなる特定物質の検出
方法を提供するものである。以下、本発明を詳細に説明
する。
【００１０】本発明は、グリセロール−３−リン酸をＡ
ＬＰの酵素基質として使用し、生成したグリセロールに
ニコチンアミノアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）をグ
リセロールデヒドルゲナーゼの存在下で接触させデヒド
ロキシアセトンを生成させるか、またはニコチンアミノ
アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）をＡＬＰの
酵素基質として使用し、生成したニコチンアミノアデニ
ンジヌクレオチドにグリセロールをグリセロールデヒド
ルゲナーゼの存在下で接触させデヒドロキシアセトンを
生成させて、生成したデヒドロキシアセトンにルシゲニ
ンを接触させて生じる発光の光量を測定してＡＬＰを検
出するものである。
ＬＰの酵素基質として使用し、生成したグリセロールに
ニコチンアミノアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）をグ
リセロールデヒドルゲナーゼの存在下で接触させデヒド
ロキシアセトンを生成させるか、またはニコチンアミノ
アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）をＡＬＰの
酵素基質として使用し、生成したニコチンアミノアデニ
ンジヌクレオチドにグリセロールをグリセロールデヒド
ルゲナーゼの存在下で接触させデヒドロキシアセトンを
生成させて、生成したデヒドロキシアセトンにルシゲニ
ンを接触させて生じる発光の光量を測定してＡＬＰを検
出するものである。
【００１１】グリセロール−３−リン酸またはニコチン
アミノアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）とＡ
ＬＰの反応はＡＬＰが酵素活性を発現し得るｐＨの範囲
で接触させればよく、その際の反応液の組成等に制限は
ないが、特にｐＨ９−１１程度が好ましい。
アミノアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）とＡ
ＬＰの反応はＡＬＰが酵素活性を発現し得るｐＨの範囲
で接触させればよく、その際の反応液の組成等に制限は
ないが、特にｐＨ９−１１程度が好ましい。
【００１２】次に、上記の工程により生じるグリセロー
ルもしくはニコチンアミノアデニンジヌクレオチドをグ
リセロールデヒドロゲナーゼの存在下でニコチンアミノ
アデニンジヌクレオチドもしくはグリセロールと接触さ
せることで、デヒドロキシアセトンを生成させる。その
際の条件はグリセロールデヒドロゲナーゼが酵素活性を
発現し得るｐＨであればよく、反応液の組成等に制限は
ないが、特にｐＨ８−１０程度が好ましい。
ルもしくはニコチンアミノアデニンジヌクレオチドをグ
リセロールデヒドロゲナーゼの存在下でニコチンアミノ
アデニンジヌクレオチドもしくはグリセロールと接触さ
せることで、デヒドロキシアセトンを生成させる。その
際の条件はグリセロールデヒドロゲナーゼが酵素活性を
発現し得るｐＨであればよく、反応液の組成等に制限は
ないが、特にｐＨ８−１０程度が好ましい。
【００１３】以上の工程で生じるデヒドロキシアセトン
をアルカリ条件下、好ましくは強アルカリ条件下でルシ
ゲニンと接触させることで、光を生じさせることができ
る。生じた光は、通常のルミノメーター等を使用して、
光を生じる反応を起こしてから一定時間の光を積算する
等の通常の測定法に従って行えば良いが、場合によって
は一定時間後の瞬間的な光強度を測定するのみでも良
い。測定結果からＡＬＰの量を判断するには、既知量の
ＡＬＰを使用して前もって測定した結果から作成される
標準曲線と未知のＡＬＰを含む試料からの結果を比較す
る等すれば良い。以上に説明したＡＬＰの検出方法は、
ＡＬＰが単独で試料中に存在している場合はもちろん、
ＡＬＰが例えば核酸、抗原、抗体、アビジン、リガン
ド、又はレセプター等と結合している場合であっても、
その結合により酵素活性が阻害されていない限り適用し
得、更にこれらを介して他のタンパク質、核酸等と複合
体を形成していても良い。
をアルカリ条件下、好ましくは強アルカリ条件下でルシ
ゲニンと接触させることで、光を生じさせることができ
る。生じた光は、通常のルミノメーター等を使用して、
光を生じる反応を起こしてから一定時間の光を積算する
等の通常の測定法に従って行えば良いが、場合によって
は一定時間後の瞬間的な光強度を測定するのみでも良
い。測定結果からＡＬＰの量を判断するには、既知量の
ＡＬＰを使用して前もって測定した結果から作成される
標準曲線と未知のＡＬＰを含む試料からの結果を比較す
る等すれば良い。以上に説明したＡＬＰの検出方法は、
ＡＬＰが単独で試料中に存在している場合はもちろん、
ＡＬＰが例えば核酸、抗原、抗体、アビジン、リガン
ド、又はレセプター等と結合している場合であっても、
その結合により酵素活性が阻害されていない限り適用し
得、更にこれらを介して他のタンパク質、核酸等と複合
体を形成していても良い。
【００１４】本発明が提供するＡＬＰの検出方法は、前
述の通り試料中の特定物質を検出する場合の一部をなす
ものである。以下に本発明のＡＬＰの検出方法を一部分
とする試料中の特定物質の検出方法について説明する。
本発明でいう特定物質とは、例えば、抗原、抗体、アビ
ジン、リガンド、レセプター又は核酸等の、血液や細胞
抽出液等の生体試料等に、天然に又は何等かの疾患やウ
イルス感染等に起因して観察される物質が例示できる。
述の通り試料中の特定物質を検出する場合の一部をなす
ものである。以下に本発明のＡＬＰの検出方法を一部分
とする試料中の特定物質の検出方法について説明する。
本発明でいう特定物質とは、例えば、抗原、抗体、アビ
ジン、リガンド、レセプター又は核酸等の、血液や細胞
抽出液等の生体試料等に、天然に又は何等かの疾患やウ
イルス感染等に起因して観察される物質が例示できる。
【００１５】本発明で提供される試料中の特定物質の検
出方法は、前述したＡＬＰの検出方法の工程に先立ちＡ
ＬＰと特定物質とで複合体を形成させ、後に前述の様な
方法でＡＬＰを検出することでこの特定物質の試料中の
量を知ろうとするものであり、大きく分けてサンドイッ
チ法と競争法からなる。
出方法は、前述したＡＬＰの検出方法の工程に先立ちＡ
ＬＰと特定物質とで複合体を形成させ、後に前述の様な
方法でＡＬＰを検出することでこの特定物質の試料中の
量を知ろうとするものであり、大きく分けてサンドイッ
チ法と競争法からなる。
【００１６】まずサンドイッチ法について説明するが、
一部の説明は競争法についても適用し得ることは言うま
でもない。この方法では、まず少なくとも特定物質、特
定物質に対して親和性を有する物質及び検出されるべき
ＡＬＰからなる複合体を形成させるが、このためにＡＬ
Ｐを特定物質に対して親和性を有する物質をと直接又は
間接的に結合させる。ＡＬＰと特定物質に対して親和性
を有する物質を直接的に結合させるには、例えばピリジ
ルジスルフィド法（石川栄治 他編、酵素免疫測定法、
医学書院、１９８７年、ｐ７５−）等を行えば良い。一
方これらを間接的に結合させるには、ＡＬＰを、特定物
質に対して親和性を有する物質、に対して親和性を有す
る物質に結合させておき、この物質を介して結合させれ
ば良い。ＡＬＰを間接的に結合させる方法については、
具体的に、特定物質が抗原で、これに対して親和性を有
する物質が抗体（抗特定物質抗体）である場合に、該抗
特定物質抗体に対する抗体を調製し、これとＡＬＰを結
合することが例示できる。この場合、少なくとも特定物
質−抗特定物質抗体−抗（抗特定物質抗体）−ＡＬＰと
いう複合体が出現することになる。
一部の説明は競争法についても適用し得ることは言うま
でもない。この方法では、まず少なくとも特定物質、特
定物質に対して親和性を有する物質及び検出されるべき
ＡＬＰからなる複合体を形成させるが、このためにＡＬ
Ｐを特定物質に対して親和性を有する物質をと直接又は
間接的に結合させる。ＡＬＰと特定物質に対して親和性
を有する物質を直接的に結合させるには、例えばピリジ
ルジスルフィド法（石川栄治 他編、酵素免疫測定法、
医学書院、１９８７年、ｐ７５−）等を行えば良い。一
方これらを間接的に結合させるには、ＡＬＰを、特定物
質に対して親和性を有する物質、に対して親和性を有す
る物質に結合させておき、この物質を介して結合させれ
ば良い。ＡＬＰを間接的に結合させる方法については、
具体的に、特定物質が抗原で、これに対して親和性を有
する物質が抗体（抗特定物質抗体）である場合に、該抗
特定物質抗体に対する抗体を調製し、これとＡＬＰを結
合することが例示できる。この場合、少なくとも特定物
質−抗特定物質抗体−抗（抗特定物質抗体）−ＡＬＰと
いう複合体が出現することになる。
【００１７】特定物質に対して親和性を有する物質と
は、例えば特定物質が蛋白質性の物質である場合には抗
体が例示でき、特に特定物質が核酸である場合には当該
核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸が例示
できる。また例えば特定物質がサイトカインやホルモン
である場合には、そのレセプターが例示でき、特定物質
が薬物や酵素である場合には阻害作用を有する化学物質
や低分子蛋白等のリガンドが例示できる。
は、例えば特定物質が蛋白質性の物質である場合には抗
体が例示でき、特に特定物質が核酸である場合には当該
核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸が例示
できる。また例えば特定物質がサイトカインやホルモン
である場合には、そのレセプターが例示でき、特定物質
が薬物や酵素である場合には阻害作用を有する化学物質
や低分子蛋白等のリガンドが例示できる。
【００１８】このようにすることで、特定物質の量と相
関する量のＡＬＰが形成された複合体中に含まれること
になる。続いて複合体に含まれないＡＬＰの除去を行
う。このためには、複合体中に含まれる特定物質に対し
て親和性を有する物質とは異なる部位で特定物質と結合
する、第２の特定物質に対して親和性を有する物質を使
用することが例示できる。例えば、複合体を形成させる
反応を生じさせる反応容器の内壁等にこのような第２の
特定物質に対して親和性を有する物質を固定化しておけ
ば、最終的には、ＡＬＰ−特定物質に対して親和性を有
する物質−特定物質−第２の特定物質に対して親和性を
有する物質−内壁、というようにＡＬＰを含む複合体を
固定化することとなり、後に反応容器を洗浄するなどす
れば複合体に含まれないＡＬＰ（ＡＬＰと特定物質に対
して親和性を有する物質が直接または間接的に結合した
もの）を分離、除去することが可能となる。
関する量のＡＬＰが形成された複合体中に含まれること
になる。続いて複合体に含まれないＡＬＰの除去を行
う。このためには、複合体中に含まれる特定物質に対し
て親和性を有する物質とは異なる部位で特定物質と結合
する、第２の特定物質に対して親和性を有する物質を使
用することが例示できる。例えば、複合体を形成させる
反応を生じさせる反応容器の内壁等にこのような第２の
特定物質に対して親和性を有する物質を固定化しておけ
ば、最終的には、ＡＬＰ−特定物質に対して親和性を有
する物質−特定物質−第２の特定物質に対して親和性を
有する物質−内壁、というようにＡＬＰを含む複合体を
固定化することとなり、後に反応容器を洗浄するなどす
れば複合体に含まれないＡＬＰ（ＡＬＰと特定物質に対
して親和性を有する物質が直接または間接的に結合した
もの）を分離、除去することが可能となる。
【００１９】前記の例では、第２の特定物質に対して親
和性を有する物質を反応容器の内壁に固定化する例を示
したが、内壁ではなく、別途調製されたビーズ等を使用
することもできる。このようなビーズに、例えば磁性物
質を混入しておけば、複合体を形成させ、当該ビーズに
固定化する反応の際に反応液を簡単に攪拌することもで
きる。このようなビーズは、従来のＥＩＡにおいて公知
である。
和性を有する物質を反応容器の内壁に固定化する例を示
したが、内壁ではなく、別途調製されたビーズ等を使用
することもできる。このようなビーズに、例えば磁性物
質を混入しておけば、複合体を形成させ、当該ビーズに
固定化する反応の際に反応液を簡単に攪拌することもで
きる。このようなビーズは、従来のＥＩＡにおいて公知
である。
【００２０】一方、複合体に含まれないＡＬＰの分離、
除去は、前記したような固定化された第２の特定物質に
対して親和性を有する物質を使用することなく実施する
ことも可能である。即ち、複合体に含まれるＡＬＰと、
複合体に含まれないＡＬＰでは見かけの分子量が異なる
ことから、例えば高速液体クロマトグラフィー等に供す
ることでもこれを分離できる。
除去は、前記したような固定化された第２の特定物質に
対して親和性を有する物質を使用することなく実施する
ことも可能である。即ち、複合体に含まれるＡＬＰと、
複合体に含まれないＡＬＰでは見かけの分子量が異なる
ことから、例えば高速液体クロマトグラフィー等に供す
ることでもこれを分離できる。
【００２１】以上のようにして、複合体に含まれるＡＬ
Ｐと複合体に含まれないＡＬＰを分離した後、前述した
ＡＬＰの検出方法に従っていずれかのＡＬＰの検出を行
うことで、試料中の特定物質の量を知ることができる。
ここで、複合体に含まれるＡＬＰの量は特定物質の量に
相関しているためこれを検出することが好ましいが、既
知量のＡＬＰ（ＡＬＰと特定物質に対して親和性を有す
る物質が直接又は間接的に結合したもの）を使用した場
合には分離、除去されたＡＬＰの量を検出することによ
っても試料中の特定物質の量を知ることができる。
Ｐと複合体に含まれないＡＬＰを分離した後、前述した
ＡＬＰの検出方法に従っていずれかのＡＬＰの検出を行
うことで、試料中の特定物質の量を知ることができる。
ここで、複合体に含まれるＡＬＰの量は特定物質の量に
相関しているためこれを検出することが好ましいが、既
知量のＡＬＰ（ＡＬＰと特定物質に対して親和性を有す
る物質が直接又は間接的に結合したもの）を使用した場
合には分離、除去されたＡＬＰの量を検出することによ
っても試料中の特定物質の量を知ることができる。
【００２２】次に競争法について説明する。競争法にお
いても、特定物質に対して親和性を有する物質を使用す
る。また、この特定物質に対して親和性を有する物質と
の結合において特定物質と同等の能力を有する物質をも
使用する。このような特定物質と同等の能力を有する物
質としては、予め調製された特定物質そのもの、特定物
質中に存在する親和性を有する物質により認識される部
分等がある。
いても、特定物質に対して親和性を有する物質を使用す
る。また、この特定物質に対して親和性を有する物質と
の結合において特定物質と同等の能力を有する物質をも
使用する。このような特定物質と同等の能力を有する物
質としては、予め調製された特定物質そのもの、特定物
質中に存在する親和性を有する物質により認識される部
分等がある。
【００２３】このような特定物質と同等の能力を有する
物質とＡＬＰを予め直接又は間接的に結合させた複合体
を、試料中の特定物と共に特定物質に対して親和性を有
する物質に対して競争的に結合させてＡＬＰ−特定物質
と同等の能力を有する物質−特定物質に対して親和性を
有する物質からなる複合体を形成させ、後にこのような
複合体を形成していないＡＬＰ−特定物質と同等の能力
を有する物質からなる複合体を分離する。競争法におい
ては、既知量のＡＬＰ−特定物質と同等の能力を有する
物質からなる複合体を特定物質と共に特定物質に対して
親和性を有する物質に対して結合させる点が特徴であ
る。
物質とＡＬＰを予め直接又は間接的に結合させた複合体
を、試料中の特定物と共に特定物質に対して親和性を有
する物質に対して競争的に結合させてＡＬＰ−特定物質
と同等の能力を有する物質−特定物質に対して親和性を
有する物質からなる複合体を形成させ、後にこのような
複合体を形成していないＡＬＰ−特定物質と同等の能力
を有する物質からなる複合体を分離する。競争法におい
ては、既知量のＡＬＰ−特定物質と同等の能力を有する
物質からなる複合体を特定物質と共に特定物質に対して
親和性を有する物質に対して結合させる点が特徴であ
る。
【００２４】ＡＬＰ−特定物質と同等の能力を有する物
質からなる複合体を分離するには、サンドイッチ法にお
ける複合体を形成していないＡＬＰを分離、除去するの
と同様に、特定物質に対して親和性を有する物質を反応
容器の内壁やビーズ等に固定化しておき洗浄したり、あ
るいは液体クロマトグラフィー等を実施すれば良い。競
争法においては分離された成分のＡＬＰを検出しても良
いし、ＡＬＰ−特定物質と同等の能力を有する物質−特
定物質に対して親和性を有する物質との複合体中のＡＬ
Ｐを検出しても良い。なお、競争法における特定物質、
特定物質に対して親和性を有する物質等はサンドイッチ
法におけるそれと同様の意味である。またサンドイッチ
法及び競争の基本的な原理については、例えばＥ．Ｉｓ
ｈｉｋａｗａら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
８、７、１９７８年等の記載を参照することができる。
質からなる複合体を分離するには、サンドイッチ法にお
ける複合体を形成していないＡＬＰを分離、除去するの
と同様に、特定物質に対して親和性を有する物質を反応
容器の内壁やビーズ等に固定化しておき洗浄したり、あ
るいは液体クロマトグラフィー等を実施すれば良い。競
争法においては分離された成分のＡＬＰを検出しても良
いし、ＡＬＰ−特定物質と同等の能力を有する物質−特
定物質に対して親和性を有する物質との複合体中のＡＬ
Ｐを検出しても良い。なお、競争法における特定物質、
特定物質に対して親和性を有する物質等はサンドイッチ
法におけるそれと同様の意味である。またサンドイッチ
法及び競争の基本的な原理については、例えばＥ．Ｉｓ
ｈｉｋａｗａら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
８、７、１９７８年等の記載を参照することができる。
【００２５】更に本発明は、以上のようなＡＬＰの検出
方法、ＡＬＰの検出方法をその一部とする試料中の特定
物質の検出方法を実施するための検出キットを提供する
ものである。具体的には少なくともグリセロール−３−
リン酸またはニコチンアミノアデニンジヌクレオチドリ
ン酸（ＮＡＤＰ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ル
シゲニンを含むものである。これらに加えて、例えば試
料中の特定物質を検出するため、特定物質に対して親和
性を有する物質等が加えられても良い。これらは例えば
凍結乾燥等の処理を施しておけば長期の保存にも適した
ものとなる。
方法、ＡＬＰの検出方法をその一部とする試料中の特定
物質の検出方法を実施するための検出キットを提供する
ものである。具体的には少なくともグリセロール−３−
リン酸またはニコチンアミノアデニンジヌクレオチドリ
ン酸（ＮＡＤＰ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ル
シゲニンを含むものである。これらに加えて、例えば試
料中の特定物質を検出するため、特定物質に対して親和
性を有する物質等が加えられても良い。これらは例えば
凍結乾燥等の処理を施しておけば長期の保存にも適した
ものとなる。
【００２６】このような検出キットに未知量のＡＬＰを
含む、例えば純粋なＡＬＰ試料や先に説明したような試
料中の特定物質の量に相関して形成された複合体に含ま
れるＡＬＰを添加することで、ＡＬＰの量を検出し強い
ては試料中の特定物質の量を知ることができる。
含む、例えば純粋なＡＬＰ試料や先に説明したような試
料中の特定物質の量に相関して形成された複合体に含ま
れるＡＬＰを添加することで、ＡＬＰの量を検出し強い
ては試料中の特定物質の量を知ることができる。
【００２７】
【実施例】以下に本発明を詳細に説明するために実施例
を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
を記載するが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
【００２８】実施例１ チューブまたはマイクロタイタープレートに０．２５ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９．８）で希釈したＡＬＰ標準溶液２５マイクロ
ｌと、同緩衝液で調製した０．１ｍＭ ＮＡＤＰ溶液２
５マイクロｌを加え、３７℃２時間反応させる。反応溶
液にさらに０．１Ｍグリシン−水酸化カリウム緩衝液
（ｐＨ９．０）で調製した０．１Ｍグリセロール溶液及
び１Ｕ／ｍｌグリセロールデヒドロゲナーゼ溶液を各々
２５マイクロｌずつ加え、３７℃３０分間反応させる。
反応溶液に２Ｎ硫酸溶液１０マイクロｌを加え酵素反応
を停止した後、１Ｍ水酸化カリウム溶液５０マイクロｌ
と、０．００５％ トリトンＸ−１００を含む８×１０
−４％ルシゲニン溶液５０マイクロｌを加え、生じる発
光をルミネッセンスリーダー（コロナ社製）で測定し
た。その結果、ＡＬＰの最小検出感度は０．１２５ａｍ
ｏｌ／ａｓｓａｙであった。
Ｍ塩化マグネシウムを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９．８）で希釈したＡＬＰ標準溶液２５マイクロ
ｌと、同緩衝液で調製した０．１ｍＭ ＮＡＤＰ溶液２
５マイクロｌを加え、３７℃２時間反応させる。反応溶
液にさらに０．１Ｍグリシン−水酸化カリウム緩衝液
（ｐＨ９．０）で調製した０．１Ｍグリセロール溶液及
び１Ｕ／ｍｌグリセロールデヒドロゲナーゼ溶液を各々
２５マイクロｌずつ加え、３７℃３０分間反応させる。
反応溶液に２Ｎ硫酸溶液１０マイクロｌを加え酵素反応
を停止した後、１Ｍ水酸化カリウム溶液５０マイクロｌ
と、０．００５％ トリトンＸ−１００を含む８×１０
−４％ルシゲニン溶液５０マイクロｌを加え、生じる発
光をルミネッセンスリーダー（コロナ社製）で測定し
た。その結果、ＡＬＰの最小検出感度は０．１２５ａｍ
ｏｌ／ａｓｓａｙであった。
【００２９】実施例２ チューブまたはマイクロタイタープレートに０．２５ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９．８）で希釈したＡＬＰ標準溶液２５マイクロ
ｌと、同緩衝液で調製した０．５ｍＭ グリセロール−
３−リン酸溶液２５マイクロｌを加え、３７℃２時間反
応させる。反応溶液にさらに０．１Ｍグリシン−水酸化
カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で調製した５ｍＭ ＮＡ
Ｄ溶液及び１Ｕ／ｍｌグリセロールデヒドロゲナーゼ溶
液を各々２５マイクロｌずつ加え、３７℃１５分間反応
させる。反応溶液に２Ｎ硫酸溶液１０マイクロｌを加え
酵素反応を停止した後、１Ｍ水酸化カリウム溶液５０マ
イクロｌと、０．００５％トリトンＸ−１００を含む８
×１０−４％ルシゲニン溶液５０マイクロｌを加え、生
じる発光を実施例１と同様に測定した。その結果、ＡＬ
Ｐの最小検出感度は０．２５ａｍｏｌ／ａｓｓａｙであ
った。
Ｍ塩化マグネシウムを含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９．８）で希釈したＡＬＰ標準溶液２５マイクロ
ｌと、同緩衝液で調製した０．５ｍＭ グリセロール−
３−リン酸溶液２５マイクロｌを加え、３７℃２時間反
応させる。反応溶液にさらに０．１Ｍグリシン−水酸化
カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で調製した５ｍＭ ＮＡ
Ｄ溶液及び１Ｕ／ｍｌグリセロールデヒドロゲナーゼ溶
液を各々２５マイクロｌずつ加え、３７℃１５分間反応
させる。反応溶液に２Ｎ硫酸溶液１０マイクロｌを加え
酵素反応を停止した後、１Ｍ水酸化カリウム溶液５０マ
イクロｌと、０．００５％トリトンＸ−１００を含む８
×１０−４％ルシゲニン溶液５０マイクロｌを加え、生
じる発光を実施例１と同様に測定した。その結果、ＡＬ
Ｐの最小検出感度は０．２５ａｍｏｌ／ａｓｓａｙであ
った。
【００３０】実施例３ マイクロタイタープレートにコーティング緩衝液である
０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０１５Ｍ炭酸ナ
トリウム−０．０３５Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．
６）緩衝液を用いて希釈した１０マイクロｌ／ｍｌ抗ウ
サギＩｇＧを２５０マイクロｌずつ各ウエルに加え、４
℃で一夜放置し、抗体を吸着させる。次いで、固相化し
たプレートに０．０５％アジ化ナトリウムをふくむ２５
％ブロックエース水溶液を３００マイクロｌずつ加え、
ブロッキングを行った。
０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０１５Ｍ炭酸ナ
トリウム−０．０３５Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．
６）緩衝液を用いて希釈した１０マイクロｌ／ｍｌ抗ウ
サギＩｇＧを２５０マイクロｌずつ各ウエルに加え、４
℃で一夜放置し、抗体を吸着させる。次いで、固相化し
たプレートに０．０５％アジ化ナトリウムをふくむ２５
％ブロックエース水溶液を３００マイクロｌずつ加え、
ブロッキングを行った。
【００３１】このようにして調製した抗体固定化プレー
トに０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．
１％ゼラチン、０．０５％アジ化ナトリウムで希釈した
既知濃度のコレシストキニン（ＣＣＫ）溶液又は試料溶
液５０マイクロｌ、同緩衝液で希釈した抗ＣＣＫ抗体溶
液及びＣＣＫ−ＡＬＰ標識体を各々２５マイクロｌずつ
加え４℃で７２時間競合反応を行った。つづいて生理食
塩水（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％アジ化ナ
トリウム）を各ウエル２００マイクロｌずつ加え、３回
洗浄後、０．０２５ｍＭ ＮＡＤＰ溶液１００マイクロ
ｌを加え３７℃で２時間反応させた。つづいて０．１５
Ｍグリセロール溶液及び１．５Ｕ／ｍｌグリセロールデ
ヒドロゲナーゼ溶液を各１５マイクロｌずつ加え３７℃
で３０分間反応させ、２Ｎ硫酸溶液１０マイクロｌを加
え酵素反応を停止後、１Ｍ水酸化カリウム溶液５０マイ
クロｌと０．００５％トリトンＸ−１００を含む８×１
０−４％ルシゲニン溶液５０マイクロｌを加え、生じる
発光を実施例１と同様に測定した。結果を図１に示す。
本法によるＣＣＫの最小検出感度は０．２ｐｇ／ａｓｓ
ａｙであった。 実施例４ マイクロタイタープレートにコーティング緩衝液である
０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０１５Ｍ炭酸ナ
トリウム−０．０３５Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．
６）緩衝液を用いて希釈した１０マイクロｌ／ｍｌ抗ヒ
ト絨毛性ゴナドトロビン（ｈＣＧ）抗体を２５０マイク
ロｌずつ各ウエルに加え、４℃で一夜放置し、抗体を吸
着させる。次いで、固相化したプレートに０．０５％ア
ジ化ナトリウムをふくむ２５％ブロックエース水溶液を
３００マイクロｌずつ加え、ブロッキングを行った。
トに０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．
１％ゼラチン、０．０５％アジ化ナトリウムで希釈した
既知濃度のコレシストキニン（ＣＣＫ）溶液又は試料溶
液５０マイクロｌ、同緩衝液で希釈した抗ＣＣＫ抗体溶
液及びＣＣＫ−ＡＬＰ標識体を各々２５マイクロｌずつ
加え４℃で７２時間競合反応を行った。つづいて生理食
塩水（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％アジ化ナ
トリウム）を各ウエル２００マイクロｌずつ加え、３回
洗浄後、０．０２５ｍＭ ＮＡＤＰ溶液１００マイクロ
ｌを加え３７℃で２時間反応させた。つづいて０．１５
Ｍグリセロール溶液及び１．５Ｕ／ｍｌグリセロールデ
ヒドロゲナーゼ溶液を各１５マイクロｌずつ加え３７℃
で３０分間反応させ、２Ｎ硫酸溶液１０マイクロｌを加
え酵素反応を停止後、１Ｍ水酸化カリウム溶液５０マイ
クロｌと０．００５％トリトンＸ−１００を含む８×１
０−４％ルシゲニン溶液５０マイクロｌを加え、生じる
発光を実施例１と同様に測定した。結果を図１に示す。
本法によるＣＣＫの最小検出感度は０．２ｐｇ／ａｓｓ
ａｙであった。 実施例４ マイクロタイタープレートにコーティング緩衝液である
０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０１５Ｍ炭酸ナ
トリウム−０．０３５Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．
６）緩衝液を用いて希釈した１０マイクロｌ／ｍｌ抗ヒ
ト絨毛性ゴナドトロビン（ｈＣＧ）抗体を２５０マイク
ロｌずつ各ウエルに加え、４℃で一夜放置し、抗体を吸
着させる。次いで、固相化したプレートに０．０５％ア
ジ化ナトリウムをふくむ２５％ブロックエース水溶液を
３００マイクロｌずつ加え、ブロッキングを行った。
【００３２】このようにして調製した抗体固定化プレー
トに０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．
１％ゼラチン、０．０５％アジ化ナトリウムで希釈した
既知濃度のｈＣＧ溶液又は試料溶液１００マイクロｌを
加え、３７℃で１時間反応を行った。つづいて生理食塩
水（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％アジ化ナト
リウム）を各ウエル２００マイクロｌずつ加え、３回洗
浄後、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、
０．１％ゼラチン、０．０５％アジ化ナトリウムで希釈
した抗ｈＣＧ抗体−ＡＬＰ標識体溶液１００マイクロｌ
を加え、３７℃で１時間反応を行った。つづいて生理食
塩水（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％アジ化ナ
トリウム）を各ウエル２００マイクロｌずつ加え、３回
洗浄後、実施例３と同様の方法でルシゲニンを用いる化
学発光法で測定した。結果を図２に示す。本法によるｈ
ＣＧの最小検出感度は０．００５ｍＩＵ／ｍｌであっ
た。
トに０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．
１％ゼラチン、０．０５％アジ化ナトリウムで希釈した
既知濃度のｈＣＧ溶液又は試料溶液１００マイクロｌを
加え、３７℃で１時間反応を行った。つづいて生理食塩
水（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％アジ化ナト
リウム）を各ウエル２００マイクロｌずつ加え、３回洗
浄後、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、
０．１％ゼラチン、０．０５％アジ化ナトリウムで希釈
した抗ｈＣＧ抗体−ＡＬＰ標識体溶液１００マイクロｌ
を加え、３７℃で１時間反応を行った。つづいて生理食
塩水（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％アジ化ナ
トリウム）を各ウエル２００マイクロｌずつ加え、３回
洗浄後、実施例３と同様の方法でルシゲニンを用いる化
学発光法で測定した。結果を図２に示す。本法によるｈ
ＣＧの最小検出感度は０．００５ｍＩＵ／ｍｌであっ
た。
【００３３】
【発明の効果】本発明では、ＡＬＰにＮＡＤＰもしくは
グリセロール−３−リン酸を接触させてＮＡＤもしくは
グリセロールを生成させ、さらにグリセロールもしくは
ＮＡＤをグリセロールデヒドルゲナーゼの存在下で接触
させデヒドロキシアセトンを生成させ、さらにルシゲニ
ンを接触させて光を生じさせ、その光を定量測定するこ
とでＡＬＰを高感度で検出することが可能である。
グリセロール−３−リン酸を接触させてＮＡＤもしくは
グリセロールを生成させ、さらにグリセロールもしくは
ＮＡＤをグリセロールデヒドルゲナーゼの存在下で接触
させデヒドロキシアセトンを生成させ、さらにルシゲニ
ンを接触させて光を生じさせ、その光を定量測定するこ
とでＡＬＰを高感度で検出することが可能である。
【図１】図１は実施例１の結果を示すものである。横軸
は測定されるべきＡＬＰの濃度をｍｏｌｅ／ｌの単位で
示したものであり、縦軸は各ＡＬＰ濃度の時の光強度を
ｃｏｕｎｔの単位で示したものである。
は測定されるべきＡＬＰの濃度をｍｏｌｅ／ｌの単位で
示したものであり、縦軸は各ＡＬＰ濃度の時の光強度を
ｃｏｕｎｔの単位で示したものである。
【図２】図２は実施例２の結果を示すものである。横軸
は測定されるべきＡＬＰの濃度をｍｏｌｅ／ｌの単位で
示したものであり、縦軸は各ＡＬＰ濃度の時の光強度を
ｃｏｕｎｔの単位で示したものである。
は測定されるべきＡＬＰの濃度をｍｏｌｅ／ｌの単位で
示したものであり、縦軸は各ＡＬＰ濃度の時の光強度を
ｃｏｕｎｔの単位で示したものである。
【図３】図３は実施例３の結果を示すものである。横軸
は測定されるべきＣＣＫの濃度をｐｇ／ａｓｓｓａｙの
単位で示したものであり、縦軸はＣＣＫ濃度０の時の光
強度を１００％としたときの各ＣＣＫ濃度のサンプルを
測定したときの光強度の割合（Ｂ／Ｂ０）を示したもの
である。
は測定されるべきＣＣＫの濃度をｐｇ／ａｓｓｓａｙの
単位で示したものであり、縦軸はＣＣＫ濃度０の時の光
強度を１００％としたときの各ＣＣＫ濃度のサンプルを
測定したときの光強度の割合（Ｂ／Ｂ０）を示したもの
である。
【図４】図４は実施例４の結果を示すものである。横軸
は測定されるべきｈＣＧの濃度をｍＩＵ／ｍｌの単位で
示したものであり、縦軸は各ｈＣＧ濃度の時の光強度を
ｃｏｕｎｔの単位で示したものである。
は測定されるべきｈＣＧの濃度をｍＩＵ／ｍｌの単位で
示したものであり、縦軸は各ｈＣＧ濃度の時の光強度を
ｃｏｕｎｔの単位で示したものである。
Claims (11)
- 【請求項１】 検出されるべきアルカリ性フォスファタ
ーゼ（ＡＬＰ）にグリセロール−３−リン酸を接触させ
てグリセロールを生成させる工程、生成したグリセロー
ルにニコチンアミノアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）
をグリセロールデヒドルゲナーゼの存在下で接触させデ
ヒドロキシアセトンを生成する工程、生成したデヒドロ
キシアセトンにルシゲニンを接触させて光を生じさせる
工程、及び生じた光を定量測定する工程からなるＡＬＰ
の検出方法。 - 【請求項２】 検出されるべきＡＬＰにニコチンアミノ
アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を接触させ
てニコチンアミノアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を
生成させる工程、生成したニコチンアミノアデニンジヌ
クレオチドにグリセロールをグリセロールデヒドルゲナ
ーゼの存在下で接触させデヒドロキシアセトンを生成す
る工程、生成したデヒドロキシアセトンにルシゲニンを
接触させて光を生じさせる工程、及び生じた光を定量測
定する工程からなるＡＬＰの検出方法。 - 【請求項３】 検出されるべきＡＬＰが、核酸、抗原、
抗体、アビジン、リガンド又はレセプターと結合してい
ることを特徴とする請求項１又は２に記載のＡＬＰの検
出方法。 - 【請求項４】 少なくとも特定物質、特定物質に対して
親和性を有する物質及び検出されるべきＡＬＰからなる
複合体を形成させる工程、複合体を形成していない検出
されるべきＡＬＰを分離する工程、複合体を形成してい
るか又は複合体を形成していないＡＬＰのいずれか一方
あるいは両方にグリセロール−３−リン酸を接触させて
グリセロールを生成させる工程、生成したグリセロール
にニコチンアミノアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を
グリセロールデヒドルゲナーゼの存在下で接触させデヒ
ドロキシアセトンを生成する工程、生成したデヒドロキ
シアセトンにルシゲニンを接触させて光を生じさせる工
程、及び生じた光を定量測定する工程からなる特定物質
の検出方法。 - 【請求項５】 少なくとも特定物質、特定物質に対して
親和性を有する物質及び検出されるべきＡＬＰからなる
複合体を形成させる工程、複合体を形成していない検出
されるべきＡＬＰを分離する工程、複合体を形成してい
るか又は複合体を形成していないＡＬＰのいずれか一方
あるいは両方にニコチンアミノアデニンジヌクレオチド
リン酸（ＮＡＤＰ）を接触させてニコチンアミノアデニ
ンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を生成させる工程、生成し
たニコチンアミノアデニンジヌクレオチドにグリセロー
ルをグリセロールデヒドルゲナーゼの存在下で接触させ
デヒドロキシアセトンを生成する工程、生成したデヒド
ロキシアセトンにルシゲニンを接触させて光を生じさせ
る工程、及び生じた光を定量測定する工程からなる特定
物質の検出方法。 - 【請求項６】 検出されるべきＡＬＰが特定物質に対し
て親和性を有する物質と直接又は間接的に結合してお
り、複合体を形成しているＡＬＰと複合体を形成してい
ないＡＬＰの分離が特定物質に対して親和性を有する物
質とは異なる部位で特定物質と結合する物質であり水に
不溶化されているものを利用して達成されることを特徴
とする請求項４又は５に記載の特定物質の検出方法。 - 【請求項７】 特定物質又は特定物質に対して親和性を
有する物質との結合において特定物質と同等の能力を有
する物質と検出されるべきＡＬＰから形成される既知量
の複合体を特定物質に対して親和性を有する物質に対し
て競合的に結合させる工程、特定物質に対して親和性を
有する物質と結合しなかった、特定物質又は特定物質に
対して親和性を有する物質との結合において特定物質と
同等の能力を有する物質と検出されるべきＡＬＰから形
成された複合体を分離する工程、特定物質に対して親和
性を有する物質を含む複合体中のＡＬＰ又は分離された
複合体中のＡＬＰのいずれか一方又は両方にグリセロー
ル−３−リン酸を接触させてグリセロールを生成させる
工程、生成したグリセロールにニコチンアミノアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）をグリセロールデヒドルゲナ
ーゼの存在下で接触させデヒドロキシアセトンを生成す
る工程、生成したデヒドロキシアセトンにルシゲニンを
接触させて光を生じさせる工程、及び生じた光を定量測
定する工程からなる特定物質の検出方法。 - 【請求項８】 特定物質又は特定物質に対して親和性を
有する物質との結合において特定物質と同等の能力を有
する物質と検出されるべきＡＬＰから形成される既知量
の複合体を特定物質に対して親和性を有する物質に対し
て競合的に結合させる工程、特定物質に対して親和性を
有する物質と結合しなかった、特定物質又は特定物質に
対して親和性を有する物質との結合において特定物質と
同等の能力を有する物質と検出されるべきＡＬＰから形
成された複合体を分離する工程、特定物質に対して親和
性を有する物質を含む複合体中のＡＬＰ又は分離された
複合体中のＡＬＰのいずれか一方又は両方にニコチンア
ミノアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を接触
させてニコチンアミノアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ）を生成させる工程、生成したニコチンアミノアデニ
ンジヌクレオチドにグリセロールをグリセロールデヒド
ルゲナーゼの存在下で接触させデヒドロキシアセトンを
生成する工程、生成したデヒドロキシアセトンにルシゲ
ニンを接触させて光を生じさせる工程、及び生じた光を
定量測定する工程からなる特定物質の検出方法。 - 【請求項９】 特定物質に対して親和性を有する物質と
結合しなかった、特定物質又は特定物質に対して親和性
を有する物質との結合において特定物質と同等の能力を
有する物質と検出されるべきＡＬＰから形成された複合
体を分離する工程が、固定化された特定物質に対して親
和性を有する物質を利用して達成されることを特徴とす
る請求項７又は８に記載の特定物質の検出方法。 - 【請求項１０】 検出されるべきＡＬＰが、核酸、抗
原、抗体、アビジン、リガンド又はレセプターと結合し
ていることを特徴とする請求項４から９いずれかの項に
記載の特定物質の検出方法。 - 【請求項１１】請求項１〜１０いずれかに記載の検出方
法を行うための検出キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2884293A JPH06237796A (ja) | 1993-02-18 | 1993-02-18 | アルカリ性フォスファターゼの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2884293A JPH06237796A (ja) | 1993-02-18 | 1993-02-18 | アルカリ性フォスファターゼの検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06237796A true JPH06237796A (ja) | 1994-08-30 |
Family
ID=12259625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2884293A Pending JPH06237796A (ja) | 1993-02-18 | 1993-02-18 | アルカリ性フォスファターゼの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06237796A (ja) |
-
1993
- 1993-02-18 JP JP2884293A patent/JPH06237796A/ja active Pending
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