JPH06242111A - 標識物としてパーオキシダーゼを用いる化学発光分析方法 - Google Patents
標識物としてパーオキシダーゼを用いる化学発光分析方法Info
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- JPH06242111A JPH06242111A JP23639693A JP23639693A JPH06242111A JP H06242111 A JPH06242111 A JP H06242111A JP 23639693 A JP23639693 A JP 23639693A JP 23639693 A JP23639693 A JP 23639693A JP H06242111 A JPH06242111 A JP H06242111A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】標識物としてパーオキシダーゼを用い、増感剤
の存在下にルミノール／過酸化水素の化学発光反応を起
こさせて生体成分を測定する場合において、反応液中の
発光量を検出・測定する際に、反応液に第２級アルコー
ルポリエトキシレート、又はそれと共に脱脂乳及び／又
は卵白アルブミンを共存させ、発光量を検出・測定す
る。 【効果】非特異的発光反応すなわち試薬ブランク（ノイ
ズ）を低下させ、特異的発光反応すなわちシグナル量を
増強させ、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズの比）を向上さ
せる。したがって、測定値の信頼性が向上する。
の存在下にルミノール／過酸化水素の化学発光反応を起
こさせて生体成分を測定する場合において、反応液中の
発光量を検出・測定する際に、反応液に第２級アルコー
ルポリエトキシレート、又はそれと共に脱脂乳及び／又
は卵白アルブミンを共存させ、発光量を検出・測定す
る。 【効果】非特異的発光反応すなわち試薬ブランク（ノイ
ズ）を低下させ、特異的発光反応すなわちシグナル量を
増強させ、Ｓ／Ｎ比（シグナル／ノイズの比）を向上さ
せる。したがって、測定値の信頼性が向上する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、標識物としてパーオキ
シダーゼを用いる化学発光分析方法に関するもので、生
体の微量成分の分析、疾患の診断等に利用できる。
シダーゼを用いる化学発光分析方法に関するもので、生
体の微量成分の分析、疾患の診断等に利用できる。
【０００２】
【従来の技術】分析対象物質を感度よく検出・測定する
方法としては、その物質に特異的に結合する抗体等の特
異結合試薬（予め、パーオキシダーゼ等の酵素で標識し
ておく場合が多い）を検体と反応させ、引き続いて標識
物であるパーオキシダーゼ等の酵素の触媒反応により生
じる信号を検出・測定する方法（いわゆる、酵素免疫測
定法等）が知られている。また、この酵素免疫測定法に
は、一抗体法、二抗体法、サンドイッチ法、ホモジーニ
アス法、ヘテロジーニアス法等、種々の改良法又は変法
が知られている。
方法としては、その物質に特異的に結合する抗体等の特
異結合試薬（予め、パーオキシダーゼ等の酵素で標識し
ておく場合が多い）を検体と反応させ、引き続いて標識
物であるパーオキシダーゼ等の酵素の触媒反応により生
じる信号を検出・測定する方法（いわゆる、酵素免疫測
定法等）が知られている。また、この酵素免疫測定法に
は、一抗体法、二抗体法、サンドイッチ法、ホモジーニ
アス法、ヘテロジーニアス法等、種々の改良法又は変法
が知られている。
【０００３】パーオキシダーゼ等の酵素の触媒反応で生
成するシグナルを効率よく測定する方法として、パーオ
キシダーゼにより触媒されるルミノール／過酸化水素の
化学発光を測定する方法があり、この場合しばしば、ル
ミノールの一電子酸化を助けるラジカル安定化剤が増感
剤として用いられる（Methods in Enzymology,Vol.133,
p.331-353,1986；特開平２−２９１２９９号公報）。
成するシグナルを効率よく測定する方法として、パーオ
キシダーゼにより触媒されるルミノール／過酸化水素の
化学発光を測定する方法があり、この場合しばしば、ル
ミノールの一電子酸化を助けるラジカル安定化剤が増感
剤として用いられる（Methods in Enzymology,Vol.133,
p.331-353,1986；特開平２−２９１２９９号公報）。
【０００４】一方、パーオキシダーゼの活性はポリオキ
シエチレンエーテル類の添加により増大することも知ら
れており（Clinica Chimica Acta, 109, 177-181, 198
1; J.Clin. Chem. Clin. Biochem., 19, 435-439, 198
1)、また酵素免疫測定法において緩衝液中にポリオキシ
エチレンエーテル類を含有させ、Ｓ／Ｎ比もしくは測定
感度を高める方法も提案されている（特表平２−５０３
０２９号公報）。また従来、担体や抗体（もしくは抗
原）固定化担体の非特異的反応をブロックする目的で、
担体や抗体（もしくは抗原）固定化担体をアルブミン、
乳蛋白質、卵白アルブミン等の蛋白質で処理することは
知られている（特開平１−２１７２６６号公報、特開平
１−２２４６６５号公報）。
シエチレンエーテル類の添加により増大することも知ら
れており（Clinica Chimica Acta, 109, 177-181, 198
1; J.Clin. Chem. Clin. Biochem., 19, 435-439, 198
1)、また酵素免疫測定法において緩衝液中にポリオキシ
エチレンエーテル類を含有させ、Ｓ／Ｎ比もしくは測定
感度を高める方法も提案されている（特表平２−５０３
０２９号公報）。また従来、担体や抗体（もしくは抗
原）固定化担体の非特異的反応をブロックする目的で、
担体や抗体（もしくは抗原）固定化担体をアルブミン、
乳蛋白質、卵白アルブミン等の蛋白質で処理することは
知られている（特開平１−２１７２６６号公報、特開平
１−２２４６６５号公報）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】分析対象物質が生体の
超微量物質等である場合には、何よりも更に感度の高い
方法の開発が望まれている。本発明は、従来法よりも更
に感度の高い方法を開発すること目的とする。
超微量物質等である場合には、何よりも更に感度の高い
方法の開発が望まれている。本発明は、従来法よりも更
に感度の高い方法を開発すること目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、感度の高
い方法を開発するべく、ルミノールの一電子酸化を容易
にする増感剤の存在下にパーオキシダーゼを用い、ルミ
ノール／過酸化水素系で反応を行う化学発光分析を種々
検討したところ、反応液に第２級アルコールポリエトキ
シレートを存在させると、パーオキシダーゼの活性（シ
グナル）が増大し、試薬ブランク（ノイズ）が低下して
Ｓ／Ｎ比が向上すること、並びに反応液に第２級直鎖ア
ルコールポリエトキシレートとともに脱脂乳及び／又は
卵白アルブミンを共存させると、両者の効果が相乗的も
しくは相加的に働いて、Ｓ／Ｎ比が大幅に向上すること
を見出し、本発明を完成した。
い方法を開発するべく、ルミノールの一電子酸化を容易
にする増感剤の存在下にパーオキシダーゼを用い、ルミ
ノール／過酸化水素系で反応を行う化学発光分析を種々
検討したところ、反応液に第２級アルコールポリエトキ
シレートを存在させると、パーオキシダーゼの活性（シ
グナル）が増大し、試薬ブランク（ノイズ）が低下して
Ｓ／Ｎ比が向上すること、並びに反応液に第２級直鎖ア
ルコールポリエトキシレートとともに脱脂乳及び／又は
卵白アルブミンを共存させると、両者の効果が相乗的も
しくは相加的に働いて、Ｓ／Ｎ比が大幅に向上すること
を見出し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は下記の（１）及び
（２）に関する。 （１）増感剤の存在下に、パーオキシダーゼで標識した
分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水素を反応さ
せ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析方法に
おいて、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液
に第２級アルコールポリエトキシレートを存在させる、
化学発光分析方法。 （２）増感剤の存在下に、パーオキシダーゼで標識した
分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水素を反応さ
せ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析方法に
おいて、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液
に第２級アルコールポリエトキシレートとともに脱脂乳
及び／又は卵白アルブミンを存存させる、化学発光分析
方法。
（２）に関する。 （１）増感剤の存在下に、パーオキシダーゼで標識した
分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水素を反応さ
せ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析方法に
おいて、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液
に第２級アルコールポリエトキシレートを存在させる、
化学発光分析方法。 （２）増感剤の存在下に、パーオキシダーゼで標識した
分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水素を反応さ
せ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析方法に
おいて、反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液
に第２級アルコールポリエトキシレートとともに脱脂乳
及び／又は卵白アルブミンを存存させる、化学発光分析
方法。
【０００８】本発明に用いる第２級アルコールポリエト
キシレートは、化１
キシレートは、化１
【化１】 （化１中、Ｒ1及びＲ2は、同じであっても異なってもよ
い飽和脂肪族アルキル基、ｎは１以上の整数である）で
表される分枝アルキルポリオキシエチレンエーテルであ
る。
い飽和脂肪族アルキル基、ｎは１以上の整数である）で
表される分枝アルキルポリオキシエチレンエーテルであ
る。
【０００９】このような第２級アルコールポリエトキシ
レートとしては、旭電化工業（株）製「アデカトール
ＳＯ シリーズ」があり、アデカトール ＳＯ−８０、ア
デカトール ＳＯ−１０５、アデカトール ＳＯ−１２
０、アデカトール ＳＯ−１３５、アデカトール ＳＯ−
１４５、アデカトール ＳＯ−１６０等が使用できる。
レートとしては、旭電化工業（株）製「アデカトール
ＳＯ シリーズ」があり、アデカトール ＳＯ−８０、ア
デカトール ＳＯ−１０５、アデカトール ＳＯ−１２
０、アデカトール ＳＯ−１３５、アデカトール ＳＯ−
１４５、アデカトール ＳＯ−１６０等が使用できる。
【００１０】これら第２級アルコールポリエトキシレー
トは、反応に用いる緩衝液又は反応液に含有させる。そ
の使用量は、少なくとも化学発光のＳ／Ｎ比を向上させ
る量で、通常、０．０１〜１０重量％の範囲、好ましく
は０．０２〜２重量％の範囲で用いる。使用量が０．０
１重量％未満であると化学発光のＳ／Ｎ比を向上させる
程度が低く、１０重量％を超えると液の粘性が大きくな
り、試薬の均一な混合が困難となる。なお、以下本明細
書で単に％とあるのは、特に断わらない限り重量％を意
味する。
トは、反応に用いる緩衝液又は反応液に含有させる。そ
の使用量は、少なくとも化学発光のＳ／Ｎ比を向上させ
る量で、通常、０．０１〜１０重量％の範囲、好ましく
は０．０２〜２重量％の範囲で用いる。使用量が０．０
１重量％未満であると化学発光のＳ／Ｎ比を向上させる
程度が低く、１０重量％を超えると液の粘性が大きくな
り、試薬の均一な混合が困難となる。なお、以下本明細
書で単に％とあるのは、特に断わらない限り重量％を意
味する。
【００１１】本発明における化学発光分析は、増感剤の
存在下に、標識物であるパーオキシダーゼとルミノール
及び過酸化水素を反応させ、生じた発光を検出・測定す
る分析法であれば特に限定するものではなく、一抗体免
疫分析法、二抗体免疫分析法、競合分析法、サンドイッ
チ法、ホモジーニアス法、ヘテロジーニアス法、ウェス
ターン分析法、ＤＮＡプローブ法等の各種分析法に利用
できるが、特に、次のような固相サンドイッチ法に好適
に用いられる。以下、固相サンドイッチ法の手順等を説
明する。
存在下に、標識物であるパーオキシダーゼとルミノール
及び過酸化水素を反応させ、生じた発光を検出・測定す
る分析法であれば特に限定するものではなく、一抗体免
疫分析法、二抗体免疫分析法、競合分析法、サンドイッ
チ法、ホモジーニアス法、ヘテロジーニアス法、ウェス
ターン分析法、ＤＮＡプローブ法等の各種分析法に利用
できるが、特に、次のような固相サンドイッチ法に好適
に用いられる。以下、固相サンドイッチ法の手順等を説
明する。
【００１２】手順： (1) 分析対象物質の特定部位に結合できる第１の結合試
薬（例えば、第１抗体）を固相担体に固定して第１結合
試薬固定化担体とする。 (2) 非特異的結合を防止するため、予めタンパク質で処
理（ブロッキング処理）した第１結合試薬固定化担体
に、検体を直接又は水性溶媒とともに加え、インキュベ
ートし、第１結合試薬固定化担体／分析対象物質の複合
体を形成させる。 (3) 洗浄液で洗浄する。 (4) これに、分析対象物質の他の特定部位に結合でき、
かつパーオキシダーゼで標識された第２の結合試薬（例
えば、第２抗体）を水性溶媒とともに加え、第１結合試
薬固定化担体／分析対象物質／パーオキシダーゼ標識化
第２結合試薬の複合体を形成させる。 (5) 洗浄液で洗浄する。 (6) 水性溶媒中、ルミノール、過酸化水素及び増感剤、
並びに第２級アルコールポリエトキシレートを加える。 (7) 生じる発光量を測定する；
薬（例えば、第１抗体）を固相担体に固定して第１結合
試薬固定化担体とする。 (2) 非特異的結合を防止するため、予めタンパク質で処
理（ブロッキング処理）した第１結合試薬固定化担体
に、検体を直接又は水性溶媒とともに加え、インキュベ
ートし、第１結合試薬固定化担体／分析対象物質の複合
体を形成させる。 (3) 洗浄液で洗浄する。 (4) これに、分析対象物質の他の特定部位に結合でき、
かつパーオキシダーゼで標識された第２の結合試薬（例
えば、第２抗体）を水性溶媒とともに加え、第１結合試
薬固定化担体／分析対象物質／パーオキシダーゼ標識化
第２結合試薬の複合体を形成させる。 (5) 洗浄液で洗浄する。 (6) 水性溶媒中、ルミノール、過酸化水素及び増感剤、
並びに第２級アルコールポリエトキシレートを加える。 (7) 生じる発光量を測定する；
【００１３】固相担体に固定する第１の結合試薬は、分
析対象物質が抗原となりうるようなものの場合は抗体
（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、又は抗体
断片等）が好適に用いられ、分析対象物質が核酸である
場合は、それに相補する（１本鎖の）核酸又は核酸断片
が好適に用いられる。
析対象物質が抗原となりうるようなものの場合は抗体
（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、又は抗体
断片等）が好適に用いられ、分析対象物質が核酸である
場合は、それに相補する（１本鎖の）核酸又は核酸断片
が好適に用いられる。
【００１４】パーオキシダーゼで標識される第２の結合
試薬は、分析対象物質が抗原となりうるようなものか核
酸か等により、第１の結合試薬が結合する部位とは異な
る部位で分析対象物質に結合できる、抗体又は核酸が用
いられる。
試薬は、分析対象物質が抗原となりうるようなものか核
酸か等により、第１の結合試薬が結合する部位とは異な
る部位で分析対象物質に結合できる、抗体又は核酸が用
いられる。
【００１５】第２の結合試薬をパーオキシダーゼで標識
するには、マレイミド・ヒンジ法、サクシンイミド法等
によりパーオキシダーゼを直接標識するか、第２の結合
試薬にビオチニル基等の化学基を有せしめたのち、これ
と反応するアビジン等の化学基を有するパーオキシダー
ゼを反応させ、間接的に標識すればよい。第２の結合試
薬を標識するパーオキシダーゼとしては、西洋ワサビ由
来の塩基性アイソザイムが好適である。塩基性アイソザ
イムにはＢ、Ｃ、Ｄ及びＥの型が知られているが、これ
らの中ではＣ型が最も好ましい。
するには、マレイミド・ヒンジ法、サクシンイミド法等
によりパーオキシダーゼを直接標識するか、第２の結合
試薬にビオチニル基等の化学基を有せしめたのち、これ
と反応するアビジン等の化学基を有するパーオキシダー
ゼを反応させ、間接的に標識すればよい。第２の結合試
薬を標識するパーオキシダーゼとしては、西洋ワサビ由
来の塩基性アイソザイムが好適である。塩基性アイソザ
イムにはＢ、Ｃ、Ｄ及びＥの型が知られているが、これ
らの中ではＣ型が最も好ましい。
【００１６】用いる固相担体としては、通常、マイクロ
タイタプレートが好適である。このようなマイクロタイ
タプレートとしては、ブラックモジュールプレート（Nu
nc社製）、マイクロフルオロプレート黒（ダイナテク社
製）、マイクロフルオロリモーバウェル黒（ダイナテク
社製）等がある。場合によっては、隣接ウェルからの迷
光を防止する白色系のマイクロタイタプレートを使用す
ることもできる。このようなマイクロタイタプレートと
しては白色顔料を含む、マイクロフルオロプレート白
（ダイナテク社製）、マイクロフルオロリモーバウェル
白（ダイナテク社製）、あるいは白色プレート（住友ベ
ークライト社製）等がある。
タイタプレートが好適である。このようなマイクロタイ
タプレートとしては、ブラックモジュールプレート（Nu
nc社製）、マイクロフルオロプレート黒（ダイナテク社
製）、マイクロフルオロリモーバウェル黒（ダイナテク
社製）等がある。場合によっては、隣接ウェルからの迷
光を防止する白色系のマイクロタイタプレートを使用す
ることもできる。このようなマイクロタイタプレートと
しては白色顔料を含む、マイクロフルオロプレート白
（ダイナテク社製）、マイクロフルオロリモーバウェル
白（ダイナテク社製）、あるいは白色プレート（住友ベ
ークライト社製）等がある。
【００１７】発光反応に用いられるルミノールは、通常
入手できる試薬グレードのものには製造原料であるヒド
ラジン及び硫化物イオンが混入している場合が多いの
で、再結晶を繰り返し、精製したものを用いる。
入手できる試薬グレードのものには製造原料であるヒド
ラジン及び硫化物イオンが混入している場合が多いの
で、再結晶を繰り返し、精製したものを用いる。
【００１８】本発明に用いられる増感剤は、ルミノール
の一電子酸化を助けて増感作用を有するもので、４−ヨ
ードフェノール、４−ブロモフェノール、４−クロロフ
ェノール、４−フェニルフェノール、２−クロロ−４−
フェニルフェノール、４−（２’−チエニル）フェノー
ル、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、４−〔４’−
（２’−メチル）チアゾリル〕フェノール、４−〔２’
−（４’−メチル）チアゾリル〕フェノール、４−
（２’−ベンゾチアゾリル）フェノール、３−（１０−
フェノチアジル）−ｎ−プロピル−スルホン酸塩等があ
る。
の一電子酸化を助けて増感作用を有するもので、４−ヨ
ードフェノール、４−ブロモフェノール、４−クロロフ
ェノール、４−フェニルフェノール、２−クロロ−４−
フェニルフェノール、４−（２’−チエニル）フェノー
ル、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、４−〔４’−
（２’−メチル）チアゾリル〕フェノール、４−〔２’
−（４’−メチル）チアゾリル〕フェノール、４−
（２’−ベンゾチアゾリル）フェノール、３−（１０−
フェノチアジル）−ｎ−プロピル−スルホン酸塩等があ
る。
【００１９】これらの増感剤の存在下にパーオキシダー
ゼの触媒作用でルミノール／過酸化水素の発光反応を行
うと、増感剤が増感ラジカルとなり、これがルミノール
と反応し発光する。
ゼの触媒作用でルミノール／過酸化水素の発光反応を行
うと、増感剤が増感ラジカルとなり、これがルミノール
と反応し発光する。
【００２０】反応液の溶媒は通常、水性溶媒を用いる。
水性溶媒には、水又はリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グ
ッド緩衝液等の緩衝液等がある。これら緩衝液のｐＨは
通常、５〜１２、好ましくは７〜１１とする。ｐＨが５
未満であると、パーオキシダーゼの最適ｐＨから外れて
発光量が弱くなり、ｐＨが１２を超えると、パーオキシ
ダーゼ活性に依存しない発光（ノイズ）が強くなる。
水性溶媒には、水又はリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グ
ッド緩衝液等の緩衝液等がある。これら緩衝液のｐＨは
通常、５〜１２、好ましくは７〜１１とする。ｐＨが５
未満であると、パーオキシダーゼの最適ｐＨから外れて
発光量が弱くなり、ｐＨが１２を超えると、パーオキシ
ダーゼ活性に依存しない発光（ノイズ）が強くなる。
【００２１】本発明で用いられる脱脂乳は、脂肪分を除
いたミルクのことで、別名、脱脂粉乳、スキムミルク等
とも呼ばれる。これは市販品、例えば、「MILK DILUENT
/BLOCKING SOLUTION」(ＫＰＬ社製、コード番号：50-82
-01)、「ブロックエース」（大日本製薬製、コード番
号：UK-B25）、「ブロックエース粉末」（大日本製薬
製、コード番号：UK-B80）等が容易に入手できる。
いたミルクのことで、別名、脱脂粉乳、スキムミルク等
とも呼ばれる。これは市販品、例えば、「MILK DILUENT
/BLOCKING SOLUTION」(ＫＰＬ社製、コード番号：50-82
-01)、「ブロックエース」（大日本製薬製、コード番
号：UK-B25）、「ブロックエース粉末」（大日本製薬
製、コード番号：UK-B80）等が容易に入手できる。
【００２２】また、本発明で用いられる卵白アルブミン
は、卵白から分離される分子量４万５千、等電点４．６
のタンパク質で、これについても市販品、例えば、「ア
ルブミン、卵白、５回結晶」（生化学工業社製、コード
番号：250440）、「オボアルブミン」（太陽化学社製、
コード番号：300-00711）、「アルブミン、卵製」（和
光純薬工業社製、コード番号：018-09882）、「Albumin
chicken egg」（シグマ社製、コード番号：A7641）等
が容易に入手できる。
は、卵白から分離される分子量４万５千、等電点４．６
のタンパク質で、これについても市販品、例えば、「ア
ルブミン、卵白、５回結晶」（生化学工業社製、コード
番号：250440）、「オボアルブミン」（太陽化学社製、
コード番号：300-00711）、「アルブミン、卵製」（和
光純薬工業社製、コード番号：018-09882）、「Albumin
chicken egg」（シグマ社製、コード番号：A7641）等
が容易に入手できる。
【００２３】これら脱脂乳又は卵白アルブミンの使用濃
度は、それぞれ、少なくともＳ／Ｎ比が向上する濃度と
する。通常、その濃度はそれぞれ、反応液の最終濃度で
０．０１〜０．５％、好ましくは０．０２〜０．２％の
範囲である。濃度が０．０１％未満ではＳ／Ｎ比を向上
させる効果が少なく、０．５％を超えると特異的発光反
応を抑えるため好ましくない。
度は、それぞれ、少なくともＳ／Ｎ比が向上する濃度と
する。通常、その濃度はそれぞれ、反応液の最終濃度で
０．０１〜０．５％、好ましくは０．０２〜０．２％の
範囲である。濃度が０．０１％未満ではＳ／Ｎ比を向上
させる効果が少なく、０．５％を超えると特異的発光反
応を抑えるため好ましくない。
【００２４】反応液には、操作性、安定性等の性能を上
げるために、他の添加物、例えば、マンニトール、ソル
ビトール等の糖アルコール等を添加してもよい。
げるために、他の添加物、例えば、マンニトール、ソル
ビトール等の糖アルコール等を添加してもよい。
【００２５】以下に実験例を示す。実験例１ ４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フ
ェノール存在下の化学発光反応における第２級アルコー
ルポリエトキシレートの添加効果 化学発光反応（無添加対照）は以下のようにして行っ
た。すなわち、ブラックモジュールプレート（Ｎｕｎｃ
社製，４７５５１５）に、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）
標識化抗エンドセリン抗体（ヤマサ醤油社製、ＭＣＡ
ＥＴ−０２）の１／１０5希釈液〔希釈用緩衝液として
５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を使
用〕１００μｌを注入し、次いで２ｍＭ ４−［４'−
（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルス
ルフォキシド溶液８μl、４ｍＭ過酸化水素含有の５０
ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）５０μl及び
２０ｍＭルミノール５０μlを添加し、ルミノメータ
（コロナ電気社製、MLR-100型）で１０分後の発光量を
測光し、シグナル（Ｓ）とした（測光条件：Response 6
4、Sense Auto）。また、ＰＯＤ標識化抗エンドセリン
抗体の１／１０5希釈液の代わりに、５０ｍＭホウ酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を用い同様に操作して
発光量を測光し、これをノイズ（Ｎ）とした。
ェノール存在下の化学発光反応における第２級アルコー
ルポリエトキシレートの添加効果 化学発光反応（無添加対照）は以下のようにして行っ
た。すなわち、ブラックモジュールプレート（Ｎｕｎｃ
社製，４７５５１５）に、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）
標識化抗エンドセリン抗体（ヤマサ醤油社製、ＭＣＡ
ＥＴ−０２）の１／１０5希釈液〔希釈用緩衝液として
５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を使
用〕１００μｌを注入し、次いで２ｍＭ ４−［４'−
（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルス
ルフォキシド溶液８μl、４ｍＭ過酸化水素含有の５０
ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）５０μl及び
２０ｍＭルミノール５０μlを添加し、ルミノメータ
（コロナ電気社製、MLR-100型）で１０分後の発光量を
測光し、シグナル（Ｓ）とした（測光条件：Response 6
4、Sense Auto）。また、ＰＯＤ標識化抗エンドセリン
抗体の１／１０5希釈液の代わりに、５０ｍＭホウ酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を用い同様に操作して
発光量を測光し、これをノイズ（Ｎ）とした。
【００２６】第２級アルコールポリエトキシレートの添
加試験は、使用するＰＯＤ標識化抗エンドセリン抗体希
釈用５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）
中に、予めアデカトール ＳＯ-135（旭電化工業製）を
０．１重量％含有させたほかは、上記と同様に操作し
た。また、比較添加実験としてアデカトール ＳＯ-135
の代わりに、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレ
ート（和光純薬工業製、「ツィーン２０」)を用い、同
様に行った。表１に測定結果を示す。
加試験は、使用するＰＯＤ標識化抗エンドセリン抗体希
釈用５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）
中に、予めアデカトール ＳＯ-135（旭電化工業製）を
０．１重量％含有させたほかは、上記と同様に操作し
た。また、比較添加実験としてアデカトール ＳＯ-135
の代わりに、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレ
ート（和光純薬工業製、「ツィーン２０」)を用い、同
様に行った。表１に測定結果を示す。
【００２７】アデカトールＳＯ-１３５の添加では、無
添加に比べ発光のノイズが約２／３、シグナルは約１．
５倍、Ｓ／Ｎ比は２倍強となった。一方、ツィーン２０
の添加では、無添加に比べ発光ノイズの低減はみられ
ず、シグナルの若干の増加だけがみられた。
添加に比べ発光のノイズが約２／３、シグナルは約１．
５倍、Ｓ／Ｎ比は２倍強となった。一方、ツィーン２０
の添加では、無添加に比べ発光ノイズの低減はみられ
ず、シグナルの若干の増加だけがみられた。
【表１】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物（＊） ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加 １，５８１ １，９６８ １．２４ アデカトール ＳＯ-135 １，１０５ ３，０４３ ２．７５ ツィーン２０（比較） １，５３７ ２，８００ １．８２ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ＊：添加物の濃度は、無添加を除きそれぞれの成分の濃
度が０．１％である（以下、実験例２〜９も同じ）。
度が０．１％である（以下、実験例２〜９も同じ）。
【００２８】実験例２ ４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノール存在下の化学発光反応における種
々の非イオン性界面活性剤の添加効果 非イオン性界面活性剤として第２級アルコールポリエト
キシレート（アデカトール ＳＯ-135）のほか、種々の
ものを用い、実験例１と同様に試験した。結果を表２に
示す。
アゾリル］フェノール存在下の化学発光反応における種
々の非イオン性界面活性剤の添加効果 非イオン性界面活性剤として第２級アルコールポリエト
キシレート（アデカトール ＳＯ-135）のほか、種々の
ものを用い、実験例１と同様に試験した。結果を表２に
示す。
【表２】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加 ２，４４２ ２，７１３ １．１１ アデカトール ＳＯ-135 １，１０５ ３，０４３ ２．７５ アデカトール ＬＯ-9 ２，０９１ ３，４５４ １．６５ アデカトール ＮＰ-695 １，７００ ３，４１７ ２．０１ アデカトール ＮＰ-700 ２，０６０ ３，９９１ １．９４ アデカトール ＰＣ-10 ２，５９８ ４，１５３ １．６０ ツィーン２０ ２，６７４ ４，０３９ １．５１ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００２９】Ｓ／Ｎを改善する効果の高い順は、アデカ
トール ＳＯ-135＞アデカトール ＮＰ-695＞アデカトー
ル ＮＰ-700＞アデカトール ＬＯ-9＞アデカトール Ｐ
Ｃ-10＞ツィーン２０であった（表２）。
トール ＳＯ-135＞アデカトール ＮＰ-695＞アデカトー
ル ＮＰ-700＞アデカトール ＬＯ-9＞アデカトール Ｐ
Ｃ-10＞ツィーン２０であった（表２）。
【００３０】実験例３ ４−［２'−（４'−メチル）チ
アゾリル］フェノール存在下の化学発光反応における第
２級アルコールポリエトキシレートの添加効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに２０ｍＭの４−［２'
−（４'−メチル）チアゾリル］フェノールを用いたほ
かは、実験例１と同様に行った。結果を表４に示した。
アゾリル］フェノール存在下の化学発光反応における第
２級アルコールポリエトキシレートの添加効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに２０ｍＭの４−［２'
−（４'−メチル）チアゾリル］フェノールを用いたほ
かは、実験例１と同様に行った。結果を表４に示した。
【表３】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加 １，１６４ １，４７８ １．２７ アデカトール ＳＯ-135 ９４８ ３，５８０ ３．７７ ツィーン２０（比較） １，２６０ ３，３７１ ２．６８ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００３１】実験例４ ４−（２'−チエニル）フェノ
ール存在下の化学発光反応における第２級アルコールポ
リエトキシレートの添加効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに１ｍＭの４−（２'−
チエニル）フェノールを用いたほかは、実験例１と同様
に行った。結果を表４に示した。
ール存在下の化学発光反応における第２級アルコールポ
リエトキシレートの添加効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに１ｍＭの４−（２'−
チエニル）フェノールを用いたほかは、実験例１と同様
に行った。結果を表４に示した。
【００３２】
【表４】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加 ７３２ ８２７ １．１３ アデカトール ＳＯ-135 ５７０ １，９２２ ３．３７ ツィーン２０（比較） ７２３ １，２２６ １．７５ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００３３】実験例５ ３−（１０−フェノチアジル）
−ｎ−プロピル−スルホン酸塩存在下の化学発光反応に
おける第２級アルコールポリエトキシレートの添加効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに２０ｍＭの３−（１０
−フェノチアジル）−ｎ−プロピル−スルホン酸塩を用
いたほかは、実験例１と同様に行った。結果を表５に示
す。
−ｎ−プロピル−スルホン酸塩存在下の化学発光反応に
おける第２級アルコールポリエトキシレートの添加効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに２０ｍＭの３−（１０
−フェノチアジル）−ｎ−プロピル−スルホン酸塩を用
いたほかは、実験例１と同様に行った。結果を表５に示
す。
【表５】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加 １，３７１ １，４９３ １．０９ アデカトール ＳＯ-135 ９４２ ３，１６２ ３．３６ ツィーン２０（比較） １，３７０ １，６６２ １．２１ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００３４】実験例６ ４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノール存在下の化学発光反応における、
第２級アルコールポリエトキシレート及び脱脂乳の共存
効果 添加剤無添加の試験（無添加対照）は以下のように操作
した。ブラックモジュールプレートに、ペルオキシダー
ゼ（ＰＯＤ）標識化抗エンドセリン抗体の１／１０5希
釈液〔希釈用緩衝液として５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ１０．０）を使用〕１００μｌを注入し、次
いで２ｍＭ ４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］
フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μl、４ｍ
Ｍ過酸化水素含有の５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ１０）５０μl及び２０ｍＭルミノール５０μlを
添加し、ルミノメータで１０分後の発光量を測光し、シ
グナル（Ｓ）とした。ノイズ（Ｎ）の測定は、ＰＯＤ標
識化抗エンドセリン抗体の１／１０5希釈液の代わり
に、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）
を使用した。
アゾリル］フェノール存在下の化学発光反応における、
第２級アルコールポリエトキシレート及び脱脂乳の共存
効果 添加剤無添加の試験（無添加対照）は以下のように操作
した。ブラックモジュールプレートに、ペルオキシダー
ゼ（ＰＯＤ）標識化抗エンドセリン抗体の１／１０5希
釈液〔希釈用緩衝液として５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ１０．０）を使用〕１００μｌを注入し、次
いで２ｍＭ ４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］
フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μl、４ｍ
Ｍ過酸化水素含有の５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ１０）５０μl及び２０ｍＭルミノール５０μlを
添加し、ルミノメータで１０分後の発光量を測光し、シ
グナル（Ｓ）とした。ノイズ（Ｎ）の測定は、ＰＯＤ標
識化抗エンドセリン抗体の１／１０5希釈液の代わり
に、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）
を使用した。
【００３５】第２級アルコールポリエトキシレート（ア
デカトール ＳＯ-135）、脱脂乳及びその両者の添加試
験は、使用するＰＯＤ標識化抗エンドセリン抗体希釈用
５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）中
に、予めそれぞれ０．１重量％含有させたほかは、上記
と同様にして行った。結果を表６に示す。なお、脱脂乳
は「MILK DILUENT/BLOCKING SOLUTION」(ＫＰＬ社製、
コード番号：50-82-01)を使用した（以下の実験例７〜
９及び実施例１〜３において用いた脱脂乳も同じ）。
デカトール ＳＯ-135）、脱脂乳及びその両者の添加試
験は、使用するＰＯＤ標識化抗エンドセリン抗体希釈用
５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）中
に、予めそれぞれ０．１重量％含有させたほかは、上記
と同様にして行った。結果を表６に示す。なお、脱脂乳
は「MILK DILUENT/BLOCKING SOLUTION」(ＫＰＬ社製、
コード番号：50-82-01)を使用した（以下の実験例７〜
９及び実施例１〜３において用いた脱脂乳も同じ）。
【表６】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加（無添加対照） １，５８１ １，９６８ １．２４ アデカトール SO-135 １，１０５ ３，０４３ ２．７５ 脱脂乳 １３５ １，６５５ １２．２ アデカトール SO-135 ┐ １３１ ２，０８２ １５．９ ＋脱脂乳 ┘ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００３６】アデカトール SO-135及び脱脂乳の両者の
添加では、Ｓ／Ｎ比は１５．９となり、アデカトール S
O-135の単独添加の場合（Ｓ／Ｎ比＝２．７５）又は脱
脂乳の単独添加の場合（Ｓ／Ｎ比＝１２．２）よりも更
に改善された（表６）。
添加では、Ｓ／Ｎ比は１５．９となり、アデカトール S
O-135の単独添加の場合（Ｓ／Ｎ比＝２．７５）又は脱
脂乳の単独添加の場合（Ｓ／Ｎ比＝１２．２）よりも更
に改善された（表６）。
【００３７】実験例７ ４−［２'−（４'−メチル）チ
アゾリル］フェノール存在下の化学発光反応における、
第２級アルコールポリエトキシレート及び脱脂乳の共存
効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに２０ｍＭの４−［２'
−（４'−メチル）チアゾリル］フェノールを用い、実
験例６と同様にして行った。結果を表７に示す。
アゾリル］フェノール存在下の化学発光反応における、
第２級アルコールポリエトキシレート及び脱脂乳の共存
効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに２０ｍＭの４−［２'
−（４'−メチル）チアゾリル］フェノールを用い、実
験例６と同様にして行った。結果を表７に示す。
【表７】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加（無添加対照） １，１６４ １，４７８ １．２７ アデカトール SO-135 ９４８ ３，５８０ ３．７７ 脱脂乳 ８５ ４９３ ５．８０ アデカトール SO-135 ┐ ９４ １，１１４ １１．９ ＋脱脂粉乳 ┘ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００３８】実験例８ ３−（１０−フェノチアジル）
−ｎ−プロピル−スルホン酸塩存在下の化学発光反応に
おける、第２級アルコールポリエトキシレート及び脱脂
乳の共存効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに２０ｍＭの３−（１０
−フェノチアジル）−ｎ−プロピル−スルホン酸塩を用
いたほかは、実験例６と同様にして行った。結果を表８
に示す。
−ｎ−プロピル−スルホン酸塩存在下の化学発光反応に
おける、第２級アルコールポリエトキシレート及び脱脂
乳の共存効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに２０ｍＭの３−（１０
−フェノチアジル）−ｎ−プロピル−スルホン酸塩を用
いたほかは、実験例６と同様にして行った。結果を表８
に示す。
【００３９】
【表８】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加（無添加対照） １，３７１ １，４９３ １．０９ アデカトール SO-135 ９４２ ３，１６２ ３．３６ 脱脂乳 １６４ １，５１０ ９．２１ アデカトール SO-135 ┐ １３０ １，５６９ １２．１ ＋脱脂乳 ┘ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００４０】実験例９ ｐ−ヨードフェノール存在下の
化学発光反応における、第２級アルコールポリエトキシ
レート及び脱脂乳の共存効果 増感剤としてｐ−ヨードフェノールを用いたほかは、実
験例６と同様にして行った。結果を表９に示す。
化学発光反応における、第２級アルコールポリエトキシ
レート及び脱脂乳の共存効果 増感剤としてｐ−ヨードフェノールを用いたほかは、実
験例６と同様にして行った。結果を表９に示す。
【表９】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 添加物 ノイズ（Ｎ） シグナル（Ｓ） Ｓ／Ｎ比 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加（無添加対照） ４，１５４ ４，１１７ ０．９９ アデカトール SO-135 １，０１５ １，９９７ １．９７ 脱脂粉乳 １４９ ５０１ ３．３６ アデカトール SO-135 ┐ １１９ ４２０ ３．５２ ＋脱脂乳 ┘ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００４１】
実施例１ エンドセリン−１の検量線（その１） 標準となるエンドセリン−１（ＥＴ−１と略す。ヒト由
来、ペプチド研究所製、コード番号４１９８−ｓ）を
０．１％ツィーン２０及び０．１％脱脂乳含有ダルベッ
コリン酸緩衝生理食塩液（以下、希釈用緩衝液とい
う。）で希釈し、それぞれ２、５、１０、２０及び４０
ｐｇ／ｍｌの濃度のエンドセリン−１標準溶液を作成し
た。
来、ペプチド研究所製、コード番号４１９８−ｓ）を
０．１％ツィーン２０及び０．１％脱脂乳含有ダルベッ
コリン酸緩衝生理食塩液（以下、希釈用緩衝液とい
う。）で希釈し、それぞれ２、５、１０、２０及び４０
ｐｇ／ｍｌの濃度のエンドセリン−１標準溶液を作成し
た。
【００４２】予め、抗エンドセリン抗体（免疫生物研究
所社製、抗エンドセリン15-21特異的抗体、コード番号:
１６１５５）を５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
で希釈して５μｇ／ｍｌとし、ブラックモジュールプレ
ート（ヌンク社製、コード番号４７５５１５）の各ウェ
ルに２００μｌずつ分注し、４℃で一晩放置して、抗体
をプレートのウェルに吸着させた。イオン交換蒸留水で
２回洗浄後、ウェルに０．５％脱脂乳４００μｌを加
え、３７℃で６時間保温し（ブロッキング処理）、その
後０．１％ツイーン２０含有カルシウムフリーダルベッ
コ燐酸緩衝生理食塩液で３回洗浄して、抗体固定化プレ
ートとした。
所社製、抗エンドセリン15-21特異的抗体、コード番号:
１６１５５）を５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
で希釈して５μｇ／ｍｌとし、ブラックモジュールプレ
ート（ヌンク社製、コード番号４７５５１５）の各ウェ
ルに２００μｌずつ分注し、４℃で一晩放置して、抗体
をプレートのウェルに吸着させた。イオン交換蒸留水で
２回洗浄後、ウェルに０．５％脱脂乳４００μｌを加
え、３７℃で６時間保温し（ブロッキング処理）、その
後０．１％ツイーン２０含有カルシウムフリーダルベッ
コ燐酸緩衝生理食塩液で３回洗浄して、抗体固定化プレ
ートとした。
【００４３】先に準備したエンドセリン−１の標準溶液
それぞれ２００μｌずつをプレートのウェルにとり、室
温で一晩放置した。その後、０．１％ツィーン２０含有
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（以下、洗浄用緩衝液
という。）で１０回洗浄し、希釈用緩衝液で２μｇ／ｍ
ｌに調整したパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識化抗エン
ドセリン−１抗体（免疫生物研究所社製、コード番号１
６１６５）２００μｌずつを各ウェルに加え、３７℃で
２時間インキュベートした。洗浄用緩衝液で１０回洗浄
後、各ウェルに順次、アデカトールＳＯ−１３５を０．
１％含む２ｍＭ過酸化水素含有５０ｍＭ（ｐＨ１０）ホ
ウ酸ナトリウム緩衝液（以下、発光基質液Ａという。）
１００μｌ、次いで２０ｍＭルミノールと０．３２ｍＭ
４−［４'−(２'−メチル)チアゾリル］フェノール含
有５０ｍＭ（ｐＨ１０）ホウ酸ナトリウム緩衝液との
１：１（容量比）混合液（以下、発光基質液Ｂとい
う。）１００μｌを加えた。その１０分後に、ルミノメ
ータで発光量を測光した。なお試薬ブランクは、エンド
セリン−１の標準溶液の代わりに希釈用緩衝液を同じ容
量とり、同様に操作したものとした。横軸にエンドセリ
ン−１の濃度をとり、縦軸に発光量（ルミカウント）を
とり、グラフにプロットしてエンドセリン−１の検量線
とした（図１中の１）。
それぞれ２００μｌずつをプレートのウェルにとり、室
温で一晩放置した。その後、０．１％ツィーン２０含有
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（以下、洗浄用緩衝液
という。）で１０回洗浄し、希釈用緩衝液で２μｇ／ｍ
ｌに調整したパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識化抗エン
ドセリン−１抗体（免疫生物研究所社製、コード番号１
６１６５）２００μｌずつを各ウェルに加え、３７℃で
２時間インキュベートした。洗浄用緩衝液で１０回洗浄
後、各ウェルに順次、アデカトールＳＯ−１３５を０．
１％含む２ｍＭ過酸化水素含有５０ｍＭ（ｐＨ１０）ホ
ウ酸ナトリウム緩衝液（以下、発光基質液Ａという。）
１００μｌ、次いで２０ｍＭルミノールと０．３２ｍＭ
４−［４'−(２'−メチル)チアゾリル］フェノール含
有５０ｍＭ（ｐＨ１０）ホウ酸ナトリウム緩衝液との
１：１（容量比）混合液（以下、発光基質液Ｂとい
う。）１００μｌを加えた。その１０分後に、ルミノメ
ータで発光量を測光した。なお試薬ブランクは、エンド
セリン−１の標準溶液の代わりに希釈用緩衝液を同じ容
量とり、同様に操作したものとした。横軸にエンドセリ
ン−１の濃度をとり、縦軸に発光量（ルミカウント）を
とり、グラフにプロットしてエンドセリン−１の検量線
とした（図１中の１）。
【００４４】また、発光基質液Ａとして２ｍＭ過酸化水
素含有５０ｍＭ（ｐＨ１０）ホウ酸ナトリウム緩衝液
（アデカトールＳＯ−１３５及び脱脂乳のいずれもに不
含）を用い、同様に操作して、これを比較対照とした。
素含有５０ｍＭ（ｐＨ１０）ホウ酸ナトリウム緩衝液
（アデカトールＳＯ−１３５及び脱脂乳のいずれもに不
含）を用い、同様に操作して、これを比較対照とした。
【００４５】実施例２ エンドセリン−１の検量線（そ
の２） 発光基質液Ａとして、０．１％アデカトールＳＯ−１３
５及び０．１％脱脂乳を含む２ｍＭ過酸化水素含有５０
ｍＭ（ｐＨ１０）ホウ酸ナトリウム緩衝液を用いたほか
は、実施例１と同様にしてエンドセリン−１の検量線を
作成した（図１中の２）。実施例１及び実施例２の結果
（図１）から、発光反応時にアデカトールＳＯ−１３５
が存在するとき、特にアデカトールＳＯ−１３５及び脱
脂乳の両者が共存するとき、エンドセリン−１の検量線
の傾斜が大きく、測定感度が高いことが分かる。
の２） 発光基質液Ａとして、０．１％アデカトールＳＯ−１３
５及び０．１％脱脂乳を含む２ｍＭ過酸化水素含有５０
ｍＭ（ｐＨ１０）ホウ酸ナトリウム緩衝液を用いたほか
は、実施例１と同様にしてエンドセリン−１の検量線を
作成した（図１中の２）。実施例１及び実施例２の結果
（図１）から、発光反応時にアデカトールＳＯ−１３５
が存在するとき、特にアデカトールＳＯ−１３５及び脱
脂乳の両者が共存するとき、エンドセリン−１の検量線
の傾斜が大きく、測定感度が高いことが分かる。
【００４６】実施例３ 健常人の血漿中のエンドセリン
−１の測定 標準となるエンドセリン−１（ペプチド研究所製、コー
ド番号４１９８−ｓ）をエンドセリン−１不含血漿で希
釈し、それぞれ２、５、１０、２０及び４０ｐｇ／ｍｌ
の濃度のエンドセリン−１標準溶液を作成した。上記エ
ンドセリン−１標準溶液並びに検体（健常人の血漿：６
体）について、実施例２と同様にして操作し、発光量を
求めた。エンドセリン−１標準溶液の発光量（検量線）
から、検体のエンドセリン−１の濃度を求めた。
−１の測定 標準となるエンドセリン−１（ペプチド研究所製、コー
ド番号４１９８−ｓ）をエンドセリン−１不含血漿で希
釈し、それぞれ２、５、１０、２０及び４０ｐｇ／ｍｌ
の濃度のエンドセリン−１標準溶液を作成した。上記エ
ンドセリン−１標準溶液並びに検体（健常人の血漿：６
体）について、実施例２と同様にして操作し、発光量を
求めた。エンドセリン−１標準溶液の発光量（検量線）
から、検体のエンドセリン−１の濃度を求めた。
【表１０】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 検体番号 ＥＴ−１（pg/ml） 検体番号 ＥＴ−１（pg/ml） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １ １．４７ ４ ３．００ ２ ２．１２ ５ ２．７９ ３ １．８７ ６ １．５５ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００４７】
【発明の効果】本発明は、パーオキシダーゼを標識物に
用いる化学発光分析における、非特異的発光反応すなわ
ち試薬ブランク（ノイズ）を低下させ、特異的発光反応
すなわちシグナル量を増強させ、Ｓ／Ｎ比（シグナル／
ノイズの比）を向上させる。したがって、測定値の信頼
性は向上する。また、本発明をエンドセリン−１の測定
に利用すると、血漿（又は血清）の濃縮等の前処理な
く、直接、定量できる。
用いる化学発光分析における、非特異的発光反応すなわ
ち試薬ブランク（ノイズ）を低下させ、特異的発光反応
すなわちシグナル量を増強させ、Ｓ／Ｎ比（シグナル／
ノイズの比）を向上させる。したがって、測定値の信頼
性は向上する。また、本発明をエンドセリン−１の測定
に利用すると、血漿（又は血清）の濃縮等の前処理な
く、直接、定量できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】エンドセリン−１の検量線を示すグラフであ
る。
る。
１…０．１％アデカトールＳＯ−１３５を含む発光基質
液Ａを用いた場合の検量線（実施例１）。 ２…０．１％アデカトールＳＯ−１３５及び０．１％脱
脂乳を含む発光基質液Ａを用いた場合の検量線（実施例
２）。
液Ａを用いた場合の検量線（実施例１）。 ２…０．１％アデカトールＳＯ−１３５及び０．１％脱
脂乳を含む発光基質液Ａを用いた場合の検量線（実施例
２）。
Claims (2)
- 【請求項１】増感剤の存在下に、パーオキシダーゼで標
識した分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水素を反
応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析方
法において、 反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に第２級
アルコールポリエトキシレートを存在させる、化学発光
分析方法。 - 【請求項２】増感剤の存在下に、パーオキシダーゼで標
識した分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水素を反
応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析方
法において、 反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に第２級
アルコールポリエトキシレートとともに脱脂乳及び／又
は卵白アルブミンを存存させる、化学発光分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23639693A JP3315775B2 (ja) | 1992-12-24 | 1993-09-22 | 標識物としてパーオキシダーゼを用いる化学発光分析方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34304992 | 1992-12-24 | ||
| JP4-343049 | 1992-12-24 | ||
| JP23639693A JP3315775B2 (ja) | 1992-12-24 | 1993-09-22 | 標識物としてパーオキシダーゼを用いる化学発光分析方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002119835A Division JP2002323495A (ja) | 1992-12-24 | 2002-04-22 | 標識物としてパーオキシダーゼを用いる化学発光分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06242111A true JPH06242111A (ja) | 1994-09-02 |
| JP3315775B2 JP3315775B2 (ja) | 2002-08-19 |
Family
ID=26532657
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23639693A Expired - Lifetime JP3315775B2 (ja) | 1992-12-24 | 1993-09-22 | 標識物としてパーオキシダーゼを用いる化学発光分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3315775B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2096110A1 (en) | 2001-12-20 | 2009-09-02 | Lumigen, Inc. | Acridane-9-dithiocarboxylate derivatives for generating chemiluminescence with a peroxidase |
-
1993
- 1993-09-22 JP JP23639693A patent/JP3315775B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2096110A1 (en) | 2001-12-20 | 2009-09-02 | Lumigen, Inc. | Acridane-9-dithiocarboxylate derivatives for generating chemiluminescence with a peroxidase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3315775B2 (ja) | 2002-08-19 |
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