JPH06256216A - 抗体結合体 - Google Patents
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- JPH06256216A JPH06256216A JP3226252A JP22625291A JPH06256216A JP H06256216 A JPH06256216 A JP H06256216A JP 3226252 A JP3226252 A JP 3226252A JP 22625291 A JP22625291 A JP 22625291A JP H06256216 A JPH06256216 A JP H06256216A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 共有結合によって抗体の炭水化物へ接合した
化合物から成り、該抗体結合体が抗体の免疫反応性と免
疫特異性をほぼ保持してなる抗体結合体の製造法および
その用途。 【効果】 本発明の抗体結合体はアフィニティ精製分
離、診断、治療用として有用である。
化合物から成り、該抗体結合体が抗体の免疫反応性と免
疫特異性をほぼ保持してなる抗体結合体の製造法および
その用途。 【効果】 本発明の抗体結合体はアフィニティ精製分
離、診断、治療用として有用である。
Description
【０００１】１. 発明の属する技術分野 本発明は、単クローン抗体及び多クローン抗体 (従来の
血清) を含む抗体が可溶性又は非可溶性の結合相手 (化
合物, リンカー, 又はサポート) に共有接合して、アフ
ィニティ精製, 分離, 診断, 治療用に有用な抗体結合体
を形成する共有接合に係わるものである。
血清) を含む抗体が可溶性又は非可溶性の結合相手 (化
合物, リンカー, 又はサポート) に共有接合して、アフ
ィニティ精製, 分離, 診断, 治療用に有用な抗体結合体
を形成する共有接合に係わるものである。
【０００２】更に詳細には、本発明は、抗体分子の抗原
結合領域の外にある抗体分子の多糖体成分と、又は抗体
分子のスルフヒドリル基と、又は抗体のFc領域のアミノ
又はカルボキシル基との接合方法に係わるものである。
生成結合体は、本質的にはもとになる抗体の免疫特異性
と免疫活性全部を保有しており、その他にも補体を活性
化する能力をも有する。
結合領域の外にある抗体分子の多糖体成分と、又は抗体
分子のスルフヒドリル基と、又は抗体のFc領域のアミノ
又はカルボキシル基との接合方法に係わるものである。
生成結合体は、本質的にはもとになる抗体の免疫特異性
と免疫活性全部を保有しており、その他にも補体を活性
化する能力をも有する。
【０００３】本発明は更に、 in vivo又はiv vitroで標
的部位へ化合物を運搬するキャリヤ・システム全般にも
係わるものである。かかるシステムはin vivo で標的部
位へ薬剤又は他の化合物を運搬するシステム、iv vitro
とin vivo での造影システム(例：腫瘍造影システム)
、細胞選別システム、更に抗原−抗体相互作用に基く
分離機構等の分野にも係わるものである。
的部位へ化合物を運搬するキャリヤ・システム全般にも
係わるものである。かかるシステムはin vivo で標的部
位へ薬剤又は他の化合物を運搬するシステム、iv vitro
とin vivo での造影システム(例：腫瘍造影システム)
、細胞選別システム、更に抗原−抗体相互作用に基く
分離機構等の分野にも係わるものである。
【０００４】本発明は更に、基質−リンカーと抗体との
接合をも含み、これにより生じた抗体結合体は抗原を接
合し、補体を活性化する能力を保持するものである。選
択的応用例では、これにより活性化した状態の化合物の
標的部位での放出を促進するものである。２. 発明の背景 ２. １. 共有接合 化合物と抗体との共有接合を行うには、色々な反応を利
用することができる。即ち、リジンのアミノ基, グルタ
ミン酸とアスパラギン酸の遊離カルボキシル酸基, シス
テインのスルフヒドリル基と芳香アミノ酸の様々な分子
を含む抗体分子のアミノ酸残基反応により行った。
接合をも含み、これにより生じた抗体結合体は抗原を接
合し、補体を活性化する能力を保持するものである。選
択的応用例では、これにより活性化した状態の化合物の
標的部位での放出を促進するものである。２. 発明の背景 ２. １. 共有接合 化合物と抗体との共有接合を行うには、色々な反応を利
用することができる。即ち、リジンのアミノ基, グルタ
ミン酸とアスパラギン酸の遊離カルボキシル酸基, シス
テインのスルフヒドリル基と芳香アミノ酸の様々な分子
を含む抗体分子のアミノ酸残基反応により行った。
【０００５】これらの抗体分子のポリペプチド・バック
ボーンへの共有接合方法には重大な欠点がある。免疫グ
ロブリンのＬ鎖Ｈ鎖のアミノ酸配列は抗原結合領域を含
む分子中に比較的規則的にかつ無作為に散らばっている
アミノ酸のすべてを含むものである。この抗原結合領域
内に化学的変異が生じた場合は、抗体内の認識要素内に
変化を導入したことになる。かかる変化は、抗体の抗原
に対する親和性と特異性とを変化させると思われ、現実
に変化させている。相異なる抗体の集団内では、かかる
抗原結合領域内のかかる変更は抗体の内のいずれかを完
全に不活性化し、又抗原結合部位と変更の近さに関して
その他の抗体をそれほど完全ではなくとも不活性化する
ことになる。この不活性化は、抗原結合部位内において
結合部位の反応を阻止するためにコンフォメーションを
変える変化に由るものであるかも知れず、又は抗原結合
領域外の領域における、抗原が抗原結合領域へ近寄るの
を制限する変化に由るものなのかも知れない。
ボーンへの共有接合方法には重大な欠点がある。免疫グ
ロブリンのＬ鎖Ｈ鎖のアミノ酸配列は抗原結合領域を含
む分子中に比較的規則的にかつ無作為に散らばっている
アミノ酸のすべてを含むものである。この抗原結合領域
内に化学的変異が生じた場合は、抗体内の認識要素内に
変化を導入したことになる。かかる変化は、抗体の抗原
に対する親和性と特異性とを変化させると思われ、現実
に変化させている。相異なる抗体の集団内では、かかる
抗原結合領域内のかかる変更は抗体の内のいずれかを完
全に不活性化し、又抗原結合部位と変更の近さに関して
その他の抗体をそれほど完全ではなくとも不活性化する
ことになる。この不活性化は、抗原結合部位内において
結合部位の反応を阻止するためにコンフォメーションを
変える変化に由るものであるかも知れず、又は抗原結合
領域外の領域における、抗原が抗原結合領域へ近寄るの
を制限する変化に由るものなのかも知れない。
【０００６】共有結合の非特定の中で最も普通に用いら
れているのは、化合物のカルボキシル基の抗体のアミノ
基へリンクするカルボジイミド反応であろう。これ以外
に、ジアルデヒド又はイミドエステル等の二基作用性助
剤を用いて化合物のアミノ基を抗体分子のアミノ基へリ
ンクすることも行われている。研究者の中には化合物と
抗体分子とをリンクする反応にシッフ基剤を用いるもの
もいる。この方法では、グリコール又はヒドロキシ基を
含有する薬剤又は細胞毒性助剤の過ヨウ素酸塩の酸化が
介在し、従ってアルデヒドが形成され、これが抗体分子
と反応することになる。接合は、抗体分子のアミノ基よ
りシッフ基剤形成を介して生じる。その他に、反応性の
スルフヒドリル基を有する化合物を抗体分子にカップリ
ングさせることも行われた。イソチオシアン酸塩をカッ
プリング剤として用いて化合物を抗体に共有接合させる
こともできる。この方法により、蛍光顕微鏡法 (Brandt
zaeg, 1973, Scand. J. Immunol. ２:273-290) や細胞
選別システム (Loken and Herzenberg, 1975, Annals
N. Y. Acad. Sci. 254:163-171) に用いるため蛍光化合
物を抗体分子へ接合させることが行われた。
れているのは、化合物のカルボキシル基の抗体のアミノ
基へリンクするカルボジイミド反応であろう。これ以外
に、ジアルデヒド又はイミドエステル等の二基作用性助
剤を用いて化合物のアミノ基を抗体分子のアミノ基へリ
ンクすることも行われている。研究者の中には化合物と
抗体分子とをリンクする反応にシッフ基剤を用いるもの
もいる。この方法では、グリコール又はヒドロキシ基を
含有する薬剤又は細胞毒性助剤の過ヨウ素酸塩の酸化が
介在し、従ってアルデヒドが形成され、これが抗体分子
と反応することになる。接合は、抗体分子のアミノ基よ
りシッフ基剤形成を介して生じる。その他に、反応性の
スルフヒドリル基を有する化合物を抗体分子にカップリ
ングさせることも行われた。イソチオシアン酸塩をカッ
プリング剤として用いて化合物を抗体に共有接合させる
こともできる。この方法により、蛍光顕微鏡法 (Brandt
zaeg, 1973, Scand. J. Immunol. ２:273-290) や細胞
選別システム (Loken and Herzenberg, 1975, Annals
N. Y. Acad. Sci. 254:163-171) に用いるため蛍光化合
物を抗体分子へ接合させることが行われた。
【０００７】鎖間の二硫酸塩結合を共有接合の部位とし
て利用することも出来る。もし鎖間の二硫酸塩結合のみ
を選別的に減ずることが出来たならば、機能親和性, 凝
集親和性, 補体固定性等の抗体の機能の内いくつかに悪
影響を与えることが出来よう。２. ２. 非共有接合 抗体結合領域 (可変領域外) での抗体分子接合の別の方
法は抗体分子の不変領域 (constant domain)に対する複
数の抗体又は不変領域内の部位に特異的に結合すること
が知られるスタフィロコッカス蛋白Ａを用いるものであ
る。これらの接合の態様は非共有であるので、とちらの
やり方も限定れており、分離・精製スキームには効率が
よくないとおもわれる。抗原の解離は、非共有的に接合
しているサポートから抗体が放出される結果になりかね
ないので、抗原の選択的溶出が行われなくなる。更にキ
ャリヤ・システムについては (２. ３部を参照のこと)
、非共有結合が抗体複合体が標的部位に達する前にこ
われる可能性が大きいので、共有リンケージの方が好ま
れる。２. ３. キャリヤ システム 薬物運搬システムにおいていくつかの助剤をキャリヤ分
子として利用しているが、上手くいった例は限られてい
る。実際には、キャリヤは毒性を有してはならず、標的
部位についての特異性を有しなくてはならない。理想的
には、標的部位においてキャリヤから化合物が活性化し
た状態で放出されるための機構があるべきである。ＤＮ
Ａ, リポゾーム, 蛋白, ステロイドホルモン, 抗体 (抗
体分子全部又は Fabフラグメント) 等のキャリヤが、放
射性化合物 (例. Ｉ125 , Ｉ131) ；ＤＮＡと結合する
助剤であるアルキル化剤や種々の抗生物質 (例. ダウノ
マイシン, アレドリアマイシン, コロラムブシル) ；メ
トトレクセイト等の代謝括抗物質, 細胞表面で反応する
助剤 (例；ヴェノムホスホリパーゼ, 微生毒物) ；蛋白
質合成抑制剤 (例：ジフテリア毒素, 誘導植物蛋白) 等
の広範囲なスペクトルを有する薬剤又は細胞毒剤と共に
従来用いられてきた。この点については以下の文献を参
照されたい. ベール (Bale et al) ：1980, キャンサ
ー, リサーチ(Cancer Research) 40:2965-2972；ゴース
・ブレアー (Gohs and Blair), 1978,ジャーナル・オブ
・ナショナル・キャンサー・インスティテュート (J. N
atl.Cancer Inst) 61(3):657-676 ；グレゴリアディス
(Gregoriadis), 1977, ネィチャー (Nature) 265:407-4
11, グレゴリアディス, 1980, Pharmac. Ther. 10；103
-118 ；トロウェ他 (Troet et al,), 1980 リセント・
リザルツ・オブ・キャンサー・リサーチ(Recent Result
s Cancer Res.), 75：229-235 本発明に関連のあるキャ
リヤ・システムについて以下に述べる。
て利用することも出来る。もし鎖間の二硫酸塩結合のみ
を選別的に減ずることが出来たならば、機能親和性, 凝
集親和性, 補体固定性等の抗体の機能の内いくつかに悪
影響を与えることが出来よう。２. ２. 非共有接合 抗体結合領域 (可変領域外) での抗体分子接合の別の方
法は抗体分子の不変領域 (constant domain)に対する複
数の抗体又は不変領域内の部位に特異的に結合すること
が知られるスタフィロコッカス蛋白Ａを用いるものであ
る。これらの接合の態様は非共有であるので、とちらの
やり方も限定れており、分離・精製スキームには効率が
よくないとおもわれる。抗原の解離は、非共有的に接合
しているサポートから抗体が放出される結果になりかね
ないので、抗原の選択的溶出が行われなくなる。更にキ
ャリヤ・システムについては (２. ３部を参照のこと)
、非共有結合が抗体複合体が標的部位に達する前にこ
われる可能性が大きいので、共有リンケージの方が好ま
れる。２. ３. キャリヤ システム 薬物運搬システムにおいていくつかの助剤をキャリヤ分
子として利用しているが、上手くいった例は限られてい
る。実際には、キャリヤは毒性を有してはならず、標的
部位についての特異性を有しなくてはならない。理想的
には、標的部位においてキャリヤから化合物が活性化し
た状態で放出されるための機構があるべきである。ＤＮ
Ａ, リポゾーム, 蛋白, ステロイドホルモン, 抗体 (抗
体分子全部又は Fabフラグメント) 等のキャリヤが、放
射性化合物 (例. Ｉ125 , Ｉ131) ；ＤＮＡと結合する
助剤であるアルキル化剤や種々の抗生物質 (例. ダウノ
マイシン, アレドリアマイシン, コロラムブシル) ；メ
トトレクセイト等の代謝括抗物質, 細胞表面で反応する
助剤 (例；ヴェノムホスホリパーゼ, 微生毒物) ；蛋白
質合成抑制剤 (例：ジフテリア毒素, 誘導植物蛋白) 等
の広範囲なスペクトルを有する薬剤又は細胞毒剤と共に
従来用いられてきた。この点については以下の文献を参
照されたい. ベール (Bale et al) ：1980, キャンサ
ー, リサーチ(Cancer Research) 40:2965-2972；ゴース
・ブレアー (Gohs and Blair), 1978,ジャーナル・オブ
・ナショナル・キャンサー・インスティテュート (J. N
atl.Cancer Inst) 61(3):657-676 ；グレゴリアディス
(Gregoriadis), 1977, ネィチャー (Nature) 265:407-4
11, グレゴリアディス, 1980, Pharmac. Ther. 10；103
-118 ；トロウェ他 (Troet et al,), 1980 リセント・
リザルツ・オブ・キャンサー・リサーチ(Recent Result
s Cancer Res.), 75：229-235 本発明に関連のあるキャ
リヤ・システムについて以下に述べる。
【０００８】リポゾームによる薬剤の運搬は標的特異性
に欠けるという重大な欠陥がある。最近この問題を解決
しようとして、薬剤を含むリポゾームへ全抗体又は Fab
フラグメントを共有接合させた研究が行われた。ヒース
(Heath at el.) 1981, Biochim. Biophys, Acta 640;6
6-81；黄 他 (Huag et al.), 1980, G, Biol, Chem.25
5(17):8015-8018 ；ヤンソンス・アンド・マレ (Janson
s and Mallet), 1981Anal. Biochem. 111；54-59 マー
ティン・他 (Martin et al) ：1981 Biochem.20；4229-
4239). 更に、抗体を前もって結合された複数の特異標
的に製剤を向けるため蛋白Ａ (Staph Ａ蛋白) をリポゾ
ームに結合させた研究も行われた。〔レセルマン他 (Le
serman et al) 1980. ネイチャー (Nature) 288 ；602-
604 〕。しかしながらリポゾームキャリヤシステムの本
質的問題で特に重要なことは、殆んどの場合標的とされ
たリポゾームはin vivo での標的部位に選択的に到達し
ないということがある。リポゾームが抗体分子によって
被われているか否かは問わず、リポゾームはマクロファ
ージにより直ちにとりいれられ、他の標的部位に到達す
る前に循環系から除去される。
に欠けるという重大な欠陥がある。最近この問題を解決
しようとして、薬剤を含むリポゾームへ全抗体又は Fab
フラグメントを共有接合させた研究が行われた。ヒース
(Heath at el.) 1981, Biochim. Biophys, Acta 640;6
6-81；黄 他 (Huag et al.), 1980, G, Biol, Chem.25
5(17):8015-8018 ；ヤンソンス・アンド・マレ (Janson
s and Mallet), 1981Anal. Biochem. 111；54-59 マー
ティン・他 (Martin et al) ：1981 Biochem.20；4229-
4239). 更に、抗体を前もって結合された複数の特異標
的に製剤を向けるため蛋白Ａ (Staph Ａ蛋白) をリポゾ
ームに結合させた研究も行われた。〔レセルマン他 (Le
serman et al) 1980. ネイチャー (Nature) 288 ；602-
604 〕。しかしながらリポゾームキャリヤシステムの本
質的問題で特に重要なことは、殆んどの場合標的とされ
たリポゾームはin vivo での標的部位に選択的に到達し
ないということがある。リポゾームが抗体分子によって
被われているか否かは問わず、リポゾームはマクロファ
ージにより直ちにとりいれられ、他の標的部位に到達す
る前に循環系から除去される。
【０００９】リポゾーム標的システムには他にも重大な
本質的問題があることを大多数の研究者が認めている。
即ち標的とされたリポゾームを標的細胞に結合すること
は必ずしもリポゾーム内容物、即ち薬剤が標的細胞内に
取り入れられることを意味しないということである。
〔ワインスタイン他 (Weinstein et al), 1978, Bioche
m. Biopyhs. Acta 509:272-288〕。標的細胞内に取り入
れられるリセプターに対して特異性を有する化合物を用
いてリポゾームを標的とすることでこの問題を解決しよ
うとした例もある、〔レセルマン他 (Leserman et al)
、1980, Proc. Natl. Aead. Sci., U.S.A. 77(8):4089
-4093 ；モウク (Mauk) 他, 1980, Proc. Natl. Acad.
Sci., U.S.A. 77(8):4430-4434 〕。しかしながら、リ
ポゾーム内容物を取りこむ問題は、腫瘍細胞の全てが食
細胞として活発ではないので解決されない。例えば、線
維肉腫細胞はリンパ腫や白血病の細胞よりもずっと食細
胞としての活性が落ちている。従って、これらのリポゾ
ームを用いた運搬システムは、究極的には細胞を死に至
らしめる物質を内部へ取りこむ標的細胞自体の能力に依
存する。
本質的問題があることを大多数の研究者が認めている。
即ち標的とされたリポゾームを標的細胞に結合すること
は必ずしもリポゾーム内容物、即ち薬剤が標的細胞内に
取り入れられることを意味しないということである。
〔ワインスタイン他 (Weinstein et al), 1978, Bioche
m. Biopyhs. Acta 509:272-288〕。標的細胞内に取り入
れられるリセプターに対して特異性を有する化合物を用
いてリポゾームを標的とすることでこの問題を解決しよ
うとした例もある、〔レセルマン他 (Leserman et al)
、1980, Proc. Natl. Aead. Sci., U.S.A. 77(8):4089
-4093 ；モウク (Mauk) 他, 1980, Proc. Natl. Acad.
Sci., U.S.A. 77(8):4430-4434 〕。しかしながら、リ
ポゾーム内容物を取りこむ問題は、腫瘍細胞の全てが食
細胞として活発ではないので解決されない。例えば、線
維肉腫細胞はリンパ腫や白血病の細胞よりもずっと食細
胞としての活性が落ちている。従って、これらのリポゾ
ームを用いた運搬システムは、究極的には細胞を死に至
らしめる物質を内部へ取りこむ標的細胞自体の能力に依
存する。
【００１０】最終的には、たとえリポゾームが標的細胞
内に取りこまれた場合でも、薬剤が活性を有する状態で
放出されるという保証はない。食作用の後で、リポゾー
ム内容物は標的細胞のリポゾーム内に取りこまれる。リ
ポゾーム内の蛋白質分解酵素の配列は、その構造を変え
たり活性部位を開裂して、薬剤を劣化させたりする。リ
ポゾーム内に含まれている多様な蛋白質分解酵素のた
め、薬剤が活性を有する状態で放出されるような結合の
仕方を考案するのが不可能と迄はいかなくとも非常にむ
つかしくなる。従って、標的細胞リポゾームの酵素内容
物に依存して薬剤を活性を有する状態で放出するのはせ
いぜい偶発的に上手くいくということにしかすぎない。
内に取りこまれた場合でも、薬剤が活性を有する状態で
放出されるという保証はない。食作用の後で、リポゾー
ム内容物は標的細胞のリポゾーム内に取りこまれる。リ
ポゾーム内の蛋白質分解酵素の配列は、その構造を変え
たり活性部位を開裂して、薬剤を劣化させたりする。リ
ポゾーム内に含まれている多様な蛋白質分解酵素のた
め、薬剤が活性を有する状態で放出されるような結合の
仕方を考案するのが不可能と迄はいかなくとも非常にむ
つかしくなる。従って、標的細胞リポゾームの酵素内容
物に依存して薬剤を活性を有する状態で放出するのはせ
いぜい偶発的に上手くいくということにしかすぎない。
【００１１】化合物又は薬剤を直接公知の抗体、単クロ
ーン抗体又は腫瘍抗原に向けられた抗体の Fab部分へ接
合することに関する標識システムについての報告が幾人
かの研究者によってなされた。これについては上記の概
論、ブライスマン他 (Blythman et al) 1981、ネイチャ
ー (Nature) 290:145-146 ; ディビス アンド プレス
トン (Davis and Preston)、1981、サイエンス (Scienc
e)、213:1385:1388 ；ハーウィツ (Hurwitz)他、1979、
Int. J. Cancer. 24:461-470) 、米国特許第4,093,607
号、英国特許第1,446,536号を参照のこと、アダールと
ハコモリ (UrdalHakomori) 、(1980、J. Biol Chem. 25
5(21):10509-10579) は、抗体を標的とし、アビジンを
介在させた薬剤の腫瘍細胞を致死させる事実について述
べた。
ーン抗体又は腫瘍抗原に向けられた抗体の Fab部分へ接
合することに関する標識システムについての報告が幾人
かの研究者によってなされた。これについては上記の概
論、ブライスマン他 (Blythman et al) 1981、ネイチャ
ー (Nature) 290:145-146 ; ディビス アンド プレス
トン (Davis and Preston)、1981、サイエンス (Scienc
e)、213:1385:1388 ；ハーウィツ (Hurwitz)他、1979、
Int. J. Cancer. 24:461-470) 、米国特許第4,093,607
号、英国特許第1,446,536号を参照のこと、アダールと
ハコモリ (UrdalHakomori) 、(1980、J. Biol Chem. 25
5(21):10509-10579) は、抗体を標的とし、アビジンを
介在させた薬剤の腫瘍細胞を致死させる事実について述
べた。
【００１２】標的システム内でのキャリヤとして、抗体
以外の蛋白について調べた研究者も多数ある。例えば、
デシアリレート (desialylated) した糖蛋白質は優先的
に肝細胞に取り入れられる上記の概論、ならびにバーン
スタイン他 (Bernstein et al) 1978 J. Natl. Cancer
Inct. 60(2):379-384 を参照されたい。抗体キャリヤシ
ステムはリポゾームキャリアシステムよりも標的につい
ての特異性を有しているが、標的部位での薬剤の放出に
は重大な問題が生じる。リポゾームを媒体とするシステ
ムと同じように、抗体−薬剤化合物は腫瘍細胞に取りこ
まれて薬物をリソゾーム酵素 (lysosomal enzymes)によ
る開裂を通って放出されるようにしなければならい (上
記概論を参照のこと) 。更に、薬剤が抗体分子の任意に
部位へ非特異性にリンクすると、これが抗原結合能力を
干渉することがあり、システムの有効性を減ずることが
ある。
以外の蛋白について調べた研究者も多数ある。例えば、
デシアリレート (desialylated) した糖蛋白質は優先的
に肝細胞に取り入れられる上記の概論、ならびにバーン
スタイン他 (Bernstein et al) 1978 J. Natl. Cancer
Inct. 60(2):379-384 を参照されたい。抗体キャリヤシ
ステムはリポゾームキャリアシステムよりも標的につい
ての特異性を有しているが、標的部位での薬剤の放出に
は重大な問題が生じる。リポゾームを媒体とするシステ
ムと同じように、抗体−薬剤化合物は腫瘍細胞に取りこ
まれて薬物をリソゾーム酵素 (lysosomal enzymes)によ
る開裂を通って放出されるようにしなければならい (上
記概論を参照のこと) 。更に、薬剤が抗体分子の任意に
部位へ非特異性にリンクすると、これが抗原結合能力を
干渉することがあり、システムの有効性を減ずることが
ある。
【００１３】非侵襲性in vivo での造影方法において最
近用いられている放射薬物学テクニックは、標的器官が
循環系から放射性薬物ラベルを除去する能力にもとづ
く。これのテクニックは種々の物質を利用して放射性化
合物を所望の標的へ運搬するものであり、かかる物質と
は基質、基質類似体, 配位子, ホルモン, 核種, 二官能
性キレート剤 (重金属又は核種と結合可能なキレート剤
を一端に有し、他端で標的細胞へ共有結合出来る反応基
を含有するリンカー基) , リポゾームを含む［スペンサ
ー R. P. (Spencer, R. P.) 編, 1980, 放射線薬物の
構造−活性の関係(Radiopharmaceuticals Structure-Ac
tivity Relationship, ニューヨーク, グリーン・アン
ド・ストラットン社刊；エッケルマン・アンド・レバン
ソン (Eckelman and Levanson), 1977, Intl. J. Cipp
l. Radication and Isotoper 28:67-82］。現在用可能
な他の非侵襲性テクニックは発光断層撮影法, 核磁共鳴
結像,in vivo 分光学等である。ブラウネル他 (Brownel
l et al) 1982, サイエンス誌Science 215:619-626は概
論であるが、放射線薬物分野におけるラベルを付した抗
体の使用を示唆している。３. 発明の概要 本発明は、抗体分子と化合物を共有接合させ、その結果
生じる抗体結合体が抗原の結合能力を保持しつつ、補体
を活性化するということに係わるものである。更に具体
的には、本発明によるかかる接合の方法は、抗体の炭水
化物成分、抗体のスルフヒドリル基ならびに抗体のFc領
域のアミノ又はカルボキシ基への接合を含む。
近用いられている放射薬物学テクニックは、標的器官が
循環系から放射性薬物ラベルを除去する能力にもとづ
く。これのテクニックは種々の物質を利用して放射性化
合物を所望の標的へ運搬するものであり、かかる物質と
は基質、基質類似体, 配位子, ホルモン, 核種, 二官能
性キレート剤 (重金属又は核種と結合可能なキレート剤
を一端に有し、他端で標的細胞へ共有結合出来る反応基
を含有するリンカー基) , リポゾームを含む［スペンサ
ー R. P. (Spencer, R. P.) 編, 1980, 放射線薬物の
構造−活性の関係(Radiopharmaceuticals Structure-Ac
tivity Relationship, ニューヨーク, グリーン・アン
ド・ストラットン社刊；エッケルマン・アンド・レバン
ソン (Eckelman and Levanson), 1977, Intl. J. Cipp
l. Radication and Isotoper 28:67-82］。現在用可能
な他の非侵襲性テクニックは発光断層撮影法, 核磁共鳴
結像,in vivo 分光学等である。ブラウネル他 (Brownel
l et al) 1982, サイエンス誌Science 215:619-626は概
論であるが、放射線薬物分野におけるラベルを付した抗
体の使用を示唆している。３. 発明の概要 本発明は、抗体分子と化合物を共有接合させ、その結果
生じる抗体結合体が抗原の結合能力を保持しつつ、補体
を活性化するということに係わるものである。更に具体
的には、本発明によるかかる接合の方法は、抗体の炭水
化物成分、抗体のスルフヒドリル基ならびに抗体のFc領
域のアミノ又はカルボキシ基への接合を含む。
【００１４】本発明の好ましい実施例では、かかる接合
の方法は抗体Ｈ鎖の炭水化物成分ならびに、一般にはCH
2 領域への共有接合に係るものである。炭水化物は抗体
の不変領域内（可変領域外）にあるので、炭水化物自体
の修飾により活性又は干渉基が直接可変領域内に導入さ
れることはない。従って、かかるアプローチは免疫反応
や免疫特異性に悪影響を与えることなしに、抗体を共有
修飾するための手段として有利である。
の方法は抗体Ｈ鎖の炭水化物成分ならびに、一般にはCH
2 領域への共有接合に係るものである。炭水化物は抗体
の不変領域内（可変領域外）にあるので、炭水化物自体
の修飾により活性又は干渉基が直接可変領域内に導入さ
れることはない。従って、かかるアプローチは免疫反応
や免疫特異性に悪影響を与えることなしに、抗体を共有
修飾するための手段として有利である。
【００１５】本発明の好ましい実施例によれば、抗体の
修飾は公知の試薬と反応を用いて炭水化物成分を共有接
合して行う。蛋白化学の代わりに、本発明者らは炭水化
物が糖蛋白質の炭水化物を修飾するという固有の蛋白化
学反応を利用した。その原理は、排他的にではなくと
も、主として炭水化物成分に係わる数多くの相異なる酵
素的、非酵素的反応があるということがある。
修飾は公知の試薬と反応を用いて炭水化物成分を共有接
合して行う。蛋白化学の代わりに、本発明者らは炭水化
物が糖蛋白質の炭水化物を修飾するという固有の蛋白化
学反応を利用した。その原理は、排他的にではなくと
も、主として炭水化物成分に係わる数多くの相異なる酵
素的、非酵素的反応があるということがある。
【００１６】本発明の生成結合体は、完全にではない
が、殆んどの免疫反応と免疫特異性を保持することが見
出された。単クローン抗体を用いてかかる結合体を生成
する時、会合定数と異質性指数とは共有修飾の本発明の
様態によって左右されるものではないが、従来法の修飾
では平均結合定数が減少し、機能上の異質性を生じるこ
とになる。更に本発明の新規な手法には使用可能な試薬
は非常に選択的であり、従って抗体分子のポリペプチド
部分の反応で検出可能なものはない。これは抗体の完全
な分子又は機能単価フラグメントを用いて行うことが出
来る。更に、修飾はIgA, IgD, IgE, IgG, IgM を含む種
々の抗体の級と、単クローン抗体を含む他のものから得
た抗体についても行うことが出来る。
が、殆んどの免疫反応と免疫特異性を保持することが見
出された。単クローン抗体を用いてかかる結合体を生成
する時、会合定数と異質性指数とは共有修飾の本発明の
様態によって左右されるものではないが、従来法の修飾
では平均結合定数が減少し、機能上の異質性を生じるこ
とになる。更に本発明の新規な手法には使用可能な試薬
は非常に選択的であり、従って抗体分子のポリペプチド
部分の反応で検出可能なものはない。これは抗体の完全
な分子又は機能単価フラグメントを用いて行うことが出
来る。更に、修飾はIgA, IgD, IgE, IgG, IgM を含む種
々の抗体の級と、単クローン抗体を含む他のものから得
た抗体についても行うことが出来る。
【００１７】本発明は更に、 in vivo又はin vitroでの
特定の細胞、組織、器官、又は他の部位へ単数又は複数
の化合物を標的とするための担体分子としての抗体の用
途ならびに標的部位での化合物のこれに続く補体を媒体
とする放出をも包含するものである。これに代えて、放
出は血清プロテアーゼにより媒介されることもある。所
望の標的（例：腫瘍細胞の抗原決定因子、ウィルス、真
菌、細胞、奇生体）に向けられた抗体をキャリヤ分子と
して要することも可能であるが、単クローン抗体は、抗
原特異性を増し、運搬システムの効率を高め、製造を容
易にするという利点がある。
特定の細胞、組織、器官、又は他の部位へ単数又は複数
の化合物を標的とするための担体分子としての抗体の用
途ならびに標的部位での化合物のこれに続く補体を媒体
とする放出をも包含するものである。これに代えて、放
出は血清プロテアーゼにより媒介されることもある。所
望の標的（例：腫瘍細胞の抗原決定因子、ウィルス、真
菌、細胞、奇生体）に向けられた抗体をキャリヤ分子と
して要することも可能であるが、単クローン抗体は、抗
原特異性を増し、運搬システムの効率を高め、製造を容
易にするという利点がある。
【００１８】in vivoで投与されると、キャリヤ抗体分
子は標的部位の抗原決定因子に接合する。引続いて起こ
るリンクした化合物の放出は、補体の活性体又は血清プ
ロテアーゼに依存する。補体（com plement)とは、或る
種の免疫複合体の生成により連続的に活性化（補体カス
ケード反応）される血清蛋白のグループに与えられた名
称である。カスケード反応の補体構成要素のうちいくつ
かは、特定の気質又は化学結合に対する特異性を有する
蛋白質分解活動を有する。
子は標的部位の抗原決定因子に接合する。引続いて起こ
るリンクした化合物の放出は、補体の活性体又は血清プ
ロテアーゼに依存する。補体（com plement)とは、或る
種の免疫複合体の生成により連続的に活性化（補体カス
ケード反応）される血清蛋白のグループに与えられた名
称である。カスケード反応の補体構成要素のうちいくつ
かは、特定の気質又は化学結合に対する特異性を有する
蛋白質分解活動を有する。
【００１９】本発明の一工程によれば、化学物は補体活
性化が可能である免疫グロブリン級の抗体キャリヤ分子
に接合する。この接合は１個又はそれ以上の活性化され
た補体酵素による開裂をうけやすいリンカーを介して行
われ、１個又はそれ以上の化合物が各抗体分子へ接合さ
れることもある。その結果生じた抗体結合体が固体に投
与される。修飾をうけた抗体と抗原との in vivoでの結
合に引続き、固体の血清補体が活性化され、化合物は選
択的に開裂され、標的部位で放出される。かかる結合体
は補体結合アッセイシステム内での標的抗原のin vitro
検出と識別にも用することができる。
性化が可能である免疫グロブリン級の抗体キャリヤ分子
に接合する。この接合は１個又はそれ以上の活性化され
た補体酵素による開裂をうけやすいリンカーを介して行
われ、１個又はそれ以上の化合物が各抗体分子へ接合さ
れることもある。その結果生じた抗体結合体が固体に投
与される。修飾をうけた抗体と抗原との in vivoでの結
合に引続き、固体の血清補体が活性化され、化合物は選
択的に開裂され、標的部位で放出される。かかる結合体
は補体結合アッセイシステム内での標的抗原のin vitro
検出と識別にも用することができる。
【００２０】本発明の実施にあたっては、抗体の抗原結
合能力又は補体活性化能力（補体結合とも称される）を
干渉することなく化合物を抗体分子に接合させることが
好ましい。補体活性化能力を有する抗体のいずれにでも
化合物を接合させるため用いることが出来る。本発明に
よる新規なリンカーならびに接合の方法を以下に述べ
る。一例として腫瘍造影又は抗原−抗体相互作用にもと
ずく分離スキームのごとき、或る種のテクニックにおい
ては、抗体が不溶性マトリックスに接合されるが、これ
には化合物が標的部位に接合した状態でいることが必要
となる。標的部位での開裂が好ましくない別の実施例で
は、活性化補体蛋白に対して感受性のないリンカーグル
ープが用いられるか、又は抗体分子が補体を活性化しな
い級又は型のものを用いる。
合能力又は補体活性化能力（補体結合とも称される）を
干渉することなく化合物を抗体分子に接合させることが
好ましい。補体活性化能力を有する抗体のいずれにでも
化合物を接合させるため用いることが出来る。本発明に
よる新規なリンカーならびに接合の方法を以下に述べ
る。一例として腫瘍造影又は抗原−抗体相互作用にもと
ずく分離スキームのごとき、或る種のテクニックにおい
ては、抗体が不溶性マトリックスに接合されるが、これ
には化合物が標的部位に接合した状態でいることが必要
となる。標的部位での開裂が好ましくない別の実施例で
は、活性化補体蛋白に対して感受性のないリンカーグル
ープが用いられるか、又は抗体分子が補体を活性化しな
い級又は型のものを用いる。
【００２１】最後に、他の化合物、例えばホルモン又は
神経伝達体の運搬をする場合、カスケード補体を活性化
せずに化合物の開裂を行うことが好ましい場合には、補
体結合をしない抗体に接合した血清プロテアーゼに対す
感性を有するリンカーを用いてもよい。４. 発明の詳細な記載 糖蛋白質は、或る種の治療用及び／又は診断用手段とし
て用いられる生物学的に重要な巨大分子のいくつかのタ
イプの内の一つである。現在認識されている糖蛋白質の
類は決して完全なものではないが、かかる物質を列挙し
てみれば免疫グロブリン血清補体成分, いくつかの酵
素, 細胞表面組織適合抗原及び細胞表面受容体等が含ま
れる。これらの化合物はポリペプチドのバックボーンへ
の共有接合された炭水化物残基を有している。抗体と
は、炭水化物成分が通常免疫グロブリン分子のＨ鎖上に
位置する糖蛋白質の一つのクラスである。（いくつかの
免疫グロブリンの概略を示す第１回を参照のこと）。炭
水化物成分を含む免疫グロブリンの Fab又はFab'フラグ
メントもここに説明する反応式に用いることができる。
神経伝達体の運搬をする場合、カスケード補体を活性化
せずに化合物の開裂を行うことが好ましい場合には、補
体結合をしない抗体に接合した血清プロテアーゼに対す
感性を有するリンカーを用いてもよい。４. 発明の詳細な記載 糖蛋白質は、或る種の治療用及び／又は診断用手段とし
て用いられる生物学的に重要な巨大分子のいくつかのタ
イプの内の一つである。現在認識されている糖蛋白質の
類は決して完全なものではないが、かかる物質を列挙し
てみれば免疫グロブリン血清補体成分, いくつかの酵
素, 細胞表面組織適合抗原及び細胞表面受容体等が含ま
れる。これらの化合物はポリペプチドのバックボーンへ
の共有接合された炭水化物残基を有している。抗体と
は、炭水化物成分が通常免疫グロブリン分子のＨ鎖上に
位置する糖蛋白質の一つのクラスである。（いくつかの
免疫グロブリンの概略を示す第１回を参照のこと）。炭
水化物成分を含む免疫グロブリンの Fab又はFab'フラグ
メントもここに説明する反応式に用いることができる。
【００２２】IgG免疫グロブリンのFab'フラグメント
は、ペプシン又はパパインで抗体分子を開裂して得る
〔前者の場合二価のフラグメント(Fab')2 となり、後者
は二つの一価のフラグメント２Fabとなる〕。４.1．抗体の選択 本発明によれば、いかなる抗原又はハプテンに向けられ
た抗体を用いてもよい。公知の抗体（抗血清）を用いて
もよいが、単クローン抗体にはいくつかの利点がある。
各単クローン抗体は一つの抗原決定因子に対する特異性
を有する。これに加えて、各単クローン抗体は無限に産
生が可能である。本発明で用いた抗体はいずれかの決定
因子、例えば、腫瘍, 細菌, 真菌, ウィルス, 奇生体,
マイコプラズマ, 組織適合性, 分画, その他の細胞膜抗
原, 病原体表面抗原, 毒素, 酵素, アレルゲン, 薬剤な
らびに生物学的活性を有する分子に用いることが出来
る。
は、ペプシン又はパパインで抗体分子を開裂して得る
〔前者の場合二価のフラグメント(Fab')2 となり、後者
は二つの一価のフラグメント２Fabとなる〕。４.1．抗体の選択 本発明によれば、いかなる抗原又はハプテンに向けられ
た抗体を用いてもよい。公知の抗体（抗血清）を用いて
もよいが、単クローン抗体にはいくつかの利点がある。
各単クローン抗体は一つの抗原決定因子に対する特異性
を有する。これに加えて、各単クローン抗体は無限に産
生が可能である。本発明で用いた抗体はいずれかの決定
因子、例えば、腫瘍, 細菌, 真菌, ウィルス, 奇生体,
マイコプラズマ, 組織適合性, 分画, その他の細胞膜抗
原, 病原体表面抗原, 毒素, 酵素, アレルゲン, 薬剤な
らびに生物学的活性を有する分子に用いることが出来
る。
【００２３】特に関連のある薬剤としては、オビオイド
類, アンフェタミン類, バルビツール酸塩, ステロイド
類, カテコラミン類, ダイランティン, テオフィリン,
ヒスタミン, カンナビノイド類等である。抗原の完全な
リストは、米国特許第4,193,983号、特に第７〜11欄に
記載があり、該特許明細書はここに言及して本願に包含
せしめる。
類, アンフェタミン類, バルビツール酸塩, ステロイド
類, カテコラミン類, ダイランティン, テオフィリン,
ヒスタミン, カンナビノイド類等である。抗原の完全な
リストは、米国特許第4,193,983号、特に第７〜11欄に
記載があり、該特許明細書はここに言及して本願に包含
せしめる。
【００２４】抗体と接合した化合物の運搬と放出を希望
する時は、 IgMクラス又は IgGのサブクラスの内いずれ
かの免疫グロブリンを用いるべきであって、何故かとい
えばこれらの免疫グロブリンは補体を活性化することが
知られているからである。他の用途では補体活性能力も
ないキャリヤ免疫グロブリンを用いてもよい。かかる免
疫グロブリン・キャリヤには以下のものが含まれる：Ig
A, IgD, IgE,の如き或る種の抗体クラス、免疫グロブリ
ンの或る種のフラグメント、即ち、半抗体分子（一つの
単Ｈ：Ｌ鎖のペア）、又はFab, Fab' 又は(Fab')2 フラ
グメント。 Invivo標的の造影を行いたい時には、抗体
フラグメントはより早い速度で標的部位に浸透するので
キャリヤとして有利である。その他、相違なる抗原決定
因子に対して反応する抗体の組合せを用いてもよい。
する時は、 IgMクラス又は IgGのサブクラスの内いずれ
かの免疫グロブリンを用いるべきであって、何故かとい
えばこれらの免疫グロブリンは補体を活性化することが
知られているからである。他の用途では補体活性能力も
ないキャリヤ免疫グロブリンを用いてもよい。かかる免
疫グロブリン・キャリヤには以下のものが含まれる：Ig
A, IgD, IgE,の如き或る種の抗体クラス、免疫グロブリ
ンの或る種のフラグメント、即ち、半抗体分子（一つの
単Ｈ：Ｌ鎖のペア）、又はFab, Fab' 又は(Fab')2 フラ
グメント。 Invivo標的の造影を行いたい時には、抗体
フラグメントはより早い速度で標的部位に浸透するので
キャリヤとして有利である。その他、相違なる抗原決定
因子に対して反応する抗体の組合せを用いてもよい。
【００２５】
【表１】
【００２６】
【００２７】４.2．化合物を抗体分子へ接合する方法 従来方法の利用に加えて、本発明は化合物を抗体分子へ
接合させるいくつかの新規な方法を含んでいる。即ち
(1)抗体分子の炭水化物生成へ接合させること(2) 抗体
分子のスルフヒドリル基へ接合させること、及び (3)抗
体分子のFc領域のアミノ基又はカルボキシル基へ接合さ
せることである。どの方法を利用した場合も、接合によ
って抗体の主要特徴である免疫特異性や免疫反応性等を
有意に変えてはならない。その他には産生された抗体結
合対の安定と反応の単純さがあげられる。４.2.1. 抗体の炭水化物への接合 下記に詳記するように、抗体の炭化水素側鎖は選択的に
酸化してアルデヒドを生成する。生成アルデヒドをアミ
ン基（例：ヒドロキシルアミン, ヒドラジン,フェニル
ヒドラジン又はセミカルバジド等のアンモニア誘導体）
と反応させてシッフ基（例：オキシム, ヒドラゾン, フ
ェニルヒドラゾン又はセミカルバゾン）を生成する。
接合させるいくつかの新規な方法を含んでいる。即ち
(1)抗体分子の炭水化物生成へ接合させること(2) 抗体
分子のスルフヒドリル基へ接合させること、及び (3)抗
体分子のFc領域のアミノ基又はカルボキシル基へ接合さ
せることである。どの方法を利用した場合も、接合によ
って抗体の主要特徴である免疫特異性や免疫反応性等を
有意に変えてはならない。その他には産生された抗体結
合対の安定と反応の単純さがあげられる。４.2.1. 抗体の炭水化物への接合 下記に詳記するように、抗体の炭化水素側鎖は選択的に
酸化してアルデヒドを生成する。生成アルデヒドをアミ
ン基（例：ヒドロキシルアミン, ヒドラジン,フェニル
ヒドラジン又はセミカルバジド等のアンモニア誘導体）
と反応させてシッフ基（例：オキシム, ヒドラゾン, フ
ェニルヒドラゾン又はセミカルバゾン）を生成する。
【００２８】又は抗体の炭水化物成分を酵素テクニック
で修飾し他の化学基との接合又は反応を可能とすること
ができる。かかる酵素の一例は酸素の存在下でガラクト
ースを酸化するガラクトースオキシダーゼである。４.2.1.1. 酸化の化学的方法 抗体分子の炭水化物成分の酸化はアルデヒド基の生成を
導く。過ヨウ素酸, パラ過ヨウ素酸, パラ過ヨウ素酸ナ
トリウム, メタ過ヨウ素酸カリウム等の酸化剤を用いる
ことが出来る。これらの中では酸素酸とその塩は第二義
的又は好ましくない副反応の度合が低いので好ましい。
一般的な議論については、ジャクソン著1944「有機反応
(Organic Reactions)２」第341頁、バントン（Bunton)
、1965「有機化学における酸化（Oxidation in Organi
c Chemistry）第１巻、（ワイバーグ編)(アカデミック
プレス社、ニューヨーク）第367頁を参照のこと。
で修飾し他の化学基との接合又は反応を可能とすること
ができる。かかる酵素の一例は酸素の存在下でガラクト
ースを酸化するガラクトースオキシダーゼである。４.2.1.1. 酸化の化学的方法 抗体分子の炭水化物成分の酸化はアルデヒド基の生成を
導く。過ヨウ素酸, パラ過ヨウ素酸, パラ過ヨウ素酸ナ
トリウム, メタ過ヨウ素酸カリウム等の酸化剤を用いる
ことが出来る。これらの中では酸素酸とその塩は第二義
的又は好ましくない副反応の度合が低いので好ましい。
一般的な議論については、ジャクソン著1944「有機反応
(Organic Reactions)２」第341頁、バントン（Bunton)
、1965「有機化学における酸化（Oxidation in Organi
c Chemistry）第１巻、（ワイバーグ編)(アカデミック
プレス社、ニューヨーク）第367頁を参照のこと。
【００２９】抗体とこれらの酸化剤との酸化反応は公知
の方法で行うことが出来る。酸化反応では、抗体は通常
水溶液の形で用いられ、その濃度は通常100mg/ml以下、
好ましくは１〜20mg/ml である。酸化剤として酸素酸又
はその塩を用いるときは、これは通常水溶液の形で用い
られ、その濃度は通常0.001 〜10mM、好ましくは1.0〜1
0mMである。酸素酸及びその塩の量は抗体の種類に左右
されるが、一般に過剰量、例えば酸化性炭水化物の２〜
10倍量が用いられる。しかし最適量は日常的な実験によ
り決定出来る。
の方法で行うことが出来る。酸化反応では、抗体は通常
水溶液の形で用いられ、その濃度は通常100mg/ml以下、
好ましくは１〜20mg/ml である。酸化剤として酸素酸又
はその塩を用いるときは、これは通常水溶液の形で用い
られ、その濃度は通常0.001 〜10mM、好ましくは1.0〜1
0mMである。酸素酸及びその塩の量は抗体の種類に左右
されるが、一般に過剰量、例えば酸化性炭水化物の２〜
10倍量が用いられる。しかし最適量は日常的な実験によ
り決定出来る。
【００３０】抗体を酸素酸又はその塩で酸化する工程に
おいて、最適範囲はpH約４〜８、温度０〜37℃及び反応
時間約15分から12時間を含む。グリコ蛋白を酸素酸又は
その塩で酸化する間、好ましくは光を遮断してグリコ蛋
白の過剰酸化を防止する。4.2.1.2. 酸化の酵素的方法 抗体分子の炭水化物部分の酸化は酵素、ガラクトースオ
キシダーゼで行うこともできる〔Cooper, et al., 195
9, J. Biol.Chem. 234:445-448〕 抗体は水溶液の形で用い、濃度は通常0.５〜20mg／mlで
ある。酵素は通常溶液ml当り約５〜１00単位、pH約5.５
〜約8.０で用いられる。pH、基質濃度、バッファ及びバ
ッファ濃度の酵素反応に対する影響はクーパー他（上
述）が述べている。４.2.1.3. 抗体結合体の産生 本発明による抗体結合体は、酸化抗体を入手可能なアミ
ン基を有する適当な結合相手と反応させて産生する。こ
の直後に得られる生成物（抗体結合体）は、最初の添加
生成物から水の分子を除去して得た炭素−窒素二重結合
を含む。
おいて、最適範囲はpH約４〜８、温度０〜37℃及び反応
時間約15分から12時間を含む。グリコ蛋白を酸素酸又は
その塩で酸化する間、好ましくは光を遮断してグリコ蛋
白の過剰酸化を防止する。4.2.1.2. 酸化の酵素的方法 抗体分子の炭水化物部分の酸化は酵素、ガラクトースオ
キシダーゼで行うこともできる〔Cooper, et al., 195
9, J. Biol.Chem. 234:445-448〕 抗体は水溶液の形で用い、濃度は通常0.５〜20mg／mlで
ある。酵素は通常溶液ml当り約５〜１00単位、pH約5.５
〜約8.０で用いられる。pH、基質濃度、バッファ及びバ
ッファ濃度の酵素反応に対する影響はクーパー他（上
述）が述べている。４.2.1.3. 抗体結合体の産生 本発明による抗体結合体は、酸化抗体を入手可能なアミ
ン基を有する適当な結合相手と反応させて産生する。こ
の直後に得られる生成物（抗体結合体）は、最初の添加
生成物から水の分子を除去して得た炭素−窒素二重結合
を含む。
【００３１】
【化１】
【００３２】アルデヒドとヒドラジドの反応については
「上級有機化学；反応・メカニズムと構造（Acvanced O
rganic Chemistry；Reactions, Mechanisms and Strust
ure)」1978年３月号（マグロウヒル株式会社、ニューヨ
ーク）第674頁を参照されたい。
「上級有機化学；反応・メカニズムと構造（Acvanced O
rganic Chemistry；Reactions, Mechanisms and Strust
ure)」1978年３月号（マグロウヒル株式会社、ニューヨ
ーク）第674頁を参照されたい。
【００３３】濃度が約0.５〜20mg／mlの酸化抗体の溶液
を結合相手と混ぜ合わせ（被結合体グループと抗体アル
デヒドの分子比は約１〜約10,000）、溶液を約１時間〜
18時間培養した。適温は０℃〜37℃、pHは約６〜８であ
る。４.2.1.4. 抗体結合体の安定化 抗体結合体が抗体とその被結合体との間で第4.2.1.3.の
項に記載の方法で生成された後、抗体結合体は適当な還
元剤、例えばナトリウムシアノボロハイドライド又はナ
トリウムボロハイドで安定化を計ることも可能である。
を結合相手と混ぜ合わせ（被結合体グループと抗体アル
デヒドの分子比は約１〜約10,000）、溶液を約１時間〜
18時間培養した。適温は０℃〜37℃、pHは約６〜８であ
る。４.2.1.4. 抗体結合体の安定化 抗体結合体が抗体とその被結合体との間で第4.2.1.3.の
項に記載の方法で生成された後、抗体結合体は適当な還
元剤、例えばナトリウムシアノボロハイドライド又はナ
トリウムボロハイドで安定化を計ることも可能である。
【００３４】抗体-CH＝N-R-還元剤→抗体-CH2-NH-R 還元剤は通常、使用されるアルデヒド基に対して約10〜
１00モル倍過剰に加える。これについての一般的情報は
ジェントフトならびにディアボーン（Jentoftand Dearb
orn）, 1979, J. Bial. Chem. 254:4359 を参照のこ
と。４.2.2. 抗体分子のスルフヒドラル基への接合 遊離スルフヒドリル基は免疫グロブリン分子のジスルフ
ィド結合から生成できる。これは抗体分子を徐々に還元
することにより可能となる。 IgGのジスルフィド結合の
中で通常最も還元しやすいものは二つのＨ鎖をリンクす
るものである。抗体分子の抗原結合領域の付近にあるジ
スルフィド結合は比較的影響をうけない（図１を参照の
こと）。かかる還元の結果、補体固定能力が失われる
が、抗体−抗原結合能力は影響をうけない（カルシュ
（Karush）他、1979, Biochem, 18:2226-2232)。Ｈ鎖内
領域で生成される遊離スルフヒドリル基は、次にカルボ
キシ又はアミノ基を含む化合物のいずれかのヨードアル
キル誘導体と反応し、（例：化合物の一つと接合してい
るリンカーグループのヨードアルキル誘導体）共有リン
ケージを形成する。かかるリンケージは免疫グロブリン
の抗原結合部位とは干渉しない。
１00モル倍過剰に加える。これについての一般的情報は
ジェントフトならびにディアボーン（Jentoftand Dearb
orn）, 1979, J. Bial. Chem. 254:4359 を参照のこ
と。４.2.2. 抗体分子のスルフヒドラル基への接合 遊離スルフヒドリル基は免疫グロブリン分子のジスルフ
ィド結合から生成できる。これは抗体分子を徐々に還元
することにより可能となる。 IgGのジスルフィド結合の
中で通常最も還元しやすいものは二つのＨ鎖をリンクす
るものである。抗体分子の抗原結合領域の付近にあるジ
スルフィド結合は比較的影響をうけない（図１を参照の
こと）。かかる還元の結果、補体固定能力が失われる
が、抗体−抗原結合能力は影響をうけない（カルシュ
（Karush）他、1979, Biochem, 18:2226-2232)。Ｈ鎖内
領域で生成される遊離スルフヒドリル基は、次にカルボ
キシ又はアミノ基を含む化合物のいずれかのヨードアル
キル誘導体と反応し、（例：化合物の一つと接合してい
るリンカーグループのヨードアルキル誘導体）共有リン
ケージを形成する。かかるリンケージは免疫グロブリン
の抗原結合部位とは干渉しない。
【００３５】一化合物を酸化免疫グロブリン又は酸化抗
体フラグメントの有利スルフヒドリル基へ接合して製造
する抗体結合体は補体を活性化するものではない。従っ
て、これらの結合体は、化合物の開裂や放出が好ましく
ないin vitroの分離や in vivoの造影システムに用いる
ことが出来る。かかる結合体は、補体を媒介しない放出
を所望する時にも用いることが出来る。かかる実施例で
は、化合物は酸化免疫グロブリン又は酸化抗体フラグメ
ント上のスルフヒドリル基へ血清プロテアーゼによる開
裂をうけやすいリンカーを介してリンクされることもで
きる。
体フラグメントの有利スルフヒドリル基へ接合して製造
する抗体結合体は補体を活性化するものではない。従っ
て、これらの結合体は、化合物の開裂や放出が好ましく
ないin vitroの分離や in vivoの造影システムに用いる
ことが出来る。かかる結合体は、補体を媒介しない放出
を所望する時にも用いることが出来る。かかる実施例で
は、化合物は酸化免疫グロブリン又は酸化抗体フラグメ
ント上のスルフヒドリル基へ血清プロテアーゼによる開
裂をうけやすいリンカーを介してリンクされることもで
きる。
【００３６】IgG免疫グロブリンのFab'フラグメントは
抗体分子をペプシン又はパパインで開裂して得る（ペプ
シン：二価フラグメント(Fab')2 パパイン：２つの単価
フラグメント２Fab)が、図１を参照されたい。 Fabと(F
ab')2 フラグメントは抗体分子全体よりも小さく、従っ
て、標的部位又は組織への浸透が容易である。これによ
り in vivo造影は明らかに有利となるが、何故ならば結
合体の in vivo部位への浸透が速やかとなるからである
（腫瘍マッス、感染部位等）。その他にも抗体フラグメ
ントを用いて生成した結合体を用いる時、これらのフラ
グメントが胎盤障壁を越えないという利点もある。その
結果、本実施例を用いる時、妊娠中の婦人における in
vivo部位（主要のごとき）を胎児を造影化合物に曝露す
ることなく撮影することが出来る。
抗体分子をペプシン又はパパインで開裂して得る（ペプ
シン：二価フラグメント(Fab')2 パパイン：２つの単価
フラグメント２Fab)が、図１を参照されたい。 Fabと(F
ab')2 フラグメントは抗体分子全体よりも小さく、従っ
て、標的部位又は組織への浸透が容易である。これによ
り in vivo造影は明らかに有利となるが、何故ならば結
合体の in vivo部位への浸透が速やかとなるからである
（腫瘍マッス、感染部位等）。その他にも抗体フラグメ
ントを用いて生成した結合体を用いる時、これらのフラ
グメントが胎盤障壁を越えないという利点もある。その
結果、本実施例を用いる時、妊娠中の婦人における in
vivo部位（主要のごとき）を胎児を造影化合物に曝露す
ることなく撮影することが出来る。
【００３７】抗体分子のスルフヒドリル基へ化合物を接
合させると補体固定能力を破壊することになるが、かか
る接合の方法により補体を媒体とする放出システムに抗
体結合体を用いるようにすることが出来る。かかる実施
例では、補体感受性を有する基質リンカーに結合した化
合物を酸化Ig分子のスルフヒドリル又は抗体フラグメン
トに接合させ、補体を活性化することの出来る完全な抗
体分子との混合物内で標的に運搬される。後者は補体を
活性化し、これにより前者から化合物を開裂する。抗体
フラグメントを、補体を用いた放出システムにおいてキ
ャリヤ分子として使用すれば、妊娠中の女性の治療が可
能となり、結合体が標的部位へより迅速に浸透するとい
う利点を提供する。
合させると補体固定能力を破壊することになるが、かか
る接合の方法により補体を媒体とする放出システムに抗
体結合体を用いるようにすることが出来る。かかる実施
例では、補体感受性を有する基質リンカーに結合した化
合物を酸化Ig分子のスルフヒドリル又は抗体フラグメン
トに接合させ、補体を活性化することの出来る完全な抗
体分子との混合物内で標的に運搬される。後者は補体を
活性化し、これにより前者から化合物を開裂する。抗体
フラグメントを、補体を用いた放出システムにおいてキ
ャリヤ分子として使用すれば、妊娠中の女性の治療が可
能となり、結合体が標的部位へより迅速に浸透するとい
う利点を提供する。
【００３８】本発明によれば、酸化抗体分子のスルフヒ
ドリル基への接合を行うため、基質リンカーはヨードア
ルキル基をリンカーの一端に接合させて修飾する。リン
カー上の修飾されていない部位は化合物へ共有接合させ
てもよく、させなくともよい。例えば、エステル又はア
ミドで第5.５項により生成した化合物にリンクした基質
リンカー（表２および表３を参照）は、ヨードアルキル
を添加して修飾し、以下に示すヨードアルキル誘導体を
生成する（注：＊印はアミド又はエステル結合を意味す
る）。
ドリル基への接合を行うため、基質リンカーはヨードア
ルキル基をリンカーの一端に接合させて修飾する。リン
カー上の修飾されていない部位は化合物へ共有接合させ
てもよく、させなくともよい。例えば、エステル又はア
ミドで第5.５項により生成した化合物にリンクした基質
リンカー（表２および表３を参照）は、ヨードアルキル
を添加して修飾し、以下に示すヨードアルキル誘導体を
生成する（注：＊印はアミド又はエステル結合を意味す
る）。
【００３９】
【化２】
【００４０】前述した様に、リンカーは活性化補体によ
る開裂をうけるかこれに耐性を有するものか、又は血清
プロテアーゼであってもよい。リンカーグループのヨー
ドアルキル誘導体を酸化抗体分子又は酸化抗体フラグメ
ントと反応させると、リンカーグループは抗体分子又は
フラグメントに共有接合する。これは以下の通りであ
る。（注：＊印はアミド又はエステル結合を意味す
る）。
る開裂をうけるかこれに耐性を有するものか、又は血清
プロテアーゼであってもよい。リンカーグループのヨー
ドアルキル誘導体を酸化抗体分子又は酸化抗体フラグメ
ントと反応させると、リンカーグループは抗体分子又は
フラグメントに共有接合する。これは以下の通りであ
る。（注：＊印はアミド又はエステル結合を意味す
る）。
【００４１】
【化３】
【００４２】４.2.3. 抗体分子のFc領域のアミシ又はカ
ルボキシ基への結合 化合物を抗体分子へリンクさせる公知方法を修正して、
本発明の目的のために使用することも出来る。これらの
公知方法では化合物を抗体分子のアミノ又はカルボキシ
ル基へ接合させる。公知方法の欠点は抗体分子と抗原と
の結合親和力が低下することにあり（例えば免疫特異性
活動の低下）、これはリンカー又は化合物の抗体分子の
Fab領域（抗原結合アーム）への非特異的結合のためで
ある。従って、公知のリンク法を利用するには、基質リ
ンカーを抗体分子上のより適切な場所へ向け、免疫複合
体形成と補体により開裂を行わしめるようにしなければ
ならない。この目的のためには、免疫グロブリンの抗原
結合アーム(Fab領域）又は半分子を、Fc領域のアミノ又
はカルボキシル基のいずれかが基質リンカー、例えば可
溶性カルボジイミド反応を介して反応を行っている間、
保護しなければならない。リンカーが化合物へ共有接合
している時は、化合物内の反応基で抗体分子との結合を
干渉するようなものは、抗体分子との結合を干渉するよ
うなものは、抗体分子をリンカーと反応させる前にブロ
ックしなければならない。抗体結合体が形成されると、
化合物内の基はデブロッキングが出来る。リンカーは活
性化された補体による開裂又は血清プロテアーゼの影響
をうけるか、又は耐性を有する。カップリングの範囲は
試薬を限定することによりコントロールできる。例えば
（注：＊印はアミド又はエステル結合を意味する）。
ルボキシ基への結合 化合物を抗体分子へリンクさせる公知方法を修正して、
本発明の目的のために使用することも出来る。これらの
公知方法では化合物を抗体分子のアミノ又はカルボキシ
ル基へ接合させる。公知方法の欠点は抗体分子と抗原と
の結合親和力が低下することにあり（例えば免疫特異性
活動の低下）、これはリンカー又は化合物の抗体分子の
Fab領域（抗原結合アーム）への非特異的結合のためで
ある。従って、公知のリンク法を利用するには、基質リ
ンカーを抗体分子上のより適切な場所へ向け、免疫複合
体形成と補体により開裂を行わしめるようにしなければ
ならない。この目的のためには、免疫グロブリンの抗原
結合アーム(Fab領域）又は半分子を、Fc領域のアミノ又
はカルボキシル基のいずれかが基質リンカー、例えば可
溶性カルボジイミド反応を介して反応を行っている間、
保護しなければならない。リンカーが化合物へ共有接合
している時は、化合物内の反応基で抗体分子との結合を
干渉するようなものは、抗体分子との結合を干渉するよ
うなものは、抗体分子をリンカーと反応させる前にブロ
ックしなければならない。抗体結合体が形成されると、
化合物内の基はデブロッキングが出来る。リンカーは活
性化された補体による開裂又は血清プロテアーゼの影響
をうけるか、又は耐性を有する。カップリングの範囲は
試薬を限定することによりコントロールできる。例えば
（注：＊印はアミド又はエステル結合を意味する）。
【００４３】
【化４】
【００４４】Fabアームの保護には幾通りかの方法があ
る。キャリヤ抗体分子の Fab部分は、キャリヤ Fab抗原
結合アーム（耐−Fab−抗体）に対して向けられた抗体
に結合することもできる。引き続き生じるリンキング反
応は、キャリヤ抗体分子の未結合のFc部分への化合物の
接合を生じる。耐−Fab−抗体はカラム内に封じこめ、
反応済、未反応の成分の分離を容易にする。
る。キャリヤ抗体分子の Fab部分は、キャリヤ Fab抗原
結合アーム（耐−Fab−抗体）に対して向けられた抗体
に結合することもできる。引き続き生じるリンキング反
応は、キャリヤ抗体分子の未結合のFc部分への化合物の
接合を生じる。耐−Fab−抗体はカラム内に封じこめ、
反応済、未反応の成分の分離を容易にする。
【００４５】かかる結合体は以下の通り生成することが
出来る（各ステップ後にバッファで完全に洗浄のこ
と）。抗 Fab抗体を臭化シアンで活性化したセファロー
ズカラム等の適当な支持マトリックスに接合する。カラ
ムにキャリヤ抗体を注入し、カラム上のすべての抗原結
合部位を飽和させる。キャリヤ抗体の Fab領域がこれで
結合され、抗 Fab抗体上の抗原結合部位を保護すること
になる。カラムをアミノ基遮断剤（例：無水酢酸, カル
ボベンゾキシクロライド等）で処理し、抗 Fab抗体及び
結合したキャリヤ抗体の両方の露出した部分上の全ての
遊離アミノ基をブロックする。それからカラムをチャオ
トロープ剤 (chaotropic agent)(例：チオシアン酸塩、
過塩素酸塩、ヨウ価物等）又は変性剤（例：尿素、ホル
モル−尿素、グアニジン塩酸塩等）で処理するが、これ
によりキャリヤ抗体と抗体 Fab抗体とを後者の免疫特異
性を破壊せずに分離することが出来る〔ダンドライカ他
(Dandliker et al); 1967、Biochemistry ６(5):1460-
1467〕。この処理によって不要なキャリヤ抗体分子が放
出され、運動抑制をうけた抗 Fab抗体を遊離させて、そ
の後免疫複合体を生成することができる。その結果、カ
ラムは抑制抗 Fab抗体から成り、非抗原、結合部位に遮
断されたアミノ基を含むことになり、キャリヤ抗体の注
入をうける。キャリヤ抗体が抗 Fab抗体に結合した後
で、公知のリンケージ反応を化合物と接合した基質リン
カーを用いて行う。唯一の利用可能なアミノ基がキャリ
ヤ抗体のFc部分上にあるので、この反応は化合物がキャ
リヤ抗体のこの部分へ基質リンカーを介して接合すると
いう結果を生む。最後に、生成結合体は適当なバッファ
（例チャオトロープ剤又は変性剤）を用いて溶出により
カラムから放出される。４.3. 結合体の相手 本発明の方法によれば、抗体は適当な結合相手なら何に
でも結合することが出来る。主たる限定要素は、接合反
応が (1)競合する好ましくない反応を制限するに足るだ
け選択的であること、 (2)抗体の反応性や選択性と干渉
しないように穏やかなものであること、という２点であ
る。わかりやすく言うと、結合相手は（a)当該化合物で
直接抗体と接合するものと、 (b)可溶性リンカーと、
(c)不溶性サポートに分けられる。４.3.1. 当該化合物 抗体が接合する相手は、抗体との反応後もその主要特性
を保有している化合物であって、抗体が免疫特異性と免
疫反応性を本質的に保持できるようにするものであれば
何んでも良い。
出来る（各ステップ後にバッファで完全に洗浄のこ
と）。抗 Fab抗体を臭化シアンで活性化したセファロー
ズカラム等の適当な支持マトリックスに接合する。カラ
ムにキャリヤ抗体を注入し、カラム上のすべての抗原結
合部位を飽和させる。キャリヤ抗体の Fab領域がこれで
結合され、抗 Fab抗体上の抗原結合部位を保護すること
になる。カラムをアミノ基遮断剤（例：無水酢酸, カル
ボベンゾキシクロライド等）で処理し、抗 Fab抗体及び
結合したキャリヤ抗体の両方の露出した部分上の全ての
遊離アミノ基をブロックする。それからカラムをチャオ
トロープ剤 (chaotropic agent)(例：チオシアン酸塩、
過塩素酸塩、ヨウ価物等）又は変性剤（例：尿素、ホル
モル−尿素、グアニジン塩酸塩等）で処理するが、これ
によりキャリヤ抗体と抗体 Fab抗体とを後者の免疫特異
性を破壊せずに分離することが出来る〔ダンドライカ他
(Dandliker et al); 1967、Biochemistry ６(5):1460-
1467〕。この処理によって不要なキャリヤ抗体分子が放
出され、運動抑制をうけた抗 Fab抗体を遊離させて、そ
の後免疫複合体を生成することができる。その結果、カ
ラムは抑制抗 Fab抗体から成り、非抗原、結合部位に遮
断されたアミノ基を含むことになり、キャリヤ抗体の注
入をうける。キャリヤ抗体が抗 Fab抗体に結合した後
で、公知のリンケージ反応を化合物と接合した基質リン
カーを用いて行う。唯一の利用可能なアミノ基がキャリ
ヤ抗体のFc部分上にあるので、この反応は化合物がキャ
リヤ抗体のこの部分へ基質リンカーを介して接合すると
いう結果を生む。最後に、生成結合体は適当なバッファ
（例チャオトロープ剤又は変性剤）を用いて溶出により
カラムから放出される。４.3. 結合体の相手 本発明の方法によれば、抗体は適当な結合相手なら何に
でも結合することが出来る。主たる限定要素は、接合反
応が (1)競合する好ましくない反応を制限するに足るだ
け選択的であること、 (2)抗体の反応性や選択性と干渉
しないように穏やかなものであること、という２点であ
る。わかりやすく言うと、結合相手は（a)当該化合物で
直接抗体と接合するものと、 (b)可溶性リンカーと、
(c)不溶性サポートに分けられる。４.3.1. 当該化合物 抗体が接合する相手は、抗体との反応後もその主要特性
を保有している化合物であって、抗体が免疫特異性と免
疫反応性を本質的に保持できるようにするものであれば
何んでも良い。
【００４６】例えば、糖蛋白の酸化炭水化物部分のアル
デヒドを結合体化合物へ接合したい場合は化合物は好ま
しくはアミノ基又はヒドラジッド基の如き反応器を含有
しているべきである。かかる結合体化合物は、ホルモ
ン、酵素、輸送蛋白、触媒、キレート化合物、受容体蛋
白の如き各種蛋白、免疫グロブリン、蛍光又は化学ルミ
ネッセンス化合物又は潜在的な蛍光又は化学ルミネッセ
ンス化合物を含む。「潜在的」蛍光又は化学ルミネッセ
ンス化合物とは他の物質と反応、修飾又は組合せた後始
めてけいう又は化学ルミネッセンスを発する化合物であ
る。
デヒドを結合体化合物へ接合したい場合は化合物は好ま
しくはアミノ基又はヒドラジッド基の如き反応器を含有
しているべきである。かかる結合体化合物は、ホルモ
ン、酵素、輸送蛋白、触媒、キレート化合物、受容体蛋
白の如き各種蛋白、免疫グロブリン、蛍光又は化学ルミ
ネッセンス化合物又は潜在的な蛍光又は化学ルミネッセ
ンス化合物を含む。「潜在的」蛍光又は化学ルミネッセ
ンス化合物とは他の物質と反応、修飾又は組合せた後始
めてけいう又は化学ルミネッセンスを発する化合物であ
る。
【００４７】当該化合物にアミノ基が含まれない時に
は、化合物を修飾してカップリングのためのアミノ又は
ヒドラジッド基をつくることが出来る。運搬システムに
用いる抗体と接合される化合物は意図する用途にあわせ
て選択する。（例：細胞増殖を殺したり予防する、ホル
モン療法, 標的造影, 遺伝子療法, 細胞分別又は分離ス
キーム）。かかる化合物は、例えば薬剤、毒素、毒素フ
ラグメント、アルキル化剤、酵素、抗生物質、抗代謝物
質、抗増殖剤、ホルモン、神経伝達剤、ＤＮＡ、放射線
不透過染料、放射性アイソトープ、発蛍光性化合物、標
識化合物、レクチン、細胞膜の透過性に変更を加える化
合物ならびに不溶性マトリックス等である。表１には本
発明に用いることの出来るいくつかの薬剤を記載した
が、これは包括的なリストでないことは当然である。
又、更に化合物を組合せて用いることも出来る。４.3.2. 可溶性リンカー 本発明によれば、抗体は一方で抗体を反応し、一方では
当該化合物又は不溶性サポートと反応するいくつかの反
応基を有する中間可溶性リンキング剤又はリンカーを介
して、どの当該化合物又は不溶性サポートのいずれにで
も共有接合することができる。リンカーは、抗体（又は
当該化合物又は不溶性サポート）との反応又は最終生成
物が抗体の反応性と選択可能性に好ましくない影響を与
えないようなものを選ばなければならない。一般的には
これらのリンカーとしてはメルカプトエタノールアミン
の如く酸化抗体をそのアミノ基を介して結合するような
異種の二機能をもつリンカーを含む。硫黄原子をデブロ
ックすると、遊離スルフヒドリル基が次の反応に利用出
来る。リンカーは抗体と当該化合物又は不溶性サポート
との間の距離を任意に選べるような大きさであればよ
い。４.3.3. 不溶性サポート 適当な不溶性サポートを直接抗体に接合させるか又は間
接的に可溶性リンカーを介して接合させてもよい。アミ
ンを含有する不溶性サポート、例えばアミン又はヒドラ
ジッド、サポート等、即ち、誘導体としてのデキストラ
ン、アガロース、ポリスチレン、ポリビニル、ポリビニ
ルアルコール、ポリアクリルアミド、ガラス、ラティス
その他適当なポリマーを含むサポートへ直接接合させる
ため酸化抗体を用いる。これらのサポートは通常粒状と
して用いられるが、特定の用途によっては管や板の両面
であってもよい。４.4. キャリヤ・システム 本発明の一実施例によれば、化合物は標的抗原に向けら
れた抗体に接合させることも出来る。標的部位での活性
化した形での化合物の放出が望ましい時は、化合物はカ
スケード補体の活性化能力を有するクラスに属する抗体
分子（免疫グロブリン）上の特定部位へ接合させる。こ
の接合は化号結合（例：エステル又はアミド リンケー
ジ）とリンカー基（例：ペプチド又はアミノ酸）であっ
て血清補体成分の内一つ又はそれ以上による開裂をうけ
やすいものを介して行われる。
は、化合物を修飾してカップリングのためのアミノ又は
ヒドラジッド基をつくることが出来る。運搬システムに
用いる抗体と接合される化合物は意図する用途にあわせ
て選択する。（例：細胞増殖を殺したり予防する、ホル
モン療法, 標的造影, 遺伝子療法, 細胞分別又は分離ス
キーム）。かかる化合物は、例えば薬剤、毒素、毒素フ
ラグメント、アルキル化剤、酵素、抗生物質、抗代謝物
質、抗増殖剤、ホルモン、神経伝達剤、ＤＮＡ、放射線
不透過染料、放射性アイソトープ、発蛍光性化合物、標
識化合物、レクチン、細胞膜の透過性に変更を加える化
合物ならびに不溶性マトリックス等である。表１には本
発明に用いることの出来るいくつかの薬剤を記載した
が、これは包括的なリストでないことは当然である。
又、更に化合物を組合せて用いることも出来る。４.3.2. 可溶性リンカー 本発明によれば、抗体は一方で抗体を反応し、一方では
当該化合物又は不溶性サポートと反応するいくつかの反
応基を有する中間可溶性リンキング剤又はリンカーを介
して、どの当該化合物又は不溶性サポートのいずれにで
も共有接合することができる。リンカーは、抗体（又は
当該化合物又は不溶性サポート）との反応又は最終生成
物が抗体の反応性と選択可能性に好ましくない影響を与
えないようなものを選ばなければならない。一般的には
これらのリンカーとしてはメルカプトエタノールアミン
の如く酸化抗体をそのアミノ基を介して結合するような
異種の二機能をもつリンカーを含む。硫黄原子をデブロ
ックすると、遊離スルフヒドリル基が次の反応に利用出
来る。リンカーは抗体と当該化合物又は不溶性サポート
との間の距離を任意に選べるような大きさであればよ
い。４.3.3. 不溶性サポート 適当な不溶性サポートを直接抗体に接合させるか又は間
接的に可溶性リンカーを介して接合させてもよい。アミ
ンを含有する不溶性サポート、例えばアミン又はヒドラ
ジッド、サポート等、即ち、誘導体としてのデキストラ
ン、アガロース、ポリスチレン、ポリビニル、ポリビニ
ルアルコール、ポリアクリルアミド、ガラス、ラティス
その他適当なポリマーを含むサポートへ直接接合させる
ため酸化抗体を用いる。これらのサポートは通常粒状と
して用いられるが、特定の用途によっては管や板の両面
であってもよい。４.4. キャリヤ・システム 本発明の一実施例によれば、化合物は標的抗原に向けら
れた抗体に接合させることも出来る。標的部位での活性
化した形での化合物の放出が望ましい時は、化合物はカ
スケード補体の活性化能力を有するクラスに属する抗体
分子（免疫グロブリン）上の特定部位へ接合させる。こ
の接合は化号結合（例：エステル又はアミド リンケー
ジ）とリンカー基（例：ペプチド又はアミノ酸）であっ
て血清補体成分の内一つ又はそれ以上による開裂をうけ
やすいものを介して行われる。
【００４８】ここに説明した化学的リンキング方法によ
りその結果得られた抗体結合体は、抗原を結合し、カス
ケード補体を活性化する能力を保持することが出来る。
従って、結合体を個体に投与すると、引続いてin virro
での標的抗原との免疫複合体の生成が行われ、これによ
り個体の血清補体が活性化される。リンカーが補体によ
る開裂をうけるように意図されているのであれば、化合
物はカスケード補体の一つ又はそれ以上の酵素によって
開裂される。化合物の放出は標的部位への運搬後に行わ
れるので、標的運搬システムの効率は大巾に改善され
る。
りその結果得られた抗体結合体は、抗原を結合し、カス
ケード補体を活性化する能力を保持することが出来る。
従って、結合体を個体に投与すると、引続いてin virro
での標的抗原との免疫複合体の生成が行われ、これによ
り個体の血清補体が活性化される。リンカーが補体によ
る開裂をうけるように意図されているのであれば、化合
物はカスケード補体の一つ又はそれ以上の酵素によって
開裂される。化合物の放出は標的部位への運搬後に行わ
れるので、標的運搬システムの効率は大巾に改善され
る。
【００４９】本発明方法は他の標的システムとくらべて
更に有利である。腫瘍の細胞全てが標的抗原決定因子を
有するわけではないことが知られているので、標的細胞
内への取り込みを必要とするような運搬システムでは、
抗原決定因子を有し且つ複合体を取り込むことの出来る
腫瘍細胞についてのみ運搬が成功する。抗原決定因子を
有しない又は取り込みが出来ない腫瘍細胞については治
療が不能である。
更に有利である。腫瘍の細胞全てが標的抗原決定因子を
有するわけではないことが知られているので、標的細胞
内への取り込みを必要とするような運搬システムでは、
抗原決定因子を有し且つ複合体を取り込むことの出来る
腫瘍細胞についてのみ運搬が成功する。抗原決定因子を
有しない又は取り込みが出来ない腫瘍細胞については治
療が不能である。
【００５０】本発明方法によれば、抗体キャリヤ分子は
化合物を標的細胞へと運搬する。しかしながら重要なこ
とは、一度標的細胞との接合が行われた後では、本発明
に記載された方法では個体の活性化された補体酵素によ
り活性化化合物の放出が可能となることである。放出が
行われた後では、化合物は自由に標的部位、例えば腫瘍
マス等へ浸透することが出来る。その結果、化合物は抗
原決定因子を有しない腫瘍細胞も、決定因子を有する腫
瘍細胞にも同じ様な作用を及ぼすことになる。更に、プ
ロセス全体は結合体の取り込みに左右されない。
化合物を標的細胞へと運搬する。しかしながら重要なこ
とは、一度標的細胞との接合が行われた後では、本発明
に記載された方法では個体の活性化された補体酵素によ
り活性化化合物の放出が可能となることである。放出が
行われた後では、化合物は自由に標的部位、例えば腫瘍
マス等へ浸透することが出来る。その結果、化合物は抗
原決定因子を有しない腫瘍細胞も、決定因子を有する腫
瘍細胞にも同じ様な作用を及ぼすことになる。更に、プ
ロセス全体は結合体の取り込みに左右されない。
【００５１】ここに述べた標的への運搬の方法はいくつ
かの目的のために用いることが出来る。結合体をつくる
ために用いる抗体、リンカー、化合物は運搬の目的によ
って選択する。特定の標的部位での薬剤化合物の運搬、
放出の結果、腫瘍細胞、がん細胞、真菌、細菌、寄生体
又はウィルスを選択的に殺したり、それらの増殖を防ぐ
ことが出来る。ホルモン、酵素又は神経伝達体を選択し
た部位へ標的として運搬することも可能である。最終的
には、本発明方法はＤＮＡ又は特定遺伝子をinvivo又は
in vitroでこの特定遺伝子欠乏標的細胞へ運搬するよう
な遺伝子療法にも応用可能となろう。
かの目的のために用いることが出来る。結合体をつくる
ために用いる抗体、リンカー、化合物は運搬の目的によ
って選択する。特定の標的部位での薬剤化合物の運搬、
放出の結果、腫瘍細胞、がん細胞、真菌、細菌、寄生体
又はウィルスを選択的に殺したり、それらの増殖を防ぐ
ことが出来る。ホルモン、酵素又は神経伝達体を選択し
た部位へ標的として運搬することも可能である。最終的
には、本発明方法はＤＮＡ又は特定遺伝子をinvivo又は
in vitroでこの特定遺伝子欠乏標的細胞へ運搬するよう
な遺伝子療法にも応用可能となろう。
【００５２】更に別の実施例においては、結合体は化合
物を標的迄運ぶが放出しないという風にすることも出来
る。従って本発明は、腫瘍、臓器、又は感染部位等のin
vivo およびin vitroの特定部位を見出し、検出し、定
量するために用いることもできる。本発明実施例は、特
に造影システム細胞選別テクニック、分離スキーム等に
有用である。
物を標的迄運ぶが放出しないという風にすることも出来
る。従って本発明は、腫瘍、臓器、又は感染部位等のin
vivo およびin vitroの特定部位を見出し、検出し、定
量するために用いることもできる。本発明実施例は、特
に造影システム細胞選別テクニック、分離スキーム等に
有用である。
【００５３】更に特定的に述べれば、造影に関しては放
射線薬物又は重金属は、 (a)リンカーへ共有結合してお
り、又は (b)キレート剤を介してリンカーと非共有結合
している。従って、標的の性質と運搬の目的によって
は、広い範囲の抗体、リンカー、当該化合物を種々組合
せて用いることが出来る。４.5. 血清補体とリンカーの選択 本発明の方法によれば、化合物の放出を希望する時はこ
の化合物を IgM級又はIgG の成る種のサブクラス（図
１）の抗体上の特定部位へリンクする。その結果得られ
た結合体は、抗原を結合し、補体カスケード反応を活性
化する能力を保有する。
射線薬物又は重金属は、 (a)リンカーへ共有結合してお
り、又は (b)キレート剤を介してリンカーと非共有結合
している。従って、標的の性質と運搬の目的によって
は、広い範囲の抗体、リンカー、当該化合物を種々組合
せて用いることが出来る。４.5. 血清補体とリンカーの選択 本発明の方法によれば、化合物の放出を希望する時はこ
の化合物を IgM級又はIgG の成る種のサブクラス（図
１）の抗体上の特定部位へリンクする。その結果得られ
た結合体は、抗原を結合し、補体カスケード反応を活性
化する能力を保有する。
【００５４】補体とは、古典的な結合順序とプロパージ
ン順序の二つの方法の内いずれか一つにより活性化でき
る血清蛋白グループに与えられた集合的名称である（ミ
ューラー−エベルハードMuller-Eberhard 、「病院実習
(Hospital Practice) 」1977年８月号33-43)。古典的順
序は、先ず IgMクラス又は IgGの成る種のサブクラスの
抗体をその対応する抗原へ結合させることから始まるの
に対して、プロパージン順序とは血清蛋白、プロパージ
ンならびに他の非免疫グロブリン血清因子に依存する。
〔レイドとポーター(Reid & Porter)、1981. Ann. Rev.
Biochem. 50:433-464〕。
ン順序の二つの方法の内いずれか一つにより活性化でき
る血清蛋白グループに与えられた集合的名称である（ミ
ューラー−エベルハードMuller-Eberhard 、「病院実習
(Hospital Practice) 」1977年８月号33-43)。古典的順
序は、先ず IgMクラス又は IgGの成る種のサブクラスの
抗体をその対応する抗原へ結合させることから始まるの
に対して、プロパージン順序とは血清蛋白、プロパージ
ンならびに他の非免疫グロブリン血清因子に依存する。
〔レイドとポーター(Reid & Porter)、1981. Ann. Rev.
Biochem. 50:433-464〕。
【００５５】古典的順序は、本発明の実施には特に重要
なものである。古典的順序の特徴は、補体システムの蛋
白質分解酵素を活性化する或る種の抗体−抗原複合体
（又は免疫複合体）の生成である。〔ボルソスとラップ
(Borsos and Rapp), 1965. J.Immunol. 95, 559-566；
コーエン (Cohen), 1968. J. Immunal. 100: 407-413;
コーエンとベッカー (Cohen & Becker), 1968, J. Immu
nol. 100; 403-406; 石坂他、1968, 1968, J. Immuno
l. 100 ; 1145-1153)。これらの活性化された補体酵素
は、カスケード補体の他の成分を開裂し、活性化する
（図２）。最終的には、「攻撃複合体」（又は溶解複合
体）の生成が起こり、標的細胞膜の一体性がくずれる結
果となる。
なものである。古典的順序の特徴は、補体システムの蛋
白質分解酵素を活性化する或る種の抗体−抗原複合体
（又は免疫複合体）の生成である。〔ボルソスとラップ
(Borsos and Rapp), 1965. J.Immunol. 95, 559-566；
コーエン (Cohen), 1968. J. Immunal. 100: 407-413;
コーエンとベッカー (Cohen & Becker), 1968, J. Immu
nol. 100; 403-406; 石坂他、1968, 1968, J. Immuno
l. 100 ; 1145-1153)。これらの活性化された補体酵素
は、カスケード補体の他の成分を開裂し、活性化する
（図２）。最終的には、「攻撃複合体」（又は溶解複合
体）の生成が起こり、標的細胞膜の一体性がくずれる結
果となる。
【００５６】古典的順序で最初に活性化される成分はＣ
１であって、これはＣ２とＣ４に作用するプロテーゼと
なる。活性化Ｃ１( Ｃ１) は特定エステラーゼ活性を有
する。活性化Ｃ４,2 (Ｃ４b,２a)は時にＣ３転換酵素と
称されることがあるが、Ｃ３を蛋白分解酵素的に開裂す
る複合体であり、活性化Ｃ３ (Ｃ３b)と共にＣ５を開裂
する。Ｃ３の開裂は補体活性化における古典的順序とプ
ロパージン順序で最初の共通ステップである。
１であって、これはＣ２とＣ４に作用するプロテーゼと
なる。活性化Ｃ１( Ｃ１) は特定エステラーゼ活性を有
する。活性化Ｃ４,2 (Ｃ４b,２a)は時にＣ３転換酵素と
称されることがあるが、Ｃ３を蛋白分解酵素的に開裂す
る複合体であり、活性化Ｃ３ (Ｃ３b)と共にＣ５を開裂
する。Ｃ３の開裂は補体活性化における古典的順序とプ
ロパージン順序で最初の共通ステップである。
【００５７】Ｃ１とＣ４b,２a との酵素活性について
は、カルボキシ末端基エルテル又はアミノ結合でin vit
o で開裂されるモデル合成基質を用いた（表２）研究が
最近行われた。これらの合成基質は本発明で述べたよう
に抗体分子と化合物の間のリンカーとして用いてもよ
い。かかるリンカーにより、特定の補体が媒介する開
裂、これに続く活性化した形での化合物の標的部位での
放出が可能となる。しかしながら補体成分のいずれかに
よる開裂をうけやすい基質をリンカーとして用いてもよ
い。
は、カルボキシ末端基エルテル又はアミノ結合でin vit
o で開裂されるモデル合成基質を用いた（表２）研究が
最近行われた。これらの合成基質は本発明で述べたよう
に抗体分子と化合物の間のリンカーとして用いてもよ
い。かかるリンカーにより、特定の補体が媒介する開
裂、これに続く活性化した形での化合物の標的部位での
放出が可能となる。しかしながら補体成分のいずれかに
よる開裂をうけやすい基質をリンカーとして用いてもよ
い。
【００５８】このようにして、本発明によれば、化合物
は基質リンカーグループの一方の末端に結合され、リン
カー・グループの他端は抗体分子上の特定部位に接合さ
れる。例えば、化合物がヒドロキシ基又はアミノ基を有
している時はペプチド, アミノ酸又は他の適当に選んだ
リンカーのカルボキシ末端基へエルテル又はアミノ結合
を介して各々接合されることもある。例えば、かかる化
合物は、シアンアマイド反応を介してリンカー・ペプチ
ドへ接合されることも出来る。化合物がリンカーとの接
合を干渉するような官能基を含む時は、化合物接合の前
にブロックし、結合体が出来ると、デブロックすること
も出来る。例えば、図３には抗新生腫薬剤であるアルケ
ラン (Alkeran)（バローズ・ウェルカム社製）とペプチ
ドＣＢＺ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｒｇの接合のための一般
式を示すものである。リンカー基は反対側の末端基又は
アミノ末端基は補体活性化能力を有する抗体分子へ結合
するための修飾をうける。
は基質リンカーグループの一方の末端に結合され、リン
カー・グループの他端は抗体分子上の特定部位に接合さ
れる。例えば、化合物がヒドロキシ基又はアミノ基を有
している時はペプチド, アミノ酸又は他の適当に選んだ
リンカーのカルボキシ末端基へエルテル又はアミノ結合
を介して各々接合されることもある。例えば、かかる化
合物は、シアンアマイド反応を介してリンカー・ペプチ
ドへ接合されることも出来る。化合物がリンカーとの接
合を干渉するような官能基を含む時は、化合物接合の前
にブロックし、結合体が出来ると、デブロックすること
も出来る。例えば、図３には抗新生腫薬剤であるアルケ
ラン (Alkeran)（バローズ・ウェルカム社製）とペプチ
ドＣＢＺ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｒｇの接合のための一般
式を示すものである。リンカー基は反対側の末端基又は
アミノ末端基は補体活性化能力を有する抗体分子へ結合
するための修飾をうける。
【００５９】化合物とリンカーの接合は、リンカーの抗
体分子接合の前でも後でもよい。寿命の短い放射性アイ
ソトープの抗体への接合などの場合は、まず中間体とし
てリンカー関連化合物から遊離している安定した修飾抗
体を先ず産生させることが好ましい。用途によっては、
化合物は修飾抗体のリンカーへ共有接合してもよい。こ
れらのペプチドリンカーは長さを可変にしておくのがよ
く、これは抗体分子から基質までの距離がリンカーと化
合物の間のアミド又はエステル結合で生じる開裂の効率
を左右するからである。これらのリンカーは、例えば、
所望の長さの有機ポリマー等であって、一端を抗体分子
上の特定部位へ共有接合出来る有機化合物を含んでもよ
い。有機ポリマーの他端は、アミノ酸又はペプチドリン
カーに接合していてもよい。表３には、本発明の抗体結
合体を生成するためのリンカー基として用いることの出
来る他の基質を記載する（表中ｎはゼロを含む整数でも
よい）。これらのシークエンスは補体基質シークエンス
のアミノ酸を類似の酸−塩基特性と置き換えて得た。こ
の表は包括的なものではない。
体分子接合の前でも後でもよい。寿命の短い放射性アイ
ソトープの抗体への接合などの場合は、まず中間体とし
てリンカー関連化合物から遊離している安定した修飾抗
体を先ず産生させることが好ましい。用途によっては、
化合物は修飾抗体のリンカーへ共有接合してもよい。こ
れらのペプチドリンカーは長さを可変にしておくのがよ
く、これは抗体分子から基質までの距離がリンカーと化
合物の間のアミド又はエステル結合で生じる開裂の効率
を左右するからである。これらのリンカーは、例えば、
所望の長さの有機ポリマー等であって、一端を抗体分子
上の特定部位へ共有接合出来る有機化合物を含んでもよ
い。有機ポリマーの他端は、アミノ酸又はペプチドリン
カーに接合していてもよい。表３には、本発明の抗体結
合体を生成するためのリンカー基として用いることの出
来る他の基質を記載する（表中ｎはゼロを含む整数でも
よい）。これらのシークエンスは補体基質シークエンス
のアミノ酸を類似の酸−塩基特性と置き換えて得た。こ
の表は包括的なものではない。
【００６０】このようにして、結合体が補体の存在化に
抗原に結合すると、化合物をリンカーへ接合するアミド
又はエステル結合が開裂され、その結果化合物がその活
性化した形で放出される。これらの化合物を個体へ投与
すると、化合物を標的部位へ運搬し、放出することが出
来、特に薬剤, 抗生物質, 代謝拮抗物質、抗増殖剤、細
胞毒のin vivoでの運搬に有効である。
抗原に結合すると、化合物をリンカーへ接合するアミド
又はエステル結合が開裂され、その結果化合物がその活
性化した形で放出される。これらの化合物を個体へ投与
すると、化合物を標的部位へ運搬し、放出することが出
来、特に薬剤, 抗生物質, 代謝拮抗物質、抗増殖剤、細
胞毒のin vivoでの運搬に有効である。
【００６１】別の実施例においては、本発明の結合体を
用いて標的抗原をin vitroで検出することも出来る。例
えば、結合体を標的抗原と血清補体を含む試験用混合物
に添加すると、その結果生じる補体を媒体とする化合物
の放出（例えば、蛍光化合物）は、該混合物内に標的抗
原の存在とその度合を示す。
用いて標的抗原をin vitroで検出することも出来る。例
えば、結合体を標的抗原と血清補体を含む試験用混合物
に添加すると、その結果生じる補体を媒体とする化合物
の放出（例えば、蛍光化合物）は、該混合物内に標的抗
原の存在とその度合を示す。
【００６２】
【表２】
【００６３】
【表３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】用途によっては、化合物の放出が好ましく
ないものもある。従って、本発明の別の実施例では、化
合物は補体酵素による開裂をうけないリンカーを介して
抗体分子へ接合される。これらのリンカーはアミノ酸、
ペプチド又は他の有機化合物で、ここにのべた方法によ
り後で抗体分子又は抗体フラグメントへの接合に用いる
ことの出来る官能基を含むよう修飾できるものを含むこ
ともある。かかる有機リンカーの一般式は次の通りであ
る。
ないものもある。従って、本発明の別の実施例では、化
合物は補体酵素による開裂をうけないリンカーを介して
抗体分子へ接合される。これらのリンカーはアミノ酸、
ペプチド又は他の有機化合物で、ここにのべた方法によ
り後で抗体分子又は抗体フラグメントへの接合に用いる
ことの出来る官能基を含むよう修飾できるものを含むこ
ともある。かかる有機リンカーの一般式は次の通りであ
る。
【００６８】Ｗ-(CH2)n-Ｑ 〔式中、Ｗは-NH-CH2- 又は -CH2- Ｑはアミノ酸, ペプチド, キレート剤 （例えばジエチレントリアミン五酢酸）又はキレート剤
誘導体）、 ｎは０からの20迄の整数である。〕 更には、化合物を補体活性化能力のない抗体分子又は抗
体フラグメントに接合することも可能である。補体活性
化能力を有しないキャリヤ抗体を用いる時は、活性化補
体による開裂をうけるリンカー又は活性化補体による開
裂をうけないリンカーを用いて接合を行う。非開裂のア
プローチではアガロース, ポリアクリルアミド等の運動
抑制又は不溶性マトリックスへ抗体分子又はフラグメン
トを接合するのに用いてもよい。その上で、これらの生
成物は複合体混合物より特定の抗原成分を分離したり、
これを識別するのに用いてもよい。このテクニックは、
抗原を含むと考えれらる混合物を運動抑制をうけた抗体
結合体と接触して行うことが出来る。
誘導体）、 ｎは０からの20迄の整数である。〕 更には、化合物を補体活性化能力のない抗体分子又は抗
体フラグメントに接合することも可能である。補体活性
化能力を有しないキャリヤ抗体を用いる時は、活性化補
体による開裂をうけるリンカー又は活性化補体による開
裂をうけないリンカーを用いて接合を行う。非開裂のア
プローチではアガロース, ポリアクリルアミド等の運動
抑制又は不溶性マトリックスへ抗体分子又はフラグメン
トを接合するのに用いてもよい。その上で、これらの生
成物は複合体混合物より特定の抗原成分を分離したり、
これを識別するのに用いてもよい。このテクニックは、
抗原を含むと考えれらる混合物を運動抑制をうけた抗体
結合体と接触して行うことが出来る。
【００６９】反応しなかった成分全てを洗い流してか
ら、標的抗原を、抗原−抗体複合体の分離能力を有する
変性剤又はチャオトロープ剤で処理して不溶性マトリッ
クスから除去することが出来る。この非開裂アプローチ
は、細胞分別テクニック〔ローケン＆ハーゼンバーグ
（Loken and Herzenberg), 1975, Annals N. Y. Acad.
Sci.254:163-171〕や化合物の放出が好ましくない場所
での腫瘍, 臓器, 感染部位等の造影システムに用いるた
めの抗体結合体をつくるのにも特に有用である。かかる
造影システムでは、抗体フラグメントの使用は明らかに
有利であって、何故かといえば、かかるフラグメントは
抗体分子全体分子よりもはるかに容易に組織マツス内に
拡散し、浸透するからである。これに加えて、抗体フラ
グメントは胎盤壁を越えない〔ベランティ（Bellant
i）、1978、「免疫学（immunology）II」、W. B. ソー
ンダース孔、フィラデルフィア〕。従って、妊娠中の婦
人でも腫瘍造影を実施することが出来る。
ら、標的抗原を、抗原−抗体複合体の分離能力を有する
変性剤又はチャオトロープ剤で処理して不溶性マトリッ
クスから除去することが出来る。この非開裂アプローチ
は、細胞分別テクニック〔ローケン＆ハーゼンバーグ
（Loken and Herzenberg), 1975, Annals N. Y. Acad.
Sci.254:163-171〕や化合物の放出が好ましくない場所
での腫瘍, 臓器, 感染部位等の造影システムに用いるた
めの抗体結合体をつくるのにも特に有用である。かかる
造影システムでは、抗体フラグメントの使用は明らかに
有利であって、何故かといえば、かかるフラグメントは
抗体分子全体分子よりもはるかに容易に組織マツス内に
拡散し、浸透するからである。これに加えて、抗体フラ
グメントは胎盤壁を越えない〔ベランティ（Bellant
i）、1978、「免疫学（immunology）II」、W. B. ソー
ンダース孔、フィラデルフィア〕。従って、妊娠中の婦
人でも腫瘍造影を実施することが出来る。
【００７０】本発明の更に別の実施例によれば、リンカ
ーの構造を化合物と抗体との間の間隔を適当にすること
が必要となろう。これは一般構造式 Ｗ-(CH2)n-Ｑ を有するリンカーを用いて可能となるが、式中Ｑはアミ
ノ酸又はペプチドであり、Ｗとｎは上記式の場合と同じ
である。
ーの構造を化合物と抗体との間の間隔を適当にすること
が必要となろう。これは一般構造式 Ｗ-(CH2)n-Ｑ を有するリンカーを用いて可能となるが、式中Ｑはアミ
ノ酸又はペプチドであり、Ｗとｎは上記式の場合と同じ
である。
【００７１】更に別の標的運搬応用例においては、補体
活性化を行わない化合物の放出が望ましい。これは活性
化によってカスケード補体が最終的に標的細胞を溶解す
るからである。故に、標的細胞を殺さずに化合物の運搬
と放出を行わねばならない時はこのアプローチが有用で
ある。ホルモン, 酵素, コルテコステロイド, 神経伝達
剤、遺伝子又は酵素等の細胞媒体物を標的細胞へ運搬し
たい時は、これが目標となる。これらの結合体は、補体
活性化のできない抗体分子又はフラグメントに血清プロ
ファーゼによる開裂を中程度に受けやすいリンカーを介
して化合物を接合させて生成することができる。この結
合体を個体に投与すると、抗原−抗体複合体が直ちに形
成されるが、化合物の開裂速度は遅く、その結果化合物
が標的部位で放出される。
活性化を行わない化合物の放出が望ましい。これは活性
化によってカスケード補体が最終的に標的細胞を溶解す
るからである。故に、標的細胞を殺さずに化合物の運搬
と放出を行わねばならない時はこのアプローチが有用で
ある。ホルモン, 酵素, コルテコステロイド, 神経伝達
剤、遺伝子又は酵素等の細胞媒体物を標的細胞へ運搬し
たい時は、これが目標となる。これらの結合体は、補体
活性化のできない抗体分子又はフラグメントに血清プロ
ファーゼによる開裂を中程度に受けやすいリンカーを介
して化合物を接合させて生成することができる。この結
合体を個体に投与すると、抗原−抗体複合体が直ちに形
成されるが、化合物の開裂速度は遅く、その結果化合物
が標的部位で放出される。
【００７２】古典的な補体順序での活性化の第一歩はＣ
１と抗体−抗原複合体との間の相互作用を必要とする。
この相互作用は、抗体分子のFc領域内に部位が存在する
ことを必須とする（図１）。炭水化物成分のいくつかは
免疫グロブリンのFc領域内に位置しているが、これはＣ
１結合がおこるための必須条件である。炭水化物成分の
除去は、免疫複合体が補体の成分Ｃ１と結合する能力を
喪失したことを意味する〔ウィンケルヘイク他（Winkel
hake et al.), 1980, J. Biol. Chem. 255:2822-282
8〕。炭水化物成分を含む免疫グロブリンの Fab又はFa
b'フラグメントはここに記載した反応式に用いることが
出来る。かかる免疫グロブリンの例はパットナム等によ
って決められたヒトの IgM順序にみられる〔Putnam et
al 1973, サイエンス(Science) 132:287〕。
１と抗体−抗原複合体との間の相互作用を必要とする。
この相互作用は、抗体分子のFc領域内に部位が存在する
ことを必須とする（図１）。炭水化物成分のいくつかは
免疫グロブリンのFc領域内に位置しているが、これはＣ
１結合がおこるための必須条件である。炭水化物成分の
除去は、免疫複合体が補体の成分Ｃ１と結合する能力を
喪失したことを意味する〔ウィンケルヘイク他（Winkel
hake et al.), 1980, J. Biol. Chem. 255:2822-282
8〕。炭水化物成分を含む免疫グロブリンの Fab又はFa
b'フラグメントはここに記載した反応式に用いることが
出来る。かかる免疫グロブリンの例はパットナム等によ
って決められたヒトの IgM順序にみられる〔Putnam et
al 1973, サイエンス(Science) 132:287〕。
【００７３】本発明の一実施例によれば、気質リンカー
はヒドラジン又はヒドラジッド誘導体をリンカーの一端
に結合させて修飾する。リンカー上の修飾をうけない部
位は化合物へ共有接合しても、しなくともよい。例えば
エステル又はアミドリンクを介して化合物へ接合した基
質リンカーは第４, ５項に記載した通り（表２および３
を参照のこと）、ペプチド鎖の反対側のアミノ末端基へ
ヒドラジッド（例：フェニルヒドラジン）を接合して修
飾する。この結果、次の構造が得られる（注：＊印はア
ミド又はエステル結合を意味する）。
はヒドラジン又はヒドラジッド誘導体をリンカーの一端
に結合させて修飾する。リンカー上の修飾をうけない部
位は化合物へ共有接合しても、しなくともよい。例えば
エステル又はアミドリンクを介して化合物へ接合した基
質リンカーは第４, ５項に記載した通り（表２および３
を参照のこと）、ペプチド鎖の反対側のアミノ末端基へ
ヒドラジッド（例：フェニルヒドラジン）を接合して修
飾する。この結果、次の構造が得られる（注：＊印はア
ミド又はエステル結合を意味する）。
【００７４】
【化５】
【００７５】上記構造式ではヒドラジンがパラ位にる
が、ヒドラジン成分をがオルト又はメタ位にある化合物
を用することも出来る。それからエステル又はアミドリ
ンクを介して化合物へ接合されたペプチドリンカーのヒ
ドラジド誘導体を酸化免疫グロブリン又は酸化炭水化物
を含む免疫グロブリンと反応させる。この結果ヒドラジ
ンが生成され、補体による開裂をうけるリンカー基を介
して免疫グロブリンの炭水化物側鎖と化合物とが共有接
合する。所望に応じて、利用したリンカーは活性化補体
又は血清プロテアーゼのいずれかによる開裂に抵抗のあ
るものでもよい（例：造影システムで用いるキレート剤
又はキレート剤誘導体を含むリンカー）別の応用例で
は、リンカーは血清プロテアーゼによる開裂を受けるも
のであってもよい。本明細書に記載したリンカーとキャ
リヤ抗体の共有結合は分子の抗原結合部位又は補体固定
を干渉しない。この結果得られた構造は以下の通りであ
る）注：＊印はアミド又はエステル結合を意味する）。
が、ヒドラジン成分をがオルト又はメタ位にある化合物
を用することも出来る。それからエステル又はアミドリ
ンクを介して化合物へ接合されたペプチドリンカーのヒ
ドラジド誘導体を酸化免疫グロブリン又は酸化炭水化物
を含む免疫グロブリンと反応させる。この結果ヒドラジ
ンが生成され、補体による開裂をうけるリンカー基を介
して免疫グロブリンの炭水化物側鎖と化合物とが共有接
合する。所望に応じて、利用したリンカーは活性化補体
又は血清プロテアーゼのいずれかによる開裂に抵抗のあ
るものでもよい（例：造影システムで用いるキレート剤
又はキレート剤誘導体を含むリンカー）別の応用例で
は、リンカーは血清プロテアーゼによる開裂を受けるも
のであってもよい。本明細書に記載したリンカーとキャ
リヤ抗体の共有結合は分子の抗原結合部位又は補体固定
を干渉しない。この結果得られた構造は以下の通りであ
る）注：＊印はアミド又はエステル結合を意味する）。
【００７６】
【化６】
【００７７】本章は主として抗体の炭水化物成分との反
応について述べたが、かかるテクニックは他の糖蛋白に
も用いられる。４.6. 抗体結合体の他の用途 本発明の抗体結合体は、医学, 産業用に種々の用途を有
しており、分離, アフィニティ精製, 珍断薬, 治療薬,
免疫アッセイ, 細胞分別, 電気泳動解析, 組織学, 細胞
学等に用いられる。これらの用途はすべて抗体が構造が
わずかに異なる化合物を特定して識別出来る能力を有し
ていることを利用している。
応について述べたが、かかるテクニックは他の糖蛋白に
も用いられる。４.6. 抗体結合体の他の用途 本発明の抗体結合体は、医学, 産業用に種々の用途を有
しており、分離, アフィニティ精製, 珍断薬, 治療薬,
免疫アッセイ, 細胞分別, 電気泳動解析, 組織学, 細胞
学等に用いられる。これらの用途はすべて抗体が構造が
わずかに異なる化合物を特定して識別出来る能力を有し
ていることを利用している。
【００７８】本発明の新規な抗体結合体は、抗体と抗原
との相互作用が検出可能な信号又は検出可能な信号の変
調手段を提供する免疫アッセイであればいずれも用いる
ことが出来る。信号は化学的、電磁的放射でもよく、特
に紫外線又は可視光線の吸収又は発光でもよく、熱的,
容積的, 電気科学的その他であってもよい。信号の変調
は、例えば蛍光又は化学ルミネッセンスの消尽又は修正
の結果であってもよく、この場合結果結合相手は蛍光又
は化学ルミネッセンス物質（又は潜在的に蛍光又は化学
ルミネッセンス物質）である。
との相互作用が検出可能な信号又は検出可能な信号の変
調手段を提供する免疫アッセイであればいずれも用いる
ことが出来る。信号は化学的、電磁的放射でもよく、特
に紫外線又は可視光線の吸収又は発光でもよく、熱的,
容積的, 電気科学的その他であってもよい。信号の変調
は、例えば蛍光又は化学ルミネッセンスの消尽又は修正
の結果であってもよく、この場合結果結合相手は蛍光又
は化学ルミネッセンス物質（又は潜在的に蛍光又は化学
ルミネッセンス物質）である。
【００７９】免疫アッセイでは、当該抗原は通常何らか
の方法でラベル又はタグを付しており、アッセイでは抗
体に結合したラベル又はタグを付した抗原の量と結合し
ていないラベル又はタグを付した抗原の量との差を識別
する。均質アッセイでは、ラベル又タッグの出す信号の
変調の結果、識別行なわれる。異種のアッセイにおいて
は、識別は結合した抗原と非結合の抗原の物理的な分離
の結果である。５．実施例：シリーズＩ 以下の実施例において抗体分子を中間体可溶リンカーを
介して当該化合物へ特定的に接合する方法を示す。５.1. 抗体分子の炭水化物成分の酸化 本実施例で用いた抗体分子は単クローンIgM(No.171とす
る）であって、ヒツジ赤血球細胞上の抗原決定因子に対
して特異性を有する。単クローン抗体をつくるには次の
方法をとった。ルイスラットにヒツジ赤血球細胞を１回
注射して免疫を与え、３日後に免疫ラットの脾臓細胞を
取り出し、マッカーン他の方法によって骨髄腫線 SP2/O
Ag14を用いて溶解した（Mcdearn et al., 1979, Immuno
l. Rev.47:91-115)。ついで、クローン細胞を培養し、
その結果得られた単クローン抗体をクリンマン＆マッカ
ーンの方法で精製した（Klinman & McKearn, 1981, J.
Immunol. Meth. 42:1-9)。
の方法でラベル又はタグを付しており、アッセイでは抗
体に結合したラベル又はタグを付した抗原の量と結合し
ていないラベル又はタグを付した抗原の量との差を識別
する。均質アッセイでは、ラベル又タッグの出す信号の
変調の結果、識別行なわれる。異種のアッセイにおいて
は、識別は結合した抗原と非結合の抗原の物理的な分離
の結果である。５．実施例：シリーズＩ 以下の実施例において抗体分子を中間体可溶リンカーを
介して当該化合物へ特定的に接合する方法を示す。５.1. 抗体分子の炭水化物成分の酸化 本実施例で用いた抗体分子は単クローンIgM(No.171とす
る）であって、ヒツジ赤血球細胞上の抗原決定因子に対
して特異性を有する。単クローン抗体をつくるには次の
方法をとった。ルイスラットにヒツジ赤血球細胞を１回
注射して免疫を与え、３日後に免疫ラットの脾臓細胞を
取り出し、マッカーン他の方法によって骨髄腫線 SP2/O
Ag14を用いて溶解した（Mcdearn et al., 1979, Immuno
l. Rev.47:91-115)。ついで、クローン細胞を培養し、
その結果得られた単クローン抗体をクリンマン＆マッカ
ーンの方法で精製した（Klinman & McKearn, 1981, J.
Immunol. Meth. 42:1-9)。
【００８０】抗体炭水化物成分の酸化は上述のクーパー
他の方法の修正法により、抗体とガラクトース・オキシ
ダーゼとを反応させて行った。（Cooper et al. 上掲）
このため、No.171単クローン抗体3.８mgを0.135M NaCl,
0.015M Tris-HCl (ph7.0),0.5mM MgCl2 , 0.15m Cacl
2 から成るバッファー１mlへ添加した。それからカラク
トース・オキシダーゼ溶液〔ニュージャージ州フリーホ
ールドのウォージントン生化学株式会社（Worthington
Biochemical Co.)製〕0.1ml アリクオートを該バッファ
ー１ml当り酵素52単位の濃度で抗体溶液へ添加した。最
後に該バッファー 0.1mlに溶解したカタラーゼ（ウォー
ジントン生化学株式会社製）43μg を反応混合物に添加
した。（カタラーゼを酸化反応中に生成した減成（degr
aded）過酸化水素に添加した）。反応混合物を室温で48
時間培養し、４℃で貯蔵した。図４は未酸化(a)と酸化
(b)抗体の励起スペクトルを示す。５.2. 抗体分子への接合のためトリペプチド−ＡＭＣの
生成 本実施例の目的のためには、合成発蛍光化合物を結合相
手として用いた。本合成化合物の特性は、発蛍光化合物
の結合と遊離状態が分光蛍光計的に判別可能であるとい
うことである。ここで酔いた合成発蛍光性化合物はニュ
ーヨーク州ロング・アイランド・ガーデンシティパーク
のセルバ・ファイン・バイオケミカルズ社（Serva Fine
Biochemicals, Inc.)製である。（カタログ♯51474)。
本化合物はアミドリンケージを介して蛍光化合物７−ア
ミノ−４−メチルクマリン (ＡＭＣ）に接合したトリペ
プチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ) から成る。グリシン
のアミノ基はカルボベンゾキシクロライド(Cbz) でブロ
ックされる。本化合物（ここではトリペプチド−ＡＭＣ
と称する）の構造式を下に示す。
他の方法の修正法により、抗体とガラクトース・オキシ
ダーゼとを反応させて行った。（Cooper et al. 上掲）
このため、No.171単クローン抗体3.８mgを0.135M NaCl,
0.015M Tris-HCl (ph7.0),0.5mM MgCl2 , 0.15m Cacl
2 から成るバッファー１mlへ添加した。それからカラク
トース・オキシダーゼ溶液〔ニュージャージ州フリーホ
ールドのウォージントン生化学株式会社（Worthington
Biochemical Co.)製〕0.1ml アリクオートを該バッファ
ー１ml当り酵素52単位の濃度で抗体溶液へ添加した。最
後に該バッファー 0.1mlに溶解したカタラーゼ（ウォー
ジントン生化学株式会社製）43μg を反応混合物に添加
した。（カタラーゼを酸化反応中に生成した減成（degr
aded）過酸化水素に添加した）。反応混合物を室温で48
時間培養し、４℃で貯蔵した。図４は未酸化(a)と酸化
(b)抗体の励起スペクトルを示す。５.2. 抗体分子への接合のためトリペプチド−ＡＭＣの
生成 本実施例の目的のためには、合成発蛍光化合物を結合相
手として用いた。本合成化合物の特性は、発蛍光化合物
の結合と遊離状態が分光蛍光計的に判別可能であるとい
うことである。ここで酔いた合成発蛍光性化合物はニュ
ーヨーク州ロング・アイランド・ガーデンシティパーク
のセルバ・ファイン・バイオケミカルズ社（Serva Fine
Biochemicals, Inc.)製である。（カタログ♯51474)。
本化合物はアミドリンケージを介して蛍光化合物７−ア
ミノ−４−メチルクマリン (ＡＭＣ）に接合したトリペ
プチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ) から成る。グリシン
のアミノ基はカルボベンゾキシクロライド(Cbz) でブロ
ックされる。本化合物（ここではトリペプチド−ＡＭＣ
と称する）の構造式を下に示す。
【００８１】
【化７】
【００８２】遊離ＡＭＣの最大励起と発光は（それぞれ
345nm, 445nm) トリペプチドと結合したＡＭＣのそれと
は違っている。（325nm, 395nm) 。これにより蛍光計ア
ッセイを用いてＡＭＣの結合分子と遊離分子との違いが
判別できる。 383nmと 455nmという励起、発光波長はア
ッセイのために適正相違を得るため利用することができ
る。これらの波長では、遊離ＡＭＣはその最大蛍光の20
％を保有するが、結合ＡＭＣの等モル量より 500倍多い
蛍光量を有している〔ジンマーマン他（Jimmerman), 19
78, Proc. Natl. Acad, Sci., U.S.A. 75(2):750-75
3〕。
345nm, 445nm) トリペプチドと結合したＡＭＣのそれと
は違っている。（325nm, 395nm) 。これにより蛍光計ア
ッセイを用いてＡＭＣの結合分子と遊離分子との違いが
判別できる。 383nmと 455nmという励起、発光波長はア
ッセイのために適正相違を得るため利用することができ
る。これらの波長では、遊離ＡＭＣはその最大蛍光の20
％を保有するが、結合ＡＭＣの等モル量より 500倍多い
蛍光量を有している〔ジンマーマン他（Jimmerman), 19
78, Proc. Natl. Acad, Sci., U.S.A. 75(2):750-75
3〕。
【００８３】トリペプチド−ＡＭＣを第5.１項で生成し
た抗体の酸化炭水化物成分へ特定的に結合させるため、
ヒドラジン誘導体をトリペプチド−ＡＭＣ化合物の末端
グリシンヘリンクした。ヒドラジン基の存在は、非常に
穏やかな条件下で抗体分子の酸化炭水化物成分の反応性
をもたらす一方で、抗原結合部位に影響を与えないとこ
ろから有利である。その結果、抗体分子の酸化炭化水素
側鎖のアルデヒド基がヒドラジン誘導体と反応してヒド
ラゾンを生成する。
た抗体の酸化炭水化物成分へ特定的に結合させるため、
ヒドラジン誘導体をトリペプチド−ＡＭＣ化合物の末端
グリシンヘリンクした。ヒドラジン基の存在は、非常に
穏やかな条件下で抗体分子の酸化炭水化物成分の反応性
をもたらす一方で、抗原結合部位に影響を与えないとこ
ろから有利である。その結果、抗体分子の酸化炭化水素
側鎖のアルデヒド基がヒドラジン誘導体と反応してヒド
ラゾンを生成する。
【００８４】ヒドラジン誘導体を接合するには（例：４
−フロロフェニルヒドラジン）、トリペプチド−ＡＭＣ
を先ず Cbz基を取り去ってグリシンアミノ末端基でデブ
ロックした。これはトリペプチド−ＡＭＣをトリフロロ
酢酸（ミズーリ州セントルイスシグマ社製）に溶解し、
溶液内に HBrガス〔ニュージャージ州イーストラザフォ
ード、マチソン社（Matheson）製〕を45分間通して行っ
た。生成物Ｈ2 Ｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＮＨ−Ａ
ＭＣは低温のジエチルエーテル〔ニュージャージ州フィ
リップスバーグ、ベーカー・ケミカル社（Baker Chemic
al Co.）製〕を添加して析出し、無水エタノール〔ペン
シルバニア州リンフィールド、パブリッカー・インダス
トリーズ（Publicker Industries Co.）製〕に溶解し
た。無水エタノールにいれた４−フロロフェニルヒドラ
ジン〔ウィスコンシン州ミルウォーキー, アルドリッチ
・ケミカル製（Aldrich Chemical Co.）〕を等モル量攪
拌しながら加えた。室温で２時間遮光した状態で培養し
た後、反応混合物を４℃で遮光状態で貯蔵した。その結
果得られた生成物（フェニルヒドラジン−トリペプチド
−ＡＭＣ）は以下の構造式を有する。
−フロロフェニルヒドラジン）、トリペプチド−ＡＭＣ
を先ず Cbz基を取り去ってグリシンアミノ末端基でデブ
ロックした。これはトリペプチド−ＡＭＣをトリフロロ
酢酸（ミズーリ州セントルイスシグマ社製）に溶解し、
溶液内に HBrガス〔ニュージャージ州イーストラザフォ
ード、マチソン社（Matheson）製〕を45分間通して行っ
た。生成物Ｈ2 Ｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＮＨ−Ａ
ＭＣは低温のジエチルエーテル〔ニュージャージ州フィ
リップスバーグ、ベーカー・ケミカル社（Baker Chemic
al Co.）製〕を添加して析出し、無水エタノール〔ペン
シルバニア州リンフィールド、パブリッカー・インダス
トリーズ（Publicker Industries Co.）製〕に溶解し
た。無水エタノールにいれた４−フロロフェニルヒドラ
ジン〔ウィスコンシン州ミルウォーキー, アルドリッチ
・ケミカル製（Aldrich Chemical Co.）〕を等モル量攪
拌しながら加えた。室温で２時間遮光した状態で培養し
た後、反応混合物を４℃で遮光状態で貯蔵した。その結
果得られた生成物（フェニルヒドラジン−トリペプチド
−ＡＭＣ）は以下の構造式を有する。
【００８５】
【化８】
【００８６】本化合物は、紫外光線で励起すると蛍光に
ついて（＋）であり、ヒドラジン基の存在についても
（＋）であった。トリペプチドにリンクしたヒドラジン
は、ヒドラジンの比色定量測定のため0.１％トリニトロ
ベンゼンスルフォン酸水溶液をスプレーして薄層クロマ
トグラフィー (ＴＬＣ）により検出した。（ピンクがか
った又はオレンジかかった茶色がヒドラジンの存在を示
す）。ＴＬＣの結果、トリペプチド−ＡＭＣの移動バン
ドにヒドラジン基の存在が示された。
ついて（＋）であり、ヒドラジン基の存在についても
（＋）であった。トリペプチドにリンクしたヒドラジン
は、ヒドラジンの比色定量測定のため0.１％トリニトロ
ベンゼンスルフォン酸水溶液をスプレーして薄層クロマ
トグラフィー (ＴＬＣ）により検出した。（ピンクがか
った又はオレンジかかった茶色がヒドラジンの存在を示
す）。ＴＬＣの結果、トリペプチド−ＡＭＣの移動バン
ドにヒドラジン基の存在が示された。
【００８７】図５に示したフェニヒドラジン−トリペプ
チド−ＡＭＣ化合物の吸収、発光スペクトラムはトリペ
プチド−ＡＭＣスペクトラムとの類似を示すが、トリペ
プチド−ＡＭＣの共有修飾と一致した最大励起、発光の
変化を示す。フェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭ
Ｃ化合物の最大励起、発光は各々345nm, 385nmである。
生成物は冷いジエチルエーテルとの溶液から析出し、洗
條して、ジメチルスルフォキシド（ニージャージー州フ
ィリップスバーグ、Baker Chemical Co.製）に溶解し
た。５.3. フェニールヒドラジッド−トリペプチド−ＡＭＣ
と抗体分子の酸化炭水化物成分への共有接合 上記第5.１項に記載した酸化単クローン抗体製剤のpHを
0.1Mアセテートバッファー（pH5.0)少量を添加して5.１
に調整した。抗体溶液へフェニルヒドラジン−トリペプ
チド−ＡＭＣ（第5.２項で生成）を約10倍量加えて、こ
れを遮光状態で37℃で一晩培養した（約14時間）。反応
混合物をセファデツクツスG-25カラム（ニュージャージ
ー州ピスカタンウェイ、Pharmacia Fine Chemicals製）
上でクロマトグラフィにかけ、未反応のフェニルヒドラ
ジン−トリペプチド−ＡＭＣを取り除いた。
チド−ＡＭＣ化合物の吸収、発光スペクトラムはトリペ
プチド−ＡＭＣスペクトラムとの類似を示すが、トリペ
プチド−ＡＭＣの共有修飾と一致した最大励起、発光の
変化を示す。フェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭ
Ｃ化合物の最大励起、発光は各々345nm, 385nmである。
生成物は冷いジエチルエーテルとの溶液から析出し、洗
條して、ジメチルスルフォキシド（ニージャージー州フ
ィリップスバーグ、Baker Chemical Co.製）に溶解し
た。５.3. フェニールヒドラジッド−トリペプチド−ＡＭＣ
と抗体分子の酸化炭水化物成分への共有接合 上記第5.１項に記載した酸化単クローン抗体製剤のpHを
0.1Mアセテートバッファー（pH5.0)少量を添加して5.１
に調整した。抗体溶液へフェニルヒドラジン−トリペプ
チド−ＡＭＣ（第5.２項で生成）を約10倍量加えて、こ
れを遮光状態で37℃で一晩培養した（約14時間）。反応
混合物をセファデツクツスG-25カラム（ニュージャージ
ー州ピスカタンウェイ、Pharmacia Fine Chemicals製）
上でクロマトグラフィにかけ、未反応のフェニルヒドラ
ジン−トリペプチド−ＡＭＣを取り除いた。
【００８８】蛋白分画の分光蛍光計分析によって、抗体
(抗体−フェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭＣ又
は抗体結合体と以下称する）に共有接合したフェニルヒ
ドラジン−トリペプチド−ＡＭＣの存在を確認した。結
合体の最大励起、発光は各々325nmと 385nmである（図
６）。結合体の励起スペクトル中 285nmで最大ピークが
みられるが、これは 385nmでの残留蛍光によるトリプト
ファン吸収によって説明が出来、又抗体分子のアミノ酸
トリプトファンからＡＭＣへの共鳴エネルギー移転の結
果かも知れない。６. 実施例：シリーズII 本シリーズ実施例の目的は本発明による抗体結合体製造
法はカルボジイミド反応が抗体の抗原結合特性に悪影響
を与えるような風には抗原結合性を左右しないことを示
すことにある。このため、ホスホリルコリン基に特異性
を有するマウスの単クローン IgMの炭水化物を酸化し、
エチレン・ジアミン・ジ−（Ｏ−ヒドロキシフェニル酢
酸)〔EDDHA〕の1,６−ジアミノヘキシル誘導体へ共有接
合して、1,６−ジアミノヘキシル-EDDHAを得た。比較の
ために、1,６−ジアミノヘキシル-EDDHAと未修飾 EDDHA
とをカルボジイミド反応を利用して IgM単クローン抗体
の同一サンプルへ接合した。これらの条件下で、1,６−
ジアミノヘキシル-EDDHAがアスパラギン酸とグルタミン
酸残基に結合し、未修飾 EDDHAがリジンに結合した。
(抗体−フェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭＣ又
は抗体結合体と以下称する）に共有接合したフェニルヒ
ドラジン−トリペプチド−ＡＭＣの存在を確認した。結
合体の最大励起、発光は各々325nmと 385nmである（図
６）。結合体の励起スペクトル中 285nmで最大ピークが
みられるが、これは 385nmでの残留蛍光によるトリプト
ファン吸収によって説明が出来、又抗体分子のアミノ酸
トリプトファンからＡＭＣへの共鳴エネルギー移転の結
果かも知れない。６. 実施例：シリーズII 本シリーズ実施例の目的は本発明による抗体結合体製造
法はカルボジイミド反応が抗体の抗原結合特性に悪影響
を与えるような風には抗原結合性を左右しないことを示
すことにある。このため、ホスホリルコリン基に特異性
を有するマウスの単クローン IgMの炭水化物を酸化し、
エチレン・ジアミン・ジ−（Ｏ−ヒドロキシフェニル酢
酸)〔EDDHA〕の1,６−ジアミノヘキシル誘導体へ共有接
合して、1,６−ジアミノヘキシル-EDDHAを得た。比較の
ために、1,６−ジアミノヘキシル-EDDHAと未修飾 EDDHA
とをカルボジイミド反応を利用して IgM単クローン抗体
の同一サンプルへ接合した。これらの条件下で、1,６−
ジアミノヘキシル-EDDHAがアスパラギン酸とグルタミン
酸残基に結合し、未修飾 EDDHAがリジンに結合した。
【００８９】これらのサンプルの結合特性を先天抗体と
比較してアフィニティと均質性を評価した。６.1. マウス単クローンIgMの酸化 リガンド, フォスフオリルコリンに対する特異性を有す
るマウス単クローンIgM 抗体を燐酸塩バッファー食塩水
（PBS, 0.01M燐酸、 0.15M塩化ナトリウム）pH7.０内で
２mg／mlの濃度で酸化した。抗体含有溶液を氷水浴で冷
却し、メタ過ヨウ素酸塩ナトリウム56.8μg を添加し
た。（1.42mg／ml溶液を40μl ：最終過ヨウ素塩濃度＝
0.26mM）。この反応混合物を１時間培養した後、エチレ
ングリコール２μl を加えた。これを更に30分間培養し
た。それからサンプルをＰＢＳで平衡化したセファデッ
クスG-25カラムを通し、蛋白分化画をプールした。６.2. リンカーとEDDHAの接合 EDDHA (1.5g, 4.2mmole)とトリエチルアミン（1.2ml,
8.4mmole)を水40mlに混合した。この不均質な溶液を60
℃に加熱し、0.５時間激しく攪拌した。溶液を真空乾燥
し、乾燥 N,N−ジメチルホルムアミド 400ml内に溶解し
た。それから溶液を氷浴の中で冷却、イソブチルクロロ
ホーメート（0.56ml, 4.2mmole）を加えた。反応混合物
を冷却しながら0.５時間攪拌した。その結果得たトリエ
チルアミン塩化水素析出物をろ過して取り除いた。 EDD
HAの混合カルボキシ無水炭酸を含有した濾過液は赤色を
呈した。
比較してアフィニティと均質性を評価した。６.1. マウス単クローンIgMの酸化 リガンド, フォスフオリルコリンに対する特異性を有す
るマウス単クローンIgM 抗体を燐酸塩バッファー食塩水
（PBS, 0.01M燐酸、 0.15M塩化ナトリウム）pH7.０内で
２mg／mlの濃度で酸化した。抗体含有溶液を氷水浴で冷
却し、メタ過ヨウ素酸塩ナトリウム56.8μg を添加し
た。（1.42mg／ml溶液を40μl ：最終過ヨウ素塩濃度＝
0.26mM）。この反応混合物を１時間培養した後、エチレ
ングリコール２μl を加えた。これを更に30分間培養し
た。それからサンプルをＰＢＳで平衡化したセファデッ
クスG-25カラムを通し、蛋白分化画をプールした。６.2. リンカーとEDDHAの接合 EDDHA (1.5g, 4.2mmole)とトリエチルアミン（1.2ml,
8.4mmole)を水40mlに混合した。この不均質な溶液を60
℃に加熱し、0.５時間激しく攪拌した。溶液を真空乾燥
し、乾燥 N,N−ジメチルホルムアミド 400ml内に溶解し
た。それから溶液を氷浴の中で冷却、イソブチルクロロ
ホーメート（0.56ml, 4.2mmole）を加えた。反応混合物
を冷却しながら0.５時間攪拌した。その結果得たトリエ
チルアミン塩化水素析出物をろ過して取り除いた。 EDD
HAの混合カルボキシ無水炭酸を含有した濾過液は赤色を
呈した。
【００９０】１−アミノ−６−トリフロロアセトアミド
ヘキサン（0.8g, 4.１ミリモル）を上記 EDDHAカルボキ
シ無水炭酸に加えた。均質溶液を0.５時間４℃で攪拌
し、凍結乾燥して油脂生成物を得た。油脂をアセトン／
エーテル（４：１）混合物で洗って、黄色の未精製生成
物を得た。固体状の１−アミノ−６−トリフロロアセト
アミドヘキシル-EDDHAを採取して、７％ K2CO3 で加水
分解し、pH４で HClで再析出して、純粋な1,６−ジアミ
ノヘキシル-EDDHA（1.4g）を得た。本化合物は、ニンヒ
ドリンテストでは陽性、薄膜クロマトグラフィでは一点
しか見えない。等モル量のTbCl3 塩基性溶液の存在下で
は 295nmでの励起は 545nmでの発光をみたが、これは E
DDHAとテルビウムイオンの間に特徴はエネルギー変換キ
レート複合体の形成が行われるからである。６.3. IgM-リンカー-EDDHA結合体の製造 第6.１項の方法で酸化した抗体を第6.２項の方法で製造
した1,６−ジアミノヘキシル-EDDHAを約 270倍モル加え
室温で１時間培養した。これに引続いて、固体のナトリ
ウムシアノボロハイドライドを加えて最終濃度を10mMと
し、それから更に室温で４時間培養した。混合物を４℃
対ＰＢＳを何度か変化させて透析し、限外濾過して濃縮
した。６.4. リンカー-EDDHAのIgMへのカルボジイミド接合 IgM抗体(1.9mg／ml)263μl に１−エチル−３−(3−ジ
メチルアミノプロビル）カルボジイミド（10mg／ml溶液
の１ml、pH5.０) 10mgとＰＢＳ(pH5.0) を添加して2.５
mlとした。混合物を室温で２時間培養した。水2.５ml
（pH5.５) に0.1M1,６−ジアミノヘキシル-EDDHAを 275
μl 加えて、溶液を室温で２時間培養した。ここへ１M
エタノールアミン10μl を加え、室温で１時間培養し
た。これをＰＢＳ (pH7.０）で一晩透析した。６.5. EDDHAのIgMに対するカルボジイミド接合 IgM抗体(1.9mg／ml)263μl へ１−エチル−３−(3−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド（10mg／ml溶液
を１ml、pH5.０) とＰＢＳ（pH5.０) を10mg添加して2.
５mlとした。混合物を室温で２時間培養した。これに
0.01M EDDHA (pH5.5を2.75ml添加し、溶液を室温で２時
間培養した。１Mエタノールアミン10μlを添加し、混合
物を室温で１時間培養した。これをＰＢＳ（pH7.０) に
かけて一晩透析した。６.6. 抗体の炭水化物を媒体とする接合の効果 未修飾のマウス単クローン抗体と第7.３章, 第7.４章,
第7.５章により製造した抗体結合体で全てホスホリルコ
リン基に特異性を有するもののアフィニティをパーキン
−エルミン型 512ダブルビーム蛍光分光計（コネチカッ
ト州ノーウォーク、Perkin-Elmer Corporation製）を用
いて蛍光消光により測定した。励起、発光波長は各々29
5nm, 345nmであり、温度はラウダ（Lauda) K-2/R循環水
浴（Brinkmann Instruments)で25℃とした。
ヘキサン（0.8g, 4.１ミリモル）を上記 EDDHAカルボキ
シ無水炭酸に加えた。均質溶液を0.５時間４℃で攪拌
し、凍結乾燥して油脂生成物を得た。油脂をアセトン／
エーテル（４：１）混合物で洗って、黄色の未精製生成
物を得た。固体状の１−アミノ−６−トリフロロアセト
アミドヘキシル-EDDHAを採取して、７％ K2CO3 で加水
分解し、pH４で HClで再析出して、純粋な1,６−ジアミ
ノヘキシル-EDDHA（1.4g）を得た。本化合物は、ニンヒ
ドリンテストでは陽性、薄膜クロマトグラフィでは一点
しか見えない。等モル量のTbCl3 塩基性溶液の存在下で
は 295nmでの励起は 545nmでの発光をみたが、これは E
DDHAとテルビウムイオンの間に特徴はエネルギー変換キ
レート複合体の形成が行われるからである。６.3. IgM-リンカー-EDDHA結合体の製造 第6.１項の方法で酸化した抗体を第6.２項の方法で製造
した1,６−ジアミノヘキシル-EDDHAを約 270倍モル加え
室温で１時間培養した。これに引続いて、固体のナトリ
ウムシアノボロハイドライドを加えて最終濃度を10mMと
し、それから更に室温で４時間培養した。混合物を４℃
対ＰＢＳを何度か変化させて透析し、限外濾過して濃縮
した。６.4. リンカー-EDDHAのIgMへのカルボジイミド接合 IgM抗体(1.9mg／ml)263μl に１−エチル−３−(3−ジ
メチルアミノプロビル）カルボジイミド（10mg／ml溶液
の１ml、pH5.０) 10mgとＰＢＳ(pH5.0) を添加して2.５
mlとした。混合物を室温で２時間培養した。水2.５ml
（pH5.５) に0.1M1,６−ジアミノヘキシル-EDDHAを 275
μl 加えて、溶液を室温で２時間培養した。ここへ１M
エタノールアミン10μl を加え、室温で１時間培養し
た。これをＰＢＳ (pH7.０）で一晩透析した。６.5. EDDHAのIgMに対するカルボジイミド接合 IgM抗体(1.9mg／ml)263μl へ１−エチル−３−(3−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド（10mg／ml溶液
を１ml、pH5.０) とＰＢＳ（pH5.０) を10mg添加して2.
５mlとした。混合物を室温で２時間培養した。これに
0.01M EDDHA (pH5.5を2.75ml添加し、溶液を室温で２時
間培養した。１Mエタノールアミン10μlを添加し、混合
物を室温で１時間培養した。これをＰＢＳ（pH7.０) に
かけて一晩透析した。６.6. 抗体の炭水化物を媒体とする接合の効果 未修飾のマウス単クローン抗体と第7.３章, 第7.４章,
第7.５章により製造した抗体結合体で全てホスホリルコ
リン基に特異性を有するもののアフィニティをパーキン
−エルミン型 512ダブルビーム蛍光分光計（コネチカッ
ト州ノーウォーク、Perkin-Elmer Corporation製）を用
いて蛍光消光により測定した。励起、発光波長は各々29
5nm, 345nmであり、温度はラウダ（Lauda) K-2/R循環水
浴（Brinkmann Instruments)で25℃とした。
【００９１】抗体濃度の計算はε280 １％＝13.5を用い
て行い、7.5×10-8から9.7×10-8Mであった。結合部位
はすべて活性を有すると見做した。サンプル量は3.０ml
であった。リガンドＮ−( 2,４−ジニトロフェニル）−
ｐ−アミノフェニルホスホリルコリン(DPPC)、の原料濃
度は1.17×10-4M であった。滴定はリン酸をバファーと
して用いた生理食塩水 pH7.4で行った。リガンドを攪拌
しながら連続的に、モーター駆動シリンジを使って9.01
μl ／分の速度で加え、蛍光度のモニターは2040デュア
ルドライブフロッピィディスクと2023プリンターを備え
た CBM2001シリーズコンピューター（Commodore Buisin
ess Machines製）にアナログ／デジタル変換用プレセッ
トＩ(Connecticut Microcomputers)をインターフェース
して行った。減衰を修正しサンプル希釈のため、非特異
性のワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症ヒト
又は抗ラクトースねずみ雑種抗体〔マンダル・アンド・
カルシュ（Mandal and Karush), 1981, J. Jmmunol. 12
7:1240〕を滴定した。リガンド溶液計 180μl を滴定毎
に添加した。結合パラメータの計算は、シップスの分布
関数〔Sips, 1948, J. Chem. Phys. 16：490〕を反復し
て用い、異種指数が0.002内のユニティとなるまで最大
消去（maximum quench) を変化させた。
て行い、7.5×10-8から9.7×10-8Mであった。結合部位
はすべて活性を有すると見做した。サンプル量は3.０ml
であった。リガンドＮ−( 2,４−ジニトロフェニル）−
ｐ−アミノフェニルホスホリルコリン(DPPC)、の原料濃
度は1.17×10-4M であった。滴定はリン酸をバファーと
して用いた生理食塩水 pH7.4で行った。リガンドを攪拌
しながら連続的に、モーター駆動シリンジを使って9.01
μl ／分の速度で加え、蛍光度のモニターは2040デュア
ルドライブフロッピィディスクと2023プリンターを備え
た CBM2001シリーズコンピューター（Commodore Buisin
ess Machines製）にアナログ／デジタル変換用プレセッ
トＩ(Connecticut Microcomputers)をインターフェース
して行った。減衰を修正しサンプル希釈のため、非特異
性のワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症ヒト
又は抗ラクトースねずみ雑種抗体〔マンダル・アンド・
カルシュ（Mandal and Karush), 1981, J. Jmmunol. 12
7:1240〕を滴定した。リガンド溶液計 180μl を滴定毎
に添加した。結合パラメータの計算は、シップスの分布
関数〔Sips, 1948, J. Chem. Phys. 16：490〕を反復し
て用い、異種指数が0.002内のユニティとなるまで最大
消去（maximum quench) を変化させた。
【００９２】Qmax値の計算は可成り不確実であって、多
分10％以下ではないと思われるが、これはこの値を得る
ために用いた反復の手順の故である。この不確実性は活
性化部位の実際の濃度と光学密度から計算したものとの
間の違いがユニティの異種指数という規準を用いた時に
得られたQmax値で補償されるからである。この補償は結
合リガンドの濃度が抗体濃度とQmaxの値の比に依存して
いるところから生じるものである。こうした依存という
事実の故で、会合定数の得られた値の精度は活性化部位
の濃度によって限定されるものではない。
分10％以下ではないと思われるが、これはこの値を得る
ために用いた反復の手順の故である。この不確実性は活
性化部位の実際の濃度と光学密度から計算したものとの
間の違いがユニティの異種指数という規準を用いた時に
得られたQmax値で補償されるからである。この補償は結
合リガンドの濃度が抗体濃度とQmaxの値の比に依存して
いるところから生じるものである。こうした依存という
事実の故で、会合定数の得られた値の精度は活性化部位
の濃度によって限定されるものではない。
【００９３】図７に未修飾抗体カルボジイミド結合体と
本発明の抗体結合体のデータを示すシップスグラフを示
す。結合測定は明らかに、本発明の炭水化物接合方法
（Δ−Δ）を介して修飾したサンプルを未修飾抗体（─
──）と比較した時の特異性,アフィニティ, 均質性の
保持を示している。ホスホリルコリン誘導体の結合ため
の会合定数を測定した所未修飾抗体は 1.0×105M-1であ
り、炭水化物接合抗体結合体は 1.1×106M-1であった。
これと対照的なのはカルボジイミド反応（□─□）によ
る修飾をうけた抗体製剤は大幅に結合が減少しており、
計算値である１─２×105 よりもずっと低い。シップス
解析におけるユニティの異種指数は、サンプルが均質
（単クローン）である場合にのみデータ整理に有効であ
る。サンプルの実際の均質性（単クローン性状）につい
てのチェックは相関係数又は実験データがシップスグラ
フの計算線をさしている場合は一致（bit)により行な
う。図７のグラフを見れば、未修飾の抗体と炭水化物結
合抗体とは良く一致しており、カルボジイミド接合のも
のは一致していないことを示している。これは多分カル
ボジイミド接合方法で選択性がないためであろう。リジ
ン, グルタミン酸, アスパルギン酸は抗原結合領域を含
む抗体分子全ての部分で生じる。その結果、抗体の少な
くともいくつかは結合部位で又はその近くで修飾され、
その結果抗原に影響を与えるか又は相互作用が生じる。
しかしながら炭水化物への接合部位は特定的であり結合
部位から離れているので、これらの実験でみられる結合
能力には変化が殆んどみられない。溶液中の共有修飾を
うけた抗体について得たものではあるが、本研究の結論
は運動抑制した抗体にも応用できると考えられる（運動
抑制した抗体を使った同一実験は技術上の理由から実施
不能である）。通常用いられる接合化学物質の不規則な
性状（臭化シアン活性化ゲル、グルタルアルデヒド粒、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルゲル等）では、
本発明の部位特定的接合とくらべて結合能力の劣ったマ
トリックスを産生するはずである。７. 実施例：シリーズIII 本実施例シリーズの目的は、抗体がその炭水化物成分を
介して効率良く不溶性のサポートに接合されることが出
来、且つ接合抗体が特定的抗原結合能力を保有する証拠
を提供することにある。７.1. アミノヘキシル−セファローズへの抗体接合 第６.1項に記載の過ヨウ素酸塩を用いて IgMと IgG抗体
を酸化したが、但し反応を消光するためエチレン グリ
コールの代わりにセファローズ CL-4B（ニュージャージ
ー州ニューマーケット、Pharmacia Fine Chemicals In
c.)を用いた。セファローズ CL-4Bを除去してのち、抗
体をアミノヘキシル−セファローズCL-4B(Pharmacia Fi
ne Chemicals, Inc.)へ添加し、温室で30分間攪拌し
た。ナトリウムシアノボロハイドを最終濃度５mMとなる
様添加し、混合物を16時間攪拌した。その結果得た抗体
と結合した樹脂（Ab-CHO-SEPH)をＰＢＳでよく洗った。
アミノヘキシル−セファローズへ結合した抗体の量は
125Ｉ-IgGと 125Ｉ-IgM抗体を用いて測定した。表４は
抗体の炭水化物成分を介した抗体の運動抑制が非常に高
能率でおこることを示す。
本発明の抗体結合体のデータを示すシップスグラフを示
す。結合測定は明らかに、本発明の炭水化物接合方法
（Δ−Δ）を介して修飾したサンプルを未修飾抗体（─
──）と比較した時の特異性,アフィニティ, 均質性の
保持を示している。ホスホリルコリン誘導体の結合ため
の会合定数を測定した所未修飾抗体は 1.0×105M-1であ
り、炭水化物接合抗体結合体は 1.1×106M-1であった。
これと対照的なのはカルボジイミド反応（□─□）によ
る修飾をうけた抗体製剤は大幅に結合が減少しており、
計算値である１─２×105 よりもずっと低い。シップス
解析におけるユニティの異種指数は、サンプルが均質
（単クローン）である場合にのみデータ整理に有効であ
る。サンプルの実際の均質性（単クローン性状）につい
てのチェックは相関係数又は実験データがシップスグラ
フの計算線をさしている場合は一致（bit)により行な
う。図７のグラフを見れば、未修飾の抗体と炭水化物結
合抗体とは良く一致しており、カルボジイミド接合のも
のは一致していないことを示している。これは多分カル
ボジイミド接合方法で選択性がないためであろう。リジ
ン, グルタミン酸, アスパルギン酸は抗原結合領域を含
む抗体分子全ての部分で生じる。その結果、抗体の少な
くともいくつかは結合部位で又はその近くで修飾され、
その結果抗原に影響を与えるか又は相互作用が生じる。
しかしながら炭水化物への接合部位は特定的であり結合
部位から離れているので、これらの実験でみられる結合
能力には変化が殆んどみられない。溶液中の共有修飾を
うけた抗体について得たものではあるが、本研究の結論
は運動抑制した抗体にも応用できると考えられる（運動
抑制した抗体を使った同一実験は技術上の理由から実施
不能である）。通常用いられる接合化学物質の不規則な
性状（臭化シアン活性化ゲル、グルタルアルデヒド粒、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルゲル等）では、
本発明の部位特定的接合とくらべて結合能力の劣ったマ
トリックスを産生するはずである。７. 実施例：シリーズIII 本実施例シリーズの目的は、抗体がその炭水化物成分を
介して効率良く不溶性のサポートに接合されることが出
来、且つ接合抗体が特定的抗原結合能力を保有する証拠
を提供することにある。７.1. アミノヘキシル−セファローズへの抗体接合 第６.1項に記載の過ヨウ素酸塩を用いて IgMと IgG抗体
を酸化したが、但し反応を消光するためエチレン グリ
コールの代わりにセファローズ CL-4B（ニュージャージ
ー州ニューマーケット、Pharmacia Fine Chemicals In
c.)を用いた。セファローズ CL-4Bを除去してのち、抗
体をアミノヘキシル−セファローズCL-4B(Pharmacia Fi
ne Chemicals, Inc.)へ添加し、温室で30分間攪拌し
た。ナトリウムシアノボロハイドを最終濃度５mMとなる
様添加し、混合物を16時間攪拌した。その結果得た抗体
と結合した樹脂（Ab-CHO-SEPH)をＰＢＳでよく洗った。
アミノヘキシル−セファローズへ結合した抗体の量は
125Ｉ-IgGと 125Ｉ-IgM抗体を用いて測定した。表４は
抗体の炭水化物成分を介した抗体の運動抑制が非常に高
能率でおこることを示す。
【００９４】
【表４】
【００９５】７.2. 分離 ２,4−ジニトロフェニル（DNP)パプテン基に対するマウ
スの単クローン IgG抗体を酸化して第７.1項にその概略
を記した方法によりアミノヘキノル−セファローズ（Ab
-CHO-SEPH)へ接合させた。抗体は又クアトレカサス他
（Cuatrecasas etal)〔1968, Proc. Natl. Acad. Sci.,
U.S.A. 61：636〕の方法によりシアノーゲ、ブロマイ
ドで活性化したセファローズへも結合した。
スの単クローン IgG抗体を酸化して第７.1項にその概略
を記した方法によりアミノヘキノル−セファローズ（Ab
-CHO-SEPH)へ接合させた。抗体は又クアトレカサス他
（Cuatrecasas etal)〔1968, Proc. Natl. Acad. Sci.,
U.S.A. 61：636〕の方法によりシアノーゲ、ブロマイ
ドで活性化したセファローズへも結合した。
【００９６】ＤＮＰ基（DNP-RNase)と結合したリボヌク
レアーゼは2,４−ジニトロフロロベンゼン（ウィスコン
シン州 ミルウォーキー州 アルドリッチ ケミカル社
製）とリボヌクレアーゼ（ミズーリ州 セント・ルイス
シグマカンパニイ製）を等モル量ずつ、0.１M 炭酸円バ
ッファph9.０内で、４時間室温で混合した。ＰＳＢで広
範囲に透析した後、 DNP-RNaseを測定し、その結果、リ
ボヌクレアーゼ１モル当りＤＮＰ基は平均0.８モルであ
ることが明らかとなった。 DNP-RNaseはクロラミン−Ｔ
(Aldrich Chemical Co., Ltd.製）を用いて 125Ｉで標
識をつけた。
レアーゼは2,４−ジニトロフロロベンゼン（ウィスコン
シン州 ミルウォーキー州 アルドリッチ ケミカル社
製）とリボヌクレアーゼ（ミズーリ州 セント・ルイス
シグマカンパニイ製）を等モル量ずつ、0.１M 炭酸円バ
ッファph9.０内で、４時間室温で混合した。ＰＳＢで広
範囲に透析した後、 DNP-RNaseを測定し、その結果、リ
ボヌクレアーゼ１モル当りＤＮＰ基は平均0.８モルであ
ることが明らかとなった。 DNP-RNaseはクロラミン−Ｔ
(Aldrich Chemical Co., Ltd.製）を用いて 125Ｉで標
識をつけた。
【００９７】二つの運動抑制された抗ＤＮＰ抗体樹脂、
Ab-CHO-SEPHとAb-CNBr-SEPHについて、 125Ｉ-DNP-RNa
seの結合能力をテストした。ＳＭチオシン酸塩ナトリウ
ムがどちらの製剤からも結合された DNP-RNaseを放出で
きないという事実からも明らかなように、二つの抗体製
剤は DNP-RNaseに対して非常に高度の結合アフィニティ
を有していた。従って、抗原結合を可逆的できるようシ
ステムを修飾するため、実験を４M 尿素の存在化で行な
った。表５のデータは炭水化物接合（Ab-CHO-SEPH)によ
り運動抑制をうけた抗体がリジン残基で運動抑制をうけ
た同じ抗体（Ab-CNBr-SEPH）よりも効率よく DNA-RNase
を結合することを示した。
Ab-CHO-SEPHとAb-CNBr-SEPHについて、 125Ｉ-DNP-RNa
seの結合能力をテストした。ＳＭチオシン酸塩ナトリウ
ムがどちらの製剤からも結合された DNP-RNaseを放出で
きないという事実からも明らかなように、二つの抗体製
剤は DNP-RNaseに対して非常に高度の結合アフィニティ
を有していた。従って、抗原結合を可逆的できるようシ
ステムを修飾するため、実験を４M 尿素の存在化で行な
った。表５のデータは炭水化物接合（Ab-CHO-SEPH)によ
り運動抑制をうけた抗体がリジン残基で運動抑制をうけ
た同じ抗体（Ab-CNBr-SEPH）よりも効率よく DNA-RNase
を結合することを示した。
【００９８】
【表５】
【００９９】８．実施例：シリーズIV 以下の実施例は、アミド又はエステル結合を介して当該
化合物（化合物と称する）ヘリンクしたペプチドの抗体
分子の特定接合の方法を示すものである。生成抗体結合
物は溶血補体固定アッセイであきらかとなった補体の固
定能力を保有している。更に、補体システムによる酵素
開裂を介して抗原細胞表面で化合物が特定的に放出され
ることが非溶血アッセイにより例示される。
化合物（化合物と称する）ヘリンクしたペプチドの抗体
分子の特定接合の方法を示すものである。生成抗体結合
物は溶血補体固定アッセイであきらかとなった補体の固
定能力を保有している。更に、補体システムによる酵素
開裂を介して抗原細胞表面で化合物が特定的に放出され
ることが非溶血アッセイにより例示される。
【０１００】以下の実施例では、化合物は発蛍光体であ
る。従って、蛍光体化合物の補体を媒体とする放出は、
蛍光分子の結合した形と遊離した形を差別することの出
来るアッセイによって検出できる。第5.１項の材料と方
法を用いて単クローン抗体（No.171）の炭水化物成分を
酸化したヒツジの赤血球細胞と血清補体の存在下では、
これらの単クローン抗体（No.171)は補体酵素カスケー
ド反応を活性化する（抗原−抗体結合の結果）。補体の
固定化はヒツジ赤血球細胞の溶解を生じせしめ、その結
果ヘモクロビンが放出される。放出されたヘモグロビン
は分光光度計で検出でき、補体の固定アッセイを可能と
する。
る。従って、蛍光体化合物の補体を媒体とする放出は、
蛍光分子の結合した形と遊離した形を差別することの出
来るアッセイによって検出できる。第5.１項の材料と方
法を用いて単クローン抗体（No.171）の炭水化物成分を
酸化したヒツジの赤血球細胞と血清補体の存在下では、
これらの単クローン抗体（No.171)は補体酵素カスケー
ド反応を活性化する（抗原−抗体結合の結果）。補体の
固定化はヒツジ赤血球細胞の溶解を生じせしめ、その結
果ヘモクロビンが放出される。放出されたヘモグロビン
は分光光度計で検出でき、補体の固定アッセイを可能と
する。
【０１０１】トリペプチド−ＡＭＣは第5.２項で記載し
たように製造した。発蛍光化合物（ＡＭＣ）の特性によ
り、その化合物の結合した形と遊離した形が分光光度計
で識別可能となる。これにより抗体結合体の補体固定性
能を測定するための明確なアッセイを提供する。更に重
要なことは、その後の補体が媒介する化合物の放出の定
量手段を提供することである。
たように製造した。発蛍光化合物（ＡＭＣ）の特性によ
り、その化合物の結合した形と遊離した形が分光光度計
で識別可能となる。これにより抗体結合体の補体固定性
能を測定するための明確なアッセイを提供する。更に重
要なことは、その後の補体が媒介する化合物の放出の定
量手段を提供することである。
【０１０２】抗体の酸化炭水化物成分へのフェニルヒド
ラジン−トリペプチド−ＡＭＣの特定的共有接合は第5.
３項に記載の方法により行った。８.1. 補体の固定アッセイ 補体の固定アッセイの二つのタイプ、溶血タイプと蛍光
分析タイプを利用した。これらのアッセイにより抗体−
フェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭＣ結合体が補
体の固定能力を保持しているか否か、ＡＭＣが補体によ
り開裂をうけた否かを判定する。８.1.1. ヒト補体の製造 ヒトの新鮮な全血10mlを17時間氷冷し、凝固させた。凝
固物は遠心分離により取り除き、その結果得られたヒト
の血清を0.５mlアリコート内で凍結させた。第８.1.2項
に記載した溶血アッセイにより、これらのサンプル中の
ヒト補体は活性を有していることが明らかとなった。８.1.2. 補体の固定化のための溶血アッセイ 濃度が約２×108 細胞／mlであるヒツジ赤血球細胞懸濁
液（ウィスコンシン州マディソン、Gibco Diagnostics
製）の 200μl アリコートを第５.3項で製造した抗体結
合体混合物（蛋白約２μg)20μl と混合した。かく拌と
37℃での培養を15分間行なって後、ヒトの血清補体（第
８.1.1項で製造）を 100μl 、混合物へ添加した。37℃
で30分から１時間培養した後、混合物を遠心分離にか
け、細胞をペレット状にした。補体を培養とする細胞溶
解の程度は、上澄み液 (412nm)内へ放出されたヘモグロ
ビンを分光光度計で測定して計測した。
ラジン−トリペプチド−ＡＭＣの特定的共有接合は第5.
３項に記載の方法により行った。８.1. 補体の固定アッセイ 補体の固定アッセイの二つのタイプ、溶血タイプと蛍光
分析タイプを利用した。これらのアッセイにより抗体−
フェニルヒドラジン−トリペプチド−ＡＭＣ結合体が補
体の固定能力を保持しているか否か、ＡＭＣが補体によ
り開裂をうけた否かを判定する。８.1.1. ヒト補体の製造 ヒトの新鮮な全血10mlを17時間氷冷し、凝固させた。凝
固物は遠心分離により取り除き、その結果得られたヒト
の血清を0.５mlアリコート内で凍結させた。第８.1.2項
に記載した溶血アッセイにより、これらのサンプル中の
ヒト補体は活性を有していることが明らかとなった。８.1.2. 補体の固定化のための溶血アッセイ 濃度が約２×108 細胞／mlであるヒツジ赤血球細胞懸濁
液（ウィスコンシン州マディソン、Gibco Diagnostics
製）の 200μl アリコートを第５.3項で製造した抗体結
合体混合物（蛋白約２μg)20μl と混合した。かく拌と
37℃での培養を15分間行なって後、ヒトの血清補体（第
８.1.1項で製造）を 100μl 、混合物へ添加した。37℃
で30分から１時間培養した後、混合物を遠心分離にか
け、細胞をペレット状にした。補体を培養とする細胞溶
解の程度は、上澄み液 (412nm)内へ放出されたヘモグロ
ビンを分光光度計で測定して計測した。
【０１０３】本アッセイの結果により、完全な溶血と抗
体の細胞表面へのほぼ 100％の結合が明らかとなった。
例えば、ヒツジ赤血球細胞懸濁液 200μl を遠心分離に
かけて得たペレットへ蒸留水を添加すると細胞は完全に
溶解し、ヘモグロビン放出する。蒸留水で完全に溶解し
たヒツジ赤血球細胞の上澄み液を 1：20で希釈したもの
は、O.D.412 が 0.646であった。結合体と補体を添加し
て溶解したヒツジの赤血球細胞の同じ希釈体のO.D.412
は 0.672であった。すなわち、結合体は抗原を結合し、
補体を固定する能力を保持した。８.1.3. 補体を媒体とするＡＭＣの放出の非溶血アッセ
イ 非溶血のアッセイの条件は上記と同じであるが、通常の
ヒツジ赤血球細胞の代りにグリタルアルデヒドで固定し
たヒツジ赤血球細胞（ミズーリ州セントルイス、Sigma
製）を用いた。グルタルアルデヒドで固定した細胞は抗
体と補体の存在下では溶解せず、したがって、ヘモグロ
ビンは放出されない。その代りに蛍光計アッセイを用い
てＡＭＣの放出を示す。蛍光計アッセイでは非溶血シス
テムが必要であり、これはヘモグロビンの存在が本シス
テム中の蛍光剤測定を干渉するからである。アッセイに
用いる前に、これらの固定赤血球細胞は未修飾抗体と、
第５.3項で製造した抗体−フェニルヒドラジン−トリペ
プチド−ＡＭＣの両方を結合することが示された。
体の細胞表面へのほぼ 100％の結合が明らかとなった。
例えば、ヒツジ赤血球細胞懸濁液 200μl を遠心分離に
かけて得たペレットへ蒸留水を添加すると細胞は完全に
溶解し、ヘモグロビン放出する。蒸留水で完全に溶解し
たヒツジ赤血球細胞の上澄み液を 1：20で希釈したもの
は、O.D.412 が 0.646であった。結合体と補体を添加し
て溶解したヒツジの赤血球細胞の同じ希釈体のO.D.412
は 0.672であった。すなわち、結合体は抗原を結合し、
補体を固定する能力を保持した。８.1.3. 補体を媒体とするＡＭＣの放出の非溶血アッセ
イ 非溶血のアッセイの条件は上記と同じであるが、通常の
ヒツジ赤血球細胞の代りにグリタルアルデヒドで固定し
たヒツジ赤血球細胞（ミズーリ州セントルイス、Sigma
製）を用いた。グルタルアルデヒドで固定した細胞は抗
体と補体の存在下では溶解せず、したがって、ヘモグロ
ビンは放出されない。その代りに蛍光計アッセイを用い
てＡＭＣの放出を示す。蛍光計アッセイでは非溶血シス
テムが必要であり、これはヘモグロビンの存在が本シス
テム中の蛍光剤測定を干渉するからである。アッセイに
用いる前に、これらの固定赤血球細胞は未修飾抗体と、
第５.3項で製造した抗体−フェニルヒドラジン−トリペ
プチド−ＡＭＣの両方を結合することが示された。
【０１０４】非溶血アッセイは、抗体結合体から特定的
な補体を媒体とするＡＭＣの放出を示すのに用いた。溶
血アッセイの場合と同じく、濃度が約２×108 細胞／ml
のグルタルアルデヒドで固定したヒツジの赤血球細胞 2
00μl を抗体−フェニルヒドラジッド−トリペプチド−
ＡＭＣ結合体と共に37℃で15分間培養した。遠心分離と
バッファーに再懸濁して後、ヒト補体製剤（第８.1.1
項）を50μl添加し、 460nmでの蛍光をモニターし、 38
0nmでの励起を時間の関数とした〔カポラル他（Caporal
e et al), 1981, J. Immunol, 128. 1963-65 〕。コン
トロールとして、結合体をヒツジの赤血球細胞との
み、；ラットの赤血球細胞とヒト補体の存在下で（用い
た単クローン抗体はラットの赤血球細胞に不在下で（用
いた単クローン抗体はラットの赤血球細胞と結合しな
い）、各々培養した。図８にこれらの実験の結果を示
す。グルタルアルデヒドで固定したヒツジの赤血球細胞
とヒトの補体で培養した結合体を表わす曲線(a) をヒン
トロールを表わす曲線(b),(c), (d)を比較すると、特定
抗体標的とヒト補体を含むサンプル内の遊離ＡＭＣの放
出が明瞭である。従って、グルタルアルデヒドで固定し
たラットの赤血球細胞とヒト補体で培養した結合体を表
わす曲線(b) と、グルタルアルデヒドで固定したヒツジ
の赤血球細胞で培養した結合体を表わす曲線(c) と、結
合体のみを表わす曲線(d) はＡＭＣの放出がないことを
示している。
な補体を媒体とするＡＭＣの放出を示すのに用いた。溶
血アッセイの場合と同じく、濃度が約２×108 細胞／ml
のグルタルアルデヒドで固定したヒツジの赤血球細胞 2
00μl を抗体−フェニルヒドラジッド−トリペプチド−
ＡＭＣ結合体と共に37℃で15分間培養した。遠心分離と
バッファーに再懸濁して後、ヒト補体製剤（第８.1.1
項）を50μl添加し、 460nmでの蛍光をモニターし、 38
0nmでの励起を時間の関数とした〔カポラル他（Caporal
e et al), 1981, J. Immunol, 128. 1963-65 〕。コン
トロールとして、結合体をヒツジの赤血球細胞との
み、；ラットの赤血球細胞とヒト補体の存在下で（用い
た単クローン抗体はラットの赤血球細胞に不在下で（用
いた単クローン抗体はラットの赤血球細胞と結合しな
い）、各々培養した。図８にこれらの実験の結果を示
す。グルタルアルデヒドで固定したヒツジの赤血球細胞
とヒトの補体で培養した結合体を表わす曲線(a) をヒン
トロールを表わす曲線(b),(c), (d)を比較すると、特定
抗体標的とヒト補体を含むサンプル内の遊離ＡＭＣの放
出が明瞭である。従って、グルタルアルデヒドで固定し
たラットの赤血球細胞とヒト補体で培養した結合体を表
わす曲線(b) と、グルタルアルデヒドで固定したヒツジ
の赤血球細胞で培養した結合体を表わす曲線(c) と、結
合体のみを表わす曲線(d) はＡＭＣの放出がないことを
示している。
【０１０５】本出願に記載し、クレームした本発明は、
上記に開示した特定の実施例によりその範囲を限定され
るものではない。これらの実施例は本発明のいくつかの
側面を例示するためのものであり、これらと均等の他の
実施例もすべて本発明の範囲内にあるものである。ここ
に示し、説明したもの以外の本発明の様々な変更は、当
該分野の技術者にとって自明であろう。かかる変更は同
時に添付の特許請求の範囲内にあるものと意図される。
上記に開示した特定の実施例によりその範囲を限定され
るものではない。これらの実施例は本発明のいくつかの
側面を例示するためのものであり、これらと均等の他の
実施例もすべて本発明の範囲内にあるものである。ここ
に示し、説明したもの以外の本発明の様々な変更は、当
該分野の技術者にとって自明であろう。かかる変更は同
時に添付の特許請求の範囲内にあるものと意図される。
【図１(a), (b)】添付図面中、図１(a), (b)は抗体分
子、即ち IgG級(a) と IgM級(b) の免疫グロブリンを示
す概略図である。
子、即ち IgG級(a) と IgM級(b) の免疫グロブリンを示
す概略図である。
【図２】図２は古典的結合経路によるカスケード反応で
活性化した補体の一部を示すＣ１からＣ９は補体蛋白を
示す。数字の上の横線は活性化酵素を示すＳ'は細胞膜
上の部位を示す。
活性化した補体の一部を示すＣ１からＣ９は補体蛋白を
示す。数字の上の横線は活性化酵素を示すＳ'は細胞膜
上の部位を示す。
【図３】図３は抗新生物剤アルケラン Alkeran（バロー
ズ−ウェルカム社製）のペプチドＣＢＺ−ｇｌｙ−ｇｌ
ｙ−ａｒｇへの結合のための一般反応式を示す。
ズ−ウェルカム社製）のペプチドＣＢＺ−ｇｌｙ−ｇｌ
ｙ−ａｒｇへの結合のための一般反応式を示す。
【図４(a), (b)】図４(a) は非酸化抗体のスペクトル図
と、図４(b) は第５.1項に従って酸化した抗体の励起ス
ペクトル図を示す。
と、図４(b) は第５.1項に従って酸化した抗体の励起ス
ペクトル図を示す。
【図５】図５は第５.2項により製造したフェニルヒドラ
ジッド−トリペプチド−ＡＭＣ化合物の励起と発光スペ
クトルを示す。
ジッド−トリペプチド−ＡＭＣ化合物の励起と発光スペ
クトルを示す。
【図６】図６は第５.3項により製造した抗体−フェニル
ヒドラジッド−トリペプチド−ＡＭＣ（APTA）結合体の
励起と発光スペクトルを示す。
ヒドラジッド−トリペプチド−ＡＭＣ（APTA）結合体の
励起と発光スペクトルを示す。
【図７】図７は、修飾を加えない抗体（・─・）、本発
明方法により修飾を加えた抗体（Δ−Δ）、アスパラギ
ン酸及び／又はグルタミン酸（□−□）への結合により
修飾した抗体（カルボジイミド）を用いた蛍光消光デー
タをシップスプロットしたグラフである。
明方法により修飾を加えた抗体（Δ−Δ）、アスパラギ
ン酸及び／又はグルタミン酸（□−□）への結合により
修飾した抗体（カルボジイミド）を用いた蛍光消光デー
タをシップスプロットしたグラフである。
【図８】図８は、いくつかのコントロールとＡＭＣの特
定の補体を媒介とする放出を示す実験結果を示す。蛍光
を 460nmでモニターし、 380nmで励起している。蛍光の
増加は、抗体−フェニールヒドラジン−トリペプチド−
ＡＭＣ（APTA）結合体からのＡＭＣの放出を示す。(a)
はグルタラルデヒドで固定したヒツジ赤血球細胞とヒト
の補体で培養したAPTA結合体を示す。(b) はグルタラル
デヒドで固定したラット赤血球細胞とヒトの補体で培養
したAPTA結合体を示す。(c) はグルタラルデヒドが固定
したヒツジの赤血球細胞で培養したAPTA結合体、(d) は
APTA結合体のみを示す。
定の補体を媒介とする放出を示す実験結果を示す。蛍光
を 460nmでモニターし、 380nmで励起している。蛍光の
増加は、抗体−フェニールヒドラジン−トリペプチド−
ＡＭＣ（APTA）結合体からのＡＭＣの放出を示す。(a)
はグルタラルデヒドで固定したヒツジ赤血球細胞とヒト
の補体で培養したAPTA結合体を示す。(b) はグルタラル
デヒドで固定したラット赤血球細胞とヒトの補体で培養
したAPTA結合体を示す。(c) はグルタラルデヒドが固定
したヒツジの赤血球細胞で培養したAPTA結合体、(d) は
APTA結合体のみを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン，デニス，ロドウェル アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19067， ヤードリー，ラムゼイ ロード 430 (72)発明者 ジョン，ウォルター，フランク，ゴアーズ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08540， プリンストン，セイヤ ドライ ブ 38 (72)発明者 チャイー，リー アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08820 イースト ウィンザー，アビント ン ドライブ， ツイン リバース アパ ート ビー−22（番地なし)
Claims (9)
- 【請求項１】 (a) 細菌抗原、ウイルス抗原、腫瘍抗
原、真菌抗原、寄生体ウイルス抗原、マイコプラズマ抗
原、分化抗原及び組織適合性抗原から成る群から選ばれ
た。抗原部位へ向けられた抗体又は抗体フラグメントを
酸化剤に曝露し、抗体又は抗体フラグメントの炭水化物
成分中にアルデヒド基を生成して、酸化炭水化物成分が
抗体又は抗体フラグメントの抗体結合領域の外に位置す
るその酸化炭化水素成分を有する抗体又は抗体フラグメ
ントを形成し、(b) 抗体又は抗体フラグメントの酸化炭
化水素成分のアルデヒド基を化合物又は化合物に共有結
合しているか又は複合しているリンカーのアミン基と反
応させて、インビボ使用に適し抗体又は抗体フラグメン
トと本質的に同じ免疫反応性と免疫特異性を有する抗体
結合体を形成することから成る抗体結合体の製造方法。 - 【請求項２】 アルデヒド基を、アミン基が二級アミ
ン、ヒドラジン、ヒドラジド、フエニルヒドラジン、ヒ
ドロキシルアミン又はセミカルバジドである化合物のア
ミン基と反応させることを特徴とする請求項１に記載の
製造方法。 - 【請求項３】 アルデヒド基を、アミン基が一級アミ
ン、二級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、フエニルヒ
ドラジン、ヒドロキシルアミン又はセミカルバジドであ
る化合物に接合したリンカーのアミン基と反応させるこ
とを特徴とする請求項１に記載の製造方法。 - 【請求項４】 該酸化剤がガラクトースオキシダーゼ又
は酸素酸又はその塩であることを特徴とする請求項１に
記載の製造方法。 - 【請求項５】 該酸化剤が過ヨウ素酸塩であることを特
徴とする請求項１に記載の製造方法。 - 【請求項６】 該抗体フラグメントがＩｇＭ抗体のFab
フラグメント又は抗体分子の半分であることを特徴とす
る請求項１に記載の製造方法。 - 【請求項７】 抗体が単クローン抗体であることを特徴
とする請求項１に記載の製造方法。 - 【請求項８】 リンカーがペプチド・リンカー、アミン
酸リンカー、又はＷ Ｑはアミノ酸、ペプチド、キレート剤又はキレート剤誘
導体、ｎは０から20までの整数である。）一般式を有す
るリンカーのアミン基含有誘導体であり、このリンカー
が治療又は診断用化合物へ接合していることを特徴とす
る請求項１に記載の製造方法。 - 【請求項９】 化合物又はリンカー化合物のアミンと酸
化炭水化物成分あるいは抗体又は抗体フラグメントのア
ルデヒドとの間で共有結合により接合した化合物又はリ
ンカー化合物から成る抗体結合物であって、該抗体結合
体が抗体又は抗体フラグメントと本質的に同じ免疫反応
性と免疫特異性を有し、そして細菌、ウイルス、腫瘍、
真菌、寄生体、マイコプラズマ、分化及び組織適合性抗
原から成る群から選ばれた抗原部位に対してインビボ投
与するのに適する抗体結合体の有効量を個体に抗与する
ことから成る、化合物を抗原部位に運搬するために抗体
結合体を使用する方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/356,315 US4671958A (en) | 1982-03-09 | 1982-03-09 | Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites |
| US44205082A | 1982-11-16 | 1982-11-16 | |
| US442050 | 1982-11-16 | ||
| US356315 | 1989-05-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06256216A true JPH06256216A (ja) | 1994-09-13 |
| JP2503334B2 JP2503334B2 (ja) | 1996-06-05 |
Family
ID=26999177
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58037569A Expired - Lifetime JPH0788310B2 (ja) | 1982-03-09 | 1983-03-09 | 抗体結合体 |
| JP3063950A Expired - Lifetime JP2503319B2 (ja) | 1982-03-09 | 1991-03-04 | 抗体結合体を用いる抗原の検出および／または分離方法 |
| JP3226252A Expired - Lifetime JP2503334B2 (ja) | 1982-03-09 | 1991-09-05 | 抗体結合体の製造方法 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58037569A Expired - Lifetime JPH0788310B2 (ja) | 1982-03-09 | 1983-03-09 | 抗体結合体 |
| JP3063950A Expired - Lifetime JP2503319B2 (ja) | 1982-03-09 | 1991-03-04 | 抗体結合体を用いる抗原の検出および／または分離方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0088695B1 (ja) |
| JP (3) | JPH0788310B2 (ja) |
| AU (1) | AU556446B2 (ja) |
| CA (1) | CA1203164A (ja) |
| DE (1) | DE3382572T2 (ja) |
| DK (1) | DK113083A (ja) |
| GR (1) | GR77424B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013521498A (ja) * | 2010-03-02 | 2013-06-10 | シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド | 抗体をスクリーニングするための方法 |
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| US5140104A (en) * | 1982-03-09 | 1992-08-18 | Cytogen Corporation | Amine derivatives of folic acid analogs |
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| IL78775A (en) * | 1985-05-15 | 1992-06-21 | Biotech Australia Pty Ltd | Oral vaccines |
| US4824659A (en) * | 1985-06-07 | 1989-04-25 | Immunomedics, Inc. | Antibody conjugates |
| NZ212437A (en) * | 1985-06-17 | 1992-06-25 | Mark Philip Best | Site-directed antibody conjugates, and their preparation |
| US5405966A (en) * | 1985-10-17 | 1995-04-11 | Theodore; Louis J. | Trichothecene conjugates |
| US4744981A (en) * | 1985-10-17 | 1988-05-17 | Neorx Corporation | Trichothecene antibody conjugates |
| FR2590674B1 (fr) * | 1985-11-25 | 1989-03-03 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveaux reactifs de diagnostic |
| AU592142B2 (en) * | 1985-11-25 | 1990-01-04 | Cytogen Corporation | Modified viral glycoproteins, diagnostic and therapeutic uses therefore |
| EP0232693A3 (fr) * | 1985-12-16 | 1988-04-06 | La Region Wallonne | Conjugués de la vinblastine et de ses dérivés, procédé pour leur préparation et compositions pharmaceutiques les contenant |
| FR2591894B1 (fr) * | 1985-12-20 | 1988-04-01 | Sanofi Sa | Immunotoxines a longue duree d'action in vivo comportant la chaine a de ricine modifiee sur ses motifs polysaccharidiques |
| US4911912A (en) * | 1985-12-20 | 1990-03-27 | Sanofi | Ribosome-inactivating glycoproteins, modified by oxidation of their osidic units and reduction, and in vivo prolonged-action immunotoxins containing such a glycoprotein |
| US4911911A (en) * | 1985-12-20 | 1990-03-27 | Sanofi | Ribosome-inactivating glycoproteins, modified by oxidation of their osidic units and formation of a schiff's base and in-vivo prolonged action immunotoxins containing such a glycoprotein |
| FR2591895B1 (fr) * | 1985-12-20 | 1988-08-26 | Sanofi Sa | Immunotoxines a longue duree d'action in vivo comportant la chaine a de ricine modifiee sur ses motifs polysaccharidiques |
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