JPH06284888A

JPH06284888A - アガラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子

Info

Publication number: JPH06284888A
Application number: JP5096549A
Authority: JP
Inventors: Yasushi Sugano; 靖史菅野; Takashi Matsumoto; 隆志松本; Masakata Noma; 正名野間
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1993-04-01
Filing date: 1993-04-01
Publication date: 1994-10-11

Abstract

(57)【要約】【構成】アガラーゼ活性を有する蛋白質をコードする
遺伝子であり、アミノ酸配列中、特定のアミノ酸配列を
有する。【効果】本発明によれば、多量のネオアガロオリゴ糖
を工業的に生産することに利用できるアガラーゼを得る
ことができ、該アガラーゼによって、寒天由来のオリゴ
糖、例えば、ネオアガロヘキサオース、ネオアガロテト
ラオース、ネオアガロビオース等のネオアガロオリゴ糖
を生産し、実際に、ネオアガロオリゴ糖を、うどん、餅
等の澱粉を用いた食品へ添加することによって、それら
の食品の劣化を防ぐと共に、細菌の増殖を抑制すること
が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】

【０００２】本発明は、アガラーゼ活性を有する蛋白質
をコードする遺伝子に関し、詳細には、例えば、ビブリ
オ sp.JT0107（以下ＪＴ０１０７と略す）の生産するア
ガラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に関す
る。

【０００３】

【従来の技術】

【０００４】海藻多糖の一種である寒天は、主に食品用
のゲル化剤、増粘剤として幅広く使われ、その他にも、
培地用試薬、核酸電気泳動用、実験用担体等の用途があ
る。

【０００５】この寒天の主成分はアガロースであり、そ
の構造は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースと、
Ｄ−ガラクトースが交互に、α−１，３結合、β−１，
４結合を繰り返す多糖である。

【０００６】このアガロースが分解されてできるオリゴ
糖であるところのネオアガロオリゴ糖は、澱粉老化抑制
作用、一般細菌に対する静菌作用、非カロリー性など
の、高機能性食品、及び食品添加物としての優れた長所
を有していることが知られている（実践バイオリアクタ
ー、食品化学新聞社発行、1990、102-105）。

【０００７】上記のネオアガロオリゴ糖は、通常のアガ
ロースの加水分解では得ることができず、アガロース分
解酵素であるアガラーゼの利用によって得ることができ
る。

【０００８】該アガラーゼは、アガロースを分解し、ネ
オアガロオリゴ糖、例えば、ネオアガロヘキサオース、
ネオアガロテトラオース、ネオアガロビオースを生産す
る酵素であり、現在数種類の物が知られている。

【０００９】シグマ社（セントルイス、アメリカ合衆
国）、及びカルバイオケム社（サンジエゴ、アメリカ合
衆国）から市販されているアガラーゼは、グラム陰性細
菌のシュウドモナスアトランティカが生産する酵素で
ある。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】

【００１１】しかしながら、従来の市販アガラーゼは、
酵素の生産性が低いのでネオアガロオリゴ糖の供給量が
少なく、また、酵素の精製法が繁雑であるため高価であ
り、主に生化学用の試薬等として用いられているだけで
あり、多量のネオアガロオリゴ糖を工業的に生産するこ
とには利用できなかった。

【００１２】そのため、ネオアガロオリゴ糖を、うど
ん、餅等の澱粉を用いた食品へ添加することに使うこと
ができず、それらの食品の劣化を防ぐと共に、細菌の増
殖を抑制することができなかった。

【００１３】従って、多量のネオアガロオリゴ糖を工業
的に生産することに利用できるアガラーゼを得ること
で、該アガラーゼによってネオアガロオリゴ糖を工業的
に生産し、実際に、ネオアガロオリゴ糖を、うどん、餅
等の澱粉を用いた食品へ添加することによって、それら
の食品の劣化を防ぐと共に、細菌の増殖を抑制すること
を可能にすることが望まれていた。

【００１４】

【課題を解決するための手段】

【００１５】本発明者らは、アガロースをネオアガロオ
リゴ糖に分解するβ−アガラーゼ活性を有する海洋細
菌、ビブリオＳＰ．ＪＴ０１０７から新規のアガラー
ゼ、すなわち agarase０１０７をコードする遺伝子を単
離し、大腸菌で遺伝子の発現を試みる研究を鋭意進めた
結果、ＪＴ０１０７のＤＮＡを抽出し、これを鋳型とし
てagarase０１０７の部分アミノ酸配列を元に作成した
合成プライマーを用いてポリメレースチェインリアクシ
ョン（以下、ＰＣＲと略す）により、 agarase０１０７
をコードする遺伝子の一部を増幅し、これをプローブと
してＪＴ０１０７のＤＮＡライブラリーより目的蛋白質
をコードする領域とそれに付随する領域を単離し、塩基
配列、及び全アミノ酸配列を決定することで本発明を完
成した。

【００１６】即ち、本発明の課題を解決するための手段
は、下記のとおりである。

【００１７】第１に、配列表の配列番号１のアミノ酸配
列中、１〜９７５で示されるアミノ酸配列をコードする
遺伝子である。

【００１８】第２に、配列表の配列番号１の塩基配列
中、１〜３２０５の塩基配列で示される遺伝子である。

【００１９】以下、本発明を詳細に説明する。

【００２０】agarase０１０７ＤＮＡは、ＪＴ０１０７
の細胞から得られる。

【００２１】なお、該ＪＴ０１０７は、工業技術院微生
物工業技術研究所に、平成３年３月６日付で、Flavobac
terium-Cytophaga complex JT0107-L4，微工研菌寄第１
２０９２号（FERM P-12092）として寄託され、入手可能
なものである。

【００２２】全ＤＮＡの抽出は、常法によればよく、フ
ェノール抽出、エタノール沈澱などの操作を併用すれば
よい。

【００２３】本発明において、一般的には、ＪＴ０１０
７の細胞壁を破壊し、フェノール抽出、エタノール沈澱
によりＤＮＡを抽出する。

【００２４】このＤＮＡを制限酵素切断し、シュークロ
ースグラジエントを用いた超遠心分離により、均一の長
さのＤＮＡ断片を選択する。

【００２５】本ＤＮＡ断片をクローニングベクターに組
み込む。

【００２６】得られた本ＤＮＡ断片を含むクローニング
ベクターを試験管内でパッケージングした後、これを宿
主大腸菌に感染させる。

【００２７】この組み換えファージをソフトアガロース
に混和した後、寒天培地にまき一夜培養することによ
り、多数の組み換えファージ（ＤＮＡライブラリー）を
得る。

【００２８】このＤＮＡライブラリーのＰＣＲによって
得られた部分agarase０１０７遺伝子をプローブとし
て、常法によりプラークハイブリダイゼーションを行
い、プローブとハイブリダイズする複数個の独立した組
換えファージを得る。

【００２９】これらファージをプラークハイブリダイゼ
ーションを繰り返すことにより単一のファージに精製す
る。

【００３０】これらファージを、大腸菌に感染後、プレ
ートライセート法によりファージを増殖させ、常法によ
り組換えファージＤＮＡを抽出する。

【００３１】本組換えファージＤＮＡを種々の制限酵素
で切断し、このうち、ＫｐｎＩまたはＥｃｏＲＩで切断
した断片をプラスミドベクターのＫｐｎＩまたはＥｃｏ
ＲＩサイトにクローニングし、ジデオキシ法で塩基配列
を決定する。

【００３２】決定された塩基配列を元に、開始コドンと
終止コドンを含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切り出
し、これを発現可能なプラスミドベクター、例えば、ｌ
ａｃプロモーター、ｔａｃプロモーターなど大腸菌のプ
ロモーターを有するプラスミドベクターに接続し、これ
を用いて、任意の宿主大腸菌、好ましくは、ＪＭ８３、
ＭＶ１１８４、ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ培地等の
通常の培地で、菌が十分増殖する条件、例えば、２３℃
〜３７℃、１２時間〜２４時間振とう培養した後、菌体
を遠心分離等の方法で集菌し、この菌体をフレンチプレ
ス、超音波破砕等の手法で破壊し、これを可溶成分と不
溶成分に分離した後、可溶成分から、硫酸アンモニウム
沈澱、透析、カラムクロマトグラフィーを施して、 aga
rase０１０７を得る。

【００３３】

【実施例】

【００３４】以下に、実施例により、本発明を詳細に説
明する。

【００３５】まず、実施例で使用する agarase０１０７
の調製例を説明する。

【００３６】天然海水１００ｍｌ、寒天３ｇ、リン酸水
素二カリウム０．３ｇ、および酵母エキス１ｇを混合
し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．０に調整し
た培地をオートクレーブで滅菌した。

【００３７】この培地にＪＴ０１０７を植菌し、２０
℃、１５０ｒｐｍで６日間振とう培養した。

【００３８】その後、培養液を１ｍｌ分取し、１ｍｌの
グリセリン溶液を含む小型バイアル瓶に入れ、−８６℃
で凍結保存し、残りの培養液は以下の実験に供した。

【００３９】ＪＴ０１０７の培養液１０００ｍｌを遠心
分離し、約９００ｍｌの培養上清と固形物とに分離し
た。

【００４０】蛋白質を塩析するために、この培養上清
に、硫酸アンモニウムを９０％飽和になるように攪拌し
ながら徐々に添加し、５℃で一晩放置した。

【００４１】生じた塩析物を遠心分離により回収し、セ
ロハンチューブを透析膜として、２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）３０００ｍｌに対して透析した。

【００４２】透析は、５℃で１８時間行ない、その間透
析外液を２回交換した。

【００４３】得られたサンプルを、予め２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱＡＥトヨパー
ル（東ソー社製の強陰イオン交換樹脂）を担体としたカ
ラム（１ｃｍ×２．５ｃｍ）に吸着させた。

【００４４】このサンプルを、２０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）から０．５塩化ナトリウムを含有する
２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）への直線濃度
勾配法（総溶出量４ｍｌ）により溶出させ、塩化ナトリ
ウム濃度が０．５Ｍ以降に溶出してくる画分６ｍｌを回
収した。

【００４５】得られた画分に２０ｍＭトリス塩酸緩衝液
を加えて２４ｍｌとし、前述の緩衝液で予め平衡化した
ＭＯＮＯ−Ｑ（ファルマシア社製の強陰イオン交換樹
脂）を担体としたカラム（０．５ｃｍ×５ｃｍ）に吸着
させて前述の直線濃度勾配法（総溶出量１５ｍｌ）によ
り溶出させ、 agarase０１０７を調製した。

【００４６】該 agarase０１０７の酵素活性を測定した
結果、酵素１ｍｇ当り約６．３ユニットの力価を示し
た。

【００４７】ここで、ガラクトース量に換算して、１分
間当り１マイクロモルのガラクトース量に相当する還元
糖を得る酵素活性を、１ユニットとした。

【００４８】

【実施例１】＊ＪＴ０１０７のＤＮＡの精製

【００４９】ＪＴ０１０７をあらかじめ平板に画線培養
し、この１白金耳を２リットルの天然海水中に０．３％
寒天、０．０２％リン酸水素２カリウム、０．１％酵母
エキスを含む培地に植菌し、初発ｐＨを８で、３リット
ルのこぶ付きフラスコを用いて回転式振とう培養器で２
０℃、１５０回転で６日間培養した。

【００５０】培養液から、遠心分離器（トミー製）を用
いて６０００回転３０分間の遠心分離により培養上清を
除去し、湿重量６．４ｇの菌体を得た。

【００５１】これを、５０ｍｌ容のファルコンチュウブ
に取り、６ｍｌのサリン−ＥＤＴＡ溶液（０．１５Ｍ塩
化ナトリウム、０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ
８．０）に懸濁し、１２ｍｇのリゾチームを加え、３７
℃で１５分間インキュベイトした。

【００５２】得られた菌液を−２０℃で６０分間凍結
し、さらに、５０ｍｌのトリス−ＳＤＳ緩衝液を加え、
６０℃で６０分間融解した。

【００５３】これに、トリス−ＳＤＳ緩衝液で飽和した
フェノール５０ｍｌを加え、１５分間撹はんした。

【００５４】これを５０ｍｌのファルコンチュウブ２本
に分注し、７０００回転で１０分間遠心分離し、上清を
得た。

【００５５】この上清から、さらに蛋白質を除去するた
めに、１００００回転１０分間の遠心分離を行ない、４
０ｍｌの水層を得た。

【００５６】水層には、粗抽出ＤＮＡが含まれており、
これに３Ｍ酢酸ナトリウム４ｍｌ、９０ｍｌのエタノー
ルを加え、生じたＤＮＡの沈澱を１００００回転１５分
間の遠心分離により回収した。

【００５７】この粗抽出ＤＮＡは、トリス−ＥＤＴＡ緩
衝液（以下ＴＥと略すこともある）３５ｍｌに溶解し、
１．７５ｍｇのＲＮａｓｅＡ、及び１．０５ｍｇのＲＮ
ａｓｅＴ₁を加え、３７℃、４０分間インキュベイト
し、３．５ｍｌのクエン酸ナトリウム、及び８０ｍｌの
冷エタノールを加え、精製ＤＮＡを沈澱として回収し、
これを２ｍｌのＴＥに溶解した。

【００５８】

【実施例２】＊agarase０１０７の部分分解

【００５９】１０ｍｌ容のキャップ付き試験管中でＪＴ
０１０７より精製した３８０μｌのagarase０１０７
（トリス−塩酸緩衝液中５５０μｇ／μｌ）に１０μｌ
のトリプシン溶液（０．１ｍＭ塩酸１ｍｌに０．４ｍｇ
トリプシン含有）を加え、３７℃で１５時間インキュベ
イトした。

【００６０】反応溶液から、減圧乾燥により溶媒を除去
し、７０μｌの０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した。

【００６１】このサンプルを、カプセルパックＣ−８カ
ラム（資生堂製）を用いて、高速液体クロマトグラフィ
ーにより、流量１ｍｌ／ｍｉｎ．で６５分間に渡りアセ
トニトリル濃度を水に対して０−５６％の割合で直線的
に濃度勾配をかけ、オリゴペプチド約３５０μｌずつ
１．５ｍｌ容のマイクロチュウブに分離回収した。

【００６２】

【実施例３】＊オリゴペプチドのアミノ酸配列の決定

【００６３】実施例２で得られたオリゴペプチドは、１
００μｌずつアプライドバイオシステムズ社製のペプチ
ドシークエンサーモデル４７７Ａ及びモデル１２０Ａに
より、アミノ末端側から順次決定していった。

【００６４】この結果得られた配列を配列番号２から配
列番号１０に記した。

【００６５】

【実施例４】＊ＰＣＲによる部分agarase０１０７ＤＮＡの合成

【００６６】実施例３で得られたオリゴペプチドの配列
のうち、配列番号８及び配列番号９で示す配列をもと
に、対応するアミノ酸の全ての可能なコドンの組合せ
を、アプライドバイオシステムズ社製のＤＮＡ合成機を
用いてオリゴヌクレオチドを合成した。

【００６７】合成したプライマー１００ｐｍｏｌ、鋳型
ＤＮＡとして、実施例１で得られたＤＮＡ５μｌを用い
て、ＤＮＡ増幅試薬キットにより、キットに添付されて
きた説明書に従い、指定の容器を用いデオキシＡＴＰ、
デオキシＴＴＰ、デオキシＧＴＰ、デオキシＣＴＰ各２
μｌ（２０ｐｍｏｌ相当）、反応緩衝液１０μｌ、アン
プリタック０．５μｌを混合し、水で総量１００μｌに
調製した。

【００６８】反応の条件は、１サイクルを９４℃で２分
間加熱後、９４℃、１．５分間熱変性させ、４２℃で
３．５分間インキュベイトし、７０℃で２分間反応させ
るものとし、ＤＮＡサーマルサイクラー（宝酒造製）で
２５回この反応を繰り返した。

【００６９】この反応物１０μｌを、０．８％アガロー
スゲルにて電気泳動したところ、約１４００塩基対のＤ
ＮＡが認められた。

【００７０】残りの反応液９０μｌにクロロホルム６０
μｌを加え、撹はん後、１５０００回転で２分間遠心分
離し、上層の水層を分取した。

【００７１】これを再度繰り返し、得られた約９０μｌ
の水層に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を加え、さ
らに、２００μｌの冷エタノールを加え、−２０℃で１
時間静置した後、１５０００回転で１５分間遠心分離
し、上清を除去しＤＮＡ沈澱を得た。

【００７２】これに、７０％エタノール２００μｌを加
え、さらに、１５０００回転で５分間遠心分離し、上清
を除去した後、真空乾燥装置（タイテック製）で５分間
乾燥し、これに、ＴＥ２０μｌを加え再溶解した。

【００７３】これにＴ４ＤＮＡポリメラーゼ１０ユニッ
ト、デオキシＡＴＰ、デオキシＴＴＰ、デオキシＧＴ
Ｐ、デオキシＣＴＰ各８μｌ（各２５ｍＭ）を加え、１
２℃で１５分間インキュベイトした後、７５℃で１０分
間加熱し、反応を停止することにより、末端が平滑化さ
れたＤＮＡを得た。

【００７４】

【実施例５】＊ＰＣＲで得られたＤＮＡの塩基配列解析

【００７５】実施例４で得られたＤＮＡ１０μｌを、さ
らに制限酵素ＰｓｔＩで約９００塩基対と約５００塩基
対の二断片に切断し、前述の方法でエタノール沈澱によ
りＤＮＡを回収し、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液１０μｌに
再溶解した。

【００７６】これら、２０ｎｇ相当を、ＰｓｔＩ、Ｓｍ
ａＩでダブルダイジェスションしたプラスミドベクター
ｐＵＣ１９（宝酒造製）２０ｎｇに、宝酒造製のライゲ
ーションキットを用いて、説明書に従い結合させ、これ
を用いて１００μｌのコンピテントセルＪＭ８３（ニュ
ーイングランドバイオラボ社）を形質転換し、１ｐｐｍ
のアンピシリンを含むＬＢ平板培地に、均一に塗沫し
た。

【００７７】これを３７℃で１５時間インキュベイト
し、生じた青色のコロニーと白色のコロニーのうち、白
色のコロニーのみを滅菌した楊子で釣菌し、これを１ｐ
ｐｍのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地で、３
７℃１５時間、１２５回転で振とう培養し、培養液か
ら、１５０００回転１０秒間の遠心分離により上清を除
去し、得られた菌体を４００μｌのＴＥに懸濁し、次い
で８００μｌのアルカリ変性液を加え、６０秒後に中和
溶液６００μｌを加え、氷水中に１時間静置し、その後
１５０００回転、１５分間の遠心分離を行ない不溶分を
除去し、可溶成分約１８００μｌに、１０８０μｌのイ
ソプロピルアルコールを加え、−２０℃で１時間静置し
た。

【００７８】その後１５０００回転１５分間の遠心分離
を行ない上清を除去し、沈澱に７０％エタノール５００
μｌを加え、１５０００回転で５分間遠心分離し、上清
を除去し、真空乾燥装置で５分間沈澱を乾燥し、これを
ＴＥ２００μｌに再溶解し、２００μｌの５Ｍ酢酸アン
モニウム溶液２００μｌを加え、氷水中に１時間静置
し、その後１５０００回転で１５分間遠心分離し、上清
を回収し、これに１０００μｌのエタノールを加え−２
０℃で１時間静置し、その後１５０００回転、１５分間
の遠心分離を行ない、上清を除去し、沈澱に７０％エタ
ノール５００μｌを加え、１５０００回転で５分間遠心
分離し、上清を除去し、真空乾燥装置で５分間沈澱を乾
燥し、これをＴＥ２０μｌに再溶解し、精製プラスミド
ＤＮＡを得た。

【００７９】このうち、２μｌに水１６μｌ、２Ｎ水酸
化ナトリウム２μｌを加えたＤＮＡ溶液を２本作製し、
それぞれ３７℃で１０分間インキュベイトした後、２Ｍ
酢酸アンモニウム３μｌ、及び水７μｌを加え、さら
に、冷エタノール７５μｌを加え、−２０℃、９０分間
静置し、その後１５０００回転１５分間の遠心分離を行
ない、上清を除去し、沈澱に７０％エタノール５００μ
ｌを加え、１５０００回転で５分間遠心分離し、上清を
除去し、真空乾燥装置で５分間沈澱を乾燥し、これをお
のおの水１０μｌに再溶解し、２μｌのファルマシア製
のユニバーサルプライマー、一方に、２μｌのファルマ
シア製のリバースプライマーを加え、さらにそれぞれ
に、ファルマシア製のアニールバッファー２μｌを加
え、３７℃、２０分間インキュベイトした後、室温で２
時間静置した。

【００８０】これを、Ｔ７シークエンシングキット（フ
ァルマシア製）と、アルファー³²Ｐ−デオキシＣＴＰ
（ニューイングランドニュークリアーデュポン製）を用
いて、ジデオキシ塩基配列決定法に従って配列を決定し
た。

【００８１】この中に、配列番号４に示す配列と、配列
番号９に示す配列の一部が含まれていたため、このＤＮ
Ａが、agarase０１０７をコードする遺伝子の一部であ
ることが明らかになった。

【００８２】

【実施例６】＊ＪＴ０１０７のＤＮＡライブラリーの作製

【００８３】実施例１で得られたＤＮＡ４００μｌ（１
９０μｇ相当）を制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ６００ユニット
（６０μｌ）、反応緩衝液５０μｌを加え、３７℃でイ
ンキュベイトを開始し、１、２、３、５、７、１０分後
に、８５μｌずつ分取し、これに、０．５Ｍ−ＥＤＴＡ
溶液９．５μｌを添加し、反応を停止した。

【００８４】これら、各反応液を５μｌずつ、０．８％
アガロースゲル電気泳動に供し、ＤＮＡの長さが、１０
０００塩基対から２００００塩基対であるものを最も多
く含む画分である反応時間５、７、１０分のサンプルを
集め、さらに、超遠心分離により１００００塩基対か
ら、２００００塩基対の画分のみを集めるために、２０
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１Ｍ塩化ナトリウ
ム、５ｍＭ−ＥＤＴＡによる緩衝液を含む１０、２０、
３０、４０％のシュクロース溶液を作製した。

【００８５】２本の１３ｍｌ容量のスイング用遠心チュ
ーブの底から順番に４０％、３０％、２０％、１０％の
シュクロース溶液を２．５ｍｌずつ静かに重層し、最後
に、前述のＤＮＡ画分２４０μｌをそれぞれに１２０μ
ｌずつ重層し、超遠心分離装置（日立製作所製）を用
い、２６０００回転、２０℃で１８時間超遠心分離を行
なった。

【００８６】超遠心分離終了後、キャピラリー管を静か
にチューブの底まで差込み、ペリスターポンプを使用し
て、約３５０μｌずつマイクロチューブに順次分画し、
各分画成分の１０μｌを０．６％アガロースゲル電気泳
動に供し、目的の１００００塩基対から、２００００塩
基対のＤＮＡが含まれている画分５本を特定した。

【００８７】これらの画分を１．５ｍｌ容の超遠心用マ
イクロチュウブ５本に移しかえ、７００μｌの冷エタノ
ールを加え、−２０℃で、１時間静置した後、卓上超遠
心装置（ベックマン社製）で、５００００回転２０分間
超遠心分離し、上清を静かに除去し、得られたＤＮＡの
沈澱に７０％エタノールを加え５００００回転２０分間
超遠心分離し、上清を静かに除去しＤＮＡの沈澱を真空
乾燥装置で５分間乾燥したのち、ＴＥ１２μｌに溶解し
た。

【００８８】このＤＮＡ溶液１μｌを、ＢａｍＨＩで切
断し、クローニングベクターＥＭＢＬ３（ストラタジー
ン社製）１μｌと混合し、０．４μｌ（４ユニット）の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼと反応緩衝液０．４μｌ（宝酒造
製）を加え、１０ｍＭのＡＴＰ０．４μｌを加え、水で
全量を４μｌとし、４℃で１５時間静置した。

【００８９】本反応液３μｌを、ギガパックゴールド
（ストラタジーン社製）を使用し、添付されてきた手順
書に従って、インビトロパッケイジングを行ない、室温
で２時間インキュベイトし、組換えファージを作製し
た。

【００９０】本組換えファージに５００μｌのファージ
希釈液（ギガパックゴールドに添付されてきた手順書に
記載されているもの）と、２０μｌのクロロホルムを加
え、混合後、７０００回転で１０秒間遠心し、ファージ
懸濁液を得た。

【００９１】この懸濁液をさらに、ファージ希釈液で１
００倍に希釈した。

【００９２】この組換えファージの宿主大腸菌であるＰ
２３９２（ストラタジーン社）を、０．２％マルトース
と１０ｍＭ硫酸マグネシウムを含むＬＢ培地５ｍｌで３
０℃１５時間振とう培養した。

【００９３】本培養液から５０００回転１０分間の遠心
分離により上清を除去し、菌体を回収し、これを１０ｍ
Ｍの硫酸マグネシウム５ｍｌに再懸濁した。

【００９４】本大腸菌懸濁液１００μｌと前述のファー
ジ希釈液１０μｌを混合し、３７℃で１５分間インキュ
ベイトした。

【００９５】４２℃にあらかじめ保温していた３ｍｌの
０．７％ＬＢアガロース溶液に、本混合液を懸濁し、直
ちに、１．５％寒天を含むＬＢ平板培地に均一に塗沫
し、３７℃で１５時間培養し、ＤＮＡライブラリーを作
製した。

【００９６】

【実施例７】＊プラークハイブリダイゼーションによる遺伝子の単離

【００９７】実施例６で作製した寒天培地上のＤＮＡラ
イブラリー上に、ナイロン膜のバイオダインＡ（日本ポ
ール製）をのせ、２分間放置することにより、寒天培地
上の各ファージの一部をナイロン膜に移した。

【００９８】ファージが吸着したナイロン膜の面を上に
して、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリ
ウムによる変性液で湿らせた濾紙３ＭＭ（住友化学製）
上に、５分間放置することにより、ファージ粒子とその
中に含まれる組換えＤＮＡを変性させた。

【００９９】次に、本ナイロン膜を、３Ｍ酢酸ナトリウ
ムによる中和液に浸した、前述の濾紙の上に５分間の
せ、中和した。

【０１００】本ナイロン膜を室温で３０分間風乾後、乾
燥器中で、８０℃１時間焼付けをおこなった。

【０１０１】実施例４のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片か
ら、実施例５の手法に従って、約５００塩基対のＤＮＡ
を得た。

【０１０２】この、２０ｎｇ相当を、ＰｓｔＩ、Ｓｍａ
Ｉでダブルダイジェスションした２０ｎｇのｐＵＣ１９
に、宝酒造製のライゲーションキットを用いて、説明書
に従い結合させ、これを１００μｌのコンピテントセル
ＪＭ８３に形質導入し、１０ｐｐｍのアンピシリンを含
むＬＢ培地５ｍｌで、３７℃１５時間振とう培養した。

【０１０３】この培養液から、実施例５の手法に従い、
プラスミドを抽出し、ＴＥ緩衝液２０μｌに再溶解し、
この２μｌをＨｉｎｄＩＩＩ３μｌ（３０００ユニッ
ト）で、反応緩衝液中３７℃３０分間インキュベイト
し、さらに、ＥｃｏＲＩ１μｌ（１０００ユニット）
で、３７℃３０分間インキュベイトした。

【０１０４】このうち１０μｌを０．８％アガロースゲ
ルで電気泳動し、約５００塩基対の断片を含むゲル２０
０ｍｇを切り出し、これに、０．１ユニットの agarase
０１０７を加え、３７℃で２時間インキュベイトし、１
５０００回転１５分間の遠心分離により、可溶成分と不
溶成分に分離し、可溶成分２００μｌから、前述したエ
タノール沈澱により、約５００塩基対のＤＮＡを沈澱さ
せ、これを１０μｌのＴＥ緩衝液に再溶解し、ランダム
プライマー（宝酒造製）２μｌを加え、９５℃３分間加
熱後、氷水中で５分間急速冷却し、ランダムプライマー
に添付されてきた使用説明書にしたがい、アルファー³²
Ｐ−デオキシＣＴＰ（ニューイングランドニュークリア
ーデュポン製）を使用して、放射性同位元素で標識され
た核酸プローブ２８μｌを作製した。

【０１０５】焼付けの終了したナイロン膜を５枚ずつハ
イブリバッグに入れ、６ｘＳＳＰＥ（モレキュラークロ
ーニング参照）、０．０５ｘＢＬＯＴＴＯ（モレキュラ
ークローニング参照）、０．１％ＳＤＳによる５０ｍｌ
のハイブリダイゼーション液を加え、前述のプローブ１
４μｌを加え、熱により、本バッグを密封した後、緩や
かに振とうしながら、６５℃１５時間ハイブリダイゼー
ションをおこなった後、ナイロン膜を本バッグより取り
出し、ポール社のナイロン膜洗浄手順書にしたがい、ナ
イロン膜を洗浄し、非特異的に吸着したプローブを取り
除き、膜を風乾後、バイオイメージアナライザー及び、
Ｘ線フィルム（富士フィルム製）を用いたオートラジオ
グラフィーにより、プローブと特異的にハイブリダイズ
した組換えＤＮＡを持つファージの存在する位置をプレ
ート上に同定した。

【０１０６】目的ファージをソフトアガーごと寒天培地
よりかきとり、１ｍｌの前述のファージ希釈液に懸濁し
た。

【０１０７】本ファージ懸濁液を１００００倍に希釈
し、前述の方法で宿主大腸菌Ｐ２３９２に感染させ、プ
レート上に塗沫し、全面溶菌させ、このプレートを４℃
で、２時間冷却し、その後、プレート上に５ｍｌの希釈
液を加え、３７℃で、緩やかに振とうしながら１時間イ
ンキュベイトし、上清約４．５ｍｌを回収し、５０００
回転で１５分間遠心分離し、その上清に、ＤＮａｓｅＩ
（宝酒造製）、ＲＮａｓｅＡ（ファルマシア製）をそれ
ぞれ１０ユニットずつ加え、３７℃で３０分間保温し
た。

【０１０８】次いで、４２％ポリエチレングリコール８
０００及び２Ｍ塩化ナトリウムによるファージ濃縮液を
加え撹はん後、氷水中で３時間放置した。

【０１０９】これを１５０００回転で１５分間遠心分離
し、ファージを沈澱させた。

【０１１０】本ファージを１ｍｌのファージ希釈液に懸
濁し、これを１５０００回転で１５分間遠心分離し、フ
ァージを沈澱させた。

【０１１１】上清を除去した後、本ファージを０．５ｍ
ｌのファージ希釈液に懸濁し、５μｌの１０％ＳＤＳを
加え、６８℃で５分間インキュベイトし、１０μｌの５
Ｍ塩化ナトリウムを加え、フェノール及びクロロホルム
を等量ずつ加え、水層を分取した。

【０１１２】これに、等量のイソプロピルアルコールを
加え、−２０℃で３０分間静置し、１５０００回転で１
５分間の遠心分離によりファージを沈澱させ、７０％の
エタノールでこの沈澱を洗い、真空乾燥装置で５分間乾
燥後、５０μｌのＴＥに溶解し、４℃で保存した。

【０１１３】

【実施例８】＊サザンハイブリダイゼーションによる遺伝子の同定

【０１１４】実施例７で得られた６種類の組換えファー
ジＤＮＡについて、常法により、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂａ
ｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩで切断後、ア
ガロースゲル電気泳動を行ない、これを、常法によりナ
イロン膜（日本ポール製）に転写後、実施例７の方法で
作製した放射標識されたプローブを用いて、ハイブリダ
イゼーションを行なった。

【０１１５】この結果、ひとつの組換えファージのＥｃ
ｏＲＩ、またはＫｐｎＩで切断された断片に少なくとも
遺伝子の一部が含まれていることが明らかとなり、これ
らの塩基配列を解析することとした。

【０１１６】

【実施例９】＊遺伝子の全塩基配列の解析

【０１１７】実施例８で得られた遺伝子の一部を含むＥ
ｃｏＲＩ、またはＫｐｎＩで切断された断片を、実施例
５に従いｐＵＣ１９に接続し、既に明らかとなっている
配列をもとに、プライマーを作製し、遺伝子歩行によ
り、その塩基配列を解析した。

【０１１８】その結果、配列番号１の配列に示される遺
伝子の全塩基配列が明らかになった。

【０１１９】

【実施例１０】＊agarase０１０７の一次構造

【０１２０】実施例９で得られた全塩基配列をもとに、
コドンの可能な組合せをすべて検討し、さらに、実施例
３で得られた agarase０１０７の部分アミノ酸配列を含
み、さらに、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって見積られた分子量が、 agarase０１０７の分子
量と著しく矛盾しないフレームを解析し、これにより配
列番号１に示される agarase０１０７の一次構造を明ら
かにした。

【０１２１】

【実施例１１】＊大腸菌でのagarase０１０７の新規製造方法

【０１２２】実施例１０で決定したagarase０１０７の
アミノ酸配列に対応する塩基配列からさらに上流の配列
番号１の配列の塩基番号１５６から始まる塩基配列ＡＡ
ＧＣＴＴを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで該遺伝子を切断
し、実施例５の手法に従い、これをプラスミドベクター
ｐＵＣ１９に接続した。

【０１２３】この組換えプラスミドを用いて、大腸菌Ｊ
Ｍ８３を形質転換した。

【０１２４】この形質転換菌１白金耳をＬＢ培地１００
０ｍｌに植菌し、３７℃で１７時間回転振とう培養し
た。

【０１２５】培養後、培養液を６０００回転１５分間の
遠心分離に供し、菌体を１６ｍｌの５０ｍＭトリス−Ｅ
ＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、これをフレンチ
プレスに供し、菌体が破砕された菌液を得た。

【０１２６】この菌液を７０００回転１５分間の遠心分
離に供し、上清を回収し、これに、硫酸アンモニウムを
４０％飽和となるように加え、４℃で１時間撹拌した
後、７０００回転１５分間の遠心分離に供し、上清を回
収し、これに、硫酸アンモニウムを９０％飽和となるよ
うに加え、４℃で３時間撹拌し、７０００回転１５分間
の遠心分離により沈澱を回収した。

【０１２７】この沈澱を１０ｍｌの２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）に再溶解し、この緩衝液１００
０ｍｌを外液として、３回透析を行なった後、モノキュ
ー（ファルマシア製）強陰イオン交換樹脂のカラムクロ
マトグラフィーにより該酵素を精製した。

【０１２８】

【実施例１２】＊ネオアガロオリゴ糖の生産

【０１２９】実施例１１で得られた酵素２０μｌと０．
２％アガロース８０μｌをマイクロチュウブ中で混合
し、３０℃の水浴中で一晩反応させ、その反応生成物の
うち、８μｌをブタノール：酢酸：水の混合比が、２：
１：１の展開溶媒で、薄層クロマトグラフィーによって
分離同定したところ、表１に示すように、ネオアガロオ
クタオース、ネオアガロヘキサオース、ネオアガロテト
ラオース、ネオアガロビオースなる、それぞれ８糖、６
糖、４糖、２糖のオリゴ糖が得られた。

【０１３０】

【表１】

【０１３１】

【発明の効果】

【０１３２】本発明によるアガラーゼは、従来の市販ア
ガラーゼよりも取り扱いが容易であり、さらに酵素精製
工程についても市販アガラーゼよりも簡便であり、低コ
ストで、多量のネオアガロオリゴ糖を工業的に生産する
ことに利用できる。

【０１３３】従って、本発明によれば、多量のネオアガ
ロオリゴ糖を工業的に生産することに利用できるアガラ
ーゼを得ることができ、該アガラーゼによって、寒天由
来のオリゴ糖、例えば、ネオアガロヘキサオース、ネオ
アガロテトラオース、ネオアガロビオース等のネオアガ
ロオリゴ糖を工業的に生産し、実際に、ネオアガロオリ
ゴ糖を、うどん、餅等の澱粉を用いた食品へ添加するこ
とによって、それらの食品の劣化を防ぐと共に、細菌の
増殖を抑制することが可能となる。

【０１３４】

【配列表】

【０１３５】配列番号：１配列の長さ：３２０５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源生物名：ビブリオスピーシーズ（Vibrio species）株名：JT0107 配列の特徴特徴を表す記号：-35 signal 存在位置：21..26 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：-10 signal 存在位置：42..47 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：121..180 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：181..3105 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：stem loop 存在位置：3116..3150 特徴を決定した方法：S

【０１３６】配列 TAAGAAATTC AACCAAGACG TTTACATGCT TCGTTACAAA AAATAATCGC AACAACGATT 60 TAGCACTCCT CAGTTAGGTG GGGAGTGCAA TCTGCTAGGT ACAAGGAATG GGCAGGAAAT 120 ATG AAG ATT AAA TTT TTA TCT GCA GCA ATT GCT GCA AGC TTA GCA TTG 168 Met Lys Ile Lys Phe Leu Ser Ala Ala Ile Ala Ala Ser Leu Ala Leu -20 -15 -10 -5 CCA TTA AGT GCT GCT ACT TTA GTC ACC TCT TTT GAG GAA GCC GAC TAC 216 Pro Leu Ser Ala Ala Thr Leu Val Thr Ser Phe Glu Glu Ala Asp Tyr 1 5 10 AGC AGC TCT GAA AAC AAT GCT GAA TTC TTG GAA GTG TCT GGA GAT GCC 264 Ser Ser Ser Glu Asn Asn Ala Glu Phe Leu Glu Val Ser Gly Asp Ala 15 20 25 ACT TCT GAA GTT TCA ACA GAA CAA GCC ACT GAT GGT AAT CAA TCG ATT 312 Thr Ser Glu Val Ser Thr Glu Gln Ala Thr Asp Gly Asn Gln Ser Ile 30 35 40 AAA GCG TCT TTT GAC GCG GCT TTC AAA CCA ATG GTT GTT TGG AAC TGG 360 Lys Ala Ser Phe Asp Ala Ala Phe Lys Pro Met Val Val Trp Asn Trp 45 50 55 60 GCA AGT TGG AAC TGG GGT GCT GAA GAT GTT ATG TCA GTA GAT GTT GTT 408 Ala Ser Trp Asn Trp Gly Ala Glu Asp Val Met Ser Val Asp Val Val 65 70 75 AAC CCT AAC GAC ACT GAC GTT ACC TTT GCT ATT AAG CTA ATC GAT AGT 456 Asn Pro Asn Asp Thr Asp Val Thr Phe Ala Ile Lys Leu Ile Asp Ser 80 85 90 GAT ATT CTT CCT GAT TGG GTA GAT GAG TCT CAA ACC TCA TTG GAC TAC 504 Asp Ile Leu Pro Asp Trp Val Asp Glu Ser Gln Thr Ser Leu Asp Tyr 95 100 105 TTT ACG GTT TCA GCT AAT ACC ACG CAG ACC TTT AGC TTT AAC TTA AAT 552 Phe Thr Val Ser Ala Asn Thr Thr Gln Thr Phe Ser Phe Asn Leu Asn 110 115 120 GGC GGC AAC GAG TTC CAA ACT CAT GGC GAA AAC TTT AGT AAA GAT AAA 600 Gly Gly Asn Glu Phe Gln Thr His Gly Glu Asn Phe Ser Lys Asp Lys 125 130 135 140 GTT ATC GGT GTG CAG TTC ATG CTC TCT GAA AAC GAT CCT CAA GTG TTG 648 Val Ile Gly Val Gln Phe Met Leu Ser Glu Asn Asp Pro Gln Val Leu 145 150 155 TAC TTT GAC AAC ATT ATG GTT GAT GGC GAA ACA GTC ACT CCG CCA CCA 696 Tyr Phe Asp Asn Ile Met Val Asp Gly Glu Thr Val Thr Pro Pro Pro 160 165 170 AGT GAT GGT GCA GTG AAT ACA CAA ACC GCG CCT GTA GCC ACC TTA GCG 744 Ser Asp Gly Ala Val Asn Thr Gln Thr Ala Pro Val Ala Thr Leu Ala 175 180 185 CAA ATC GAA GAC TTT GAA ACC ATT CCA GAT TAC TTA CGA CCT GAT GGT 792 Gln Ile Glu Asp Phe Glu Thr Ile Pro Asp Tyr Leu Arg Pro Asp Gly 190 195 200 GGG GTA AAC GTT TCA ACT ACT ACT GAG ATT GTG ACT AAA GGC GCT GCA 840 Gly Val Asn Val Ser Thr Thr Thr Glu Ile Val Thr Lys Gly Ala Ala 205 210 215 220 GCA ATG GCT GCC GAG TTT ACT GCA GGT TGG AAC GGT TTA GTG TTT GCA 888 Ala Met Ala Ala Glu Phe Thr Ala Gly Trp Asn Gly Leu Val Phe Ala 225 230 235 GGT ACT TGG AAT TGG GCT GAA CTA GGT GAA CAC ACC GCA GTT GCC GTT 936 Gly Thr Trp Asn Trp Ala Glu Leu Gly Glu His Thr Ala Val Ala Val 240 245 250 GAC GTT TCA AAT AAT AGC GAT AGC AAT ATC TGG TTG TAC TCA CGT ATC 984 Asp Val Ser Asn Asn Ser Asp Ser Asn Ile Trp Leu Tyr Ser Arg Ile 255 260 265 GAA GAT GTA AAT AGC CAA GGC GAA ACA GCG ACT CGC GGC GTA TTG GTT 1032 Glu Asp Val Asn Ser Gln Gly Glu Thr Ala Thr Arg Gly Val Leu Val 270 275 280 AAA GCT GGC GAA TCG AAA ACC ATC TAC ACC AGC TTA AAT GAC AAC CCT 1080 Lys Ala Gly Glu Ser Lys Thr Ile Tyr Thr Ser Leu Asn Asp Asn Pro 285 290 295 300 TCA TTG CTT ACT CAA GAT GAG CGT GTG TCA GCT TTA GGT TTG CGT GAT 1128 Ser Leu Leu Thr Gln Asp Glu Arg Val Ser Ala Leu Gly Leu Arg Asp 305 310 315 ATT CCG GCA GAC CCA ATG AGC GCC CAA AAC GGC TGG GGT GAT TTT GTT 1176 Ile Pro Ala Asp Pro Met Ser Ala Gln Asn Gly Trp Gly Asp Phe Val 320 325 330 GCT TTA GAC AAA TCT CAA ATT ACC GCT ATT CGT TAC TTC ATT GGC GAA 1224 Ala Leu Asp Lys Ser Gln Ile Thr Ala Ile Arg Tyr Phe Ile Gly Glu 335 340 345 TTA GCC AGC GGT GAG ACT AGC CAA ACA CTT GTG TTT GAT AAC ATG CGT 1272 Leu Ala Ser Gly Glu Thr Ser Gln Thr Leu Val Phe Asp Asn Met Arg 350 355 360 GTG ATT AAA GAC CTT AAC CAC GAA TCA GCC TAT GCA GAA ATG ACT GAT 1320 Val Ile Lys Asp Leu Asn His Glu Ser Ala Tyr Ala Glu Met Thr Asp 365 370 375 380 GCT ATG GGG CAA AAC AAC TTA GTC ACT TAT GCA GGT AAA GTT GCC AGC 1368 Ala Met Gly Gln Asn Asn Leu Val Thr Tyr Ala Gly Lys Val Ala Ser 385 390 395 AAA GAA GAG TTA GCT AAG TTA AGT GAT CCG GAA ATG GCT GCT TTG GGT 1416 Lys Glu Glu Leu Ala Lys Leu Ser Asp Pro Glu Met Ala Ala Leu Gly 400 405 410 GAG TTA ACC AAC CGC AAT ATG TAC GGT GGT AAC CCA GAT TCG TCA CCA 1464 Glu Leu Thr Asn Arg Asn Met Tyr Gly Gly Asn Pro Asp Ser Ser Pro 415 420 425 GCT ACA GAC TGT GTG CTA GCT ACG CCT GCC TCG TTT AAC GCT TGT AAA 1512 Ala Thr Asp Cys Val Leu Ala Thr Pro Ala Ser Phe Asn Ala Cys Lys 430 435 440 GAC GCT GAT GGT AAC TGG CAA TTG GTA GAC CCA GCA GGT AAT GCG TTC 1560 Asp Ala Asp Gly Asn Trp Gln Leu Val Asp Pro Ala Gly Asn Ala Phe 445 450 455 460 TTC TCA ACC GGT GTT GAT AAC ATT CGT TTG CAA GAT ACT TAC ACC ATG 1608 Phe Ser Thr Gly Val Asp Asn Ile Arg Leu Gln Asp Thr Tyr Thr Met 465 470 475 ACC GGC GTG TCG AGT GAC GCC GAA TCT GAG TCT GCA CTT CGC CAG TCA 1656 Thr Gly Val Ser Ser Asp Ala Glu Ser Glu Ser Ala Leu Arg Gln Ser 480 485 490 ATG TTT ACA GAA ATT CCA AGT GAT TAT GTA AAT GAA AAC TAT GGC CCT 1704 Met Phe Thr Glu Ile Pro Ser Asp Tyr Val Asn Glu Asn Tyr Gly Pro 495 500 505 GTG CAT AGT GGA CCT GTT TCT CAA GGC CAA GCT GTA AGT TTT TAC GCT 1752 Val His Ser Gly Pro Val Ser Gln Gly Gln Ala Val Ser Phe Tyr Ala 510 515 520 AAT AAC TTA ATT ACC CGC CAC GCT AGC GAA GAC GTA TGG CGA GAC ATT 1800 Asn Asn Leu Ile Thr Arg His Ala Ser Glu Asp Val Trp Arg Asp Ile 525 530 535 540 ACT GTT AAG CGC ATG AAA GAC TGG GGC TTT AAC ACC TTA GGT AAC TGG 1848 Thr Val Lys Arg Met Lys Asp Trp Gly Phe Asn Thr Leu Gly Asn Trp 545 550 555 ACC GAT CCT GCG TTG TAT GCA AAC GGT GAC GTT CCT TAC GTG GCA AAT 1896 Thr Asp Pro Ala Leu Tyr Ala Asn Gly Asp Val Pro Tyr Val Ala Asn 560 565 570 GGT TGG TCA ACC TCT GGT GCC GAT CGT CTT CCA GTT AAA CAA ATT GGC 1944 Gly Trp Ser Thr Ser Gly Ala Asp Arg Leu Pro Val Lys Gln Ile Gly 575 580 585 AGC GGC TAC TGG GGA CCA CTT CCT GAT CCG TGG GAT GCT AAC TTT GCT 1992 Ser Gly Tyr Trp Gly Pro Leu Pro Asp Pro Trp Asp Ala Asn Phe Ala 590 595 600 ACC AAT GCC GCC ACA ATG GCT GCA GAG ATC AAA GCT CAG GTT GAA GGC 2040 Thr Asn Ala Ala Thr Met Ala Ala Glu Ile Lys Ala Gln Val Glu Gly 605 610 615 620 AAC GAA GAG TAC TTA GTG GGT ATT TTT GTT GAT AAC GAA ATG AGC TGG 2088 Asn Glu Glu Tyr Leu Val Gly Ile Phe Val Asp Asn Glu Met Ser Trp 625 630 635 GGC AAT GTC ACT GAT GTT GAA GGC TCT CGT TAT GCG CAA ACG CTA GCG 2136 Gly Asn Val Thr Asp Val Glu Gly Ser Arg Tyr Ala Gln Thr Leu Ala 640 645 650 GTG TTC AAT ACC GAC GGT ACT GAT GCA ACA ACT AGC CCT GCT AAA AAT 2184 Val Phe Asn Thr Asp Gly Thr Asp Ala Thr Thr Ser Pro Ala Lys Asn 655 660 665 AGC TTT ATT TGG TTC TTA GAA AAC CAG CGT TAT ACC GGT GGC ATT GCT 2232 Ser Phe Ile Trp Phe Leu Glu Asn Gln Arg Tyr Thr Gly Gly Ile Ala 670 675 680 GAC CTA AAC GCA GCC TGG GGA ACC GAT TAT GCG TCT TGG GAT GCG ACG 2280 Asp Leu Asn Ala Ala Trp Gly Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Asp Ala Thr 685 690 695 700 TCG CCA GCG CAA GAG TTA GCT TAT GTG GCT GGC ATG GAA GCT GAT ATG 2328 Ser Pro Ala Gln Glu Leu Ala Tyr Val Ala Gly Met Glu Ala Asp Met 705 710 715 CAG TTC CTT GCT TGG CAG TTT GCT TTC CAG TAC TTC AAC ACC GTA AAC 2376 Gln Phe Leu Ala Trp Gln Phe Ala Phe Gln Tyr Phe Asn Thr Val Asn 720 725 730 ACA GCA TTA AAA GCT GAG TTA CCA AAC CAC TTG TAC TTG GGC TCT CGC 2424 Thr Ala Leu Lys Ala Glu Leu Pro Asn His Leu Tyr Leu Gly Ser Arg 735 740 745 TTT GCA GAT TGG GGA CGT ACT CCT GAT GTA GTA AGT GCT GCT GCG GCT 2472 Phe Ala Asp Trp Gly Arg Thr Pro Asp Val Val Ser Ala Ala Ala Ala 750 755 760 GTT GTT GAT GTA ATG AGC TAC AAC ATC TAC AAA GAC AGC ATT GCA GCT 2520 Val Val Asp Val Met Ser Tyr Asn Ile Tyr Lys Asp Ser Ile Ala Ala 765 770 775 780 GCC GAT TGG GAT GCT GAT GCC TTA AGT CAA ATC GAA GCC ATT GAT AAG 2568 Ala Asp Trp Asp Ala Asp Ala Leu Ser Gln Ile Glu Ala Ile Asp Lys 785 790 795 CCG GTA ATT ATT GGC GAG TTC CAC TTC GGT GCG CTT GAT AGT GGT TCG 2616 Pro Val Ile Ile Gly Glu Phe His Phe Gly Ala Leu Asp Ser Gly Ser 800 805 810 TTT GCA GAA GGT GTA GTA AAT GCC ACT TCG CAA CAA GAT CGT GCA GAC 2664 Phe Ala Glu Gly Val Val Asn Ala Thr Ser Gln Gln Asp Arg Ala Asp 815 820 825 AAA ATG GTT AGC TTT TAC GAA TCA GTA AAT GCC CAT AAA AAC TTT GTA 2712 Lys Met Val Ser Phe Tyr Glu Ser Val Asn Ala His Lys Asn Phe Val 830 835 840 GGT GCG CAT TGG TTC CAA TAC ATC GAT TCA CCA TTA ACG GGT CGT GCA 2760 Gly Ala His Trp Phe Gln Tyr Ile Asp Ser Pro Leu Thr Gly Arg Ala 845 850 855 860 TGG GAT GGC GAA AAC TAC AAC GTT GGT TTT GTT AGC AAT ACT GAC ACG 2808 Trp Asp Gly Glu Asn Tyr Asn Val Gly Phe Val Ser Asn Thr Asp Thr 865 870 875 CCA TAT ACA TTG ATG ACA GAT GCT GCG CGT GAG TTT AAC TGT GGC ATG 2856 Pro Tyr Thr Leu Met Thr Asp Ala Ala Arg Glu Phe Asn Cys Gly Met 880 885 890 TAC GGC ACT GAC TGC TCT AGC TTA AGC AAT GCT ACT GAA GCT GCT TCG 2904 Tyr Gly Thr Asp Cys Ser Ser Leu Ser Asn Ala Thr Glu Ala Ala Ser 895 900 905 AGA GCG GGT GAG TTG TAT ACC GGT ACC AAT ATT GGT GTT AGC CAC TCT 2952 Arg Ala Gly Glu Leu Tyr Thr Gly Thr Asn Ile Gly Val Ser His Ser 910 915 920 GGC CCA GAA GCG CCA GAT CCA GGT GAG CCA GTA GAT CCA CCA ATT GAT 3000 Gly Pro Glu Ala Pro Asp Pro Gly Glu Pro Val Asp Pro Pro Ile Asp 925 930 935 940 CCG CCA ACA CCA CCA ACG GGT GGC GTA ACT GGC GGT GGC GGT AGC GCA 3048 Pro Pro Thr Pro Pro Thr Gly Gly Val Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ala 945 950 955 GGT TGG TTA TCG CTA CTA GGT TTG GCC GGC GTA TTT TTA CTA AGA CGT 3096 Gly Trp Leu Ser Leu Leu Gly Leu Ala Gly Val Phe Leu Leu Arg Arg 960 965 970 CGT AAA GTG TAAGGACTGT GCCGCCTCGT AAATTAAGTT GTATTGCGAG 3145 Arg Lys Val 975 GCGGCCTTTT TATTTTCAGG AAGAAATATG AAGTATCTAT ATATTGTCCG CGGGCCATTT 3205

【０１３７】配列番号：２配列の長さ：４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１３８】配列番号：３配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１３９】配列番号：４配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Ile Glu Asp Val Asn Ser Xaa Gly Glu Thr Ala Thr Arg 1 5 10

【０１４０】配列番号：５配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１４１】配列番号：６配列の長さ：９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１４２】配列番号：７配列の長さ：１６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Ser Leu Asn Asp Asn Pro Ser Leu Leu Thr Gln Asp Glu Arg Val Ser 1 5 10 15

【０１４３】配列番号：８配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１４４】配列番号：９配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント

【０１４５】配列番号：１０配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Asn Met Tyr Gly Gly Asn Pro Asp Ser Ser Pro Ala Thr 1 5 10

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:20） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１のアミノ酸配列中、
１〜９７５で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝
子。
【請求項２】配列表の配列番号１の塩基配列中、１〜
３２０５の塩基配列で示される遺伝子。