JPH06284890A - メロンプロテアーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 メロンプロテアーゼをコードするＤＮＡを取
得し、メロンプロテアーゼを微生物で生産させる。 【構成】 成長期のメロン果実より調製したｍＲＮＡを
用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリ
ーからメロンプロテアーゼｃＤＮＡを単離し、塩基配列
を決定した。さらに、このｃＤＮＡを有する発現型プラ
スミドを作製し、大腸菌の形質転換株を得、これを培養
することによりメロンプロテアーゼを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、メロンプロテアーゼを
コードするＤＮＡ、このＤＮＡを組み込んだプラスミ
ド、該プラスミドが導入された形質転換体、およびメロ
ンプロテアーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物の果実には、その生理的意義は不明
であるが、プロテアーゼが多量に存在するものが知られ
ている。

【０００３】これらのうち、チオールプロテアーゼ、例
えばパパイヤ由来のパパイン、パイナップル由来のブロ
メライン、イチジク由来のフィシン、キウイ由来のアク
チニジンなどについては古くから多くの研究がなされて
おり、植物酵素の中でも物理化学的、酵素化学的性質や
構造などがよく解析された酵素である（Brocklehurst,
K. et al. In Hydrolytic Enzymes, Neuberger, A. and
Brocklehurst, K.(Eds.), Chapter 2, p.39-158, Else
vier, Amsterdam (1987)）。

【０００４】またこれらの酵素は応用面でも、食肉の軟
化、ビールや清酒の混濁防止、クラッカーやビスケット
の製造などの食品加工用、および消化剤、消炎剤などの
医薬用に広く用いられている（小巻利章著、酵素応用の
知識、６章、および９章、幸書房、東京(1986)）。

【０００５】これに対して植物起源のセリンプロテアー
ゼに関する研究は少ないが、メロン果実中にはユニーク
な耐熱性のアルカリ性セリンプロテアーゼが大量に存在
していることが知られている。中でもプリンスメロンに
存在する酵素はククミシン（cucumisin）と命名され（K
aneda, M. et al., J. Biochem. 78, 1287-1296 (197
5)）、研究用試薬として市販されている。

【０００６】ククミシンは広い基質特異性を有し、特に
Asp, Glu, Lys, Argなどの荷電アミノ酸残基のカルボキ
シル末端側を優先的に加水分解する（Kaneda, M. et a
l., Agric. Biol. Chem. 50 1975〜1076 (1986)）。ま
た、アミノ酸配列の一部などについても若干明らかにさ
れている。さらに、活性残基の一つであるSerの周辺
は、枯草菌由来のセリンプロテアーゼであるサチライシ
ン（subtilisin）と相同性が高いことも示されている
（Kaneda, M. et al. J. Biochem. 95, 825-829 (198
4)）。しかしながら、詳細な基質特異性や一次構造は知
られていない。

【０００７】一方、ウリ科植物からはいくつかのククミ
シン様セリンプロテアーゼが既に報告されており、ハニ
デュメロン、カラスウリからカゼイン分解活性を指標と
してプロテアーゼが精製されている（Kaneda, M. et a
l. J. Biochem. 99, 569-577(1986)）。

【０００８】マスクメロンでも同様にククミシン様セリ
ンプロテアーゼの存在が知られており、受粉後の時期の
異なる果実について組織別にカゼイン分解活性を測定し
た結果、果実のネット形成期までの成長初期に合成さ
れ、完熟まで量的に変化せず、果芯部の果汁中に蓄積す
ることがわかっている。また、組織のブロッティング分
析により、このプロテアーゼの合成部位は種子に接した
周囲の組織と考えられている。

【０００９】さらに、受粉後１０日前後の種子を包む袋
状組織は、その外側の組織と比べて強いアミノ酸取り込
み活性を有しており、この組織が前記プロテアーゼの合
成部位である可能性が示唆されている。さらに別の実験
より前駆体の存在も示唆されている。このように果汁へ
の蓄積と前駆体が存在することから、この酵素は分泌酵
素であると推察されており、分子量67kdの成熟酵素は果
実の成長後期に果汁中で分子量54kdのメロンプロテアー
ゼに限定自己消化していると考えられている（Yamagat
a, H. et al. Agric. Biol. Chem. 53, 1009-1017 (198
9)）。尚、本明細書においては、このマスクメロン由来
のククミシン様セリンプロテアーゼを「メロンプロテア
ーゼ」という。

【００１０】ククミシンを含め、メロン由来のククミシ
ン様プロテアーゼは耐熱性のアルカリプロテアーゼであ
り、応用面でのメリットが多く、また果実由来であるの
で安全性も高いと考えられ、食品、ファイン関連への利
用が期待される。また、上記のように、動物由来のセリ
ンプロテアーゼよりも、微生物のサチライシンファミリ
ーのセリンプロテアーゼと進化学的に類縁関係にあるこ
とから、本酵素の分子進化上の位置づけをめざしたり、
本酵素の前駆体のプロセッシング機構をタンパク工学的
手法により解析することは非常に興味深い。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来メ
ロン由来のプロテアーゼはメロンから抽出されており、
製造コストや量産性にも限界がある。従って、工業用に
利用する為には、遺伝子工学的手法を用いた生産量の増
大が不可欠である。また、用途をさらに拡大するために
タンパク工学的手法による酵素の機能の改変を行うため
には、本酵素の遺伝子を取得し、微生物などの宿主を用
いた大量生産系を確立することが必要となる。

【００１２】本発明は、かかる観点からなされたもので
あり、微生物を用いたメロンプロテアーゼの生産系を確
立することを目的とし、そのためにメロンプロテアーゼ
をコードするＤＮＡを取得し、このＤＮＡを組み込んだ
プラスミドを作製し、このプラスミドを保持する形質転
換体を得ることを課題とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、成長期のメロン果
実果芯部より調製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、
このｃＤＮＡライブラリーからメロンプロテアーゼ全長
をコードするｃＤＮＡクローンを単離し、これを発現ベ
クターに組み込み、メロンプロテアーゼを生産する形質
転換体を得ることに成功し、本発明に至った。

【００１４】すなわち本発明は、メロンプロテアーゼを
コードするＤＮＡ、メロンプロテアーゼ前駆体をコード
するＤＮＡである。また、本発明は、メロンプロテアー
ゼをコードするＤＮＡと、エシェリキアコリ（大腸菌）
で発現可能なプロモーターとを有する大腸菌で複製可能
なプラスミド、及びこのプラスミドを保持する大腸菌形
質転換体、さらには、この形質転換体を培養し、菌体か
らメロンプロテアーゼを回収することを特徴とするメロ
ンプロテアーゼの製造法を提供する。

【００１５】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１６】 ＜１＞メロンプロテアーゼをコードするＤＮＡ 本発明のメロンプロテアーゼをコードするＤＮＡは、例
えば、マスクメロンから染色体ライブラリーを作製し、
このライブラリーからオリゴヌクレオチドプローブある
いは抗体を用いてスクリーニングすることにより得られ
る。

【００１７】しかし、植物遺伝子にはイントロンが多数
存在するものが多いので、発現を目的とするにはｃＤＮ
Ａを取得することが好ましい。ｃＤＮＡライブラリーは
通常の方法で作製すればよいが、ｃＤＮＡ合成の鋳型と
なるｍＲＮＡは、メロンプロテアーゼが合成、蓄積され
る、果実のネット形成期までの成長初期の種子に接した
周囲の組織から調製するのが好ましい。

【００１８】ｃＤＮＡライブラリーからメロンプロテア
ーゼｃＤＮＡを選択するには、上述したようにオリゴヌ
クレオチドプローブを用いてもよいが、メロンプロテア
ーゼの一次構造はごく一部しか知られておらず、植物に
は類似遺伝子が存在する場合が多いので、メロンプロテ
アーゼに対する抗体を用いたスクリーニングが好まし
い。例えば、ｃＤＮＡライブラリーをλgt11のような発
現型ベクターを用いて作製すると、シャーレに形成させ
たファージのプラークをフィルターに移し取り、酵素結
合２次抗体を用いてスクリーニングすることができる。
得られたｃＤＮＡがコード領域全長に満たない場合は、
複数の部分ｃＤＮＡを連結することにより、全長に相当
する配列を得ることができる。

【００１９】このようにして得られたメロンプロテアー
ゼｃＤＮＡの塩基配列及びこの配列から予想されるアミ
ノ酸配列を配列表配列番号１に示す。尚、精製されたメ
ロンプロテアーゼタンパクから決定したＮ末端アミノ酸
配列（配列番号２）から、メロンプロテアーゼは前駆体
として合成される分泌タンパクであり、配列番号１にお
いてアミノ酸番号−１１０〜−１がプロペプチド及びシ
グナルペプチドであることが示唆された。

【００２０】本発明において、メロンプロテアーゼをコ
ードするＤＮＡとは、少なくともメロンプロテアーゼ成
熟タンパク（アミノ酸番号１〜６７１）をコードする部
分を含むという意味であり、プロペプチド及びシグナル
ペプチドあるいはこれらの一部を有するメロンプロテア
ーゼ前駆体をコードするＤＮＡも含まれる。また、配列
番号１の塩基配列は、メロンプロテアーゼをコードする
配列の例示であり、この配列中のコドンを等価のコドン
に置き換えた配列も、メロンプロテアーゼをコードする
ＤＮＡに含まれる。

【００２１】また、メロンプロテアーゼ成熟タンパクあ
るいはメロンプロテアーゼ前駆体をコードするＤＮＡに
加えて、メロンプロテアーゼ成熟タンパクあるいはプロ
ペプチド及びシグナルペプチドの一部又は全部を含む前
駆体をコードするＤＮＡと他のペプチドあるいはタンパ
クをコードするＤＮＡとを連結したもの、すなわちメロ
ンプロテアーゼ融合タンパクをコードするＤＮＡも、同
様に以下の発明に使用することができる。

【００２２】＜２＞メロンプロテアーゼをコードするＤ
ＮＡを発現するプラスミド及び形質転換体 メロンプロテアーゼをコードするＤＮＡを発現するプラ
スミドは、メロンプロテアーゼをコードするＤＮＡの
５’末端側にプロモーターを連結したものを、ベクター
に挿入するすることにより得られる。

【００２３】プロモーター、あるいはベクターの種類
は、使用する宿主に併せて適宜選択する。以下に、宿主
に大腸菌を使用する場合について説明する。プロモータ
ーとしては、通常大腸菌における異種タンパク生産に用
いられるプロモーターを使用することができる。例え
ば、T7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモータ
ー、tacプロモーター、PLプロモーター等が挙げられ
る。

【００２４】また、ベクターとしては、いわゆるマルチ
コピー型のものが好ましく、Col E1由来の複製開始点を
有するプラスミド、例えばpUC系のプラスミドやpBR322
あるいはその誘導体が挙げられる。また、形質転換体を
選別するために、アンピシリン耐性遺伝子等のマーカー
を有することが好ましい。

【００２５】このようなプラスミドとして、強力なプロ
モーターを持つ発現ベクターが市販されており（pGEMEX
-1（プロメガ社製）、pUC系（宝酒造（株）等）、pPROK
系（クロンテック製）、pKK233-2（クロンテック製）ほ
か）、本発明に使用することができる。

【００２６】また、生産量を増大させるためには、メロ
ンプロテアーゼをコードするＤＮＡの下流に転写終結配
列であるターミネーターを連結することが好ましい。こ
のターミネーターとしては、T7ターミネーター、fdファ
ージターミネーター、T4ターミネーター、テトラサイク
リン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌trpA遺伝子の
ターミネーター等が挙げられる。

【００２７】上記ベクターに、プロモーター、メロンプ
ロテアーゼをコードするＤＮＡ、ターミネーターの順に
連結したＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドで大腸菌を
形質転換すると、メロンプロテアーゼを生産する形質転
換体が得られる。

【００２８】後述の実施例で説明するメロンプロテアー
ゼ融合タンパク発現型プラスミドpGEMSP1（図１）を保
持する大腸菌JM109(DE3)は、AJ12749と命名され、工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１３１３５
号として寄託されている。

【００２９】尚、pGEMSP1は、メロンプロテアーゼのＮ
末端側にT7ファージのカプシドタンパクの一部が連結し
た融合タンパクを発現するプラスミドであるが、プロモ
ーターに直接メロンプロテアーゼをコードするＤＮＡを
連結すればメロンプロテアーゼを単独で発現する。

【００３０】＜３＞メロンプロテアーゼの製造法 メロンプロテアーゼをコードするＤＮＡを発現するプラ
スミドによる形質転換体、例えば、前記AJ12749を培養
すると、菌体中にメロンプロテアーゼが生産される。培
養は、前培養を行った後、本培養においてプロモーター
が誘導される条件で行うのが好ましい。

【００３１】メロンプロテアーゼ前駆体をコードするＤ
ＮＡを使用し、上記と同様にプラスミド、形質転換体を
作製すると、メロンプロテアーゼ前駆体を製造すること
ができる。

【００３２】

【実施例】以下、本発明の実施例を説明する。

【００３３】

【実施例１】（メロンプロテアーゼをコードするＤＮＡ
の取得） 受粉後１０日目のマスクメロン（Cucumis melo L. cv.
Earls Favourite）の果芯部200gを細断し、液体窒素中
で凍結し、乳鉢と乳棒で粉砕した。この試料を、予め65
℃に加温しておいた40mlのグアニジウム溶液（4.5Mグア
ジニウムイソチオシアネート、0.25M Tris-HCl pH7.5、
50mM EDTA-2Na pH8.0、50mM メルカプトエタノール水溶
液）に、85.08gのグアニジウムイソチオシアネートと共
に加え、ヒスコトロン（日音医理科器機製作所）で懸濁
した。

【００３４】懸濁液を滅菌ガーゼで濾過した後、12℃で
10分間、10,000rpmで遠心分離し、上清200mlに20mlの20
% N-ラウロイルザルコシンナトリウム水溶液を加え、65
℃で２分間保温した。これにCsCl 22gを加えて溶解した
後、遠心チューブ（日立40PAシールチューブ）中の15ml
の7.5M CsCl溶液に重層し、超遠心分離（日立工機55P-7
2, RP50-2-892 ローター,36,000rpm,18℃,20時間）に供
した。得られたＲＮＡ沈澱はジエチルピロカーボネート
処理した5mM EDTA-2Na pH8.0、0.5%N-ラウロイルザルコ
シンナトリウム水溶液に溶解し、常法に従ってエタノー
ル沈澱処理を行い全ＲＮＡ沈澱を得た。

【００３５】この全ＲＮＡ沈澱を、10mM Tris-HCl pH7.
5,0.5M NaCl,0.5% SDS水溶液に溶解し、常法に従ってオ
リゴｄＴセルロースカラムを用いたクロマトグラフィー
でpoly(A)⁺ＲＮＡを回収し、これをｍＲＮＡ画分とし
た。このｍＲＮＡを鋳型とし、ファルマシア社製のｃＤ
ＮＡ合成キットを用い、キット添付の説明書に従ってｃ
ＤＮＡを作製した。得られたｃＤＮＡにEcoRIアダプタ
ーを付加した後、λgt11ベクターに組み込み、ｃＤＮＡ
ライブラリーを構築した。尚、λgt11は、クローニング
部位の上流にlacプロモーターを有しているので、isopr
opyl-β-D-thio-galactopyranoside(IPTG)で誘導するこ
とによりクローニング断片を発現させることができる。

【００３６】ライブラリーからのメロンプロテアーゼｃ
ＤＮＡの検索は、抗体を用いた免疫スクリーニングによ
り行った。抗体は、67kDメロンプロテアーゼ（Yamagat
a, H., et al. Agirc. Biol. Chem. 53, 1009-1017 (19
89)）でウサギを免疫し、得られた抗体から常法により
精製し、さらにアフィニティー精製を行ったものを用い
た。

【００３７】上記ライブラリーのファージと大腸菌Y109
0R^-を軟寒天培地に懸濁し、シャーレ中の寒天培地上に
重層した。４２℃で４時間培養後、10mM IPTGを染み込
ませたニトロセルロースフィルターをこの寒天培地上に
載せ、さらに４２℃で一晩、４℃で１時間培養を行っ
た。このフィルターを培地からはがし、ＴＢＳＴ（20mM
Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 0.05%(V/V) Tween 20）
で洗滌後、ブロッキング溶液（１％スキムミルク、20mM
Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 0.02%(V/V) NaN₃）、
一次抗体（抗メロンプロテアーゼ抗体）、二次抗体（ア
ルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ウサギIgG抗体：TAG
O Inc.製）を含む溶液に順次浸した後、5-bromo-4-chlo
ro-3-indolyl-phosphate及びNitroblue tetrazoliumを
含む発色溶液に浸し、発色させた。フィルター上のポジ
ティブスポットの位置に対応するプラークからファージ
を回収した。

【００３８】こうして５つの陽性クローンが得られた。
これらの挿入断片をプローブとしてpoly(A)⁺ＲＮＡのノ
ーザンハイブリダイゼイション分析を行ったところ、挿
入断片よりも分子量の大きい箇所（2.9kbp）でハイブリ
ダイズするバンドが確認され、前記陽性クローンは不完
全長ｃＤＮＡを保持していることが示唆された。そこで
クローンの１つの挿入断片を用いて前記ｃＤＮＡライブ
ラリーをプラークハイブリダイゼイション法でスクリー
ニングした結果、ほぼ完全長ｃＤＮＡを挿入断片として
保持するクローンλMSP177が得られ、この塩基配列を常
法に従いダイデオキシ法で決定した。この塩基配列と、
塩基配列から予想されるアミノ酸配列を、配列表の配列
番号１に示した。

【００３９】一方、メロンプロテアーゼのＮ末端のアミ
ノ酸配列をＤＡＢＩＴＣ法（蛋白質・核酸・酵素 29巻
374頁 1984年）によって決定したところ、配列番号２
に示した配列が得られた。この配列は、上記メロンプロ
テアーゼｃＤＮＡから予想されるアミノ酸配列のＮ末端
部分の途中（配列番号１中アミノ酸番号１〜１１）に見
出された。このことから、メロンプロテアーゼはプロペ
プチド及びシグナルペプチド（配列番号１中アミノ酸番
号−１１０〜−１に相当）を有する前駆体タンパクとし
て生産され、その後プロセシングされて成熟酵素（配列
番号１中アミノ酸番号１〜６２１に相当）となることが
示唆された。

【００４０】クローンλMSP177の挿入配列を、EcoRIア
ダプター内に存在する制限酵素NotI認識部位で切り出
し、プラスミドベクターpBluescriptII KS-（STRATAGEN
E社製）のNotI認識部位に組み込み、プラスミドpBSMSP1
を得た。

【００４１】

【実施例２】（メロンプロテアーゼをコードするＤＮＡ
の大腸菌における発現） 前記プラスミドpBSMSP1を制限酵素 HindIIIで切断する
と2.6kbpのＤＮＡ断片が切り出される。この断片には、
配列表の配列番号１に示された配列のうち5'末端から43
番目の塩基以降の配列が含まれているが、この43番目の
塩基は、成熟酵素のＮ末端アミノ酸に相当するＤＮＡ塩
基配列（配列番号１中塩基番号３５２）よりも上流側に
位置している。よって、この2.6kbp断片はメロンプロテ
アーゼをコードするＤＮＡ全長を含むものと考えられ
る。

【００４２】上記2.6kbp断片を、大腸菌の発現ベクター
pGEMEX-1（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）のHindIII認識部位に
組み込み、pGEMSP1と命名した（図１）。ベクターpGEME
X-1は、T7 gene 10（T7ファージのカプシドタンパクを
コードする）を有し、このT7 gene 10のコード領域とタ
ーミネーターとの間のマルチクローニング部位にHindII
I部位が存在する。したがって、pGEMSP1は、T7ファージ
のカプシドタンパクの一部とメロンプロテアーゼとの融
合タンパク（予想分子量約100kD）をコードする（図
１）。

【００４３】pGEMSP1を大腸菌JM109(DE3)に導入し、AJ1
2749を得た。大腸菌JM109(DE3)は、IPTGの存在下でT7プ
ロモーターを誘導することができるので、AJ12749は、I
PTGにより、T7ファージのカプシドタンパクの一部とメ
ロンプロテアーゼとの融合タンパクの発現が誘導され
る。AJ12749は、工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第１３１３５号として寄託した。

【００４４】AJ12749を、100mg/lアンピシリンを含むＬ
Ｂ培地（T. Maniatis, et al., Molecular Cloning, 3,
A. 1 (1989)）にて37℃で培養し、OD₆₁₀が0.5程度の時
点で0.5mM IPTGを添加し、さらに３時間培養した後に集
菌した。全菌体タンパクをＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルで電気泳動し、常法によりウェスタンブロッティン
グを行い、上記と同様にウサギ抗メロンプロテアーゼ抗
体等を用いて発色反応を行ったところ、融合タンパクの
予想される分子量の位置にバンドが確認された。一方、
プラスミドを保持しない宿主大腸菌、あるいは非誘導の
AJ12749で同様にウェスタン分析を行ったが、バンドは
認められなかった。

【００４５】

【発明の効果】本発明により、メロンプロテアーゼをコ
ードするＤＮＡ、これを発現するプラスミド、このプラ
スミドを保持する形質転換体が得られた。また、この形
質転換体を培養することにより、メロンプロテアーゼを
製造することができる。本発明は、食品・ファインケミ
カル分野においてメロンプロテアーゼをより容易に利用
することを可能ならしめるものである。

【００４６】

【配列表】

【００４７】配列番号：1 配列の長さ：2552 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Cucumis melo L. 組織の種類：受粉後１０日目の果実果芯部 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：22..2214 特徴を決定した方法：P 特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：22..351 特徴を決定した方法：P 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：352..2214 特徴を決定した方法：S 配列 CTGATAGCAA AAAGCACTAC T ATG TCT TCT TCT CTA ATC TTC AAG CTT TTC 51 Met Ser Ser Ser Leu Ile Phe Lys Leu Phe -110 -105 TTT TTT AGT CTT TTC TTC AGT AAT CGA CTC GCT TCT AGA TTG GAT TCT 99 Phe Phe Ser Leu Phe Phe Ser Asn Arg Leu Ala Ser Arg Leu Asp Ser -100 -95 -90 -85 GAC GAT GAT GGA AAA AAC ATT TAT ATT GTA TAC ATG GGG AGG AAG CTA 147 Asp Asp Asp Gly Lys Asn Ile Tyr Ile Val Tyr Met Gly Arg Lys Leu -80 -75 -70 GAG GAT CCT GAT TCT GCT CAT TTA CAT CAT AGG GCA ATG TTG GAA CAA 195 Glu Asp Pro Asp Ser Ala His Leu His His Arg Ala Met Leu Glu Gln -65 -60 -55 GTT GTT GGC AGC ACT TTT GCT CCA GAA TCT GTG CTC CAC ACT TAC AAG 243 Val Val Gly Ser Thr Phe Ala Pro Glu Ser Val Leu His Thr Tyr Lys -50 -45 -40 AGA AGT TTC AAC GGA TTC GCA GTG AAA CTT ACT GAA GAA GAA GCT GAA 291 Arg Ser Phe Asn Gly Phe Ala Val Lys Leu Thr Glu Glu Glu Ala Glu -35 -30 -25 AAG ATT GCC AGT ATG GAG GGT GTG GTG TCT GTG TTT TTA AAT GAA ATG 339 Lys Ile Ala Ser Met Glu Gly Val Val Ser Val Phe Leu Asn Glu Met -20 -15 -10 -5 AAC GAA CTT CAT ACG ACA AGA TCA TGG GAT TTT CTG GGT TTT CCA CTA 387 Asn Glu Leu His Thr Thr Arg Ser Trp Asp Phe Leu Gly Phe Pro Leu 1 5 10 ACT GTT CCT CGT CGA AGT CAA GTG GAA AGC AAC ATA GTT GTT GGA GTT 435 Thr Val Pro Arg Arg Ser Gln Val Glu Ser Asn Ile Val Val Gly Val 15 20 25 TTG GAC ACC GGA ATC TGG CCG GAA TCT CCC AGT TTC GAC GAT GAA GGG 483 Leu Asp Thr Gly Ile Trp Pro Glu Ser Pro Ser Phe Asp Asp Glu Gly 30 35 40 TTC AGT CCT CCA CCA CCC AAA TGG AAG GGC ACT TGT GAA ACC TCC AAC 531 Phe Ser Pro Pro Pro Pro Lys Trp Lys Gly Thr Cys Glu Thr Ser Asn 45 50 55 60 AAC TTT CGT TGC AAC AGA AAA ATT ATT GGA GCT CGA TCA TAT CAC ATA 579 Asn Phe Arg Cys Asn Arg Lys Ile Ile Gly Ala Arg Ser Tyr His Ile 65 70 75 GGC CGT CCC ATT TCA CCC GGT GAT GTG AAT GGT CCA AGA GAC ACA AAT 627 Gly Arg Pro Ile Ser Pro Gly Asp Val Asn Gly Pro Arg Asp Thr Asn 80 85 90 GGA CAC GGG ACG CAC ACT GCA TCA ACA GCG GCT GGT GGT CTA GTT AGC 675 Gly His Gly Thr His Thr Ala Ser Thr Ala Ala Gly Gly Leu Val Ser 95 100 105 CAG GCA AAT CTA TAC GGT CTC GGG CTC GGG ACG GCA AGA GGA GGA GTT 723 Gln Ala Asn Leu Tyr Gly Leu Gly Leu Gly Thr Ala Arg Gly Gly Val 110 115 120 CCC TTA GCG CGA ATC GCT GCA TAC AAG GTA TGC TGG AAT GAT GGT TGC 771 Pro Leu Ala Arg Ile Ala Ala Tyr Lys Val Cys Trp Asn Asp Gly Cys 125 130 135 140 TCT GAT ACA GAC ATT CTT GCA GCA TAT GAC GAT GCC ATT GCG GAT GGA 819 Ser Asp Thr Asp Ile Leu Ala Ala Tyr Asp Asp Ala Ile Ala Asp Gly 145 150 155 GTC GAT ATT ATA TCT CTT TCA GTG GGT GGG GCT AAT CCA CGA CAT TAT 867 Val Asp Ile Ile Ser Leu Ser Val Gly Gly Ala Asn Pro Arg His Tyr 160 165 170 TTC GTT GAT GCC ATT GCC ATC GGA TCT TTC CAT GCA GTA GAG AGA GGA 915 Phe Val Asp Ala Ile Ala Ile Gly Ser Phe His Ala Val Glu Arg Gly 175 180 185 ATA TTA ACA TCC AAT TCT GCT GGG AAT GGA GGC CCT AAT TTC TTC ACC 963 Ile Leu Thr Ser Asn Ser Ala Gly Asn Gly Gly Pro Asn Phe Phe Thr 190 195 200 ACC GCA AGC CTG TCT CCG TGG CTT CTG TCT GTT GCT GCA AGC ACC ATG 1011 Thr Ala Ser Leu Ser Pro Trp Leu Leu Ser Val Ala Ala Ser Thr Met 205 210 215 220 GAC AGA AAG TTT GTC ACA CAA GTA CAG ATT GGT AAT GGA CAG AGC TTT 1059 Asp Arg Lys Phe Val Thr Gln Val Gln Ile Gly Asn Gly Gln Ser Phe 225 230 235 CAG GGA GTT TCA ATT AAC ACA TTT GAT AAT CAA TAC TAT CCC CTT GTT 1107 Gln Gly Val Ser Ile Asn Thr Phe Asp Asn Gln Tyr Tyr Pro Leu Val 240 245 250 AGT GGG CGT GAT ATA CCC AAT ACT GGT TTC GAT AAG TCC ACC TCA AGG 1155 Ser Gly Arg Asp Ile Pro Asn Thr Gly Phe Asp Lys Ser Thr Ser Arg 255 260 265 TTC TGC ACG GAC AAG TCA GTG AAT CCC AAT TTG TTA AAG GGA AAA ATT 1203 Phe Cys Thr Asp Lys Ser Val Asn Pro Asn Leu Leu Lys Gly Lys Ile 270 275 280 GTT GTT TGT GAA GCG AGT TTC GGT CCT CAT GAA TTC TTT AAG TCC TTG 1251 Val Val Cys Glu Ala Ser Phe Gly Pro His Glu Phe Phe Lys Ser Leu 285 290 295 300 GAT GGT GCA GCG GGT GTC CTC ATG ACA TCA AAT ACG AGG GAT TAT GCA 1299 Asp Gly Ala Ala Gly Val Leu Met Thr Ser Asn Thr Arg Asp Tyr Ala 305 310 315 GAC TCC TAT CCC TTG CCT TCT TCC GTT CTC GAC CCA AAT GAT CTC CTT 1347 Asp Ser Tyr Pro Leu Pro Ser Ser Val Leu Asp Pro Asn Asp Leu Leu 320 325 330 GCC ACT TTG CGT TAT ATT TAT TCA ATT CGC TCT CCT GGT GCA ACC ATT 1395 Ala Thr Leu Arg Tyr Ile Tyr Ser Ile Arg Ser Pro Gly Ala Thr Ile 335 340 345 TTC AAG AGT ACC ACA ATC CTC AAT GCA TCT GCA CCT GTT GTT GTT TCC 1443 Phe Lys Ser Thr Thr Ile Leu Asn Ala Ser Ala Pro Val Val Val Ser 350 355 360 TTC TCA TCC AGG GGT CCT AAT CGT GCA ACT AAA GAT GTT ATT AAG CCA 1491 Phe Ser Ser Arg Gly Pro Asn Arg Ala Thr Lys Asp Val Ile Lys Pro 365 370 375 380 GAC ATA AGT GGT CCA GGA GTC GAA ATT CTA GCA GCA TGG CCT TCT GTT 1539 Asp Ile Ser Gly Pro Gly Val Glu Ile Leu Ala Ala Trp Pro Ser Val 385 390 395 GCA CCA GTT GGT GGA ATC CGT AGA AAC ACA CTT TTT AAT ATA ATC TCA 1587 Ala Pro Val Gly Gly Ile Arg Arg Asn Thr Leu Phe Asn Ile Ile Ser 400 405 410 GGA ACA TCA ATG TCT TGT CCA CAT ATC ACT GGA ATT GCA ACC TAC GTT 1635 Gly Thr Ser Met Ser Cys Pro His Ile Thr Gly Ile Ala Thr Tyr Val 415 420 425 AAA ACA TAC AAT CCT ACT TGG TCT CCT GCT GCC ATC AAG TCA GCA CTC 1683 Lys Thr Tyr Asn Pro Thr Trp Ser Pro Ala Ala Ile Lys Ser Ala Leu 430 435 440 ATG ACA ACC GCT TCA CCC ATG AAT GCT AGG TTC AAT CCA CAG GCA GAG 1731 Met Thr Thr Ala Ser Pro Met Asn Ala Arg Phe Asn Pro Gln Ala Glu 445 450 455 460 TTT GCA TAT GGT TCA GGC CAT GTT AAC CCG CTA AAA GCA GTA AGA CCT 1779 Phe Ala Tyr Gly Ser Gly His Val Asn Pro Leu Lys Ala Val Arg Pro 465 470 475 GGG TTG GTT TAT GAT GCA AAT GAA AGC GAC TAC GTT AAA TTC TTG TGT 1827 Gly Leu Val Tyr Asp Ala Asn Glu Ser Asp Tyr Val Lys Phe Leu Cys 480 485 490 GGT CAA GGT TAC AAC ACC CAG GCG GTT CGA CGT ATC ACC GGA GAC TAT 1875 Gly Gln Gly Tyr Asn Thr Gln Ala Val Arg Arg Ile Thr Gly Asp Tyr 495 500 505 AGT GCT TGT ACT TCT GGT AAT ACT GGT AGA GTA TGG GAT TTA AAC TAT 1923 Ser Ala Cys Thr Ser Gly Asn Thr Gly Arg Val Trp Asp Leu Asn Tyr 510 515 520 CCT TCT TTT GGA CTT TCA GTA TCT CCT TCA CAG ACT TTC AAT CAA TAC 1971 Pro Ser Phe Gly Leu Ser Val Ser Pro Ser Gln Thr Phe Asn Gln Tyr 525 530 535 540 TTC AAC AGA ACT CTC ACG AGT GTC GCC CCT CAA GCA TCA ACA TAT AGA 2019 Phe Asn Arg Thr Leu Thr Ser Val Ala Pro Gln Ala Ser Thr Tyr Arg 545 550 555 GCT ATG ATC TCT GCC CCA CAA GGC CTT ACT ATC TCA GTG AAT CCT AAT 2067 Ala Met Ile Ser Ala Pro Gln Gly Leu Thr Ile Ser Val Asn Pro Asn 560 565 570 GTT CTA TCA TTT AAT GGC CTT GGA GAT AGA AAA TCT TTT ACC TTG ACA 2115 Val Leu Ser Phe Asn Gly Leu Gly Asp Arg Lys Ser Phe Thr Leu Thr 575 580 585 GTT CGA GGA TCA ATA AAA GGA TTT GTA GTG TCA GCT TCT TTG GTG TGG 2163 Val Arg Gly Ser Ile Lys Gly Phe Val Val Ser Ala Ser Leu Val Trp 590 595 600 AGC GAT GGT GTA CAC TAT GTG AGA AGC CCT ATA ACC ATC ACA AGT CTA 2211 Ser Asp Gly Val His Tyr Val Arg Ser Pro Ile Thr Ile Thr Ser Leu 605 610 615 620 GTT TAATGACTTT TGCCTTTTTG AAATAAAGAA AAAGGAGTTA AAATAAAAAG 2264 Val AAAGTGAAAG TGTGGGAAAG AAGTATCGCA TTTCTTCCAT TACTCTTTCA TTTTTGTTTG 2324 TTCTTTGTCA TCTAGGTAAG GTGGTGGCGA CTTTTGAAAT AAGTGTGTGT CTATACTGTC 2384 ACTATTAGTA ATAAAAAGTG TCGTGCTATA CGTAGCTTTA CCTTCGAGAG GTTTTATTAA 2444 TTTTGATACT TTCCATGGTT GTTTAGCTCT TTAGGGGCAA ATTTTTCTGG TTCACACATG 2504 ATGTGGTAAT TCGGTTAAAT GAGGCATTTT TATCTTCTGT TAAAAAAA 2552

【００４８】配列番号：2 配列の長さ：11 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源 生物名：Cucumis melo L. 組織の種類：受粉後１０日目の果実果芯部

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドpGEMSP1の概念図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表配列番号１のアミノ酸番号１〜６
   ２１のアミノ酸配列を有するメロンプロテアーゼをコー
   ドするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 前記ＤＮＡが、配列番号１の塩基番号３
   ５２〜２２１４の塩基配列を含むことを特徴とする請求
   項１記載のメロンプロテアーゼをコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号１のアミノ酸番号−１１０〜６
   ２１のアミノ酸配列を有するメロンプロテアーゼ前駆体
   をコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 前記ＤＮＡが、配列番号１の塩基番号２
   ２〜２２１４の塩基配列を含むことを特徴とする請求項
   ２記載のメロンプロテアーゼ前駆体をコードするＤＮ
   Ａ。
5. 【請求項５】 請求項１又は２記載のメロンプロテアー
   ゼをコードするＤＮＡと、エシェリキア コリ（Escheri
   chia coli）で発現可能なプロモーターとを有するエシ
   ェリキア コリで複製可能なプラスミド。
6. 【請求項６】 請求項５記載のプラスミドを保持するエ
   シェリキア コリ形質転換体。
7. 【請求項７】 請求項７記載の形質転換体を培養し、菌
   体からメロンプロテアーゼを回収することを特徴とする
   メロンプロテアーゼの製造法。