JPH06284896A - ポリフェノール配糖体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 医薬や化粧品等の中間体や配合成分等として
有用なポリフェノール配糖体の酵素を用いる製造法を提
供する。 【構成】 サイクロデキストリン合成能を有さず、マル
トオリゴ糖分解能を有する糖化型アミラーゼの存在下に
おいて、糖基質とポリフェノール受容体を反応させるこ
とを特徴とするポリフェノール配糖体の製造法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、サイクロデキストリ
ン合成能を有さず、マルトオリゴ糖分解能を有する糖化
型アミラーゼを用いるポリフェノール配糖体の製造法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ポリフェノール配糖体は、従来から、甘
味料、鎮痛剤、下剤、抗マラリヤ剤および強壮剤等とし
て利用されるだけでなく、優れた美白効果を発揮する化
粧品の配合成分としても利用できる(特願平３−３４１
５１号明細書参照)有用な化合物であり、本件出願人は
先に、サイクロデキストリン合成能とマルトース分解能
を有さない新規な酵素を用いるポリフェノール配糖体の
製造法を提供した(特願平４−２７９２６号明細書参
照)。

【０００３】この発明は、さらに別異の酵素を用いるポ
リフェノール配糖体の製造法を提供するためになされた
ものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】即ちこの発明は、従来は
工業的にほとんど利用されていなかった糖化型アミラー
ゼのなかで、サイクロデキストリン合成能を有さず、マ
ルトオリゴ糖分解能を有する酵素がポリフェノール配糖
体合成能を有するという知見に基づいてなされたもので
あって、その要旨は、サイクロデキストリン合成能を有
さず、マルトオリゴ糖分解能を有する糖化型アミラーゼ
の存在下において、糖基質とポリフェノール受容体を反
応させることを特徴とするポリフェノール配糖体の製造
法に存する。

【０００５】本発明に使用する酵素、即ち、サイクロデ
キストリン合成能を有さず、マルトオリゴ糖分解能を有
する糖化型アミラーゼは自体公知の酵素であるが、該酵
素がポリフェノール配糖体合成能を有するということは
全く知られていなかった。この種の糖化型アミラーゼと
しては、例えば、バシルス・ズブチリス、ストレプトコ
ッカス・ボビス、ストレプトマイセス・ハイグロスコピ
カス、ストレプトマイセス・プレコックス、リゾプス・
デレマーおよびアスペルギルス・ニーガー等の細菌から
生産される上記特性を有する酵素が例示される。

【０００６】上記の細菌を用いる該糖化型アミラーゼの
調製は自体公知の方法、例えば、福本らの方法[プロシ
ーディングズ・オブ・ジャパン・アカデミー(Ｐroc. Ｊ
apanＡcademy)、第２７巻、第３５２頁〜第３５８頁(１
９５１年)およびアミラーゼシンポジウム(日本応用酵素
協会・アミラーゼ部会)、第４７頁〜第５３頁(１９６５
年)参照]等に準拠しておこなえばよい。

【０００７】上記の特性を有する糖化型アミラーゼは、
広範囲の糖基質を加水分解し、種々のポリフェノール類
にグルコースを転移させ、これによって多種多様なポリ
フェノール配糖体が得られる。この種の糖基質およびポ
リフェノール受容体としては下記のものが例示される：糖基質 ：澱粉、アミロペクチン、アミロース、マルトオ
リゴ糖(Ｇ₂〜Ｇ₇)。ポリフェノール受容体 ：カテキン、カフェー酸、コウジ
酸、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシノール、プ
ロトカテキュー酸、α−レゾルシル酸、フロログルシノ
ール、没食子酸。

【０００８】澱粉等の糖基質およびカテキン等のポリフ
ェノール受容体を、上述の酵素の存在下で反応させる方
法は、通常、酢酸緩衝液等の緩衝液を用いて反応系のｐ
Ｈを約４〜９に調製し、約１０〜６０℃で約３〜７０時
間おこなう。反応溶媒としては、水、メタノール／水
(５〜５０体積％)、エタノール／水(５〜５０体積％)、
酢酸エチル／水(１０〜８０体積％)等が例示される。な
お、使用する酵素を不溶性担体に固定化することによ
り、製造したポリフェノール配糖体から酵素を除くステ
ップを省略することもできる。

【０００９】

【実施例】以下、本発明を実施例によって説明する。実施例１ 酵素の調製は前記の福本らの方法に準拠しておこなっ
た。可溶性澱粉１０ｗ／ｖ％、ポリペプトン２ｗ／ｖ
％、肉エキス２ｗ／ｖ％含有する水溶液を１２１℃で１
５分間加圧滅菌することによって培地を調製した。坂口
フラスコ(５００ｍｌ)内へ該培地を１００ｍｌ入れ、次
いでバシルス・ズブチリス１ＦＯ １４１４０を１白金
耳量植菌し、１２０ｒｐｍの条件下、３０℃で２４時間
振盪培養した(種培養)。上記のようにして新たに調製し
た培地３リットルに、該培養液を混入させ、該混合物を
ミニジャー(５リットル)内において、撹拌２００ｒｐｍ
および通気量３リットル／ｍｉｎの条件下において、３
７℃で１２０時間にわたって通気撹拌培養した(本培
養)。培養液２．５リットルを遠心分離処理(９０００ｒ
ｐｍ：１５分間)に付すことによって得られた培養上清
２．４５リットルに硫酸アンモニウムを加え、０．２〜
０．６飽和の画分を常法に従い得た。該画分を水に対し
て透析後、１Ｍ酢酸を用いてｐＨを５．０に調製し、５
０ｍＭ酢酸緩衝液(ｐＨ５．０)を用いて平衡化したデュ
オライトＣ−１０カラム(１５．９ｃｍ²×２７ｃｍ)に
注入し、該酢酸緩衝液２リットルを用いて洗浄した。該
洗浄液を、分画分子量３０００の限外濾過膜(旭化成工
業株式会社製ペンシル型モジュールＳＥＰ−００１３)
を用いて１５０ｍｌまで濃縮し、部分精製酵素を得た。
上述の精製過程の結果を表１にまとめて示す。

【００１０】

【表１】

【００１１】表１中の活性量(単位)は下記の方法によっ
て算出した値である。活性量 可溶性澱粉を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ５．
３)に．０．５ｗ／ｖ％の濃度で溶解した溶液０．４５
ｍｌに酵素液０．０５ｍｌを加え、４０℃で１０分間反
応をおこなった後、０．５Ｎ塩酸１．０ｍｌを添加する
ことによって反応を停止させ、次いで、ヨウ素５ｍｇと
ヨウ化カリウム５０ｍｇを水１００ｍｌに溶解させた溶
液２．５ｍｌを加え、室温で２０分間放置後、６６０ｎ
ｍにおける吸光度を測定し、該吸光度を１分間に１％低
下させる酵素量を１単位とした(ブランクテストは、酵
素の代わりに上記緩衝液を用いる以外は上記と同様の操
作によっておこなった)。

【００１２】実施例２ (ポリフェノール配糖体合成活性測定法) ハイドロキノンの酢酸エチル溶液(０．５Ｍ)０．５ｍｌ
および可溶性澱粉５ｗ／ｖ％、酢酸ナトリウム緩衝液
(ｐＨ５．３)５０ｍＭおよび実施例１で製造した酵素１
０単位／ｍｌを含有する水溶液０．５ｍｌを蓋付試験管
(５ｍｌ)に入れ、該試験管を回転数２８０ｒｐｍの条件
下において、４０℃で１８時間振盪させた。静置後、水
性層を下記の条件下での薄層クロマトグラフィー分析に
付し、酵素のポリフェノール配糖体合成活性を確認し
た。 薄層 ：メルク社製シリカゲル６０Ｆ２５４ガラスプ
レート 展開溶媒：酢酸エチル／酢酸／水＝３／２／２(体積比) 検出 ：３３ｖ／ｖ％硫酸／メタノール混合液を薄層
に噴霧後、該薄層を１２０℃で１０分間加熱する。 Ｒｆ値 ：０．６１〜０．８６(澱粉の分解物のＲｆ値
は０．５８以下である)

【００１３】実施例３および４ 澱粉の代わりに、アミロペクチン、アミロースまたはマ
ルトオリゴ糖を使用する以外は、実施例２の手順に準拠
して、本発明による酵素のポリフェノール配糖体合成活
性を確認した。

【００１４】実施例５〜１３(受容体特異性) ハイドロキノンの代わりに、カテキン、カフェー酸、コ
ウジ酸、カテコール、レゾルシノール、プロトカテキュ
ー酸、α−レゾルシル酸、フロログルシノールまたは没
食子酸を使用する以外は、実施例２の手順に準拠して、
本発明による酵素のポリフェノール配糖体合成活性を確
認した。

【００１５】実施例１４(ハイドロキノン配糖体の調製) 実施例１で調製した酵素液１，０００単位、ハイドロキ
ノン２．５ｗ／ｖ％、澱粉２ｗ／ｖ％および酢酸緩衝液
(ｐＨ５．３)１０ｍＭから成る混合液１００ｍｌを三角
フラスコ(２００ｍｌ)内に入れ、４０℃で９０時間反応
をおこなうことによってハイドロキノン配糖体を合成し
た。反応混合物にエタノール２００ｍｌを添加して反応
を停止させた後、析出不溶物を遠心分離処理によって除
去した。残留液をロータリーエバボレーターを用いる減
圧濃縮乾燥処理に付した後、残渣を水１０ｍｌに溶解さ
せ、該水溶液を下記の条件下でカラムクロマトグラフィ
ー処理に付し、溶離液体積４４０〜４８０ｍｌで反応生
成物２を、同体積４８０〜５４０ｍｌで反応生成物１を
溶離させた： カラム：内径２．６ｃｍ×長さ９１ｃｍ 充填剤：バイオゲルｐ−２(４００メッシュ) 溶離液：５％(ｖ／ｖ)エタノール水溶液 得られた画分を、それぞれロータリーエバボレーターを
用いて減圧濃縮乾固させた後、さらに真空乾燥機を用い
て乾燥処理をおこなって、白色粉末として生成物１を１
１０ｍｇ、生成物２を５１ｍｇ得た。該生成物は下記の
条件下での薄層クロマトグラフィーにおいて単一であっ
た。(生成物１のＲｆ値：０．６１、生成物２のＲｆ
値：０．５２)： 薄層 ：シリカゲル６０Ｆ２５４ 展開溶媒：酢酸エチル／酢酸／水(３：１：１) 検出 ：紫外線照射また硝酸／メタノール(１：２)混
合物を噴霧後、１１０〜１２０℃に加熱して発色させ
る。¹ Ｈ−ＮＭＲ分析の結果、該生成物１および２をそれぞ
れハイドロキノン−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド、ハ
イドロキノン−Ｏ−α−マルトシドと同定した。

【００１６】

【発明の効果】本発明によれば、従来は工業的にほとん
ど利用されていなかった特定の糖化型アミラーゼを利用
することによって、広範囲の糖基質とポリフェノール受
容体を原料として、特に医薬や化粧品等の配合成分とし
て有用な多種多様なポリフェノール配糖体を効率よく製
造することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 西野 豊和 大阪府寝屋川市下木田町14番５号 倉敷紡 績株式会社技術研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サイクロデキストリン合成能を有さず、
   マルトオリゴ糖分解能を有する糖化型アミラーゼの存在
   下において、糖基質とポリフェノール受容体を反応させ
   ることを特徴とするポリフェノール配糖体の製造法。
2. 【請求項２】 糖化型アミラーゼが、バシルス・ズブチ
   リス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトマイセ
   ス・ハイグロスコピカス、ストレプトマイセス・プレコ
   ックス、リゾプス・デレマーまたはアスペルギルス・ニ
   ーガーが生産する酵素である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 糖基質が澱粉、アミロース、アミロペク
   チンまたはマルトオリゴ糖(Ｇ₂〜Ｇ₇)である請求項１記
   載の方法。
4. 【請求項４】 ポリフェノール受容体がカテキン、カフ
   ェー酸、コウジ酸、ハイドロキノン、カテコール、レゾ
   ルシノール、プロトカテキュー酸、α−レゾルシル酸、
   フロログルシノールまたは没食子酸である請求項１記載
   の方法。