JPH06287142A - 抗ｈｉｖ剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、従来知られている抗ＨＩＶ剤に比
較し、高活性を有しながら毒性が低く副作用の少ない安
全で実用性のある抗ＨＩＶ剤を提供することを目的とし
ている。 【構成】 β-1,3グリコシド結合を主鎖とし、主鎖４残
基に対し１の割合でβ-1,6グリコシド結合による１残基
からなる側鎖が存在するホモグルカンの硫酸エステル誘
導体からなることを特徴とする抗ＨＩＶ剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、従来知られている抗Ｈ
ＩＶ剤に比較し、高活性であり、しかも低毒性で副作用
の少ない実用的な抗ＨＩＶ剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年世界的に爆発的な広がりを示してい
る後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原ウィルス
（Human Immunodeficiency Virus、以下ＨＩＶと略称す
る。）に代表されるレトロウィルスに対して抗ウィルス
効果を示す化合物の探索が精力的に進められ、現在ＡＩ
ＤＳの治療薬としてアジドジデオキシチミジン（ＡＺ
Ｔ）（Ｍｉｔｕｙａ，Ｈ．ら；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８５，８２，７０９
６）が臨床的に用いられている。しかしＡＺＴは、症状
の改善と患者への延命効果は示すものの治療薬、予防薬
とはなり得ておらず、また骨髄抑制等の重篤な副作用を
示す問題点を有する。

【０００３】これらの観点から最近、ＡＩＤＳ治療薬と
して化学修飾多糖、特に多糖の硫酸エステル化物が注目
されておりデキストラン硫酸、カードラン硫酸あるいは
レンチナン硫酸（特開平２−１４５６０１号公報、特開
平３−２１８３１７号公報）等の報告が見受けられる。

【０００４】しかしαグルカンであるデキストランの硫
酸エステル化物であるデキストラン硫酸は生体内での安
定性が極めて悪く、また高い血液凝固阻害効果を示す等
の問題点を有している。またβ-1,3グリコシド結合のみ
からなるカードランあるいはその低分子体から誘導され
るカードラン硫酸は生体内での半減期が短い結果、効果
の持続性が低いという短所を有し、これはその側鎖を持
たない直鎖状の構造に起因すると言われている。

【０００５】β-1,3グリコシド結合からなる主鎖５残基
に対し２の割合でβ-1,6グリコシド結合の側鎖を持つホ
モグルカンのレンチナンあるいはその低分子体を原料と
するレンチナン硫酸は、レンチナンがシイタケの子実体
からの抽出物であり安価に大量かつ安定に供給すること
に困難が伴う等の問題を有しており、更なる有効で安全
な薬剤の開発が強く望まれているのが現状である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的と
するところは、従来知られている抗ＨＩＶ剤に比較し、
高活性であり、低毒性で副作用の少ない実用的な抗ＨＩ
Ｖ剤を提供するにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上述の目的は、β-1,3グ
リコシド結合を主鎖とし、主鎖４残基に対し１の割合で
β-1,6グリコシド結合による１残基からなる側鎖が存在
するホモグルカンの硫酸エステル誘導体を含有すること
を特徴とする抗ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Viru
s）剤によって達成される。

【０００８】本発明で用いられるホモグルカンは、合成
されたものでも良いが、天然物のホモグルカンであって
もよい。

【０００９】天然物のホモグルカンとしては、例えば不
完全菌の１種であるマクロホモプシス属に属するマクロ
ホモプシス ＫＡＢ−５５（微工研受託９３６６号）の
産生するホモグルカン（特開平４−１２２７０１号公報
参照）等が好ましいものとして挙げられる。

【００１０】上記マクロホモプシス ＫＡＢ−５５の産
生するホモグルカンは、下記の性質を有するものであ
る。

【００１１】（ａ）分子ふるいを原理とした高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定した分子量
が約１千万以上である。 （ｂ）粘度の温度依存性が、０．３重量％以下の濃度に
於いて、５〜８５℃間で一定の粘度を有し、０．３重量
％を越える濃度でも２０〜８５℃間で一定の粘度を有す
る。 （ｃ）１２１℃下，１ｋｇ／ｃｍ² のオートクレーブ加
熱（２０分間）処理によっても粘度が安定である。

【００１２】ホモグルカンの低分子化の方法としては、
従来から知られている酸あるいはアルカリによる限定加
水分解方法、エンドβ-1,3グルカナーゼによる部分消化
方法、あるいは超音波照射等による物理的方法等が挙げ
られる。

【００１３】これらの反応混合物から低分子体ホモグル
カンを分離するには、いわゆる多糖類の精製、分画に用
いられる種々の手段、例えばアルコールやアセトン等の
添加による沈澱法、ゲル濾過法、限外濾過法等を用いる
ことが出来る。

【００１４】ホモグルカンの平均分子量は、ＨＰＬＣに
よって求めることが出来る。本発明のホモグルカンとし
ては、例えば見かけの平均分子量が、約１千万以上を示
す天然型のものや、前記低分子化の処理条件によって異
なってくるが、８００乃至５，０００，０００のもの等
が挙げられる。

【００１５】ホモグルカンの硫酸エステル化誘導体はピ
リジン、ホルムアミドあるいはジメチルホルムアミドの
存在下に硫酸化剤、例えばクロルスルホン酸、スルファ
ミン酸、無水硫酸等を作用させるか、無水硫酸と有機塩
基、例えばピリジン、ジメチルホルムアミド、トリメチ
ルアミン、ジメチルアニリン等との混合試薬を反応させ
ることによって硫酸化することが出来る。またホモグル
カンをジメチルスルホキシドに溶解後、硫酸化剤である
ピペリジン硫酸を一定条件で作用させることによりホモ
グルカンの低分子化と硫酸エステル化反応を同時に行な
うことも出来る。

【００１６】これらの反応に際しては、試料および試薬
を十分に乾燥をするのが良い。更に目的とする誘導体の
硫酸根の導入度（置換度）に適した試薬濃度、反応時間
および温度が、収量低下、褐変化や一旦導入された硫酸
根の離脱反応が起こらないように選択するのが良い。

【００１７】本発明のホモグルカン硫酸エステル誘導体
は、反応後アルコールあるいはアセトン等の有機溶媒を
反応液に添加して、生じる沈澱によって回収でき、その
他ゲル濾過法、透析法、限外濾過法等によって回収する
ことが出来る。

【００１８】本発明のホモグルカン硫酸エステル誘導体
は、水に対する溶解性が高く、低毒性であり、且つ相対
的な抗ＨＩＶ活性が高いので医薬品等として期待出来
る。

【００１９】本発明の抗ＨＩＶ剤はＨＩＶ感染の予防お
よび治療に有用であり経口的あるいは非経口的に投与す
ることが出来、必要に応じて錠剤、カプセル、散剤、顆
粒剤、トローチ、坐剤等の剤型、あるいは注射剤、懸濁
注射剤等の剤型として用いることが出来る。

【００２０】ホモグルカン硫酸エステル誘導体の投与量
は、体内において目的とする予防もしくは治療効果を生
ずるのに十分な量であれば良く、目的の用途により、ま
た患者の体重や症状、剤型等によって随時決定し得る。
例えば一般に成人１日当たり０．０１乃至２０ｍｇ／ｋ
ｇとなる量を経口あるいは注射により投与できる。

【００２１】

【実施例】以下に、実施例および試験例を具体的に示
し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに
よって何ら限定されるものではない。

【００２２】実施例１ マクロホモプシス ＫＡＢ−５５により産生されたホモ
グルカン（天然型、平均分子量１千万）３．０ｇに１０
０ｍｌのジメチルホルムアミドを添加し常温で３時間撹
拌して溶解した。これにクロルスルホン酸とトリエチル
アミンから合成したトリエチルアミン−スルホン酸１５
ｇを添加し、氷水中で２０時間撹拌しながら反応を行な
った。反応後、１０％の重炭酸ナトリウム溶液に対し１
昼夜透析し、これに４倍量のエタノールを添加して生じ
た沈澱を回収した。この沈澱をエタノールで更に３回洗
浄した後、減圧乾燥し目的の硫酸エステルナトリウム塩
５．１ｇを得た（以下、ＭＰＳ−１と略称する）。

【００２３】実施例２ マクロホモプシス ＫＡＢ−５５により産生されたホモ
グルカン（天然型、平均分子量１千万）５．０ｇを９０
％蟻酸５０ｍｌに溶解し、８５℃で３０分間処理して平
均分子量約１００，０００に低分子化されたホモグルカ
ンを得た。この３．０ｇに１００ｍｌのジメチルホルム
アミドを添加し常温で１時間撹拌して溶解した。これに
クロルスルホン酸とトリエチルアミンから合成したトリ
エチルアミン−スルホン酸１５ｇを添加し、氷水中で２
４時間撹拌しながら反応を行なった。反応後、１０％の
重炭酸ナトリウム溶液に対し１昼夜透析した後、更に蒸
留水に対し１昼夜透析し、これを凍結乾燥して目的の硫
酸エステルナトリウム塩４．４ｇを得た（以下、ＭＰＳ
−２と略称する）。

【００２４】試験例１ 実施例１，２で得られたホモグルカン硫酸エステル誘導
体のＨＩＶ（ヒトレトロウィルス）増殖抑制能を以下の
ように測定した。

【００２５】（１）材料 （ａ）細胞：ＨＴＬＶ−１持続感染細胞株ＭＴ−４を用
い、フェノールレッドを除去したＲＰＭＩ−１６４０培
地（極東製）に１０％ウシ胎仔血清および１０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ（同仁化学製）を添加して培養した。 （ｂ）ウィルス：ＨＩＶはＭｏｌｔ−４／ＨＴＬＶ−II
I の培養上澄から得た。

【００２６】（２）方法 ９６穴平底プレートにＭＴ−４細胞を８×１０³ 個／５
０μl ／穴になるよう培養し、ＨＩＶをＭ．Ｏ．Ｉ．
（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏ
ｎ）０．００２で感染させ、３７℃で１週間保温してウ
ィルスを細胞に吸着させた。吸着操作後細胞を洗浄し、
製造例１，２で合成したホモグルカン硫酸エステル誘導
体を種々の濃度（１〜１００μｇ／ｍｌ）で添加して３
７℃、５％ＣＯ₂ の条件下で６日間培養した。

【００２７】一方、ＭＴＴ[ 3-(4,5-Dimethylthiazol-2
-yl)-2,5-Diphyenyl Tetrazolium Bromide] を少量のジ
メチルスルホキシドに溶解し、培地で希釈して０．５ｍ
ｇ／ｍｌ溶液を調製した。この溶液１ｍｌに０．１５３
ｍｇ／ｍｌのＰＭＳ（Phenazine Methosulfate）溶液２
０μl を混合した。この混合液各５０μl を上記の６日
間培養したプレートの穴に加え、３７℃で４時間放置し
た後、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した（プレート
の穴に培地１００μl を添加したものをブランクとし
た）。試料のＨＩＶ抑制活性は、細胞の死滅を５０％抑
えるのに必要なホモグルカン硫酸エステル誘導体の濃
度、ＥＤ₅₀（μｇ／ｍｌ）で示した。

【００２８】試験例２ 抗ウイルス剤は宿主細胞に対しても毒性を示す場合が多
い。そこで試料の毒性を以下に示す方法で検討した。

【００２９】ＭＴ−４細胞を試験例１と同様の条件で培
養し、種々の濃度の実施例１，２で得られたホモグルカ
ン硫酸エステル誘導体を添加してウィルスを感染させる
ことなしに６日間培養し、試験例１と同様の方法で比色
定量した。細胞毒性はＩＤ₅₀（μｇ／ｍｌ）で示した。

【００３０】試験例１および２によって得られたホモグ
ルカン硫酸エステル誘導体、ＭＰＳ−１およびＭＰＳ−
２のＨＩＶ抑制活性と細胞毒性の試験結果を表１に示し
た。

【００３１】

【表１】

【００３２】以上の結果から、ホモグルカン硫酸エステ
ル誘導体は高いヒトレトロウィルス増殖抑制活性を持
ち、かつ低毒性であることから医薬品等として期待出来
る。

【００３３】実施例３（カプセル剤） 実施例１で得られたＭＰＳ−１４００ｍｇ、乳糖１９５
ｍｇおよびステアリン酸マグネシウム５ｍｇを常法によ
りよく混合してゼラチン硬カプセルに充填し、カプセル
剤を作製した。

【００３４】実施例４（注射剤） 実施例２で得られたＭＰＳ−２１００ｍｇ、塩化ナトリ
ウム９ｇおよびベンジルアルコール９ｇを注射用蒸留水
に溶解して全量を１，０００ｍｌとした。この溶液を孔
径０．２μｍのメンブランフィルターを用いて無菌濾過
し、無菌操作で内容量５０ｍｌのバイアルに充填、ゴム
施栓を行ないアルミキャップで巻き締めして注射剤を作
製した。

【００３５】

【発明の効果】以上の通り、本発明の抗ＨＩＶ剤は、強
いＨＩＶ増殖抑制作用を有し、ＨＩＶ感染の予防および
治療に有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） 7804−4Ｂ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 β-1,3グリコシド結合を主鎖とし、主鎖
   ４残基に対し１の割合でβ-1,6グリコシド結合による１
   残基からなる側鎖が存在するホモグルカンの硫酸エステ
   ル誘導体を含有することを特徴とする抗ＨＩＶ（Human
   Immunodeficiency Virus）剤。
2. 【請求項２】 ホモグルカンが、平均分子量８００〜
   ５，０００，０００に低分子化されたものであることを
   特徴とする請求項１記載の抗ＨＩＶ剤。
3. 【請求項３】 ホモグルカンが、マクロホモプシス属の
   糸状菌が産生するホモグルカンであることを特徴とする
   請求項１記載の抗ＨＩＶ剤。
4. 【請求項４】 ホモグルカンが、平均分子量８００〜
   ５，０００，０００に低分子化されたものであることを
   特徴とする請求項３記載の抗ＨＩＶ剤。