JPH06293787A - テトラクロロラフィノース - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明はラフィノースの新規テトラ塩素化誘
導体であるテトラクロロラフィノース、及びその製造方
法に関する。 【構成】 トリフェニルホスフィンオキシド又はスルフ
ィドの存在下、ラフィノースを塩化チオニルと反応させ
ることにより、テトラクロロラフィノースを製造するこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はラフィノースの新規テト
ラ塩素化誘導体、その製造法および蔗糖より約６００×
甘い強力な甘味剤シュクラロース（４，１′，６′−ト
リクロロ−４，１′，６′−トリデオキシガラクトシュ
クロース、ＴＧＳとして知られる）の製造に使用する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】シュクラロースへの経路（例えば、Ｋｈ
ａｎ等、ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ、
３９、１９７５、２５３；Ｆａｉｒｃｌｏｕｇｈら、Ｃ
ａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４０、１
９７５、２８５−２９８、米国特許第４，３６２，８６
９号、英国特許第２，０６５，６４８号参照）には、６
位をブロックしてその位置の塩素化を防止し、４−、
１′−および６′−位を塩素化する蔗糖誘導体の生成を
包含する。米国特許第４，３６２，８６９号とＦａｉｒ
ｃｌｏｕｇｈの方法では、蔗糖を３つの主な位置（６
−、１′−および６′−）でトリチル化しついでパーア
セチル化する。ついでトリチル基を除いて、２，３，
４，３′，４′−ペンタアセテートを得る。４位のアセ
テートは、不活性溶媒中稀酢酸で処理して、塩素化可能
な２，３，６，３′，４′−ペンタアセテートを得る特
許方法の場合には、６位に移動させる。この方法はトリ
チル化、アセチル化、脱トリチル化および異性化の結合
工程を含むから、６位を塩素化させない簡単な方法が要
望されている。

【０００３】その他の方法（例えば、米国特許第４，３
８０，４７６号と英国特許第２，０７９，７４９号）で
は、６位を選択的にアシル化し続いて２−、３−、３′
−および４′位の未保護ヒドロキシ基の存在下４−、
１′−および６′位を選択的に塩素化するものである。
しかし、選択的アシル化を実施するのは難しい。

【０００４】したがって、限られた工程でシュクラロー
スの簡単な製造法が依然要望されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】選択的６−アシル化の
別法として、６位に大きな基、例えば糖を付加すること
である。このようなトリサッカライドが出発物質として
考慮される場合、２つの問題が即おきる。

【０００６】先ず、このトリサッカライドは４位（転
化）、１′−と６′−位で、任意には６位の糖の位置さ
れ得ることが必要である。しかし、６位に大きな糖基が
存在することは、重要な４位が立体障害を受け、ハロゲ
ン原子を付加することが難しいことを意味する。

【０００７】比較的普通のライト型のトリサッカライド
はラフィノース、Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→６）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
２）−β−Ｄ−フラクトフラノシドである。ラフィノー
スの塩素化はＨｏｕｇｈら（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７１、８５−９３、１９７９）に
より研究されている。４−、６−、１′−および６′−
位の蔗糖を塩素化しうる強力な塩素化剤、塩化スルフリ
ルを使って、４−クロロ置換生成物が得られないことが
分かった。モノ−、ジ−およびトリサッカライド混合物
は若干の塩素化メチルグリコシドと共に得られた。

【０００８】我々自身の研究で分ったことは、ラフィノ
ースとビルスマイヤー試薬と反応させて、複雑な反応混
合物を得たことである。

【０００９】第２の問題は、適当に４，１′，６′−塩
素化トリサッカライドが得られたとしても、糖を６位か
ら除いてシュクラローズを遊離する有効な化学的又は酵
素的方法を見つけることが必要である。しかし、この分
子の塩素化は極性的に、構造的に、特に酵素が作用する
のに適する未塩素化糖からの配座の点で非常に異質のも
のにする。ガラクトース環を除くのにラフィノースに作
用する酵素が、塩素置換基がグリコシド結合（すなわ
ち、４位）に近い位置に存在するラフィノースの塩素化
誘導体に必ずしも働かないことを、このことは意味して
いる。これに類似するものとして、蔗糖とシュクラロー
ス間の差異である。多くの微生物が蔗糖を急速に分解し
うるが、シュクラロースはｉｎ ｖｉｖｏでは分解せ
ず、ある土壌微生物によりゆっくり分解するだけであ
る。

【００１０】有用なシュクラロースの生産に対するこの
アプローチの要件は、トリサッカライドが蔗糖部分の
４，１′−および６′−位でのみ、そして多分第３環の
１つ以上の位置で塩素化されねばならないことかつ塩素
化生成物が塩素化ガラクトシュクロースを分解せず又は
その部分を脱塩素化せずに（１→６）−ガラクトシルリ
ンクでのみ分解せねばならないことである。

【００１１】驚いたことに、本発明者はラフィノースを
塩素化して、６−Ｏ−（６−クロロ−６−デオキシガラ
クトース）−置換シュクラロースを得る方法を見出し
た。更に、このテトラクロロ糖を分解して、シュクラロ
ースを遊離する酵素を見出した。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、新規化
合物としてテトラクロロラフィノース、即ちＯ−α−Ｄ
−６−クロロ−６−デオキシガラクトピラノシル−（１
→６）α−Ｄ−４−クロロ−４−デオキシガラクトピラ
ノシル−（１→２）−β−Ｄ−１，６−ジクロロ−１，
６−ジデオキシフラクトフラノシド、又は４，１′，
６′，−６″−テトラクロロ−４，１′，６′，−６″
−テトラデオキシガラクトラフィノースを供する。この
化合物はＴＣＲと呼ぶ。

【００１３】また、本発明はトリアリールホスフィンオ
キシド、例えばトリフェニルホスフィンオキシドの存在
下ラフィノースを塩化チオニルと反応させて、ＴＣＲを
製造する方法を供する。

【００１４】トリフェニルホスフィンオキシド（ＴＰＰ
Ｏ）は５〜２５モル％、例えば７．５〜１５％ＴＰＰお
よび９５〜７５モル％、例えば９２．５〜８５％ＴＰＰ
Ｏの混合物を使って、一定比のトリフェニルホスフィン
（ＴＰＰ）が伴なうのが望ましい。ＴＰＰ／塩化チオニ
ル塩素化剤の副産物がＴＰＰＯであるから、ＴＰＰ自体
も使用できる。このことは、反応が進むにつれて、ＴＰ
ＰＯとＴＰＰの混合物が発生することを意味する。

【００１５】他のトリアリールホスフィンオキシドはＴ
ＰＰＯの代りに、特に３つのフェニル環の１つが重合体
鎖に結合しているもの、例えばフェニルがスチレンによ
り置換されている場合、ＲｅｇｅｎとＬｅｅ（Ｊ．Ｏｒ
ｇ．Ｃｈｅｍ．４０、１６６９−１６７０、１９７５）
に記載されている試薬と代替することができる。

【００１６】同様に、ＴＰＰＯは同じように反応するス
ルフィド（ＴＰＰＳ）により代替できる。

【００１７】トリアリールホスフィン／トリアリールホ
スフィンオキシド又はスルフィド対ラフィノース比は３
〜４モル／モル、例えば約３．２モル／モルが望まし
く、塩化チオニル対ラフィノース比は８〜１５％モル／
モル、例えば１０〜１１モル／モルが望ましい。

【００１８】反応はラフィノース用非オキシ溶媒と塩素
化剤の存在下で進行する。適当な溶媒にはアミンやアミ
ド、特にピリジンやルチジンの如き芳香族３級アミン、
又はＤＭＦの如きＮ，Ｎ−ジアルキルアミドがある。

【００１９】反応は約０℃で始まり、続いて約１１０°
に一般に上げるのがよい。

【００２０】ＴＣＲはヘプタエステル、例えばヘプタア
セテートの形で単離し、ついでエステル基を稀アルコー
ル性ナトリウムアルコキシドで加水分解して除くのがよ
い。

【００２１】本発明の別の特徴によれば、６位から６−
クロロ−６−デオキシ−ガラクトシル部分を除く作用を
示す酵素の存在下ＴＣＲ溶液を温置して、シュクラロー
スを製造する方法を供する。

【００２２】この酵素は多くの入手可能な酵素から直接
又はその酵素を生産しうる微生物の培養から選択するこ
とができる。ガラクトシダーゼは特に興味のあるもので
あるが、メリビオース（Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノース）はラフィ
ノースの成分であるが、塩素化ＴＣＲは転化構成を有す
るという事実に鑑みて、メリビアーゼは余り興味あるも
のとは考えられない。これらの酵素はラフィノースから
蔗糖を遊離しうるとしても、ＴＣＲについて何か有用な
活性を示さないことが分った。バクテリア、カビおよび
植物由来の２０数個のα−ガラクトシダーゼ酵素を試験
したが、わずか８つのものがＴＣＲ加水分解活性を示
し、いずれもカビ由来のものである。最も活性のある酵
素はＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｖｉｎａｃｅａ，Ｃｉｒ
ｃｉｎｅｌｌａ ｍｕｓａｅ株のものおよびＡｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ノボ社提供）の一株のもの
であった。驚いたことに、北海道製糖提供のＭｏｒｔｉ
ｅｒｅｌｌａ ｖｉｎａｃｅａ ｖａｒ，ｒａｆｆｉｎ
ｏｓｅｕｔｉｌｉｚｅｒ（ＡＴＣＣ ２００３４）由来
のメリビアーゼは最高活性であった。それでも、ＴＣＲ
に対する反応率はラフィノース自体のわずか数％に過ぎ
ない。それにも拘らず、ラフィノースとＴＣＲとの配座
と構成上の有意な差を考えて、この活性率でも予期でき
ないもので、ＴＣＲは殆んど完全にシュクラロースに加
水分解される。

【００２３】Ｍ．ｖｉｎａｃｅａ ｖａｒ，ｒａｆｆｉ
ｎｏｓｅｕｔｉｌｉｚｅｒのペレット化細胞は日本のビ
ート糖の加工上１９６８年以来、アメリカではそれより
以前に使われてきた（Ｏｂａｒａ Ｊ． ＆ Ｈａｓｈ
ｉｍｏｔｏ Ｓ．，Ｓｕｇａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｒｅｖｉｅｗｓ ４、２０９、１９７６／７７および
米国特許第３，８６７，２５６号と第３，９５７，５７
８号、Ｎａｒｉｔａ等）。

【００２４】酵素処理は水溶液で行なうのがよく、反応
には水を必要とするが、α−ガラクトシダーゼは多くの
有機溶媒中ＴＣＲをシュクラロースに激しく加水分解し
うることが分った。したがって、この酵素は水不混和性
有機溶媒にて最も安定であり、活性であり、一方、ＴＣ
Ｒは親水性溶媒でのみ非常に可溶性であることが分っ
た。したがって、酢酸エチル、ｎ−ブタノールおよびメ
チルイソブチルケトンの如き親水性であるが水不混和性
有機溶媒がＴＣＲ加水分解用溶媒として最も適している
と考えられた。例えば、水性バッファー（加水分解のた
め十分の水を供する）で予めで飽和した酢酸エチル中触
媒的変換数（Ｋｃａｔ）により規定したＴＣＲ加水分解
率は水性バッファーにおける場合に類似している。この
ことが意味することは、この酵素は有機溶媒に懸濁した
場合でも、その十分な触媒活性を保持することである。
水性バッファーで予備飽和させた各有機溶媒は単一の有
機相として残ることを強調することは肝要である。本発
明は２相溶媒系に関するものでなく、酵素は有機相にて
機能している。

【００２５】上記した溶媒以外に、他の溶媒もＴＣＲ加
水分解支持能について試験した。高度に水混和性溶媒
（ジオキサン、アセトン、メタノール、ＴＨＦなど）は
３０％ｖ／ｖ水性バッファーの存在下でも加水分解を維
持できなかった。疎水性、水不混和性溶媒（ｎ−オクタ
ノール、ニトロベンゼン、ブチロニトリルなど）はＴＣ
Ｒ加水分解を維持できたが、これらの溶媒におけるＴＣ
Ｒの溶解度が低い（５％ｗ／ｖ未満）ので、大規模の使
用を制限している。親水性、水不混和性溶媒（酢酸エチ
ル、ｎ−ブタノール、メチルイソブチルケトンなど）は
高い触媒活性と高いＴＣＲ溶解度を維持することができ
た。

【００２６】第１表は水性バッファーと比較して、各種
溶媒（すべて水性バッファーで予め飽和させた）中５５
℃でＴＣＲとシュクラロースの溶解度を示す。

【００２７】

【表１】 第 １ 表 溶 媒 ＴＣＲ シュクラロース 水 １５％ ３０％ ｎ−ブタノール ＞５０％ ＞５０％ メチルイソブチルケトン ＞５０％ ６％ 酢酸エチル ＞５０％ 5.７％ ｎ−オクタノール ５％ ＜１％ ニトロベンゼン ＜２％ ＜１％

【００２８】明かに、ＴＣＲ溶解度は親水性水不混和溶
媒にて最大であった。他方、シュクラロースの溶解度に
は多くの変化がみられた。これはバッチ反応について酢
酸エチルやメチルイソブチルケトンにおいてシュクラロ
ースを選択的に結晶化するのに使用でき、あるいは連続
的充填床法をｎ−ブタノールにて実施できる（すべての
反応体と生成物は可溶）。

【００２９】有機媒体中加水分解反応を行なう利点のう
ち、熱的安定性（酢酸エチル中５５℃におけるα−ガラ
クトシダーゼの安定性は水溶液の場合より約５０％高
い）が促進されかつ基質溶解性（上記溶媒中のＴＣＲの
溶解度は５０％ｗ／ｖ以上であるのに対し、水性バッフ
ァーでは溶解度にわずか１５％ｗ／ｖである）が増大し
た。

【００３０】水性および有機系において、Ｍ．ｖｉｎａ
ｃｅａメリビアーゼに対し約５５℃とｐＨ４．５−５．
５である酵素最適温度とｐＨで処理すべきは当然であ
る。水−飽和有機溶媒中、これは水性バッファーのｐＨ
を意味する。この温度とｐＨ５．０で、生成シュクラロ
ースは分解しないことが分った。

【００３１】この酵素は例えばペレットの超音波処理に
よって生成する細胞のない抽出液として水性系に溶解又
は分散することができ、あるいは床又はカラムに充填し
たペレットとして固定化の形で使用できる。他の有機系
においては、酵素は不溶性のままで残りかつまた床又は
カラムで使用できる。

【００３２】シュクラロース生成物の分別は任意の便
法、例えば蒸発および有機溶媒に抽出して、クロマトグ
ラフ技術により、あるいは水性系や非水性系から選択的
に結晶化して行なうことができる。

【００３３】次の例により本発明を説明する。 例 １ （ａ） ４，１′，６′，６″−テトラクロロ−４，
１′，６′，６″−テトラデオキシガラクトラフィノー
スヘプタアセテート

【００３４】無水ラフィノース（４．０ｇ）、トリフェ
ニルホスフィンオキシド（５．９ｇ）およびトリフェニ
ルホスフィン（０．６６ｇ、ＴＰＰＯ １０重量％、全
ＴＰＰＯおよびＴＰＰ ３モル当量）のピリジン（４０
ｍｌ）の冷溶液に約０℃で、攪拌し乍ら塩化チオニル
（８．６ｍｌ、１５モル当量）を加えた。反応混合物を
１時間で室温にもっていき、ついで１０５−１１０℃で
４．５時間加熱した。メタノール（１０ｍｌ）を添加し
た後、溶液をシラップ状まで濃縮した。このシラップの
ピリジン溶液（５０ｍｌ）を室温で２時間無水酢酸（５
ｍｌ）で処理した。ＴＬＣ（エーテル／アセトン、４：
１）で、少量生成物は早期移動し、主生成物は遅く移動
した。この溶液を濃縮し、エーテル／アセトン（２：
１、ｖ／ｖ）を使ってシリカゲルのカラムで溶離し、シ
ラップとして、４，１′，６′，６″−テトラクロロ−
４，１′，６′，６″−テトラデオキシガラクトラフィ
ノースヘプタアセテート（４．７５ｇ）を得た。ＴＬＣ
によれば、試料にはＴＰＰＯと遅く移動する不純物の存
在を示した。

【００３５】（ｂ） ４，１′，６′，６″−テトラク
ロロ−４，１′，６′，６″−テトラデオキシガラクト
ラフィノース ナトリウムメトキシド／メタノール（５０ｍｌ）を使
い、ｐＨ９．５、室温で３時間上記シラップ（４．７５
ｇ）を脱エステル化した。溶液をＡｍｂｅｒｌｙｓｔ
１５（Ｈ）⁺ レジンで中和し、濃縮して、半固形残渣を
得、水で抽出した。不溶性ＴＰＰＯは濾別し、水抽出液
は酢酸エチル／アセトン（２：１ｖ／ｖ）を使い、シリ
カゲル（１００ｇ）のカラムで溶離して精製し、純粋の
４，１′，６′，６″−テトラクロロ−４，１′，
６′，６″−テトラデオキシガラクトラフィノース
（１．４９ｇ、ラフィノース基準で３２．６％）、
〔α〕_D ＋８０°（Ｃ０．７、アセトン）を得た。

【００３６】無水酢酸とピリジンでこの生成物を常法に
よりアセチル化して、工程（ａ）の温アセテート、
〔α〕_D ＋１３２°（Ｃ０．２５、アセトン）を得た。

【００３７】ヘプタアセテートの質量分析データ：ｍ／
ｚ、７５３、〔（Ｍ＋１）⁺ −２ＡｃＯＨ、オクテット
（４Ｃｌ）〕、５７１〔４−クロロガラクトピラノシル
−（１→６）−４−クロロガラクトピラノシルカチオ
ン、トリプレット９：６：１（２Ｃｌ）〕、３０７〔６
−クロロガラクトピラノシルカチオン、ダブレット３：
１、（１Ｃｌ）〕、２８３〔１，６−ジクロロフラクト
フラノシルカチオン、トリプレット９：６：１（２Ｃ
ｌ）〕。

【００３８】ＴＣＲの質量分析データ：ｍ／ｚ５９６
〔Ｍ＋ＮＨ₄ 、オクテット、４Ｃｌ〕、３９６と３９８
（重複ピーク）〔６−クロロガラクトピラノシル−（１
→６）−４−クロロガラクトピラノシルカチオン（２Ｃ
ｌ）：１，６−ジクロロフラクトシル−（２→１）−４
−クロロガラクトピラノシルカチオン（３Ｃｌ）〕、１
９８〔６−クロロ−ガラクトピラノシル＋ＮＨ₄ 、ダブ
レット（３：１）（１Ｃｌ）〕。

【００３９】４，１′，６′，６″−テトラクロロ−
４，１′，６′，６″−テトラデオキシガラクトラフィ
ノースヘプタアセテートの¹ Ｈ−ＮＭＲデータ

【００４０】

【表２】 プロトン ケミカルシフト カップリングコンスタント （τ） （Ｈｚ） Ｈ−１ 5.６８ ｄ，Ｊ _1,2 3.５ Ｈ−２ 5.０８ ｑ，Ｊ _2,3 １0.０ Ｈ−３ 5.４１ ｑ，Ｊ _3,4 3.５ Ｈ−４ 4.７６ ｑ，Ｊ _4,5 1.５ Ｈ−５ 4.５７ − Ｈ−１′ａ，１′ｂ 4.０４ − Ｈ−３′ 5.４１ ｄ，Ｊ _3',4' 6.５ Ｈ−４′ 5.３４ ｔ，Ｊ _4',5' 6.５ Ｈ−５′ 4.２７ ｍ Ｈ−１″ 5.４３ ｄ，Ｊ _1",2" 3.５ Ｈ−２″ 5.１６ ｑ，Ｊ _2",3" １1.０ Ｈ−３″ 4.９４ ｑ，Ｊ _2",3" 3.５ Ｈ−４″ 5.０１ − Acetate H 1.９２，2.０３，2.０４ ｓ 2.０５，2.０６，2.０７

【００４１】４，１′，６′，６″−テトラクロロ−
４，１′，６′，６″−テトラデオキシガラクトラフィ
ノースの¹³Ｃ−ＮＭＲデータ

【００４２】

【表３】 炭 素 ケミカルシフト （τ） Ｃ−２′ １０3.０５ Ｃ−１″ ９9.８１ Ｃ−１ ９2.３１ Ｃ−５′ ８2.４０ Ｃ−３′ ７5.８９ Ｃ−４′ ７5.４０ Ｃ−５″ ７1.１７ Ｃ−３″ ６9.１２ Ｃ−４″ ６9.０４ Ｃ−２″ ６8.２４ Ｃ−２，３，５ ６7.８８，６7.４０，６7.３２ Ｃ−６ ６7.０４ Ｃ−４ ６5.４２ Ｃ−１′ ４6.３５ Ｃ−６′ ４4.１２

【００４３】例 ２ ４，１′，６′，６″−テトラ
クロロラフィノースヘプタアセテートを介してＴＣＲの
単離 無水ラフィノース（１０ｇ、１９．８ミリモル）／ピリ
ジン（３５ｍｌ、４３４ミリモル）溶液に、トリフェニ
ルホスフィンオキシド（１６ｇ、５７．５ミリモル）と
トリフェニルホスフィン（１．６ｇ、６．１ミリモル）
を加温、攪拌して溶解した。ついで塩化チオニル（１５
ｍｌ、２０７ミリモル）を０℃（氷−塩浴）で３０分混
合物に加えた。反応混合物を室温にもっていった（攪拌
した場合は、発熱が経験された）。反応混合物を１０５
−１１０℃で加熱した。５分以内に、発熱が始まり、内
部温度は１５０℃に上った。温度を３０分内に浴温まで
下げた。加熱は４．５時間続けた。溶液を室温にもって
いき、２４時間攪拌下室温で過剰の無水酢酸（約２５ｍ
ｌ）で処理した。別法として、アセチル化反応時間は１
００℃で反応を行なって１時間まで減ずることができ
る。

【００４４】混合物を熱トルエンで抽出して、生成物を
単離した。トルエン層を水性炭酸ナトリウム、水で洗
い、脱水（Ｎａ₂ ＳＯ₄ ）しそして濾液を濃縮した。ト
ルエン抽出液には炭水化物とトリフェニルホスフィンオ
キシド混合物から成る固体２６ｇを含有した。更に黒い
残渣をトルエンと水性炭酸ナトリウムで攪拌し、黒色固
形残渣を濾去し、第２のトルエン抽出液を得、これを分
別脱水（Ｎａ₂ ＳＯ₄ ）し、そして濃縮（４ｇ）した。
一緒にした抽出液にジエチルエーテルを加え、トリフェ
ニルホスフィンオキシド（１５ｇ）を沈澱させた。エー
テル抽出液をシラップ状（約１５ｇ）に濃縮し、メタノ
ール（約１００ｍｌ）にとり、１Ｍナトリウムメトキシ
ド（ｐＨ１０）で２時間処理した。この溶液を酸性レジ
ンで中和し、炭床で濾過した。溶液を濃縮し、真空オー
ブン中４０℃で２４時間脱水した（１０．８ｇ）。残渣
を水で抽出し、残存ＴＰＰ＝０を濾去し、濾液を濃縮
し、ＴＣＲ（５．３ｇ）を得た。ＴＬＣ（酢酸エチル：
アセトン：水、８：６：１）により、炭水化物の約８０
％がＴＣＲであった。

【００４５】例 ３ ＴＣＲの直接的単離 無水ラフィノース（２０ｇ、３９．７ミリモル）のピリ
ジン（７０ｍｌ、８６８ミリモル）溶液を上記例に記載
したように、トリフェニルホスフィンオキシド（３２
ｇ、１１５ミリモル）、トリフェニルホスフィン（３．
２ｇ、１２．２ミリモル）および塩化チオニル（３０ｍ
ｌ、４１４ミリモル）で処理した。反応混合物を室温に
もっていき、１０５−１１０℃で約４．５時間加熱し
た。メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ、３００ｍｌ）
を熱反応混合物（約７０°）に加え、攪拌し、ＭＩＢＫ
層をデカントした。黒色残渣を更に熱（約７０℃）ＭＩ
ＢＫ（１００ｍｌ）で抽出した。合わせたＭＩＢＫ抽出
液を冷水性炭酸ナトリウムで洗い、脱水（ＣａＳＯ₄ ）
し、濃縮してシラップを得た。このシラップをメタノー
ル（５０ｍｌ）にとり、室温で約１時間ナトリウムメト
キシド（ｐＨ１０）で処理し、ＴＣＲを得た。ＴＬＣ
（酢酸エチル：アセトン：水、８：６：１）により、主
生成物は標準ＴＣＲと一致した。メタノール溶液を酸性
レジンで脱イオンし、活性炭で脱色し、濾過し、濾液を
濃縮し、固形残渣を得た。残渣を熱水で攪拌し、濾過
し、濾液を濃縮し、固形ＴＣＲ（９．８ｇ、６０％純度
ＨＰＬＣ、収率２６％）を得た。

【００４６】例 ４ シュクラロース（少量）水溶液
の調製 例１のテトラクロロガラクトラフィノース（２０ｍｇ）
を０．１Ｍ−クエン酸塩／リン酸塩バッファー（ｐＨ
５．０）（２ｍｌ）と共にスクリュートップボトルに入
れ、１％（ｗ／ｖ）溶液を得た。この水レベルは必要に
応じ水を添加して次のインキュベーション中維持した。

【００４７】Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｕｉｎａｃｅａ
ｕａｒ ｒａｆｆｉｎｏｓｅｕｔｉｌｉｚｅｒ（ＡＴ
ＣＣ ２００３４）（北海道製糖より供給）のペレット
化細胞状のメリビアーゼを加え（１０ｍｇ）、混合物を
５５℃で１００時間までインキュベーションした。加水
分解度は酢酸エチル：エタノール：水（４５：５：１）
で溶出した試料２５０μｌをＴＬＣ分析するかあるいは
アセトニトリル２０％（ｖ／ｖ）により溶出したＷａｔ
ｅｒ Ｄｅｘｔｒｏｐａｋ Ｃ１８逆相カラムでＨＰＬ
Ｃにより定期的に行ない、生成物は屈折率検出器を使っ
て測定した。結果は第１図にプロットした。例えば、約
５３％が４８時間後に加水分解し、約７０％が９０時間
に加水分解した。生成物をクロマトグラフィにより分離
し、シュクラロース以外に、６−クロロガラクトースと
ＴＣＲの存在を検出した。ＴＣＲはこのシステムでは１
５％（ｗ／ｖ）まで使用できる。水溶液中に、酵素は
５．８Ｍｍのミカエリス定数（Ｋｍ）と５２．５ｍｇ／
酵素ｇ／１時間のＫｃａｔを示す。

【００４８】例 ５ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｕｉｎａｃｅａ ｕａｒ ｒ
ａｆｆｉｎｏｓｅｕｔｉｌｉｚｅｒ（ＡＴＣＣ ２００
３４）（３ｇ）のペレットは、ラフィノース５％ｗ／ｖ
含有０．１Ｍクエン酸塩、リン酸塩バッファーｐＨ５．
０の溶液にて水和し、１１ｃｍ×０．９ｃｍカラムに充
填し、水ジャケットで床容量７ｃｍ³ にした。このカラ
ムは循環水流ポンプを使って５５℃に維持した。ＴＣＲ
をシュクラロースを加水分解するのに使用した場合、５
０％転換についてカラムの半減期は１３日であることが
分った。

【００４９】例 ６ ＴＣＲをシュクラロースに加水
分解しうる微生物 α−ガラクトシダーゼ活性を有すると報告された微生物
はＡＴＣＣから得た。１ｇ／ｌ酵母エキス＋５ｇ／ｌラ
フィノースを含有する無機塩培地（Ｊａｙａｓｕｒｉ
ａ，１９５５ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １２ ４１９−４２８）
１００ｍｌを含む５００ｍｌ振盪フラスコにて３０℃で
培養した。細胞は生育対数期に遠心分取（５０００回転
／分、１０分）し、クエン酸塩／リン酸塩バッファーｐ
Ｈ５．０の５倍容量にて再懸濁し、氷浴にて０℃に維持
し、最大出力でＭＳＥソニチーター（Ｄａｗｅ Ｓｏｎ
ｉｐｒｏｂｅ Ｔｙｐｅ １１３０Ａ）にて３×２０秒
バーストにより破壊した。生成懸濁液を３０分遠心分離
（１７，０００回転／分）し、残渣と上清液はｐ−ニト
ロフェニルα−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ）
を使って、細胞くず乾燥重量ｇ当りα−ガラクトシダー
ゼ活性単位で試験した。上清液には殆んど酵素活性は検
出されなかった。ついで陽性の培養物は例４のようにＴ
ＣＲ加水分解について試験し、結果は細胞残渣乾燥重量
ｇ／１時間当りのｍｇシュクラロースで示した（７０％
転換率）。結果は次の通りである。

【００５０】

【表４】 酵 素 ＴＣＲ 微 生 物 ATCC No. 単 位 加水分解 Absidia griseola 20430 35.5 0 Absidia griseola 20431 18.6 < 0.2 Absidia griseola 22618 43.7 0 Aspergillus awamori 44733 20.8 0 Aspergillus niger 36220 20.1 0.49 Circinella muscae 16008 75.4 1.12 Circinella muscae 20394 28.9 < 0.2 Circinella muscae 22337 11.3 0 Mortierella vinacea 20034 18.2 1.09 Mortierella vinacea 34195 8.9 1.33 Mortierella vinacea 42425 10.6 1.06 Saccharomyces uvarum 42367 1.6 0 Talaromyces thermophilus 16461 < 1.0 0 Mortierella vinacea Hokkaido 21.3 4.3 （ペレット）

【００５１】例 ７ 有機培地におけるシュクラロー
スの生産 例１のＴＣＲ（２３ｍｇ）を５ｍｌスクリュートップガ
ラスビンに入れ、水性バッファ（酢酸ナトリウム、５０
ｍＭ、ｐＨ５．０）で予め飽和させた有機溶媒を加え、
２０ｍＭ（１．１５％ｗ／ｖ）溶液を得た。Ｍ．ｕｉｎ
ａｃｅａ ｕａｒ ｒａｆｆｉｎｏｓｅｕｔｉｌｉｚｅ
ｒ（ＡＴＣＣ ２００３４）のペレット化細胞状α−ガ
ラクトシダーゼを各ビンに加え（１００ｍｇ）、１％ｖ
／ｖ水性バッファーを加え、３０秒間攪拌し、ついで５
５℃、１００ｒｐｍで水浴振盪機中にガラスビンをおい
て反応を開始させた。定期的に、試料を取り、溶離剤と
して２０％水性アセトニトリルを使って、逆相（Ｗａｔ
ｅｒｓ Ｄｅｘｔｒｏｐａｋ Ｃ１８）カラムを取りつ
けたＨＰＬＣシステムに２５μｌを注入し、生成したシ
ュクラロースと残存ＴＣＲを測定した。２４時間のイン
キュベーション中シュクラロースの生成に及ぼす有機溶
媒の効果は第２図に示す。第２図には、ＴＣＲをシュク
ラロースの経時的加水分解過程を水性バッファー（曲線
１）についておよび３つの溶媒、メチルイソブチルケト
ン（２）、酢酸エチル（３）ならびにｎ−ブタノール
（４）についてプロットしてある。メチルイソブチルケ
トンおよび水性バッファーにおける加水分解反応は類似
していた。酢酸エチルとｎ−ブタノールでは低率と転換
がそれぞれ得られた。すべての場合、２４時間において
５０％以上の転換が観られ、水性バッファーとメチルイ
ソブチルケトンにおいては７０％の転換率であった。

【００５２】別の実験では、水性バッファーと酢酸エチ
ルでは酵素はミカエリス／メンテン速度論を示した。酢
酸エチル中ＫｍとＫｃａｔは夫々１６．４ｍＭ ＴＣＲ
と５６．３ｍｇシュクラロース／ｇペレット／時間であ
った。酢酸エチル中ＴＣＲ加水分解の時間コースは２０
ｍＭ ＴＣＲでの水性バッファーにおけるものより低か
った理由は酢酸エチル中のＴＣＲの高Ｋｍによるもので
あって、低触媒活性によるものではなかった。５０ｍＭ
ＴＣＲを使用した場合、酢酸エチル中のＴＣＲ加水分
解の率と転換は水性バッファーの場合に類似していた。

【図面の簡単な説明】

【図１】メリビアーゼによるテトラクロロガラクトラフ
ィノースの加水分解率を示すグラフ。

【図２】シュクラロースの生成に及ぼす有機溶媒の効果
を示すグラフ。

【符号の説明】

１ 水性バッファー ２ メチルイソブチルケトン ３ 酢酸エチル ４ ｎ−ブタノール

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キザー サルタン マフテイ イギリス国バークシヤー アールジー２ ８イーエイ，リーデイング，シンフイール ド ライズ ピースヘブン （番地なし) (72)発明者 リアツ アメツド カーン イギリス国バークシヤー，ソニング，オー ルド バス ロード，ラムジイ（番地な し) (72)発明者 ピーター サムエル ジエームス チーサ ム イギリス国ケント，ノース アツシユフオ ード，ブラボーン リーズ，プロスペクト ウエイ 59 (72)発明者 アンドリユー ジヨン ハツキング イギリス国バークシヤー アールジー１ ６エツチピー，リーデイング，バス ロー ド，バレリー コート 28 (72)発明者 ジヨナサン セス ドーデイツク イギリス国バークシヤー アールジー４ ７エスワイ，リーデイング，ケイバーシヤ ム，ヘムデイーン ロード 71

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｏ−α−Ｄ−６−クロロ−６−デオキシ
   ガラクトピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−４−クロロ
   −４−デオキシガラクトピラノシル−（１→２）−β−
   Ｄ−１，６−ジクロロ−１，６−ジデオキシフラクトフ
   ラノシド（ＴＣＲ）。
2. 【請求項２】 トリアリールホスフィンオキシド又はス
   ルフィドの存在下塩化チオニルでラフィノースを反応さ
   せることを特徴とする、ＴＣＲの製造法。