JPH06303975A - 核酸分子の切断方法 - Google Patents
核酸分子の切断方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 特異的標的部位で標的核酸を切断する方法で
あって、（ａ）標的核酸及びパイロット核酸を含んでな
る切断構造を形成し、ここで標的核酸の第一領域がパイ
ロット核酸とアニーリングされて二重らせんを形成し、
かつ二重らせんに隣接する標的核酸の第二領域がパイロ
ット核酸とアニーリングされないで二重らせん領域と非
アニーリング領域の間で接合部位を形成し、及び（ｂ）
切断構造を、切断構造の配列に依存せずに標的部位で切
断構造を優先的に切断することができる切断剤に接触さ
せ、及び（ｃ）切断構造と切断剤を、切断が起こり得る
条件下で温置する各工程を含んでなる方法。 【効果】 特異的部位においてＲＮＡ、ＤＮＡ分子等の
一本鎖の核酸分子を切断することができる。また核酸分
子を配列非依存的様式によってあらゆる所望の部位で切
断でき、切断が高温で行えて、切断部位が特異的制限エ
ンドヌクレアーゼ部位に制限されることがない。
あって、（ａ）標的核酸及びパイロット核酸を含んでな
る切断構造を形成し、ここで標的核酸の第一領域がパイ
ロット核酸とアニーリングされて二重らせんを形成し、
かつ二重らせんに隣接する標的核酸の第二領域がパイロ
ット核酸とアニーリングされないで二重らせん領域と非
アニーリング領域の間で接合部位を形成し、及び（ｂ）
切断構造を、切断構造の配列に依存せずに標的部位で切
断構造を優先的に切断することができる切断剤に接触さ
せ、及び（ｃ）切断構造と切断剤を、切断が起こり得る
条件下で温置する各工程を含んでなる方法。 【効果】 特異的部位においてＲＮＡ、ＤＮＡ分子等の
一本鎖の核酸分子を切断することができる。また核酸分
子を配列非依存的様式によってあらゆる所望の部位で切
断でき、切断が高温で行えて、切断部位が特異的制限エ
ンドヌクレアーゼ部位に制限されることがない。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸分子を操作するため
の分子生物学的技術に関する。より詳細には核酸分子を
切断するＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ
活性の利用に関する。
の分子生物学的技術に関する。より詳細には核酸分子を
切断するＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ
活性の利用に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】核酸の切断 多くの分子生物学的技術は、限定された部位で特異的に
ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を切断する可能性に依存してい
る。制限酵素は通常パリンドローム性で、４〜６個の長
さの塩基対である特異的配列部位で二本鎖ＤＮＡを切断
する。数百の制限酵素が現在まで発見されているが、そ
れらの殆どが二本鎖ＤＮＡ分子を切断するだけである。
数種の制限酵素について、その効率は低いが、通常二本
鎖ＤＮＡに於いて認識される配列を有する部位で一本鎖
ＤＮＡを切断する能力を持つことが知られている。多数
の異なる制限酵素が種々の部位で二本鎖ＤＮＡを切断す
る一方で、これらの酵素は酵素の基質配列特異性に適合
する配列部位でのみ切断し、研究者が望むあらゆる部位
で切断を行うものではない。従って制限酵素による切断
反応は、特異的なヌクレオチド配列と二本鎖ＤＮＡの使
用に限定されている。
ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を切断する可能性に依存してい
る。制限酵素は通常パリンドローム性で、４〜６個の長
さの塩基対である特異的配列部位で二本鎖ＤＮＡを切断
する。数百の制限酵素が現在まで発見されているが、そ
れらの殆どが二本鎖ＤＮＡ分子を切断するだけである。
数種の制限酵素について、その効率は低いが、通常二本
鎖ＤＮＡに於いて認識される配列を有する部位で一本鎖
ＤＮＡを切断する能力を持つことが知られている。多数
の異なる制限酵素が種々の部位で二本鎖ＤＮＡを切断す
る一方で、これらの酵素は酵素の基質配列特異性に適合
する配列部位でのみ切断し、研究者が望むあらゆる部位
で切断を行うものではない。従って制限酵素による切断
反応は、特異的なヌクレオチド配列と二本鎖ＤＮＡの使
用に限定されている。
【０００３】Ｆｏｋ１等のクラス の制限酵素は、それ
らの認識配列以外の部位でＤＮＡを切断する。Ｆｏｋ１
は、ＤＮＡへ選択部位を指令するアダプターオリゴヌク
レオチドを介して選択部位で一本鎖ＤＮＡを切断する指
令を受ける（ポジャスカら（Podhajska, et al.), Gen
e, ４０，１７５−１８２：１９８５）。このアダプタ
ーには２つの領域があり、一つは酵素の認識部位として
働き、他は一本鎖ＤＮＡへ雑種形成を行う。このアダプ
ターの標的への結合特異性は、その酵素が不適合な塩基
対を認容する能力、及び４０℃以下の温度で反応を温置
する必要性ゆえに比較的低いものとなろう。ＤＮＡのみ
がこの反応系での切断の基質となることが知られてい
る。
らの認識配列以外の部位でＤＮＡを切断する。Ｆｏｋ１
は、ＤＮＡへ選択部位を指令するアダプターオリゴヌク
レオチドを介して選択部位で一本鎖ＤＮＡを切断する指
令を受ける（ポジャスカら（Podhajska, et al.), Gen
e, ４０，１７５−１８２：１９８５）。このアダプタ
ーには２つの領域があり、一つは酵素の認識部位として
働き、他は一本鎖ＤＮＡへ雑種形成を行う。このアダプ
ターの標的への結合特異性は、その酵素が不適合な塩基
対を認容する能力、及び４０℃以下の温度で反応を温置
する必要性ゆえに比較的低いものとなろう。ＤＮＡのみ
がこの反応系での切断の基質となることが知られてい
る。
【０００４】自己触媒活性を有するＲＮＡ分子であるリ
ボザイムは、核酸を切断するための標的となることがで
きる。しかし、特異的標的切断部位は一定の配列要求を
持っている。（サイモンズ（Symons), R. Ann. Rev of
Biochem.６１：６４１−６７１，１９９２）。
ボザイムは、核酸を切断するための標的となることがで
きる。しかし、特異的標的切断部位は一定の配列要求を
持っている。（サイモンズ（Symons), R. Ann. Rev of
Biochem.６１：６４１−６７１，１９９２）。
【０００５】核酸を切断する他の方法には、非特異的ヌ
クレアーゼの利用がある。ヌクレアーゼは核酸を切断す
る酵素である。上述した制限エンドヌクレアーゼ等のエ
ンドヌクレアーゼは、内部のリン酸ジエステル結合の加
水分解により核酸を切断する。制限エンドヌクレアーゼ
は特異的なヌクレオチド配列でのみ切断するが、マング
ビーン(Mang Bean) ヌクレアーゼ等の他のエンドヌクレ
アーゼは配列特異性ではない。対照的に、エクソヌクレ
アーゼは核酸鎖を末端から切断する。構造特異的ヌクレ
アーゼの例としては、一本鎖核酸を分解するヌクレアー
ゼであるヘビ毒ホスホジエステラーゼＩがある。エクソ
ヌクレアーゼあるいはエンドヌクレアーゼ等の非配列特
異性ヌクレアーゼは、配列特異的様式で核酸分子を切断
するのに直接用いることはできない。
クレアーゼの利用がある。ヌクレアーゼは核酸を切断す
る酵素である。上述した制限エンドヌクレアーゼ等のエ
ンドヌクレアーゼは、内部のリン酸ジエステル結合の加
水分解により核酸を切断する。制限エンドヌクレアーゼ
は特異的なヌクレオチド配列でのみ切断するが、マング
ビーン(Mang Bean) ヌクレアーゼ等の他のエンドヌクレ
アーゼは配列特異性ではない。対照的に、エクソヌクレ
アーゼは核酸鎖を末端から切断する。構造特異的ヌクレ
アーゼの例としては、一本鎖核酸を分解するヌクレアー
ゼであるヘビ毒ホスホジエステラーゼＩがある。エクソ
ヌクレアーゼあるいはエンドヌクレアーゼ等の非配列特
異性ヌクレアーゼは、配列特異的様式で核酸分子を切断
するのに直接用いることはできない。
【０００６】ＲＮＡは、ＲＮアーゼＰ等のＲＮアーゼの
配列特異的認識部位として働くアダプター分子の雑種形
成を介して特異的部位で切断される（リーら（Li et a
l.) Proc. Natl. Acad. Sci.,８９：３１８５−３１８
９，１９９２）。分子生物学の分野では、制限エンドヌ
クレアーゼによって認識された配列に限定されないあら
ゆる特異的配列で核酸を切断する技術が必要とされてい
る。
配列特異的認識部位として働くアダプター分子の雑種形
成を介して特異的部位で切断される（リーら（Li et a
l.) Proc. Natl. Acad. Sci.,８９：３１８５−３１８
９，１９９２）。分子生物学の分野では、制限エンドヌ
クレアーゼによって認識された配列に限定されないあら
ゆる特異的配列で核酸を切断する技術が必要とされてい
る。
【０００７】ＤＮＡポリメラーゼ ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）は、ＤＮＡ鎖の合成を
触媒する。また多くのＤＮＡＰは、ヌクレアーゼ活性を
持つことが知られている。
触媒する。また多くのＤＮＡＰは、ヌクレアーゼ活性を
持つことが知られている。
【０００８】数種のＤＮＡＰは、ＤＮＡ鎖の５’及び
３’末端からヌクレオチドを取り除くことが知られてい
る（コルンベルクら（Kornberg, et al.),「ＤＮＡの複
製」 (DNA Replication)、第２版、W.H.フリーマンアン
ドカンパニー(Freeman and Co)出版社、１９９２）。こ
れらの活性は、通常「５’エキソヌクレアーゼ」及び
「３’エキソヌクレアーゼ」とそれぞれ呼ばれている。
例えば数種ＤＮＡＰのＮ−末端領域に位置する５’エキ
ソヌクレアーゼ活性は、複製におけるラギング鎖合成中
のＲＮＡプライマーの除去及び修復中の破損ヌクレオチ
ドの除去にあずかる。大腸菌(E. coli) から分離された
もの（ＤＮＡＰＥｃｌ）等の数種のＤＮＡＰはまた、合
成中のプルーフ・リーディング(proof reading) にあず
かる３’エキソヌクレアーゼ活性をも有する( コルンベ
ルク（Kornberg) ，前出) 。
３’末端からヌクレオチドを取り除くことが知られてい
る（コルンベルクら（Kornberg, et al.),「ＤＮＡの複
製」 (DNA Replication)、第２版、W.H.フリーマンアン
ドカンパニー(Freeman and Co)出版社、１９９２）。こ
れらの活性は、通常「５’エキソヌクレアーゼ」及び
「３’エキソヌクレアーゼ」とそれぞれ呼ばれている。
例えば数種ＤＮＡＰのＮ−末端領域に位置する５’エキ
ソヌクレアーゼ活性は、複製におけるラギング鎖合成中
のＲＮＡプライマーの除去及び修復中の破損ヌクレオチ
ドの除去にあずかる。大腸菌(E. coli) から分離された
もの（ＤＮＡＰＥｃｌ）等の数種のＤＮＡＰはまた、合
成中のプルーフ・リーディング(proof reading) にあず
かる３’エキソヌクレアーゼ活性をも有する( コルンベ
ルク（Kornberg) ，前出) 。
【０００９】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰＴ
ａｑ）と呼ばれるサームス・アクアティカス(Thermus a
quaticus) から分離されたＤＮＡＰは、５’エキソヌク
レアーゼ活性をもつが、機能性３’エキソヌクレオリテ
ィックドメインを欠く( ローヤーら(Lawyer, et.al.),
J. Biol. Chem. Sci.,１２：２８８，１９８７) 。それ
ぞれクレナウ(Klenow)断片（ＤＮＡＰＫｌn ）及びスト
ッフェル(Stoffel) 断片（ＤＮＡＰＳtf）と呼ばれるＤ
ＮＡＰＥｃｌ及びＤＮＡＰＴａｑの誘導体は、酵素的あ
るいは遺伝的操作の結果として５’エキソヌクレアーゼ
ドメインを欠いている（ブルトラーグら（Brutlag, et
al.), Biochem. Biophys. Res. Commun., ３７：９８
２，１９６９；エルリッヒら(Erlich, et al.), Scienc
e,２５２：１６４３，１９９１；セトロウら(Setlow, e
t al.), J. Biol. Chem., ２４７：２３２，１９7
２）。ＤＮＡＰＴａｑの５’エキソヌクレアーゼ活性
は、同時合成を要すると報告されている（Ｄ．Ｈ．ゲル
ファンド(Gelfand),ＰＣＲ技術；ＤＮＡ増幅の原理と応
用(PCR Technology; Principles and Application For
DNAAmplification)、ヘンリーA エルリッヒ(Henry A.Er
lich)編、Stockto Press 、１７、１９８９）。ＤＮＡ
ＰＴａｑ及びＤＮＡＰＥｃｌの５’エキソヌクレアーゼ
の消化産物は殆どがモノヌクレオチドであるが、短いオ
リゴヌクレオチド（１２ヌクレオチド以下）も観察する
ことができ、このことより、これらいわゆる５’エキソ
ヌクレアーゼは、エンドヌクレオリティックに(endonuc
leolitically)機能できることが示唆される。（セトロ
ウ（Setlow),前出；ホーランドら(Holland, et al.), P
roc. Natl. Acad . Sci ．ＵＳＡ．，８８：７２７６，
１９９１）。それゆえ、我々はこれらの活性を「５’ヌ
クレアーゼ」と呼ぶことにしたい。
ａｑ）と呼ばれるサームス・アクアティカス(Thermus a
quaticus) から分離されたＤＮＡＰは、５’エキソヌク
レアーゼ活性をもつが、機能性３’エキソヌクレオリテ
ィックドメインを欠く( ローヤーら(Lawyer, et.al.),
J. Biol. Chem. Sci.,１２：２８８，１９８７) 。それ
ぞれクレナウ(Klenow)断片（ＤＮＡＰＫｌn ）及びスト
ッフェル(Stoffel) 断片（ＤＮＡＰＳtf）と呼ばれるＤ
ＮＡＰＥｃｌ及びＤＮＡＰＴａｑの誘導体は、酵素的あ
るいは遺伝的操作の結果として５’エキソヌクレアーゼ
ドメインを欠いている（ブルトラーグら（Brutlag, et
al.), Biochem. Biophys. Res. Commun., ３７：９８
２，１９６９；エルリッヒら(Erlich, et al.), Scienc
e,２５２：１６４３，１９９１；セトロウら(Setlow, e
t al.), J. Biol. Chem., ２４７：２３２，１９7
２）。ＤＮＡＰＴａｑの５’エキソヌクレアーゼ活性
は、同時合成を要すると報告されている（Ｄ．Ｈ．ゲル
ファンド(Gelfand),ＰＣＲ技術；ＤＮＡ増幅の原理と応
用(PCR Technology; Principles and Application For
DNAAmplification)、ヘンリーA エルリッヒ(Henry A.Er
lich)編、Stockto Press 、１７、１９８９）。ＤＮＡ
ＰＴａｑ及びＤＮＡＰＥｃｌの５’エキソヌクレアーゼ
の消化産物は殆どがモノヌクレオチドであるが、短いオ
リゴヌクレオチド（１２ヌクレオチド以下）も観察する
ことができ、このことより、これらいわゆる５’エキソ
ヌクレアーゼは、エンドヌクレオリティックに(endonuc
leolitically)機能できることが示唆される。（セトロ
ウ（Setlow),前出；ホーランドら(Holland, et al.), P
roc. Natl. Acad . Sci ．ＵＳＡ．，８８：７２７６，
１９９１）。それゆえ、我々はこれらの活性を「５’ヌ
クレアーゼ」と呼ぶことにしたい。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は一本鎖の核酸分
子を切断する方法に関する。以下、この一本鎖核酸分子
を「標的」分子と呼ぶ。
子を切断する方法に関する。以下、この一本鎖核酸分子
を「標的」分子と呼ぶ。
【００１１】第一に、切断構造は標的核酸とパイロット
核酸を含んで形成される。標的核酸の第一領域は、パイ
ロット核酸へアニーリングされて二重らせん構造を形成
する。その二重らせんへ隣接する標的核酸の第二領域
は、パイロット核酸へアニーリングされておらず、その
ためアニーリング領域と非アニーリング領域との間に接
合部位を形成している。
核酸を含んで形成される。標的核酸の第一領域は、パイ
ロット核酸へアニーリングされて二重らせん構造を形成
する。その二重らせんへ隣接する標的核酸の第二領域
は、パイロット核酸へアニーリングされておらず、その
ためアニーリング領域と非アニーリング領域との間に接
合部位を形成している。
【００１２】第二に、この切断構造は標的部位で優先的
に切断構造を切断することができる切断剤と接触され
る。切断剤は、切断構造の配列に無関係に作用する。
に切断構造を切断することができる切断剤と接触され
る。切断剤は、切断構造の配列に無関係に作用する。
【００１３】第三に、切断構造及び切断剤は、切断がお
こる条件下でインキュベートされる。
こる条件下でインキュベートされる。
【００１４】本発明の好ましい態様において、パイロッ
ト核酸は標的分子へ共有結合的に結合している。本発明
の他の好ましい態様においては、パイロット核酸はオリ
ゴヌクレオチドである。
ト核酸は標的分子へ共有結合的に結合している。本発明
の他の好ましい態様においては、パイロット核酸はオリ
ゴヌクレオチドである。
【００１５】本発明の好ましい態様において、切断を行
う実体は酵素である。本発明の特に好ましい態様におい
て、切断剤はＤＮＡポリメラーゼのドメインである。本
発明の他の好ましい態様においては、切断剤は熱安定性
である。
う実体は酵素である。本発明の特に好ましい態様におい
て、切断剤はＤＮＡポリメラーゼのドメインである。本
発明の他の好ましい態様においては、切断剤は熱安定性
である。
【００１６】本発明の他の好ましい態様において、本発
明方法の第三の段階は４０℃〜８５℃の間の温度処理で
ある。
明方法の第三の段階は４０℃〜８５℃の間の温度処理で
ある。
【００１７】本発明の好ましい態様において、標的部位
は前記結合部位の二つのヌクレオチドの内部である。
は前記結合部位の二つのヌクレオチドの内部である。
【００１８】本発明の目的は、特異的部位においてＲＮ
Ａ、ＤＮＡ分子等の核酸分子を切断することである。
Ａ、ＤＮＡ分子等の核酸分子を切断することである。
【００１９】本発明の特徴は、核酸分子が配列非依存的
様式(sequence independent manner) で、あらゆる所望
の部位で切断できることである。
様式(sequence independent manner) で、あらゆる所望
の部位で切断できることである。
【００２０】本発明の利点は、切断が高温で行えること
である。
である。
【００２１】本発明の他の利点は、切断部位が特異的制
限エンドヌクレアーゼ部位に制限されないことである。
限エンドヌクレアーゼ部位に制限されないことである。
【００２２】本発明の他の目的、利点及び特徴は、以下
の明細書、図面及び特許請求の範囲の考察により明らか
となる。
の明細書、図面及び特許請求の範囲の考察により明らか
となる。
【００２３】１ 概説 本発明は、核酸分子を切断する方法に関する。「核酸」
とは、あらゆるポリヌクレオチドを意味する。この方法
は、配列よりも構造によって基質を認識するＤＮＡポリ
メラーゼの５’ヌクレアーゼ（ＤＮＡＰ）の利点を利用
するものである。この特徴は、所望の部位で基質を切断
することを酵素に指令する適当なパイロット核酸へ高温
で標的配列をアニーリングすることにより、酵素に対し
て配列特異性を課すことによって利用できる。また、二
つの類似の核酸又は核酸を含む複合体との配列又は構造
的相違を分析するための間接的プローブとしても用いる
ことができる。
とは、あらゆるポリヌクレオチドを意味する。この方法
は、配列よりも構造によって基質を認識するＤＮＡポリ
メラーゼの５’ヌクレアーゼ（ＤＮＡＰ）の利点を利用
するものである。この特徴は、所望の部位で基質を切断
することを酵素に指令する適当なパイロット核酸へ高温
で標的配列をアニーリングすることにより、酵素に対し
て配列特異性を課すことによって利用できる。また、二
つの類似の核酸又は核酸を含む複合体との配列又は構造
的相違を分析するための間接的プローブとしても用いる
ことができる。
【００２４】図１は、本発明に適するヌクレオチド基質
を表す模式図である。ここで適当な基質を「切断構造」
と称する。図１に示すように、本発明の切断構造は標的
分子とパイロット核酸とを含んでなる。標的核酸分子
は、図１中のパイロット「オリゴヌクレオチド」と呼ば
れるパイロット核酸をアニーリングするのに十分相補性
である第一領域を有する。アニーリング後、図１の標的
分子の５’領域は遊離(free)となり、標的分子の３’領
域がアニーリングされる。図１の構造を「二股状二重ら
せん」と称する。アニーリング領域及び非アニーリング
領域は「接合部位」を決定する。「接合部位」とは二重
らせん型の第一ヌクレオチドと非アニーリングのヌクレ
オチドとの間の部位を意味する。
を表す模式図である。ここで適当な基質を「切断構造」
と称する。図１に示すように、本発明の切断構造は標的
分子とパイロット核酸とを含んでなる。標的核酸分子
は、図１中のパイロット「オリゴヌクレオチド」と呼ば
れるパイロット核酸をアニーリングするのに十分相補性
である第一領域を有する。アニーリング後、図１の標的
分子の５’領域は遊離(free)となり、標的分子の３’領
域がアニーリングされる。図１の構造を「二股状二重ら
せん」と称する。アニーリング領域及び非アニーリング
領域は「接合部位」を決定する。「接合部位」とは二重
らせん型の第一ヌクレオチドと非アニーリングのヌクレ
オチドとの間の部位を意味する。
【００２５】アニーリング反応後、アニーリングされた
分子は切断剤へ接触される。「切断剤」とは、特異的部
位で切断構造を切断できるＤＮＡＰ、ＤＮＡＰのドメイ
ン、あるいは合成蛋白質又はペプチド等の分子を意味す
る。切断剤の好ましい例はＤＮＡＴａｑ等のＤＮＡＰの
５’ヌクレアーゼ活性である。
分子は切断剤へ接触される。「切断剤」とは、特異的部
位で切断構造を切断できるＤＮＡＰ、ＤＮＡＰのドメイ
ン、あるいは合成蛋白質又はペプチド等の分子を意味す
る。切断剤の好ましい例はＤＮＡＴａｑ等のＤＮＡＰの
５’ヌクレアーゼ活性である。
【００２６】切断構造を切断剤へ接触後、この構造及び
作用剤を切断が起こる条件下にインキュベートする。以
下の実施例は、ＤＮＡＰＴａｑ、ＤＮＡＰＴｆｌ，ＤＮ
ＡＰＴｔｈ及びＤＮＡＰＥｃｌ等の用いられた種々の特
異的切断剤に適する条件を開示する。しかしながら、分
子生物学の当業者であれば、他の切断剤に適当な条件を
決定できるであろう。
作用剤を切断が起こる条件下にインキュベートする。以
下の実施例は、ＤＮＡＰＴａｑ、ＤＮＡＰＴｆｌ，ＤＮ
ＡＰＴｔｈ及びＤＮＡＰＥｃｌ等の用いられた種々の特
異的切断剤に適する条件を開示する。しかしながら、分
子生物学の当業者であれば、他の切断剤に適当な条件を
決定できるであろう。
【００２７】インキュベーション後、標的分子は切断部
位で切断される。切断部位の正確な位置は図１〜図４に
示す。図１の二股状二重らせんを切断剤と一緒にインキ
ュベートした場合、その切断部位は接合部位の二つのヌ
クレオチドの内側である。プライマー（以下及び図２及
び図３で説明する）が切断構造の一部である場合、もし
プライマーが図２及び図３で示すように接合部位に伸長
するならば、その切断部位は接合部位の２つのヌクレオ
チドの内側である。もしプライマーが接合部位へ伸長し
ないならば、その切断部位は標的ヌクレオチドの５’ア
ーム内の部位へ位置を変える。
位で切断される。切断部位の正確な位置は図１〜図４に
示す。図１の二股状二重らせんを切断剤と一緒にインキ
ュベートした場合、その切断部位は接合部位の二つのヌ
クレオチドの内側である。プライマー（以下及び図２及
び図３で説明する）が切断構造の一部である場合、もし
プライマーが図２及び図３で示すように接合部位に伸長
するならば、その切断部位は接合部位の２つのヌクレオ
チドの内側である。もしプライマーが接合部位へ伸長し
ないならば、その切断部位は標的ヌクレオチドの５’ア
ーム内の部位へ位置を変える。
【００２８】本発明方法では一本鎖分子を必要とする。
しかしながら二本鎖分子の切断を望む場合は、二本鎖分
子を変性させ、個々のパイロットオリゴヌクレオチドを
両鎖中の所望の切断部位に形成することが必要である。
しかしながら二本鎖分子の切断を望む場合は、二本鎖分
子を変性させ、個々のパイロットオリゴヌクレオチドを
両鎖中の所望の切断部位に形成することが必要である。
【００２９】パイロット核酸は、標的分子へ共有結合的
に結合するか、あるいはオリゴヌクレオチドのように外
因的に加えられた核酸分子となることができる。図１に
おいては、該パイロットは標的分子へ加えられているオ
リゴヌクレオチドとして示されている。しかし、アニー
リングしているパイロット核酸は、標的分子の第１セク
ションに対して相補性な標的分子の別領域となることが
できる。
に結合するか、あるいはオリゴヌクレオチドのように外
因的に加えられた核酸分子となることができる。図１に
おいては、該パイロットは標的分子へ加えられているオ
リゴヌクレオチドとして示されている。しかし、アニー
リングしているパイロット核酸は、標的分子の第１セク
ションに対して相補性な標的分子の別領域となることが
できる。
【００３０】好ましくは切断剤は、ＤＮＡＰＴａｑであ
る。ＤＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼが、長い５’伸
長部を放出できる特異的エンドヌクレアーゼであるとい
う我々の観察は、ＤＮＡＰの５’ヌクレアーゼ活性に関
するこれまでの研究（セトロウ（Setlow),前出；ホーラ
ンド(Holland),前出）が、数個のヌクレオチドより長い
生成物を報告していないことから、予期しないものであ
った。同様にＤＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼに関す
る発表も、このヌクレアーゼ活性が組み換え体の合成を
必要としたことを指摘した( ローヤー(Lawyer), 前出；
ホーランド(Holland),前出）。この要求は、プライマー
依存の切断を阻害する高濃度のＫＣｌ中で行った反応に
おいて観察されており、加えられたプライマーは切断部
位まで伸長されていなければならなかったものであろ
う。
る。ＤＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼが、長い５’伸
長部を放出できる特異的エンドヌクレアーゼであるとい
う我々の観察は、ＤＮＡＰの５’ヌクレアーゼ活性に関
するこれまでの研究（セトロウ（Setlow),前出；ホーラ
ンド(Holland),前出）が、数個のヌクレオチドより長い
生成物を報告していないことから、予期しないものであ
った。同様にＤＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼに関す
る発表も、このヌクレアーゼ活性が組み換え体の合成を
必要としたことを指摘した( ローヤー(Lawyer), 前出；
ホーランド(Holland),前出）。この要求は、プライマー
依存の切断を阻害する高濃度のＫＣｌ中で行った反応に
おいて観察されており、加えられたプライマーは切断部
位まで伸長されていなければならなかったものであろ
う。
【００３１】好ましくはインキュベーション工程は４０
〜８５℃の間の温度で行い、切断剤は熱安定性酵素であ
る。これは、ＤＮＡＰＴａｑ又は他の熱安定性の酵素が
用いられる場合、切断反応が７５℃またはそれ以上で行
われるためであり、また研究者が標的とパイロットオリ
ゴヌクレオチドとの相互作用が高温で安定であることを
利用して切断部位に対して高度な特異性を課すことがで
きるからである。（「熱安定性」とは、４０℃以上のイ
ンキュベーション温度、好ましくは７０℃以上のインキ
ュベーション温度で、切断を起こすために十分な時間の
間安定な酵素をいう。）高度な配列特異性は、ＰＣＲ増
幅におけるある種の鋳型に対する選択に有用である。さ
らにこの特異性は、一本鎖コンホーメーション多型性に
よって分析できるような最適サイズの核酸断片の生産に
利用できる（ＳＳＣＰ，オリタら(Orita, et al.), Gen
omics ５：８７４，１９８９；K.ハヤシ(Hayaski), PCR
Meth. and Appl.１：３４，１９９１）。
〜８５℃の間の温度で行い、切断剤は熱安定性酵素であ
る。これは、ＤＮＡＰＴａｑ又は他の熱安定性の酵素が
用いられる場合、切断反応が７５℃またはそれ以上で行
われるためであり、また研究者が標的とパイロットオリ
ゴヌクレオチドとの相互作用が高温で安定であることを
利用して切断部位に対して高度な特異性を課すことがで
きるからである。（「熱安定性」とは、４０℃以上のイ
ンキュベーション温度、好ましくは７０℃以上のインキ
ュベーション温度で、切断を起こすために十分な時間の
間安定な酵素をいう。）高度な配列特異性は、ＰＣＲ増
幅におけるある種の鋳型に対する選択に有用である。さ
らにこの特異性は、一本鎖コンホーメーション多型性に
よって分析できるような最適サイズの核酸断片の生産に
利用できる（ＳＳＣＰ，オリタら(Orita, et al.), Gen
omics ５：８７４，１９８９；K.ハヤシ(Hayaski), PCR
Meth. and Appl.１：３４，１９９１）。
【００３２】本発明において好ましい他の切断剤は、サ
ームス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)、サー
ムス・フラバス(Thermus flavus) のＤＮＡＰである。
しかしながら、本発明方法は、ＤＮＡＰＥｃｌ等の非熱
安定性酵素にも適し、これらの酵素に適当な温度条件に
おいてもインキュベーション工程を行うことができる。
ームス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)、サー
ムス・フラバス(Thermus flavus) のＤＮＡＰである。
しかしながら、本発明方法は、ＤＮＡＰＥｃｌ等の非熱
安定性酵素にも適し、これらの酵素に適当な温度条件に
おいてもインキュベーション工程を行うことができる。
【００３３】２．パイロットオリゴヌクレオチドを用い
た標的核酸分子の切断 本発明の好ましい実施態様において、切断構造のパイロ
ット核酸成分は、所望の切断部位の３’側上の一定の長
さの配列、及び５’側上の一個のヌクレオチドに相補性
であるようにデザインされたオリゴヌクレオチドであ
る。図１はこの組み立て及び特異的切断部位を説明して
いる。二本鎖分子中で切断されると、二本鎖分子は変性
し、分離されたパイロットオリゴヌクレオチドによっ
て、以下に述べる手順が両方の鎖に施される。二本鎖核
酸分子を変性させる好ましい方法は、該分子の「溶融温
度」以上の温度へ該分子を加熱することである。
た標的核酸分子の切断 本発明の好ましい実施態様において、切断構造のパイロ
ット核酸成分は、所望の切断部位の３’側上の一定の長
さの配列、及び５’側上の一個のヌクレオチドに相補性
であるようにデザインされたオリゴヌクレオチドであ
る。図１はこの組み立て及び特異的切断部位を説明して
いる。二本鎖分子中で切断されると、二本鎖分子は変性
し、分離されたパイロットオリゴヌクレオチドによっ
て、以下に述べる手順が両方の鎖に施される。二本鎖核
酸分子を変性させる好ましい方法は、該分子の「溶融温
度」以上の温度へ該分子を加熱することである。
【００３４】その基本的手順は、該パイロットの５’末
端が一本鎖の標的分子と二重らせんを形成し、該パイロ
ットの３’末端が標的と対をなさないように、パイロッ
トオリゴヌクレオチドを部分的にアニーリングすること
である。これにより、図１に表したような二股構造が形
成される。さらに図１に示すように、標的分子の不対の
５’領域を５’アーム(arm) と呼び、パイロットオリゴ
ヌクレオチドの不対の３’領域を３’アームと呼ぶ。
端が一本鎖の標的分子と二重らせんを形成し、該パイロ
ットの３’末端が標的と対をなさないように、パイロッ
トオリゴヌクレオチドを部分的にアニーリングすること
である。これにより、図１に表したような二股構造が形
成される。さらに図１に示すように、標的分子の不対の
５’領域を５’アーム(arm) と呼び、パイロットオリゴ
ヌクレオチドの不対の３’領域を３’アームと呼ぶ。
【００３５】形成された複合体は次いで切断剤に接触さ
れ、標的分子は５’領域内で、二重らせん中の１つのヌ
クレオチドが切断される。図１に示すように、標的分子
が切断される部位を「切断部位」と呼ぶ。
れ、標的分子は５’領域内で、二重らせん中の１つのヌ
クレオチドが切断される。図１に示すように、標的分子
が切断される部位を「切断部位」と呼ぶ。
【００３６】長い５’アームには、切断を阻害する構造
を含むこともある。この構造は、反応を熱安定な５’ヌ
クレアーゼを用いて昇温して行うことにより取り除くこ
とができる。
を含むこともある。この構造は、反応を熱安定な５’ヌ
クレアーゼを用いて昇温して行うことにより取り除くこ
とができる。
【００３７】図１に示す配列は、不対の３’アームを有
する。このアームは、ヌクレオチド１個程度の短いもの
であるか、あるいは極めて長い（２５００個以上のヌク
レオチド）場合もある。この種の複合体中の標的分子の
切断は、「プライマー非依存型(primer-independent)」
切断と称され、３’アームへアニーリングされるプライ
マーの欠如を反映する。過剰のパイロットオリゴヌクレ
オチドは、非特異的結合を妨げる温度において、標的Ｄ
ＮＡへアニーリングされる。酵素に適当なpHを維持する
ため、反応緩衝液を選択し、塩を低濃度にする。例え
ば、ＤＮＡＰＴａｑの５’エキソヌクレアーゼ活性を切
断剤として用いる場合は、緩衝液はpH８．５（２０℃
下）に調整し、塩は２０mM程度のＫＣｌとするのが最も
好ましい。約４０mM以上のＫＣｌ濃度は図１の構造にお
いて標的分子の切断を阻害することが認められた。従前
のＤＮＡＰＴａｑを用いた合成反応においては、最適塩
濃度として通常５０mM以下とされていた。
する。このアームは、ヌクレオチド１個程度の短いもの
であるか、あるいは極めて長い（２５００個以上のヌク
レオチド）場合もある。この種の複合体中の標的分子の
切断は、「プライマー非依存型(primer-independent)」
切断と称され、３’アームへアニーリングされるプライ
マーの欠如を反映する。過剰のパイロットオリゴヌクレ
オチドは、非特異的結合を妨げる温度において、標的Ｄ
ＮＡへアニーリングされる。酵素に適当なpHを維持する
ため、反応緩衝液を選択し、塩を低濃度にする。例え
ば、ＤＮＡＰＴａｑの５’エキソヌクレアーゼ活性を切
断剤として用いる場合は、緩衝液はpH８．５（２０℃
下）に調整し、塩は２０mM程度のＫＣｌとするのが最も
好ましい。約４０mM以上のＫＣｌ濃度は図１の構造にお
いて標的分子の切断を阻害することが認められた。従前
のＤＮＡＰＴａｑを用いた合成反応においては、最適塩
濃度として通常５０mM以下とされていた。
【００３８】前記アニーリングされた複合体は次いで切
断剤と接触され、標的分子の切断を基質と生成物の電気
泳動等の一般的方法によってモニターする。
断剤と接触され、標的分子の切断を基質と生成物の電気
泳動等の一般的方法によってモニターする。
【００３９】この切断様式は、標的核酸内のモノヌクレ
オチド又はポリヌクレオチドの配列差異を検出するのに
も有用である。ある標的核酸が特異的位置に一定のヌク
レオチドをもっているかどうかを検出するため、別方法
で、既知の配列内で（例えば特異的部位の突然変異）１
つの配列選択へ完全に雑種形成し、一方他の選択ではそ
の最も先端の３’末端で少なくとも１つの不適合ヌクレ
オチドを形成するようにパイロットオリゴヌクレオチド
をデザインすることができる。切断がうまく行われれ
ば、該パイロットオリゴヌクレオチドが標的核酸へ完全
に相補性でないことが示される。
オチド又はポリヌクレオチドの配列差異を検出するのに
も有用である。ある標的核酸が特異的位置に一定のヌク
レオチドをもっているかどうかを検出するため、別方法
で、既知の配列内で（例えば特異的部位の突然変異）１
つの配列選択へ完全に雑種形成し、一方他の選択ではそ
の最も先端の３’末端で少なくとも１つの不適合ヌクレ
オチドを形成するようにパイロットオリゴヌクレオチド
をデザインすることができる。切断がうまく行われれ
ば、該パイロットオリゴヌクレオチドが標的核酸へ完全
に相補性でないことが示される。
【００４０】標的核酸とパイロットオリゴヌクレオチド
の他の配列を図２に示す。図２の配列は、パイロットオ
リゴヌクレオチドの３’アームへ、アニーリングされた
「プライマー」と称される他のオリゴヌクレオチドを含
んでいる。アニーリングされたプライマーの３’末端
は、接合部位の１５個のヌクレオチド内にあることが好
ましい。プライマーの３’末端が接合部位の４個のヌク
レオチド内にあることが、さらに好ましい。さらに、プ
ライマーの３’末端が接合部位の１個のヌクレオチド内
にあることが最も好ましい。
の他の配列を図２に示す。図２の配列は、パイロットオ
リゴヌクレオチドの３’アームへ、アニーリングされた
「プライマー」と称される他のオリゴヌクレオチドを含
んでいる。アニーリングされたプライマーの３’末端
は、接合部位の１５個のヌクレオチド内にあることが好
ましい。プライマーの３’末端が接合部位の４個のヌク
レオチド内にあることが、さらに好ましい。さらに、プ
ライマーの３’末端が接合部位の１個のヌクレオチド内
にあることが最も好ましい。
【００４１】この構造の切断を「プライマー指令型(pri
mer-directed) 」切断と称する。我々はプライマー指令
型切断がより高い頻度で起こり、反応混合物中の塩濃度
に比較的影響されないことを見出した。図２に表した複
合体は、プライマー非依存型切断（図１）の塩抑制を許
容する利点を持っている。従って、二次的構造での偶発
的切断を、５０mM程度あるいはそれ以上の濃度のＫＣｌ
の包含によって抑制することができる。
mer-directed) 」切断と称する。我々はプライマー指令
型切断がより高い頻度で起こり、反応混合物中の塩濃度
に比較的影響されないことを見出した。図２に表した複
合体は、プライマー非依存型切断（図１）の塩抑制を許
容する利点を持っている。従って、二次的構造での偶発
的切断を、５０mM程度あるいはそれ以上の濃度のＫＣｌ
の包含によって抑制することができる。
【００４２】プライマーは、プライマー／パイロット二
重らせんが、パイロット／標的のアニーリングのために
選ばれた温度で十分長期間安定であり、好ましくはすべ
てのパイロットオリゴヌクレオチド３’アームを飽和す
るのに十分高濃度であることを条件として、いかなる配
列をもとることができる。特異的部位で標的分子を切断
するため、前述のプライマー非依存型切断で述べた反応
を組み合わせる。本発明の好ましい態様においては、あ
らゆるプライマーを欠く構造での切断を抑制するため、
５０mMあるいはそれ以上へＫＣｌの濃度を増加してい
る。５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素へ接触させた
後、前述のように切断をモニターする。
重らせんが、パイロット／標的のアニーリングのために
選ばれた温度で十分長期間安定であり、好ましくはすべ
てのパイロットオリゴヌクレオチド３’アームを飽和す
るのに十分高濃度であることを条件として、いかなる配
列をもとることができる。特異的部位で標的分子を切断
するため、前述のプライマー非依存型切断で述べた反応
を組み合わせる。本発明の好ましい態様においては、あ
らゆるプライマーを欠く構造での切断を抑制するため、
５０mMあるいはそれ以上へＫＣｌの濃度を増加してい
る。５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素へ接触させた
後、前述のように切断をモニターする。
【００４３】プライマー指令型切断の別法を図３に示
す。この場合には、パイロットオリゴヌクレオチドは、
必須(intergral) プライマーとして働く３’末端ヘアピ
ン(hair pin)を有する。ヘアピンのループ末端はテトラ
ループと称され、ステムループ構造へ並外れた熱安定性
を付与する特異的配列となっている( アンタオら(Antao
et al.), Nucl. Acids Res., １９：５９０１，１９９
１）。プライマーがパイロット核酸と共有結合的に結合
している場合は、３’アームへアニーリングされるプラ
イマーの存在はプライマー濃度とは関連しない。このよ
うなパイロットの存在下での標的分子の切断は、ランダ
ム切断の塩抑制等のプライマー指令型切断のあらゆる利
点を有し、かつ唯一のオリゴヌクレオチドの添加を要求
する。
す。この場合には、パイロットオリゴヌクレオチドは、
必須(intergral) プライマーとして働く３’末端ヘアピ
ン(hair pin)を有する。ヘアピンのループ末端はテトラ
ループと称され、ステムループ構造へ並外れた熱安定性
を付与する特異的配列となっている( アンタオら(Antao
et al.), Nucl. Acids Res., １９：５９０１，１９９
１）。プライマーがパイロット核酸と共有結合的に結合
している場合は、３’アームへアニーリングされるプラ
イマーの存在はプライマー濃度とは関連しない。このよ
うなパイロットの存在下での標的分子の切断は、ランダ
ム切断の塩抑制等のプライマー指令型切断のあらゆる利
点を有し、かつ唯一のオリゴヌクレオチドの添加を要求
する。
【００４４】ＲＮＡ標的分子の切断は、前記のあらゆる
複合体の形成によって達成でき、さらに、図４に示すも
のでは、パイロットオリゴヌクレオチドが遊離の３’ア
ームをもっていない。この配列は、雑種形成及び／又は
逆転写のためにデザインされたオリゴヌクレオチドをパ
イロットオリゴヌクレオチドとして用い、実験に適する
場合は、その逆の使用もできるという利点を持ってい
る。
複合体の形成によって達成でき、さらに、図４に示すも
のでは、パイロットオリゴヌクレオチドが遊離の３’ア
ームをもっていない。この配列は、雑種形成及び／又は
逆転写のためにデザインされたオリゴヌクレオチドをパ
イロットオリゴヌクレオチドとして用い、実験に適する
場合は、その逆の使用もできるという利点を持ってい
る。
【００４５】ＲＮＡ切断は、構造研究あるいは欠稜タン
パク質研究における後続の翻訳のためのＲＮＡ断片の作
製に利用される。本発明方法では５’ヌクレアーゼは、
ＲＮＡ／ＤＮＡ異種二重らせんにそって数部位でＲＮＡ
を切断する前述のＲＮアーゼＨと対照的に、単一の予知
可能部位でＲＮＡを切断する。本反応はＤＮＡ切断に関
して前記したように組み立てられ、通常プライマー指令
型切断に用いられる高塩濃度条件下で行われる。
パク質研究における後続の翻訳のためのＲＮＡ断片の作
製に利用される。本発明方法では５’ヌクレアーゼは、
ＲＮＡ／ＤＮＡ異種二重らせんにそって数部位でＲＮＡ
を切断する前述のＲＮアーゼＨと対照的に、単一の予知
可能部位でＲＮＡを切断する。本反応はＤＮＡ切断に関
して前記したように組み立てられ、通常プライマー指令
型切断に用いられる高塩濃度条件下で行われる。
【００４６】３．内部アニーリングによる標的核酸の切
断 本発明の切断方法は、内的相同があるため分子の一部が
分子の他の一部とアニーリングを行う分子を切断するの
に用いることができる。この特徴は、変異体の特異配列
に関する事前の知見なしにＤＮＡ断片の内部配列差異を
検出するのに有用である。５’ヌクレアーゼの基質とし
て核酸を識別する二股状二重らせん構造は、一本鎖分子
自体が折りたたまれることを許容することによりつくら
れる。そのような折りたたまれた構造は、標的分子の
３’末端とパイロット核酸の５’末端が共有結合的に結
合することを除いて、図１〜図３に示したものに類似し
ている。一本鎖が折りたたまれた場合の構造は、その長
さ、特異的配列、反応温度、及び塩基対を安定化しある
いは分解する他の溶質並びに塩の存在に依存する。
断 本発明の切断方法は、内的相同があるため分子の一部が
分子の他の一部とアニーリングを行う分子を切断するの
に用いることができる。この特徴は、変異体の特異配列
に関する事前の知見なしにＤＮＡ断片の内部配列差異を
検出するのに有用である。５’ヌクレアーゼの基質とし
て核酸を識別する二股状二重らせん構造は、一本鎖分子
自体が折りたたまれることを許容することによりつくら
れる。そのような折りたたまれた構造は、標的分子の
３’末端とパイロット核酸の５’末端が共有結合的に結
合することを除いて、図１〜図３に示したものに類似し
ている。一本鎖が折りたたまれた場合の構造は、その長
さ、特異的配列、反応温度、及び塩基対を安定化しある
いは分解する他の溶質並びに塩の存在に依存する。
【００４７】核酸鎖内の単一ヌクレオチド程度の小さな
ものから、約３００ヌクレオチド長程度までの変化は、
非変性ゲル電気泳動による移動性の変化により十分検出
できるほど折りたたみ構造を変化させ（一本鎖コンホー
メーション多型性、ＳＳＣＰ）、多数の密接に関連する
分子間の識別を可能とするのに十分な特徴を与えるもの
である。この構造上の同一な変化は、本発明方法による
切断パターンの変化により判定できる。この分析方法は
対立遺伝子の相違等の人間の遺伝子変異の検査、あるい
は高度に多様化し、急速に変異するウィルスの異なる単
離株の特徴化等のより単純な生物の分析に利用できる。
ものから、約３００ヌクレオチド長程度までの変化は、
非変性ゲル電気泳動による移動性の変化により十分検出
できるほど折りたたみ構造を変化させ（一本鎖コンホー
メーション多型性、ＳＳＣＰ）、多数の密接に関連する
分子間の識別を可能とするのに十分な特徴を与えるもの
である。この構造上の同一な変化は、本発明方法による
切断パターンの変化により判定できる。この分析方法は
対立遺伝子の相違等の人間の遺伝子変異の検査、あるい
は高度に多様化し、急速に変異するウィルスの異なる単
離株の特徴化等のより単純な生物の分析に利用できる。
【００４８】ＲＮＡあるいはＤＮＡの特異的断片は、指
令型５’ヌクレアーゼ切断、制限的消化あるいは生体外
増幅（ＲＮＡに関する生体外転写、又はＤＮＡに関する
ＰＣＲ）によって生物から分離される。材料は、もし二
本鎖であれば熱により変性され、反応液は相補性鎖の即
時的再アニーリングを最小限として分子内相互作用を助
けるため十分に希釈する。反応は用いる酵素に適当なｐ
Ｈの緩衝液中で行い、ＤＮＡ鎖に沿って偶発的に起こる
基質構造の切断を許すため塩濃度を低くする。所望の数
の切断生成物を与えるのに、経験的に定めた温度と反応
時間で、この材料を切断剤に接触させる。低温で反応を
行うと、減少した切断速度を補償するのにより長時間の
インキュベーションが必要となる。反応生成物を分析
し、適当な標準品及び対照品と比較する。検定はオート
ラジオグラフィーで可視化して電気泳動で分離するか、
雑種形成膜へ移してプロービングして行う。
令型５’ヌクレアーゼ切断、制限的消化あるいは生体外
増幅（ＲＮＡに関する生体外転写、又はＤＮＡに関する
ＰＣＲ）によって生物から分離される。材料は、もし二
本鎖であれば熱により変性され、反応液は相補性鎖の即
時的再アニーリングを最小限として分子内相互作用を助
けるため十分に希釈する。反応は用いる酵素に適当なｐ
Ｈの緩衝液中で行い、ＤＮＡ鎖に沿って偶発的に起こる
基質構造の切断を許すため塩濃度を低くする。所望の数
の切断生成物を与えるのに、経験的に定めた温度と反応
時間で、この材料を切断剤に接触させる。低温で反応を
行うと、減少した切断速度を補償するのにより長時間の
インキュベーションが必要となる。反応生成物を分析
し、適当な標準品及び対照品と比較する。検定はオート
ラジオグラフィーで可視化して電気泳動で分離するか、
雑種形成膜へ移してプロービングして行う。
【００４９】重要な分子構造を反映する特徴的切断パタ
ーンが一定の核酸断片について確立された場合は、本発
明の切断反応をその構造中の変化の検定方法として用い
ることができる。前記した一種の変化は、突然変異ある
いは対立遺伝子変異の分析において観察されるように、
核酸自体の配列の一部が変化することに基因するもので
ある。他の変化は、切断分析前の核酸への異物の結合に
よって誘導できる。異物の例としては、相補性核酸（即
ちＲＮＡ又はＤＮＡプローブ）の断片、タンパク質（例
えば核酸結合タンパク質）、又は重要な核酸分子との相
互作用が期待できる他のものが挙げられる。
ーンが一定の核酸断片について確立された場合は、本発
明の切断反応をその構造中の変化の検定方法として用い
ることができる。前記した一種の変化は、突然変異ある
いは対立遺伝子変異の分析において観察されるように、
核酸自体の配列の一部が変化することに基因するもので
ある。他の変化は、切断分析前の核酸への異物の結合に
よって誘導できる。異物の例としては、相補性核酸（即
ちＲＮＡ又はＤＮＡプローブ）の断片、タンパク質（例
えば核酸結合タンパク質）、又は重要な核酸分子との相
互作用が期待できる他のものが挙げられる。
【００５０】例えば、核酸の構造に対するオリゴヌクレ
オチドの影響を観察するため、適当な塩類及び緩衝液中
で、標的分子を前記のように熱変性し、過剰の相補性オ
リゴヌクレオチドの存在下反応温度まで冷却降下させ
る。反応温度で切断剤を添加し、遊離の核酸に関して予
め定めた時間、核酸と相互反応させる。オリゴヌクレオ
チド又はヌクレアーゼを除いた対照反応を併行的に実施
する。インキュベーション期間終了時、酵素を不活化す
るＥＤＴＡを十分量加えるなどして反応を止め、前記し
たように切断パターンについて検定する。
オチドの影響を観察するため、適当な塩類及び緩衝液中
で、標的分子を前記のように熱変性し、過剰の相補性オ
リゴヌクレオチドの存在下反応温度まで冷却降下させ
る。反応温度で切断剤を添加し、遊離の核酸に関して予
め定めた時間、核酸と相互反応させる。オリゴヌクレオ
チド又はヌクレアーゼを除いた対照反応を併行的に実施
する。インキュベーション期間終了時、酵素を不活化す
るＥＤＴＡを十分量加えるなどして反応を止め、前記し
たように切断パターンについて検定する。
【００５１】我々は、加えた異物が切断部位と直接相互
作用を行う必要がないことに気づいた。それは、潜在的
切断部位の構造又は接近可能性を変化させる様式で標的
断片と相互作用することだけを必要とする。例えば、加
えられたオリゴヌクレオチドは、別の方法で切断構造の
形成に働きあるいは阻害する断片の領域を隔離すること
ができる。同様に、かかるオリゴヌクレオチドは、標的
分子内の部位でパイロット又はプライマーオリゴヌクレ
オチドとして切断に加わることができる。この種の実験
で異物に要求される唯一の点は、一定の反応条件で、一
定の核酸断片に対して、持続的かつ反復的に作用するこ
とである。
作用を行う必要がないことに気づいた。それは、潜在的
切断部位の構造又は接近可能性を変化させる様式で標的
断片と相互作用することだけを必要とする。例えば、加
えられたオリゴヌクレオチドは、別の方法で切断構造の
形成に働きあるいは阻害する断片の領域を隔離すること
ができる。同様に、かかるオリゴヌクレオチドは、標的
分子内の部位でパイロット又はプライマーオリゴヌクレ
オチドとして切断に加わることができる。この種の実験
で異物に要求される唯一の点は、一定の反応条件で、一
定の核酸断片に対して、持続的かつ反復的に作用するこ
とである。
【００５２】４．好適な切断剤 本発明においては、所望の切断部位で二股状二重らせん
を切断できる切断剤を必要とする。好適な切断剤とは、
配列非依存的様式で二股状二重らせんを切断できるもの
である。単に特異的配列で切断できる制限エンドヌクレ
アーゼは好適な切断剤とは言えない。特に適するヌクレ
アーゼは、ＤＮＡＰＴａｑ、ＤＮＡＰＴｆｌ及びＤＮＡ
ＰＴｔｈ等の熱安定酵素である。ＤＮＡＰＥｃｌのよう
な非熱安定性酵素も又、本発明において適するものであ
る。バクテリオファージＴ７の遺伝子６タンパク質も好
適な切断剤であると予想される。
を切断できる切断剤を必要とする。好適な切断剤とは、
配列非依存的様式で二股状二重らせんを切断できるもの
である。単に特異的配列で切断できる制限エンドヌクレ
アーゼは好適な切断剤とは言えない。特に適するヌクレ
アーゼは、ＤＮＡＰＴａｑ、ＤＮＡＰＴｆｌ及びＤＮＡ
ＰＴｔｈ等の熱安定酵素である。ＤＮＡＰＥｃｌのよう
な非熱安定性酵素も又、本発明において適するものであ
る。バクテリオファージＴ７の遺伝子６タンパク質も好
適な切断剤であると予想される。
【００５３】特定の作用剤が本発明に関して適当か否か
を調べたい場合は、その作用剤が二股状二重らせん基質
を認識し、かつ切断する能力を有するかどうかをテスト
することができる。候補となる酵素は、図１〜図４に示
した構造をもつ供試複合体へその作用剤を接触させて構
造特異的切断作用をテストすることができる。適当なヌ
クレオチド配列の例は、配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１）及び図５中に示されている。図５中に示した
３’アームに相補性のプライマーオリゴヌクレオチド
は、これらのテストに好ましいものである。図５のプラ
イマーオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号２（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２）に示される。図５に示すように、
部位「ａ」での切断は、プライマーが結合部位へ伸びな
い場合に得られるものである。部位「ｂ」での切断は、
プライマーが結合部位へ伸びる場合に得られるものであ
る。
を調べたい場合は、その作用剤が二股状二重らせん基質
を認識し、かつ切断する能力を有するかどうかをテスト
することができる。候補となる酵素は、図１〜図４に示
した構造をもつ供試複合体へその作用剤を接触させて構
造特異的切断作用をテストすることができる。適当なヌ
クレオチド配列の例は、配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１）及び図５中に示されている。図５中に示した
３’アームに相補性のプライマーオリゴヌクレオチド
は、これらのテストに好ましいものである。図５のプラ
イマーオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号２（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２）に示される。図５に示すように、
部位「ａ」での切断は、プライマーが結合部位へ伸びな
い場合に得られるものである。部位「ｂ」での切断は、
プライマーが結合部位へ伸びる場合に得られるものであ
る。
【００５４】テストを完全に行うため、３つの反応を行
う。１）プライマー指令型切断（図２及び図５）をテス
トする。このタイプのものは、反応液中の塩濃度の変化
に比較的影響されず、それゆえ候補の酵素が通常活性発
現に要求するいかなる溶質条件においても実施すること
ができる；２）例えば低塩緩衝液のような、プライマー
非依存型切断を許容する緩衝液中で、酵素がこれらの条
件下で活性であることを調べるため、類似のプライマー
指令型切断を行う。及び３）プライマー非依存型切断
（図１及び図５、但しプライマーは無添加）を、同一の
低塩緩衝液中で行う。
う。１）プライマー指令型切断（図２及び図５）をテス
トする。このタイプのものは、反応液中の塩濃度の変化
に比較的影響されず、それゆえ候補の酵素が通常活性発
現に要求するいかなる溶質条件においても実施すること
ができる；２）例えば低塩緩衝液のような、プライマー
非依存型切断を許容する緩衝液中で、酵素がこれらの条
件下で活性であることを調べるため、類似のプライマー
指令型切断を行う。及び３）プライマー非依存型切断
（図１及び図５、但しプライマーは無添加）を、同一の
低塩緩衝液中で行う。
【００５５】好適なＤＮＡ基質は、化学的に合成する
か、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって生成できる。
後者の方法による場合は、分子のヘアピン部分を互いに
隣接し、逆方向を向いている短いＤＮＡ片のクローニン
グベクター複製コピー中へ挿入することによって作るこ
とができる。この逆の反復を包含し、かつ短い（約２０
個のヌクレオチド）不対の５’及び３’アームを与える
のに十分なフランキング配列を含む二本鎖断片が、制限
酵素分解あるいは５’ヌクレアーゼ（例えばVentTMＤＮ
Ａポリメラーゼ、AmplitaqTMＤＮＡポリメラーゼのスト
ッフェル断片) を欠く酵素を用いて行ったＰＣＲによっ
てベクターから放出される。
か、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって生成できる。
後者の方法による場合は、分子のヘアピン部分を互いに
隣接し、逆方向を向いている短いＤＮＡ片のクローニン
グベクター複製コピー中へ挿入することによって作るこ
とができる。この逆の反復を包含し、かつ短い（約２０
個のヌクレオチド）不対の５’及び３’アームを与える
のに十分なフランキング配列を含む二本鎖断片が、制限
酵素分解あるいは５’ヌクレアーゼ（例えばVentTMＤＮ
Ａポリメラーゼ、AmplitaqTMＤＮＡポリメラーゼのスト
ッフェル断片) を欠く酵素を用いて行ったＰＣＲによっ
てベクターから放出される。
【００５６】供試のＤＮＡはどちらか一方の末端又は内
側をラジオアイソトープ又は非放射性のタッグでラベル
できる。ヘアピンＤＮＡが合成された一本鎖であるかク
ローニングされた二本鎖であるかを見るため、ＤＮＡは
使用前にあらゆる二重らせんを溶融するため加熱され
る。これを氷で冷却すると、図５に示した構造が形成さ
れる。この構造物は検定の実施に十分な時間安定であ
る。
側をラジオアイソトープ又は非放射性のタッグでラベル
できる。ヘアピンＤＮＡが合成された一本鎖であるかク
ローニングされた二本鎖であるかを見るため、ＤＮＡは
使用前にあらゆる二重らせんを溶融するため加熱され
る。これを氷で冷却すると、図５に示した構造が形成さ
れる。この構造物は検定の実施に十分な時間安定であ
る。
【００５７】上記試験１では検出可能な量の供試分子と
好ましくは１０〜１００倍モル過剰なプライマーを、供
試酵素に適合することがわかっている緩衝液中に入れ
る。試験２では、同量の分子をｐＨ、酵素安定剤（例え
ば子牛血清アルブミン、非イオン性洗剤、ゼラチン）及
び還元剤（例えばジチオスレイトール、２−メルカプト
エタノール）に関しては同じであるが、すべての塩を２
０mMＫＣｌで置き換えた前記緩衝液と同じ溶液中に入れ
る。通常塩を含まずに使用する酵素用の緩衝液は、この
濃度を得るのに用いられない。試験３ではプライマーを
含まない同量の供試分子を試験２で用いたものと同じ緩
衝液条件下で合わせる。
好ましくは１０〜１００倍モル過剰なプライマーを、供
試酵素に適合することがわかっている緩衝液中に入れ
る。試験２では、同量の分子をｐＨ、酵素安定剤（例え
ば子牛血清アルブミン、非イオン性洗剤、ゼラチン）及
び還元剤（例えばジチオスレイトール、２−メルカプト
エタノール）に関しては同じであるが、すべての塩を２
０mMＫＣｌで置き換えた前記緩衝液と同じ溶液中に入れ
る。通常塩を含まずに使用する酵素用の緩衝液は、この
濃度を得るのに用いられない。試験３ではプライマーを
含まない同量の供試分子を試験２で用いたものと同じ緩
衝液条件下で合わせる。
【００５８】上記３つの試験反応液をすべて酵素の試験
供試複合体に対するモル比がおよそ１：１である十分量
の酵素と接触させる。必要な酵素量はメーカーにより与
えられた特異活性（ユニット／mg）及び分子量から計算
できる。我々の場合、モル比に関係なく０．５単位／
０．０１pMの標的を常時用いた。この反応液を、酵素安
定性又は複合体安定性のいずれかで許容される温度まで
でかつそれを越えない温度範囲で（おそらく好熱菌(the
rmophiles)の酵素では７２℃まで）切断を十分に可能と
する時間（１０〜６０分）インキュベートする。試験
１、２及び３の生成物を変成ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により一般的な分析を行い、オートラジオグラフ
ィー又はそのラベル化方式に適する相当な方法によって
可視化する。５’アームが不可視なオリゴヌクレオチド
又はオリゴヌクレオチドのグループを放出すれば、内部
の切断がうまく行ったことを示している。
供試複合体に対するモル比がおよそ１：１である十分量
の酵素と接触させる。必要な酵素量はメーカーにより与
えられた特異活性（ユニット／mg）及び分子量から計算
できる。我々の場合、モル比に関係なく０．５単位／
０．０１pMの標的を常時用いた。この反応液を、酵素安
定性又は複合体安定性のいずれかで許容される温度まで
でかつそれを越えない温度範囲で（おそらく好熱菌(the
rmophiles)の酵素では７２℃まで）切断を十分に可能と
する時間（１０〜６０分）インキュベートする。試験
１、２及び３の生成物を変成ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により一般的な分析を行い、オートラジオグラフ
ィー又はそのラベル化方式に適する相当な方法によって
可視化する。５’アームが不可視なオリゴヌクレオチド
又はオリゴヌクレオチドのグループを放出すれば、内部
の切断がうまく行ったことを示している。
【００５９】ＤＮＡＰＴａｑを用いて試験１を１．５mM
ＭｇＣｌ2 及び５０mMＫＣｌを含む１０mMのトリス・Ｃ
ｌ緩衝液中２０℃、pH８．５で行い、一方試験２及び３
では、ＫＣｌ濃度を２０mMへ減らした。試験１及び２で
は、図５の供試分子１０fMを１pMの表示のプライマーと
混合する場合、酵素の０．１単位を完全に切断するのに
５５℃で１０分間のインキュベーションで十分である。
試験３では７２℃、１０分間のインキュベーションでは
プライマーの存在なしにこの分子の同量を完全に切断す
る。いずれの場合も反応生成物は延長したインキュベー
ション期間中（６０分以上）、ヌクレアーゼの混入がな
いことを条件として安定であるので、過度の消化は起こ
らない。図５に示す分子を５’末端でラベルする場合、
２１又は２５個のヌクレオチド長を持つ放出された５’
断片が、４５mMトリス硼酸塩pH８．３、１．４mMＥＤＴ
Ａの緩衝液中、７Ｍ尿素で１９：１の比で架橋された２
０％ポリアクリルアミドゲル上に都合よく分析される。
ＭｇＣｌ2 及び５０mMＫＣｌを含む１０mMのトリス・Ｃ
ｌ緩衝液中２０℃、pH８．５で行い、一方試験２及び３
では、ＫＣｌ濃度を２０mMへ減らした。試験１及び２で
は、図５の供試分子１０fMを１pMの表示のプライマーと
混合する場合、酵素の０．１単位を完全に切断するのに
５５℃で１０分間のインキュベーションで十分である。
試験３では７２℃、１０分間のインキュベーションでは
プライマーの存在なしにこの分子の同量を完全に切断す
る。いずれの場合も反応生成物は延長したインキュベー
ション期間中（６０分以上）、ヌクレアーゼの混入がな
いことを条件として安定であるので、過度の消化は起こ
らない。図５に示す分子を５’末端でラベルする場合、
２１又は２５個のヌクレオチド長を持つ放出された５’
断片が、４５mMトリス硼酸塩pH８．３、１．４mMＥＤＴ
Ａの緩衝液中、７Ｍ尿素で１９：１の比で架橋された２
０％ポリアクリルアミドゲル上に都合よく分析される。
【００６０】数種の酵素あるいは酵素標品が、前記した
切断条件下で機能できる関連活性又は交雑活性を持ち、
５’ヌクレアーゼの検出を妨害できる。基質の破壊ある
いは５’ヌクレアーゼ切断及びその生成物の他のマスキ
ングを避けるため、これら他の活性を考慮して反応条件
を変更することが必要である。例えば大腸菌(E. coli)
のＤＮＡポリメラーゼＩ（ＤＮＡＰＥｃｌ）は、その
５’ヌクレアーゼ及びポリメラーゼ活性に加えて、３’
から５’方向のＤＮＡを分解できる3 ’エキソヌクレア
ーゼをもっている。従って、図５中の分子が、前記した
条件下でこのポリメラーゼと接触した場合、３’エキソ
ヌクレアーゼは、すばやく３’アームを除去し、５’ヌ
クレアーゼ切断のための基質として必要な二股構造を破
壊し、切断は検出されない。この構造を切断するＤＮＡ
ＰＥｃｌの真の能力は、条件変化（例えば反応ｐＨの変
化）、突然変異、又は活性拮抗物の添加によって３’エ
キソヌクレアーゼが阻害されるかどうかによって示され
る。標的分子に無関係な一本鎖拮抗性オリゴヌクレオチ
ド、１００pMのＤＮＡＰＥｃｌの切断反応への添加は、
５’アームの５’ヌクレアーゼの放出を妨害することな
しに、図５の分子の３’アームの消化を効果的に阻害す
る。拮抗物質の濃度は臨界的ではないが、反応期間中
３’エキソヌクレアーゼを占有するのに十分高濃度でな
ければならない。
切断条件下で機能できる関連活性又は交雑活性を持ち、
５’ヌクレアーゼの検出を妨害できる。基質の破壊ある
いは５’ヌクレアーゼ切断及びその生成物の他のマスキ
ングを避けるため、これら他の活性を考慮して反応条件
を変更することが必要である。例えば大腸菌(E. coli)
のＤＮＡポリメラーゼＩ（ＤＮＡＰＥｃｌ）は、その
５’ヌクレアーゼ及びポリメラーゼ活性に加えて、３’
から５’方向のＤＮＡを分解できる3 ’エキソヌクレア
ーゼをもっている。従って、図５中の分子が、前記した
条件下でこのポリメラーゼと接触した場合、３’エキソ
ヌクレアーゼは、すばやく３’アームを除去し、５’ヌ
クレアーゼ切断のための基質として必要な二股構造を破
壊し、切断は検出されない。この構造を切断するＤＮＡ
ＰＥｃｌの真の能力は、条件変化（例えば反応ｐＨの変
化）、突然変異、又は活性拮抗物の添加によって３’エ
キソヌクレアーゼが阻害されるかどうかによって示され
る。標的分子に無関係な一本鎖拮抗性オリゴヌクレオチ
ド、１００pMのＤＮＡＰＥｃｌの切断反応への添加は、
５’アームの５’ヌクレアーゼの放出を妨害することな
しに、図５の分子の３’アームの消化を効果的に阻害す
る。拮抗物質の濃度は臨界的ではないが、反応期間中
３’エキソヌクレアーゼを占有するのに十分高濃度でな
ければならない。
【００６１】供試分子の類似の破壊は、候補ヌクレアー
ゼ標品中の混入物によってもたらされる可能性がある。
候補ヌクレアーゼの純度を決定し、調査されている標品
への供試分子の接触中及び接触後間の状態を知るために
は、これらの試験を数回繰り返すことが必要である。
ゼ標品中の混入物によってもたらされる可能性がある。
候補ヌクレアーゼの純度を決定し、調査されている標品
への供試分子の接触中及び接触後間の状態を知るために
は、これらの試験を数回繰り返すことが必要である。
【００６２】
実施例１． Ａ．ＤＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼ ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（サカイら（Sakai, e
t. al.), Science２３９：４８７，１９８８；ムリスら
（Mullis, et al.), Methods Enzymol. １５５：３３
５，１９８７）において、ＤＮＡＰＴａｑは、全てでは
ないが多くのＤＮＡ配列を増幅できる。我々がＤＮＡＰ
Ｔａｑを用いて増幅できない配列は、図５に示す長い配
列である。このＤＮＡ配列は、それ自身を折りたたみ、
二本の一本鎖アームをもったヘアピンを形成できる際立
った特徴を有し、ＰＣＲにおいて用いられるプライマー
に相当するものである。
t. al.), Science２３９：４８７，１９８８；ムリスら
（Mullis, et al.), Methods Enzymol. １５５：３３
５，１９８７）において、ＤＮＡＰＴａｑは、全てでは
ないが多くのＤＮＡ配列を増幅できる。我々がＤＮＡＰ
Ｔａｑを用いて増幅できない配列は、図５に示す長い配
列である。このＤＮＡ配列は、それ自身を折りたたみ、
二本の一本鎖アームをもったヘアピンを形成できる際立
った特徴を有し、ＰＣＲにおいて用いられるプライマー
に相当するものである。
【００６３】この増幅不能が、酵素の５’ヌクレアーゼ
活性によるものであるかどうかをテストするため、我々
はＤＮＡＰＴａｑとＤＮＡＰＳｔｆについて３０サイク
ルのＰＣＲの期間中、このＤＮＡ配列の増幅能力を比較
した。合成オリゴヌクレオチドはウィスコンシン−マデ
ィソン大学の生物工学センターから入手した。ＤＮＡＰ
Ｔａｑ及びＤＮＡＰＳｔｆはパーキン・エルマー−セタ
ス（Perkin Elmer-Cetus）から入手した。ポリメラーゼ
連鎖反応は、１０mMトリス・Ｃｌ（pH８．３）５０μｌ
溶液中に、１ngのプラスミド標的(target)ＤＮＡ、５pM
の各プライマー、４０μM の各ｄＮＴＰ及び２．５単位
のＤＮＡＰＴａｑ又はＤＮＡＰＳｔｆを含んで構成し
た。ＤＮＡＰＴａｑ反応では、５０mMＫＣｌ及び１．５
mM ＭｇＣｌ2 を用いた一方、ＤＮＡＰＳｔｆ反応で
は、１０mMＫＣｌ及び４mMＭｇＣｌ2を用いた。温度は
３０サイクル期間中、９５℃で３０秒、５５℃で１分、
７２℃で１分とした。各反応の１０パーセントは、４５
mMトリス・ホウサン酸塩、pH８．３、１．４mMＥＤＴＡ
の緩衝液中で６％ポリアクリルアミド（架橋比２９：
１）を通したゲル電気泳動によって分析した。
活性によるものであるかどうかをテストするため、我々
はＤＮＡＰＴａｑとＤＮＡＰＳｔｆについて３０サイク
ルのＰＣＲの期間中、このＤＮＡ配列の増幅能力を比較
した。合成オリゴヌクレオチドはウィスコンシン−マデ
ィソン大学の生物工学センターから入手した。ＤＮＡＰ
Ｔａｑ及びＤＮＡＰＳｔｆはパーキン・エルマー−セタ
ス（Perkin Elmer-Cetus）から入手した。ポリメラーゼ
連鎖反応は、１０mMトリス・Ｃｌ（pH８．３）５０μｌ
溶液中に、１ngのプラスミド標的(target)ＤＮＡ、５pM
の各プライマー、４０μM の各ｄＮＴＰ及び２．５単位
のＤＮＡＰＴａｑ又はＤＮＡＰＳｔｆを含んで構成し
た。ＤＮＡＰＴａｑ反応では、５０mMＫＣｌ及び１．５
mM ＭｇＣｌ2 を用いた一方、ＤＮＡＰＳｔｆ反応で
は、１０mMＫＣｌ及び４mMＭｇＣｌ2を用いた。温度は
３０サイクル期間中、９５℃で３０秒、５５℃で１分、
７２℃で１分とした。各反応の１０パーセントは、４５
mMトリス・ホウサン酸塩、pH８．３、１．４mMＥＤＴＡ
の緩衝液中で６％ポリアクリルアミド（架橋比２９：
１）を通したゲル電気泳動によって分析した。
【００６４】結果を図６に示す。期待の生成物はＤＮＡ
ＰＳｔｆによってつくられ、ＤＮＡＰＴａｑではできな
かった。ＤＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼ活性は、こ
のＤＮＡ配列の増幅不能の原因となっていると結論し
た。
ＰＳｔｆによってつくられ、ＤＮＡＰＴａｑではできな
かった。ＤＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼ活性は、こ
のＤＮＡ配列の増幅不能の原因となっていると結論し
た。
【００６５】この構造のＤＮＡの基質領域中の５’不対
ヌクレオチドがＤＮＡＰＴａｑにより除去されるかどう
かをテストするため、同じ二種のポリメラーゼを用いて
４サイクル(cycle) のＰＣＲ期間中、末端をラベルした
５’アームの運命を比較した（図７）。図５中に説明し
たヘアピン鋳型は、ＤＮＡＰＳｔｆ及び32Ｐで５’末端
をラベルしたプライマーを用いてつくられた。ＤＮＡの
５’末端は、ＤＮＡＰＴａｑにより、数個の大形の断片
として放出されたが、ＤＮＡＰＳｔｆによっては放出は
起こらなかった。（その移動性に基づく）これら断片の
サイズから、ＤＮＡの殆どあるいはすべての不対の５’
アームが含まれていることが示唆された。このことよ
り、我々は切断が二股状二重らせんの基部あるいはその
近接部で起こることを知った。これら放出された断片
は、直接配列分析及び末端のデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼによって伸長される断片の能力で立証
されるように３’−ＯＨ基で終わっている。
ヌクレオチドがＤＮＡＰＴａｑにより除去されるかどう
かをテストするため、同じ二種のポリメラーゼを用いて
４サイクル(cycle) のＰＣＲ期間中、末端をラベルした
５’アームの運命を比較した（図７）。図５中に説明し
たヘアピン鋳型は、ＤＮＡＰＳｔｆ及び32Ｐで５’末端
をラベルしたプライマーを用いてつくられた。ＤＮＡの
５’末端は、ＤＮＡＰＴａｑにより、数個の大形の断片
として放出されたが、ＤＮＡＰＳｔｆによっては放出は
起こらなかった。（その移動性に基づく）これら断片の
サイズから、ＤＮＡの殆どあるいはすべての不対の５’
アームが含まれていることが示唆された。このことよ
り、我々は切断が二股状二重らせんの基部あるいはその
近接部で起こることを知った。これら放出された断片
は、直接配列分析及び末端のデオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼによって伸長される断片の能力で立証
されるように３’−ＯＨ基で終わっている。
【００６６】図８〜図１０は、反応成分の異なる組み合
わせであり、本発明の特徴を示している。特に示さない
限り、本切断反応は、全量１０μｌの１０mMトリス・Ｃ
ｌ、pH８．５、５０mMＫＣｌ、１．５mMＭｇＣｌ2 中、
０．０１pMの熱変性末端ラベル化へアピンＤＮＡ（ラベ
ルされていない相補性鎖も存在する）、１pMのプライマ
ー（３’アームに相補性）、及び０．５単位のＤＮＡＰ
Ｔａｑ（およそ０．０２６pMと想定）を含んで構成され
ている。前記したように、いくつかの反応では異なる濃
度のＫＣｌが用いられ、各実験で用いられる正確な時間
及び温度は、それぞれの図や説明中に示されている。プ
ライマーを含んだ反応は、図５に示したものを使用し
た。いくつかの例では、プライマーはポリメラーゼ及び
適当なｄＮＴＰの使用を介して結合部位へ伸長された。
わせであり、本発明の特徴を示している。特に示さない
限り、本切断反応は、全量１０μｌの１０mMトリス・Ｃ
ｌ、pH８．５、５０mMＫＣｌ、１．５mMＭｇＣｌ2 中、
０．０１pMの熱変性末端ラベル化へアピンＤＮＡ（ラベ
ルされていない相補性鎖も存在する）、１pMのプライマ
ー（３’アームに相補性）、及び０．５単位のＤＮＡＰ
Ｔａｑ（およそ０．０２６pMと想定）を含んで構成され
ている。前記したように、いくつかの反応では異なる濃
度のＫＣｌが用いられ、各実験で用いられる正確な時間
及び温度は、それぞれの図や説明中に示されている。プ
ライマーを含んだ反応は、図５に示したものを使用し
た。いくつかの例では、プライマーはポリメラーゼ及び
適当なｄＮＴＰの使用を介して結合部位へ伸長された。
【００６７】反応は、最終反応温度で MgCl2又は酵素を
添加して開始した。反応はインキュベーション温度で、
２０mMＥＤＴＡ及び０．０５％マーカー色素を含む９５
％ホルムアミド８μｌの添加によって停止した。リスト
されたＴm 計算は、オリゴTMプライマー分析ソフトウェ
ア（ナショナルバイオサイエンス、インコーポレーショ
ン、プリマウス、ミネソタ）を用いて行った。これら
は、ＤＮＡ濃度０．２５μM 、全塩濃度１５又は６５mM
で測定した（すべての反応中の１．５mMＭｇＣｌ2 は、
これら計算については１５mM塩の値として計算した）。
添加して開始した。反応はインキュベーション温度で、
２０mMＥＤＴＡ及び０．０５％マーカー色素を含む９５
％ホルムアミド８μｌの添加によって停止した。リスト
されたＴm 計算は、オリゴTMプライマー分析ソフトウェ
ア（ナショナルバイオサイエンス、インコーポレーショ
ン、プリマウス、ミネソタ）を用いて行った。これら
は、ＤＮＡ濃度０．２５μM 、全塩濃度１５又は６５mM
で測定した（すべての反応中の１．５mMＭｇＣｌ2 は、
これら計算については１５mM塩の値として計算した）。
【００６８】図８は、切断部位に対する反応成分と条件
の影響を調べるために設計した１組の実験結果を示すオ
ートラジオグラムである。図８Ａは切断に要求される反
応成分の測定結果である。５’末端ラベル化ヘアピンＤ
ＮＡは、表示された成分とともに、５５℃で３０分間イ
ンキュベートされた。生成物は変性ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分析され、生成物の長さをヌクレオ
チドで表示した。図８Ｂは、添加プライマー不存在の場
合の切断部位に対する温度の影響を示す。反応液は表示
された温度で１０分間、ＫＣｌの不存在下インキュベー
トされる。生成物のヌクレオチドの長さが表示される。
の影響を調べるために設計した１組の実験結果を示すオ
ートラジオグラムである。図８Ａは切断に要求される反
応成分の測定結果である。５’末端ラベル化ヘアピンＤ
ＮＡは、表示された成分とともに、５５℃で３０分間イ
ンキュベートされた。生成物は変性ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分析され、生成物の長さをヌクレオ
チドで表示した。図８Ｂは、添加プライマー不存在の場
合の切断部位に対する温度の影響を示す。反応液は表示
された温度で１０分間、ＫＣｌの不存在下インキュベー
トされる。生成物のヌクレオチドの長さが表示される。
【００６９】驚くべきことに、ＤＮＡＰＴａｑによる切
断には、プライマー(primer)もｄＮＴＰも必要でないこ
とがわかった（図８Ａ参照）。従って、５’ヌクレアー
ゼ活性を重合から切り離すことができる。ヌクレアーゼ
活性にはマグネシウムイオンが要求される。なお、マン
ガンイオンでも活性の損失なしに代用が可能である。亜
鉛もカルシウムイオンも切断反応には用いられない。反
応は２５℃〜８５℃の広い温度域にわたって起こり、高
温ほど切断速度は増大する。
断には、プライマー(primer)もｄＮＴＰも必要でないこ
とがわかった（図８Ａ参照）。従って、５’ヌクレアー
ゼ活性を重合から切り離すことができる。ヌクレアーゼ
活性にはマグネシウムイオンが要求される。なお、マン
ガンイオンでも活性の損失なしに代用が可能である。亜
鉛もカルシウムイオンも切断反応には用いられない。反
応は２５℃〜８５℃の広い温度域にわたって起こり、高
温ほど切断速度は増大する。
【００７０】さらに図８に示すように、添加ｄＮＴＰの
不存在条件下でプライマーは伸長されていないが、ヘア
ピンの切断部位及び速度の両方に影響する。切断部位の
変化（図８Ａ）は、明らかにＤＮＡ基質のアーム間に形
成される短い二重らせんの破壊から生じるものである。
プライマーの不存在条件で、図５中下線で示した配列は
対となり、伸長した二重らせんを形成する。伸長した二
重らせんの末端での切断は、添加プライマーなしに、図
８Ａのレーン上にみられる１１個のヌクレオチド断片を
放出する。過剰のプライマーの添加（図８Ａ、レーン３
及び４）あるいは昇温でのインキュベーション（図８
Ｂ）は、二重らせんの短い伸長を破壊し、より長い５’
アーム、つまりより長い切断生成物を生じる。
不存在条件下でプライマーは伸長されていないが、ヘア
ピンの切断部位及び速度の両方に影響する。切断部位の
変化（図８Ａ）は、明らかにＤＮＡ基質のアーム間に形
成される短い二重らせんの破壊から生じるものである。
プライマーの不存在条件で、図５中下線で示した配列は
対となり、伸長した二重らせんを形成する。伸長した二
重らせんの末端での切断は、添加プライマーなしに、図
８Ａのレーン上にみられる１１個のヌクレオチド断片を
放出する。過剰のプライマーの添加（図８Ａ、レーン３
及び４）あるいは昇温でのインキュベーション（図８
Ｂ）は、二重らせんの短い伸長を破壊し、より長い５’
アーム、つまりより長い切断生成物を生じる。
【００７１】プライマーの３’末端の位置は、正確な切
断部位に影響を及ぼす。我々は電気泳動分析により、プ
ライマーの不存在条件（図８Ｂ）で、切断は第１及び第
２塩基対間の基質二重らせんの末端（伸長型又は短縮
型、温度に依存する）で起こることを知った。プライマ
ーが二重らせんの塩基まで伸長する場合、切断は同様に
二重らせん中に一個のヌクレオチドを生成する。しかし
プライマーの３’末端の基質二重らせんの間に４又は６
個のヌクレオチドのギャップが存在する場合は、切断部
位は５’方向の４〜６個のヌクレオチドへ移される。プ
ライマーの３’末端の位置に連携した切断部位の移行
は、プライマーの５’アームと一本鎖ギャップ下流間の
短く不完全な二重らせんの形成を介した基質二重らせん
の伸長によるものである。この説明は、この領域中の異
なる配列を持つ基質が、同一ではないが類似した形で行
動するという我々の観察と一致する。
断部位に影響を及ぼす。我々は電気泳動分析により、プ
ライマーの不存在条件（図８Ｂ）で、切断は第１及び第
２塩基対間の基質二重らせんの末端（伸長型又は短縮
型、温度に依存する）で起こることを知った。プライマ
ーが二重らせんの塩基まで伸長する場合、切断は同様に
二重らせん中に一個のヌクレオチドを生成する。しかし
プライマーの３’末端の基質二重らせんの間に４又は６
個のヌクレオチドのギャップが存在する場合は、切断部
位は５’方向の４〜６個のヌクレオチドへ移される。プ
ライマーの３’末端の位置に連携した切断部位の移行
は、プライマーの５’アームと一本鎖ギャップ下流間の
短く不完全な二重らせんの形成を介した基質二重らせん
の伸長によるものである。この説明は、この領域中の異
なる配列を持つ基質が、同一ではないが類似した形で行
動するという我々の観察と一致する。
【００７２】図９はプライマーオリゴヌクレオチドの存
在下（図９Ａ）又は不存在下（図９Ｂ）に於ける切断の
動力学を説明する。この反応は５０mMＫＣｌ（図９Ａ）
又は２０mMＫＣｌ（図９Ｂ）のいずれかを用いて５５℃
で行った。反応生成物は変成ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分析し、生成物の長さをヌクレオチドで示
した。「Ｍ」はマーカーを表し、５’末端をラベルした
１９-nt オリゴヌクレオチドである。このような塩条件
下で、図９Ａ及び図９Ｂは、反応がプライマーの存在下
でプライマーの不存在下に比べて約２０倍速いことを示
す。この効率に及ぼす効果は、基質に対する酵素の適当
な配列及び安定化に寄与できる。
在下（図９Ａ）又は不存在下（図９Ｂ）に於ける切断の
動力学を説明する。この反応は５０mMＫＣｌ（図９Ａ）
又は２０mMＫＣｌ（図９Ｂ）のいずれかを用いて５５℃
で行った。反応生成物は変成ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分析し、生成物の長さをヌクレオチドで示
した。「Ｍ」はマーカーを表し、５’末端をラベルした
１９-nt オリゴヌクレオチドである。このような塩条件
下で、図９Ａ及び図９Ｂは、反応がプライマーの存在下
でプライマーの不存在下に比べて約２０倍速いことを示
す。この効率に及ぼす効果は、基質に対する酵素の適当
な配列及び安定化に寄与できる。
【００７３】切断速度に対するプライマーの相対的影響
は、両反応が５０mMＫＣｌ中で行われるときずっと大き
くなる。我々はプライマーの存在下で切断速度が約５０
mMまでＫＣｌ濃度とともに増加することを測定した。し
かしプライマーの存在下でのこの反応の阻害は、１００
mMで明らかであり、１５０mMＫＣｌで本質的に完全であ
る。反対にプライマーの不存在下では、切断速度は２０
mMまでＫＣｌの濃度によって増大されるが、３０mM以上
の濃度では減少する。５０mMＫＣｌでは反応は殆ど完全
に阻害される。プライマーの不存在下でのＫＣｌによる
切断の阻害は、温度によって影響を受け、より低温度で
より顕著となる。
は、両反応が５０mMＫＣｌ中で行われるときずっと大き
くなる。我々はプライマーの存在下で切断速度が約５０
mMまでＫＣｌ濃度とともに増加することを測定した。し
かしプライマーの存在下でのこの反応の阻害は、１００
mMで明らかであり、１５０mMＫＣｌで本質的に完全であ
る。反対にプライマーの不存在下では、切断速度は２０
mMまでＫＣｌの濃度によって増大されるが、３０mM以上
の濃度では減少する。５０mMＫＣｌでは反応は殆ど完全
に阻害される。プライマーの不存在下でのＫＣｌによる
切断の阻害は、温度によって影響を受け、より低温度で
より顕著となる。
【００７４】切断されるアームの５’末端の認識は基質
認識の重要な特徴と思われる。我々はこれまで環状Ｍ１
３ＤＮＡ等の遊離の５’末端を欠く基質を切断できなか
った。限定された５’アームを有する基質を用いてさ
え、ＤＮＡＰＴａｑによる切断速度はアームの長さによ
って影響される。プライマー及び５０mMＫＣｌの存在
下、ヌクレオチド長２８の５’伸長部の切断は、５５℃
で２分以内に本質的に完了する。対照的に８０及び１９
１個のヌクレオチドの５’アームを有する分子の切断
は、２０分後でそれぞれ９０％及び４０％しか完了しな
い。高温でのインキュベーションが長い伸長の抑制的効
果を減じることは、５’アーム中の２次構造あるいは酵
素中の熱不安定構造が反応を阻害できることを示してい
る。過剰の基質条件下で行った混合試験は、長いアーム
を持った分子は非増殖的複合体中の有効な酵素と優先的
に結びつかないことを示す。これらの結果は、５’ヌク
レアーゼドメインが５’アームを一端から他端へ下流へ
移動することにより、二股状二重らせん末端の切断部位
へ接近することを示す。より長い５’アームは、より偶
発的な２次的構造（特にＫＣｌ濃度が高い場合）をとる
ことが予想される。その構造は、その移動をより妨げる
ものである。
認識の重要な特徴と思われる。我々はこれまで環状Ｍ１
３ＤＮＡ等の遊離の５’末端を欠く基質を切断できなか
った。限定された５’アームを有する基質を用いてさ
え、ＤＮＡＰＴａｑによる切断速度はアームの長さによ
って影響される。プライマー及び５０mMＫＣｌの存在
下、ヌクレオチド長２８の５’伸長部の切断は、５５℃
で２分以内に本質的に完了する。対照的に８０及び１９
１個のヌクレオチドの５’アームを有する分子の切断
は、２０分後でそれぞれ９０％及び４０％しか完了しな
い。高温でのインキュベーションが長い伸長の抑制的効
果を減じることは、５’アーム中の２次構造あるいは酵
素中の熱不安定構造が反応を阻害できることを示してい
る。過剰の基質条件下で行った混合試験は、長いアーム
を持った分子は非増殖的複合体中の有効な酵素と優先的
に結びつかないことを示す。これらの結果は、５’ヌク
レアーゼドメインが５’アームを一端から他端へ下流へ
移動することにより、二股状二重らせん末端の切断部位
へ接近することを示す。より長い５’アームは、より偶
発的な２次的構造（特にＫＣｌ濃度が高い場合）をとる
ことが予想される。その構造は、その移動をより妨げる
ものである。
【００７５】切断は少なくても２キロベースまで標的分
子あるいはパイロット核酸のいずれかの長い３’アーム
によって阻害されそうもない。他の極端な例では、ヌク
レオチド１個程度に短いパイロット核酸の３’アーム
が、プライマー非依存型反応においてやや不十分ではあ
るが切断を支えることができることを見いだした。完全
に対になったオリゴヌクレオチドは、プライマーの伸長
の間のＤＮＡ鋳型の切断を誘発されない。相補性鎖が唯
一の不対３’ヌクレオチドを含む場合でさえ、分子を切
断するＤＮＡＰＴａｑの能力は対立遺伝子特異的ＰＣＲ
の最適化において有用である。不対３’末端をもつＰＣ
Ｒプライマーは、ヌクレオチドトリフォスフェートの不
存在下ＤＮＡＰＴａｑを用いた潜在的鋳型プライマー複
合体内の予備インキュベーションの間、不要な鋳型の選
択的切断を指令するパイロットオリゴヌクレオチドとし
て働くことができる。
子あるいはパイロット核酸のいずれかの長い３’アーム
によって阻害されそうもない。他の極端な例では、ヌク
レオチド１個程度に短いパイロット核酸の３’アーム
が、プライマー非依存型反応においてやや不十分ではあ
るが切断を支えることができることを見いだした。完全
に対になったオリゴヌクレオチドは、プライマーの伸長
の間のＤＮＡ鋳型の切断を誘発されない。相補性鎖が唯
一の不対３’ヌクレオチドを含む場合でさえ、分子を切
断するＤＮＡＰＴａｑの能力は対立遺伝子特異的ＰＣＲ
の最適化において有用である。不対３’末端をもつＰＣ
Ｒプライマーは、ヌクレオチドトリフォスフェートの不
存在下ＤＮＡＰＴａｑを用いた潜在的鋳型プライマー複
合体内の予備インキュベーションの間、不要な鋳型の選
択的切断を指令するパイロットオリゴヌクレオチドとし
て働くことができる。
【００７６】実施例２ Ｂ．他のＤＮＡＰの５’ヌクレアーゼ活性 他のＤＮＡＰ中の５’ヌクレアーゼが本発明方法に好適
であるかどうかを決定するため、一連の酵素、それらの
いくつかは明瞭な５’ヌクレアーゼ活性を欠くものとし
て文献に報告されているものを試験した。これらは図５
に示すヘアピン基質に対して、各酵素による合成に最適
であると報告されている条件下で試験を行った。
であるかどうかを決定するため、一連の酵素、それらの
いくつかは明瞭な５’ヌクレアーゼ活性を欠くものとし
て文献に報告されているものを試験した。これらは図５
に示すヘアピン基質に対して、各酵素による合成に最適
であると報告されている条件下で試験を行った。
【００７７】ＤＮＡＰＥｃｌ及びＤＮＡＰＫｌn はプロ
メガ・コーポレーションから入手し；ピロコッカス・フ
リアス(Pyrococcus frurious) のＤＮＡＰ（ＤＮＡＰＰ
ｆｕ，バーグセイドら（Bargseid, et. al.), Strategi
es,(Stratagene, La Jolla,CA)４：３４，１９９１）は
ストラタジェンから入手、サーモコッカス・リトラリス
(Thermococcus litoralis) のＤＮＡＰ（ＤＮＡＰＴｌ
ｉ，VentTM(exo-), パーラーら(Perler, et. al.), Pro
c. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８９：５５７７，１９９
２）は、ニューイングランド・バイオラブスから入手
し、サームス・フラバス(Thermus flavus)のＤＮＡＰ
（ＤＮＡＰＴｆｌ，カールディンら（Kaledin, et. a
l.), Biokhimiya ４６：１５７６，１９８１）はエピセ
ンター・テクノロジースから入手し、サームス・サーモ
フィラス（Thermus thermophilus) のＤＮＡＰ（ＤＮＡ
ＰＴｔｈ，カーバレイラら（Carballeira, et al.), Bi
otechniques 9:276, 1990,；マイヤースら（Myers, et.
al.), Biochemistry ３０，７６６１, １９９１）は
Ｕ．Ｓ．バイオケミカルスから入手した。
メガ・コーポレーションから入手し；ピロコッカス・フ
リアス(Pyrococcus frurious) のＤＮＡＰ（ＤＮＡＰＰ
ｆｕ，バーグセイドら（Bargseid, et. al.), Strategi
es,(Stratagene, La Jolla,CA)４：３４，１９９１）は
ストラタジェンから入手、サーモコッカス・リトラリス
(Thermococcus litoralis) のＤＮＡＰ（ＤＮＡＰＴｌ
ｉ，VentTM(exo-), パーラーら(Perler, et. al.), Pro
c. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８９：５５７７，１９９
２）は、ニューイングランド・バイオラブスから入手
し、サームス・フラバス(Thermus flavus)のＤＮＡＰ
（ＤＮＡＰＴｆｌ，カールディンら（Kaledin, et. a
l.), Biokhimiya ４６：１５７６，１９８１）はエピセ
ンター・テクノロジースから入手し、サームス・サーモ
フィラス（Thermus thermophilus) のＤＮＡＰ（ＤＮＡ
ＰＴｔｈ，カーバレイラら（Carballeira, et al.), Bi
otechniques 9:276, 1990,；マイヤースら（Myers, et.
al.), Biochemistry ３０，７６６１, １９９１）は
Ｕ．Ｓ．バイオケミカルスから入手した。
【００７８】各ＤＮＡポリメラーゼの０．５単位を、プ
ライマー依存型反応用のメーカーから提供された緩衝
液、あるいはプライマー非依存型反応用の１０mMトリス
・Ｃｌ，pH８．５、１．５mMＭｇＣｌ2 及び２０mMＫＣ
ｌ緩衝液のいずれかを用いて、２０μｌの反応液中で検
定した。ＤＮＡＰＥｃｌ及びＤＮＡＰＫｌn を用いた反
応を、５mMトリス・Ｃｌ、pH７．５、５mMＭｇＣｌ2、
０．１mMＤＴＴ中で、１００pMの２０mer オリゴヌクレ
オチドとともに行い、反応混合液は酵素添加前に３７℃
とした。
ライマー依存型反応用のメーカーから提供された緩衝
液、あるいはプライマー非依存型反応用の１０mMトリス
・Ｃｌ，pH８．５、１．５mMＭｇＣｌ2 及び２０mMＫＣ
ｌ緩衝液のいずれかを用いて、２０μｌの反応液中で検
定した。ＤＮＡＰＥｃｌ及びＤＮＡＰＫｌn を用いた反
応を、５mMトリス・Ｃｌ、pH７．５、５mMＭｇＣｌ2、
０．１mMＤＴＴ中で、１００pMの２０mer オリゴヌクレ
オチドとともに行い、反応混合液は酵素添加前に３７℃
とした。
【００７９】図１０はこれらの試験結果を記録したオー
トラジオグラムである。図１０Ａは、数種の好熱細菌の
ＤＮＡＰのエンドヌクレアーゼの反応を示すものであ
る。反応液をプライマーの存在下１０分間５５℃、ある
いはプライマーの不存在下７２℃で３０分間インキュベ
ートし、生成物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分析した。生成物の長さをヌクレオチドで示し
た。図１０Ｂは、ＤＮＡＰＥｃｌの５’ヌクレアーゼに
よるエンドヌクレオリティックな切断を示す。ＤＮＡＰ
Ｅｃｌ及びＤＮＡＰＫｌn 反応は、３７℃で５分間イン
キュベートされる。ＤＮＡＰＥｃｌレーンの２５個及び
１１個のヌクレオチドの切断生成物の明るいバンドに注
目して欲しい（それぞれ、プライマーの存在下、不存在
下でつくられた）。図６Ｂは、同様にプライマーの存在
下（＋）又は不存在下（−）でのＤＮＡＰＴａｑ反応を
示す。これらの反応はそれぞれ５０mM、及び２０mMＫＣ
ｌ下で行われ、５５℃で１０分間インキュベートした。
トラジオグラムである。図１０Ａは、数種の好熱細菌の
ＤＮＡＰのエンドヌクレアーゼの反応を示すものであ
る。反応液をプライマーの存在下１０分間５５℃、ある
いはプライマーの不存在下７２℃で３０分間インキュベ
ートし、生成物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分析した。生成物の長さをヌクレオチドで示し
た。図１０Ｂは、ＤＮＡＰＥｃｌの５’ヌクレアーゼに
よるエンドヌクレオリティックな切断を示す。ＤＮＡＰ
Ｅｃｌ及びＤＮＡＰＫｌn 反応は、３７℃で５分間イン
キュベートされる。ＤＮＡＰＥｃｌレーンの２５個及び
１１個のヌクレオチドの切断生成物の明るいバンドに注
目して欲しい（それぞれ、プライマーの存在下、不存在
下でつくられた）。図６Ｂは、同様にプライマーの存在
下（＋）又は不存在下（−）でのＤＮＡＰＴａｑ反応を
示す。これらの反応はそれぞれ５０mM、及び２０mMＫＣ
ｌ下で行われ、５５℃で１０分間インキュベートした。
【００８０】図１０Ａに示すように、真正細菌サームス
・サーモフィラス及びサームス・フラバスのＤＮＡＰ
は、プライマーの存在、不存在いずれでも、ＤＮＡＰＴ
ａｑと同じ場所で基質を切断する。対照的に、古細菌ピ
ロコッカス・フリオサス及びサーモコッカス・リトラリ
スのＤＮＡＰは、エンドヌクレオリティックに基質を切
断することができない（図１０中、未切断(uncut) のバ
ンド）。ピロコッカス・フリアス及びサーモコッカス・
リトラリスのＤＮＡＰは、真正細菌性酵素と殆ど配列相
同性を共有しない（イトウら（Ito ，et. al.), Nucl.
Acids. Res. １９：４０４５，１９９１；マーサーら(M
athur, et. al.), Nuel. Acids. Res.１９：６９５２，
１９９１；パーラーら(Perler, et. al.),も参照）。図
１０Ｂに示すように、ＤＮＡＰＥｃｌも基質を切断する
が、しかし生じた切断生成物は３’エキソヌクレアーゼ
を阻害しない限り検出が難しい。ＤＮＡＰＥｃｌ及びＤ
ＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼドメインのアミノ酸配
列は、約３８％が相同である（ゲルファンド(Gelfand),
前出）。
・サーモフィラス及びサームス・フラバスのＤＮＡＰ
は、プライマーの存在、不存在いずれでも、ＤＮＡＰＴ
ａｑと同じ場所で基質を切断する。対照的に、古細菌ピ
ロコッカス・フリオサス及びサーモコッカス・リトラリ
スのＤＮＡＰは、エンドヌクレオリティックに基質を切
断することができない（図１０中、未切断(uncut) のバ
ンド）。ピロコッカス・フリアス及びサーモコッカス・
リトラリスのＤＮＡＰは、真正細菌性酵素と殆ど配列相
同性を共有しない（イトウら（Ito ，et. al.), Nucl.
Acids. Res. １９：４０４５，１９９１；マーサーら(M
athur, et. al.), Nuel. Acids. Res.１９：６９５２，
１９９１；パーラーら(Perler, et. al.),も参照）。図
１０Ｂに示すように、ＤＮＡＰＥｃｌも基質を切断する
が、しかし生じた切断生成物は３’エキソヌクレアーゼ
を阻害しない限り検出が難しい。ＤＮＡＰＥｃｌ及びＤ
ＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼドメインのアミノ酸配
列は、約３８％が相同である（ゲルファンド(Gelfand),
前出）。
【００８１】ＤＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼドメイ
ンも同様に、バクテリオファージＴ７の遺伝子６により
エンコードされる５’エキソヌクレアーゼと約１９％相
同である（Ｊ．Ｊ．ダンら（Dunn, et. al.), J. Mol.
Biol.,１６６：４７７，１９８３）。ＤＮＡ重合ドメイ
ンへ共有結合的に結合していないこのヌクレアーゼは、
添加プライマーの不存在下で、前記した５’ヌクレアー
ゼにより切断された部位に類似又は同一の部位でＤＮＡ
エンドヌクレオティックに切断できることを見いだし
た。この５’エキソヌクレアーゼの性質はプライマー存
在下での試験を不可能とし、３’アームへ複製したプラ
イマーはこの活性のための基質となる。
ンも同様に、バクテリオファージＴ７の遺伝子６により
エンコードされる５’エキソヌクレアーゼと約１９％相
同である（Ｊ．Ｊ．ダンら（Dunn, et. al.), J. Mol.
Biol.,１６６：４７７，１９８３）。ＤＮＡ重合ドメイ
ンへ共有結合的に結合していないこのヌクレアーゼは、
添加プライマーの不存在下で、前記した５’ヌクレアー
ゼにより切断された部位に類似又は同一の部位でＤＮＡ
エンドヌクレオティックに切断できることを見いだし
た。この５’エキソヌクレアーゼの性質はプライマー存
在下での試験を不可能とし、３’アームへ複製したプラ
イマーはこの活性のための基質となる。
【００８２】実施例３ Ｃ．トランス切断(Transcleavage) 切断基質は、標的となる核酸と、所望の切断点での基質
構造の形成を通して標的へヌクレアーゼを向けるように
デザインされたパイロットオリゴヌクレオチドを含んで
なる、別のポリヌクレオチドからも得ることができる。
生じた基質複合体は、所望の切断点に対向する３’伸長
部を持つ二重らせんを含んでいる。
構造の形成を通して標的へヌクレアーゼを向けるように
デザインされたパイロットオリゴヌクレオチドを含んで
なる、別のポリヌクレオチドからも得ることができる。
生じた基質複合体は、所望の切断点に対向する３’伸長
部を持つ二重らせんを含んでいる。
【００８３】切断がパイロットオリゴヌクレオチドによ
って指令できることを示すため、我々は二つの潜在的パ
イロットオリゴヌクレオチドの存在下、一本鎖標的ＤＮ
ＡをＤＮＡＰＴａｑとともにインキュベートした。標的
とパイロット核酸が共有結合的に結合しないトランス切
断反応は、０．０１pMの単一末端ラベル化基質ＤＮＡ、
１単位のＤＮＡＰＴａｑ、及び５pMのパイロットオリゴ
ヌクレオチドを２０μｌの同一緩衝液中に含んで行われ
る。ＰＣＲにより生じる二本鎖基質ＤＮＡを変性するた
め、９５℃で１分間インキュベートしてこれらの成分を
結合し、次いで反応液の温度を最終インキュベーション
温度まで下げる。３０−１２及び１９−１２と呼ばれる
これら二つのオリゴヌクレオチドは、それぞれＤＮＡに
相補性の３０又は１９個のヌクレオチドと、短いヘアピ
ンを形成できる３’末端部にさらに１２個のヌクレオチ
ドの伸長部を持っている。オリゴヌクレオチド３０−１
２及び１９−１２は、標的鎖の５’末端から延びた８５
個及び２７個のヌクレオチドであるＤＮＡの領域へ雑種
形成できる。
って指令できることを示すため、我々は二つの潜在的パ
イロットオリゴヌクレオチドの存在下、一本鎖標的ＤＮ
ＡをＤＮＡＰＴａｑとともにインキュベートした。標的
とパイロット核酸が共有結合的に結合しないトランス切
断反応は、０．０１pMの単一末端ラベル化基質ＤＮＡ、
１単位のＤＮＡＰＴａｑ、及び５pMのパイロットオリゴ
ヌクレオチドを２０μｌの同一緩衝液中に含んで行われ
る。ＰＣＲにより生じる二本鎖基質ＤＮＡを変性するた
め、９５℃で１分間インキュベートしてこれらの成分を
結合し、次いで反応液の温度を最終インキュベーション
温度まで下げる。３０−１２及び１９−１２と呼ばれる
これら二つのオリゴヌクレオチドは、それぞれＤＮＡに
相補性の３０又は１９個のヌクレオチドと、短いヘアピ
ンを形成できる３’末端部にさらに１２個のヌクレオチ
ドの伸長部を持っている。オリゴヌクレオチド３０−１
２及び１９−１２は、標的鎖の５’末端から延びた８５
個及び２７個のヌクレオチドであるＤＮＡの領域へ雑種
形成できる。
【００８４】予想した通り、３０−１２と５’ラベル化
した標的ＤＮＡ及びＤＮＡＰＴａｑの混合物とのインキ
ュベーションにより、ヌクレオチド８５個長のＤＮＡ断
片が生産される。二重らせんの計算上の融点を上回る８
０℃では、（より安定で、長く、自己相補性のヘアピン
を用いて検定した場合）なお切断活性はあるものの、切
断は起こらない。５５℃では、添加パイロットオリゴヌ
クレオチドの不存在下、数種の新たな切断生成物が蓄積
する。我々は、この蓄積は切断の基質として働けるＤＮ
Ａ標的内の相補性配列の間に偶発的な二重らせんの形成
が起こったためと考えた。これらの生成物は、適当なプ
ライマーの不存在下、あるいはいずれかのパイロットオ
リゴヌクレオチドが存在する場合に、切断を抑制する５
０mMＫＣｌの存在下で反応を行った場合は観察されなか
った。
した標的ＤＮＡ及びＤＮＡＰＴａｑの混合物とのインキ
ュベーションにより、ヌクレオチド８５個長のＤＮＡ断
片が生産される。二重らせんの計算上の融点を上回る８
０℃では、（より安定で、長く、自己相補性のヘアピン
を用いて検定した場合）なお切断活性はあるものの、切
断は起こらない。５５℃では、添加パイロットオリゴヌ
クレオチドの不存在下、数種の新たな切断生成物が蓄積
する。我々は、この蓄積は切断の基質として働けるＤＮ
Ａ標的内の相補性配列の間に偶発的な二重らせんの形成
が起こったためと考えた。これらの生成物は、適当なプ
ライマーの不存在下、あるいはいずれかのパイロットオ
リゴヌクレオチドが存在する場合に、切断を抑制する５
０mMＫＣｌの存在下で反応を行った場合は観察されなか
った。
【００８５】異なる温度で１９−１２及び３０−１２と
ともにインキュベーションした反応として生じた生成物
の分析により、標的の切断の特異性を調べた。１９−１
２とその補体との二重らせんについて計算したＴm は、
ＫＣｌの不存在下で５０℃より若干低い値である。期待
通り、ＤＮＡＰＴａｑ及び１９−１２とＤＮＡとのイン
キュベーションは、５０℃で２７ヌクレオチド長の切断
生成物を形成したが、７５℃では形成しなかった。この
生成物の収率は、Ｔm を５０℃以上に上昇させるＫＣｌ
の添加によって増加し、その温度での基質複合体の濃度
を増加させる。１９−１２を３０−１２に代えると、す
べてのケースにおいて、８５個のヌクレオチド生成物の
放出を起こした。０−２０と称されるＤＮＡ標的に相補
性のない（但し３’末端でテトラループとヘアピンを形
成する潜在能力を持っている）非特異的オリゴヌクレオ
チドは、５０mMＫＣｌの存在、不存在のいずれにおいて
も、５０℃で切断に何らの影響を持たなかった。このよ
うに、切断反応の特異性は、標的に対する相補性の程度
及びインキュベーションの条件によって制御することが
できる。
ともにインキュベーションした反応として生じた生成物
の分析により、標的の切断の特異性を調べた。１９−１
２とその補体との二重らせんについて計算したＴm は、
ＫＣｌの不存在下で５０℃より若干低い値である。期待
通り、ＤＮＡＰＴａｑ及び１９−１２とＤＮＡとのイン
キュベーションは、５０℃で２７ヌクレオチド長の切断
生成物を形成したが、７５℃では形成しなかった。この
生成物の収率は、Ｔm を５０℃以上に上昇させるＫＣｌ
の添加によって増加し、その温度での基質複合体の濃度
を増加させる。１９−１２を３０−１２に代えると、す
べてのケースにおいて、８５個のヌクレオチド生成物の
放出を起こした。０−２０と称されるＤＮＡ標的に相補
性のない（但し３’末端でテトラループとヘアピンを形
成する潜在能力を持っている）非特異的オリゴヌクレオ
チドは、５０mMＫＣｌの存在、不存在のいずれにおいて
も、５０℃で切断に何らの影響を持たなかった。このよ
うに、切断反応の特異性は、標的に対する相補性の程度
及びインキュベーションの条件によって制御することが
できる。
【００８６】実施例４ Ｄ．ＲＮＡの切断 前記検討したトランス切断実験において使用された配列
をＲＮＡに置き換えて、その反応の基質として働き得る
能力を調べた。ＲＮＡは、パイロットオリゴヌクレオチ
ドの存在に依存する反応において所望の位置で切断され
る。著しい特徴として、ＲＮＡ切断の場合は、３’アー
ムはパイロットオリゴヌクレオチドに必要ではない。こ
の切断が、３０塩基対長のＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせんに
そって数カ所の位置でＲＮＡを切断することが予想され
た前述のＲＮアーゼＨによることは考えもしなかったこ
とである。ＤＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼは異種二
重らせん領域の５’末端に近い単一部位でＲＮＡを切断
する構造特異的ＲＮアーゼＨである。
をＲＮＡに置き換えて、その反応の基質として働き得る
能力を調べた。ＲＮＡは、パイロットオリゴヌクレオチ
ドの存在に依存する反応において所望の位置で切断され
る。著しい特徴として、ＲＮＡ切断の場合は、３’アー
ムはパイロットオリゴヌクレオチドに必要ではない。こ
の切断が、３０塩基対長のＲＮＡ−ＤＮＡ二重らせんに
そって数カ所の位置でＲＮＡを切断することが予想され
た前述のＲＮアーゼＨによることは考えもしなかったこ
とである。ＤＮＡＰＴａｑの５’ヌクレアーゼは異種二
重らせん領域の５’末端に近い単一部位でＲＮＡを切断
する構造特異的ＲＮアーゼＨである。
【００８７】ＤＮＡＰＴａｑ及びＤＮＡＰＴｔｈの双方
は、Mg2+の存在下でオリゴヌクレオチドと重複したＲＮ
Ａを切断するが、ＤＮＡＰＴａｑだけがMn2+の存在下で
ＲＮＡを分解する。この差異は、何故ＤＮＡＰＴｔｈが
Mn2+の存在下で鋳型としてＲＮＡを用いることができる
かを説明するのに役立つ。従って、逆転写酵素としての
これらの酵素の使用は、鋳型の切断へ導かない条件を必
要とする。
は、Mg2+の存在下でオリゴヌクレオチドと重複したＲＮ
Ａを切断するが、ＤＮＡＰＴａｑだけがMn2+の存在下で
ＲＮＡを分解する。この差異は、何故ＤＮＡＰＴｔｈが
Mn2+の存在下で鋳型としてＲＮＡを用いることができる
かを説明するのに役立つ。従って、逆転写酵素としての
これらの酵素の使用は、鋳型の切断へ導かない条件を必
要とする。
【００８８】
【発明の効果】本発明方法によれば、特異的部位におい
てＲＮＡ、ＤＮＡ分子等の一本鎖の核酸分子を切断する
ことができる。また核酸分子を配列非依存的様式によっ
てあらゆる所望の部位で切断でき、切断が高温で行え
て、切断部位が特異的制限エンドヌクレアーゼ部位に制
限されることがない。
てＲＮＡ、ＤＮＡ分子等の一本鎖の核酸分子を切断する
ことができる。また核酸分子を配列非依存的様式によっ
てあらゆる所望の部位で切断でき、切断が高温で行え
て、切断部位が特異的制限エンドヌクレアーゼ部位に制
限されることがない。
【００８９】
（１）一般的情報： （ｉ）出願人（発明者）：ダールベルグ， ジェイムス
イー． リアミチェフ， ビクトル アイ． ブロウ， メアリー アン ディー． （ｉｉ）発明の名称：核酸の切断方法 （ｉｉｉ） 配列の数：２ （ｉｖ）通信住所： （Ａ）受信人：クウアレス アンド ブラデイ （Ｂ）通り：イースト ウイスコンシン アベニュー
４１１ （Ｃ）市：ミルウオーキー （Ｄ）州：ウイスコンシン （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：５３２０２ （ｖ）コンピューター判読形態： （Ａ）ミディウムタイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパーチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ
−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース ＃１．
０，バージョン＃１．２５ （ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）弁護士／弁理士情報： （Ａ）氏名：ベイカー， ジーン シー． （Ｂ）登録番号：３５，４３３ （Ｃ）参照／名簿番号：９６−２９６−９２１７−４ （ｉｘ）電気通信情報： （Ａ）電話：（４１４）２７７−５７０７ （Ｂ）テレファックス：（４１４）２７７−５５９１
イー． リアミチェフ， ビクトル アイ． ブロウ， メアリー アン ディー． （ｉｉ）発明の名称：核酸の切断方法 （ｉｉｉ） 配列の数：２ （ｉｖ）通信住所： （Ａ）受信人：クウアレス アンド ブラデイ （Ｂ）通り：イースト ウイスコンシン アベニュー
４１１ （Ｃ）市：ミルウオーキー （Ｄ）州：ウイスコンシン （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：５３２０２ （ｖ）コンピューター判読形態： （Ａ）ミディウムタイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ コンパーチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ
−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース ＃１．
０，バージョン＃１．２５ （ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）弁護士／弁理士情報： （Ａ）氏名：ベイカー， ジーン シー． （Ｂ）登録番号：３５，４３３ （Ｃ）参照／名簿番号：９６−２９６−９２１７−４ （ｉｘ）電気通信情報： （Ａ）電話：（４１４）２７７−５７０７ （Ｂ）テレファックス：（４１４）２７７−５５９１
【００９０】（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：
１： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：９１ 塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：オリゴヌクレオチド （ｉｉｉ） ハイポセティカル：ＹＥＳ （ｘｉ）配列
１： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：９１ 塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：オリゴヌクレオチド （ｉｉｉ） ハイポセティカル：ＹＥＳ （ｘｉ）配列
【００９１】
【化１】
【００９２】（３）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：
２： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７ 塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：オリゴヌクレオチド （ｉｉｉ） ハイポセティカル：ＹＥＳ （ｘｉ）配列
２： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７ 塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：オリゴヌクレオチド （ｉｉｉ） ハイポセティカル：ＹＥＳ （ｘｉ）配列
【００９３】
【化２】
【図１】図１は、パイロット核酸の相補的領域へ雑種形
成された標的分子の領域を含む二股状二重らせんを表す
模式図である。
成された標的分子の領域を含む二股状二重らせんを表す
模式図である。
【図２】図２は標的分子領域、パイロットオリゴヌクレ
オチド及び、パイロット核酸の３’伸長部に相補性の核
酸であるプライマーを含む二股状二重らせんを表す模式
図である。
オチド及び、パイロット核酸の３’伸長部に相補性の核
酸であるプライマーを含む二股状二重らせんを表す模式
図である。
【図３】図３は標的分子及びプライマーに共有結合的に
結合したパイロットオリゴヌクレオチドを含む二股状二
重らせんを表す模式図である。
結合したパイロットオリゴヌクレオチドを含む二股状二
重らせんを表す模式図である。
【図４】図４はパイロット核酸の３’伸長部を持たない
二股状二重らせんを示す模式図である。
二股状二重らせんを示す模式図である。
【図５】図５は模範的な二股状二重らせんとプライマー
のヌクレオチド配列を示す図である。
のヌクレオチド配列を示す図である。
【図６】図６は二股状二重らせんをＤＮＡＰＴａｑ又は
ＤＮＡＰＳｔｆで増幅する試みを示すゲル電気泳動の結
果のゲル染色の写真である。
ＤＮＡＰＳｔｆで増幅する試みを示すゲル電気泳動の結
果のゲル染色の写真である。
【図７】図７はＤＮＡＰＴａｑによる二股状二重らせん
の切断とＤＮＡＰＳｔｆによる無切断を分析する、ゲル
の電気泳動の結果のオートラジオグラムの写真である。
の切断とＤＮＡＰＳｔｆによる無切断を分析する、ゲル
の電気泳動の結果のオートラジオグラムの写真である。
【図８】図８Ａ及びＢはＤＮＡＰＴａｑを用いた二股状
二重らせんを切断する試みにおける、異なる反応成分の
添加（Ａ）及びインキュベーション温度の変化（Ｂ）に
おける切断あるいは無切断(uncut) を分析する一組のゲ
ルの電気泳動の結果のオートラジオグラムの写真であ
る。
二重らせんを切断する試みにおける、異なる反応成分の
添加（Ａ）及びインキュベーション温度の変化（Ｂ）に
おける切断あるいは無切断(uncut) を分析する一組のゲ
ルの電気泳動の結果のオートラジオグラムの写真であ
る。
【図９】図９Ａ及びＢはプライマーの存在下（Ａ）及び
非存在下（Ｂ）での経時的切断反応を示す電気泳動の結
果のオートラジオグラムの写真である。
非存在下（Ｂ）での経時的切断反応を示す電気泳動の結
果のオートラジオグラムの写真である。
【図１０】図１０Ａ及びＢは種々のＤＮＡＰを用いた二
股状二重らせん（プライマーを有するもの及び有さない
ないもの）を切断する試みを示すゲルの電気泳動の結果
のオートラジオグラムの写真である。
股状二重らせん（プライマーを有するもの及び有さない
ないもの）を切断する試みを示すゲルの電気泳動の結果
のオートラジオグラムの写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ビクトル アイ． リアミチエフ アメリカ合衆国 53713 ウイスコンシン マデイソン ポスト ロード 2221 ＃５ (72)発明者 メアリー アン デイー． ブロウ アメリカ合衆国 53711 ウイスコンシン マデイソン ハマースリー ロード 5905
Claims (24)
- 【請求項１】 （ａ）標的核酸及びパイロット核酸を含
んでなる切断構造を形成する工程であって、標的核酸の
第一領域がパイロット核酸とアニーリングされて二重ら
せんを形成し、かつ二重らせんに隣接する標的核酸の第
二領域がパイロット核酸とアニーリングされないで二重
らせん領域と非アニーリング領域の間で接合部位を形成
する工程 （ｂ）切断構造を、切断構造の配列に依存せずに標的部
位で切断構造を優先的に切断することができる切断剤に
接触させる工程、及び （ｃ）切断構造と切断剤を、切断が起こり得る条件下で
温置する工程の各工程を含んでなる特異的標的部位で標
的核酸を切断する方法。 - 【請求項２】 標的部位が接合部位の二つのヌクレオチ
ド内にある請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 パイロット核酸が標的核酸と共有結合的
に連結される請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 パイロット核酸が標的核酸と共有結合的
に連結されない請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 パイロット核酸がオリゴヌクレオチドで
ある請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 標的核酸の第一領域が標的核酸の第二領
域の３’側である請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 パイロット核酸が、標的分子とアニーリ
ングされない少なくとも一つのヌクレオチドを含んでな
る領域を含んでなる請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 切断構造がプライマー核酸をさらに含ん
でなり、プライマーがパイロット核酸の領域とアニーリ
ングされる請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 プライマーがパイロット核酸に共有結合
的に結びつけられる請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 アニーリングされたプライマーの３’
末端が接合部位の１５個のヌクレオチド内にある請求項
８記載の方法。 - 【請求項１１】 アニーリングされたプライマーの３’
末端が接合部位の４個のヌクレオチド内にある請求項１
０記載の方法。 - 【請求項１２】 アニーリングされたプライマーの３’
末端が接合部位の１個のヌクレオチド内にある請求項１
１記載の方法。 - 【請求項１３】 切断部位が接合部位の２個のヌクレオ
チド内にある請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 切断剤が酵素である請求項１記載の方
法。 - 【請求項１５】 酵素がタンパク質である請求項１４記
載の方法。 - 【請求項１６】 切断剤が酵素のドメインである請求項
１記載の方法。 - 【請求項１７】 酵素がＤＮＡポリメラーゼである請求
項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 ＤＮＡポリメラーゼがサームス・サー
モフィラス（Thermus thermophilus）、サームス・アク
アティカス（Thermus aquaticus ）、大腸菌（Escheric
hia coli）及びサームス・フラバス（Thermus flavus）
からなる群から選ばれた微生物から単離される請求項１
７記載の方法。 - 【請求項１９】 切断剤がバクテリオファージＴ７の遺
伝子６生産物である請求項１記載の方法。 - 【請求項２０】 切断剤が熱安定性である請求項１記載
の方法。 - 【請求項２１】 標的分子がＤＮＡである請求項１記載
の方法。 - 【請求項２２】 標的分子がＲＮＡである請求項１記載
の方法。 - 【請求項２３】 （ｃ）工程が４０℃〜８５℃の間の温
度で行われる請求項１記載の方法。 - 【請求項２４】 （ｃ）工程が５０ｍＭより多いＫＣｌ
の存在下である請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/986,330 US5422253A (en) | 1992-12-07 | 1992-12-07 | Method of site specific nucleic acid cleavage |
| US07/986,330 | 1992-12-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06303975A true JPH06303975A (ja) | 1994-11-01 |
| JP3518884B2 JP3518884B2 (ja) | 2004-04-12 |
Family
ID=25532311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33981893A Expired - Lifetime JP3518884B2 (ja) | 1992-12-07 | 1993-12-07 | 核酸分子の切断方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5422253A (ja) |
| EP (1) | EP0601834B1 (ja) |
| JP (1) | JP3518884B2 (ja) |
| AT (1) | ATE195141T1 (ja) |
| DE (1) | DE69329141T2 (ja) |
| DK (1) | DK0601834T3 (ja) |
| ES (1) | ES2148208T3 (ja) |
| GR (1) | GR3034654T3 (ja) |
| PT (1) | PT601834E (ja) |
Families Citing this family (79)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5846717A (en) | 1996-01-24 | 1998-12-08 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage |
| US6872816B1 (en) | 1996-01-24 | 2005-03-29 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid detection kits |
| WO1997027214A1 (en) * | 1996-01-24 | 1997-07-31 | Third Wave Technologies, Inc. | Invasive cleavage of nucleic acids |
| US5994069A (en) | 1996-01-24 | 1999-11-30 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acids by multiple sequential invasive cleavages |
| US5843654A (en) * | 1992-12-07 | 1998-12-01 | Third Wave Technologies, Inc. | Rapid detection of mutations in the p53 gene |
| US5888780A (en) * | 1992-12-07 | 1999-03-30 | Third Wave Technologies, Inc. | Rapid detection and identification of nucleic acid variants |
| US6673616B1 (en) * | 1992-12-07 | 2004-01-06 | Third Wave Technologies, Inc. | Methods and compositions for characterizing nucleic acids |
| US6372424B1 (en) * | 1995-08-30 | 2002-04-16 | Third Wave Technologies, Inc | Rapid detection and identification of pathogens |
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