JPH0630574B2

JPH0630574B2 - オリゴヌクレオチド‐西洋ワサビパーオキシダーゼ共有結合接合体

Info

Publication number: JPH0630574B2
Application number: JP63508221A
Authority: JP
Inventors: レベンソン，コレイ; チャン，チュ‐アン; ティー．オーケス，フレッド
Original assignee: シタスコーポレイション
Priority date: 1987-10-02
Filing date: 1988-09-19
Publication date: 1994-04-27
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: EP0372002A1; JPH02502695A; IL87880A; WO1989002932A1; CA1300532C; IL87880A0

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は一般にＤＮＡハイブリダイゼーションプローブ
に関し、そしてさらに詳しくはオリゴヌクレオチドと西
洋ワサビパーオキシダーゼ(HRP)との共有結合接合体に
関する。

背景技術非−アイソトープ性標識化合成ＤＮＡ断片は分子生物学
において、例えばＤＮＡ配列決定、ＤＮＡプローブに基
礎を置く診断等の分野において広範な用途を有する。本
明細書において開示される接合体は、オリゴヌクレオチ
ド中の１又は複数のヒドロキシル部位において１又は複
数のスルヒドリル基を導入することによる特定の基によ
るオリゴヌクレオチドの標識化を促進する試薬を用いて
製造される。

合成オリゴヌクレオチドの５′−末端にスルヒドリル基
を導入する方法は知られている。Connolly,Nuc.Acids R
es.13(12)：4485-4502(1985)及びNuc.Acids Res.15
(7)：3131-3139(1987)は、２−メルカプトエタノール、
３−メルカプトプロパン−１−オール及び６−メルカプ
トヘキサン−１−オールのＳ−トリチル−０−メトキシ
−モルホリノホスフィン誘導体、すなわち、次の式：（式中、ｘは２，３又は６である）で表わされる試薬を用いて合成ＤＮＡにスルヒドリル成
分を導入する方法を記載している。

しかしながら、この及び他の従来技術の方法は下記の欠
点の１つ又は複数を有する。

（１）オリゴヌクレオチドの５′−末端をスルヒドリ
ル、アミノ又はヒドロキシ基に連結する短いスペーサー
鎖が誘導体化された構造の不安定性をもらたす…、すな
わち、オリゴヌクレオチドへの固体支持体又は嵩ばった
標識種の接近が構造的障害を惹起し、そしてそれ故にプ
ローブに基く用途における誘導体化されたオリゴヌクレ
オチドの使用を妨害する；（２）オリゴヌクレオチドの５′−末端をスルヒドリ
ル、アミノ又はヒドロキシ基に連結する疏水性スペーサ
ー鎖が、ＤＮＡプローブに基礎を置く方法において一般
に使用される水性溶剤での溶解性の問題をもたらす；（３）常用されている官能化試薬はしばしば、一般に使
用されるＤＮＡ合成法と適合せず、その主たる理由は、
官能化試薬が試薬及びそれと一緒に典型的に使用される
溶剤と適合しないためである；（４）常用されている官能化試薬は高収率で合成するこ
とがしばしば困難であり、複雑な多段階反応である；（５）ある種の既知試薬は使用直前に複数の活性化剤に
より処理する必要がある；（６）常用されている官能化試薬は、末端スルヒドリ
ル、アミノ又はヒドロキシ成分とオリゴヌクレオチド鎖
との距離を増加するための複数のスペーサー鎖の「接ぎ
合わせ」を許容しないのみならず、一般にそれらはオリ
ゴヌクレオチド鎖にそっての複数官能化を許容しない；（７）常用されている官能化試薬は一般に５′−ヒドロ
キシル末端以外の位置での官能化を許容しない；及び（８）常用されている官能化試薬と時として、激しい条
件下での脱保護を必要とし、この脱保護反応はしばしば
容易に検出できない。

従って、上記の点を考慮したオリゴヌクレオチド官能化
剤の必要性が当業界において存在する。本発明は、上記
の問題点を克服する幾つかの新規な官能化試薬に関す
る。さらに詳しくは、本発明は、記載されるような新規
なオリゴヌクレオチド官能化試薬を用いて製造すること
ができるスルヒドリル官能化オリゴヌクレオチドを「誘
導体化する」(derivatizing)方法に向けられる。

オリゴヌクレオチドと標識用酵素との共有結合接合体が
文献に記載されている。例えば、Jablonskiら、Nuc.Aci
ds Res.14(15)：6115-6128(1986)はホモ二官能試薬ジサ
クシニミジルスベレートを用いて製造されるオリゴヌク
レオチドとアルカリ性ホスファターゼとの共有結合接合
体を記載している。Renz及びKurz,Nuc.Acids Res.12
(8)：3435-3445(1981)は約1400の分子量を有するポリエ
チレンイミンスペーサーを用いるオリゴヌクレオチドと
ＨＲＰとの共有結合複合体を記載している。さらに、Ru
th及びJablonski,Nucleosides and Nucleotides ６（１
及び２）：541-542(1981)は、オリゴマーと酵素との間
に19−原子スペーサー鎖を有するオリゴデオキシヌクレ
オチドとアルカリホスファターゼとの接合体を記載して
いる。これらのプローブは好結果に使用されているが、
しかしながら、一層安定な、そしてより早く発色し、従
ってより効果的でより迅速なモニター可能な検出手段を
提供することが望まれている。

発明の開示従って、本発明の第一の目的はＨＲＰに共有結合により
接合したスルヒドリル官能化オリゴヌクレオチドを含ん
で成る、安定で容易にモニター可能な「誘導体化され
た」オリゴヌクレオチドを提供することである。

本発明の他の目的は、このような共有結合接合体の製造
方法を提供することである。

本発明の他の目的は、ＤＮＡプローブに基礎を置く用途
においてこれらの接合体を使用する方法を提供すること
である。

本発明の他の目的、利点及び新規な特徴は部分的には以
後の記載において示され、そして部分的には以後の試験
に基いて、又は本発明の実施により当業者に知られるで
あろう。本発明の目的及び利点は添付された請求の範囲
中に特に指摘される手段及び組合せにより実現されそし
て達成されるであろう。

本発明の好ましい態様においては、スルヒドリル基を導
入するために、オリゴヌクレオチド鎖をそれに含まれる
ヒドロキシル基において官能化するためにオリゴヌクレ
オチド官能化試薬が使用される。カップリング反応は、
特にBeaucage及びCaruthers,Tetrahedron Lett.(1981)2
2：1859-1862により記載されているように、オリゴヌク
レオチドのヒドロキシル基にホスホラミダイトをカップ
リングするための標準的技法を用いて行われる。官能化
の後、オリゴヌクレオチドは、記載されるようにＨＲＰ
により新たなスルヒドリル部位において誘導体化され
る。

発明を実施するための態様「スルヒドリル官能化」又は単に「官能化」とは、本明
細書において使用される場合、保護されているか又は保
護されていないスルヒドリル成分をオリゴヌクレオチド
鎖に導入することを意味する。官能化により導入された
スルヒドリル基は、本明細書に記載するようにスペーサ
ー鎖によりオリゴヌクレオチド鎖から分離される。

「誘導体化」は、本明細書において使用する場合、官能
化されたオリゴヌクレオチドが、付加されたスルヒドリ
ル、アミノ又はヒドロキシル成分において、検出可能な
種、すなわちプローブに基礎を置く用途における標識と
して役立つ種と反応することを意味する。従って「誘導
体化された」オリゴヌクレオチドは、「誘導体化」種に
より検出可能なものである。前記のごとく、本発明にお
ける誘導体化種は酵素である西洋ワサビパーオキシダー
ゼである。

「オリゴヌクレオチド」は本明細書において使用する場
合、ヌクレオチド、典型的にはデオキシリボヌクレオチ
ドモノマーユニットの一本鎖又は二本鎖、典型的には１
本鎖である。本発明の試薬及び方法は単一ヌクレオチド
モノマー又は全長ＤＮＡ鎖と組み合わせて使用すること
ができるが、本発明における「オリゴヌクレオチドは典
型的には、約２〜約400モノマーユニット、そしてさら
に典型的には、ほとんどのプローブに基礎を置く用途の
ために、約２〜約100モノマーユニットの一本鎖であ
る。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（又は「AS
O」）として使用するための最適長さは約135〜21塩基対
である。

「プローブに基礎を置く」用途における誘導体化された
オリゴヌクレオチドの使用は、検体中のオリゴヌクレオ
チドセグメント又は配列を検出又は定量するための標識
された鎖の使用を意味することが意図される。

「保護される」遊離スルヒドリル基は、生ずる保護され
た基が、保護基が存在する１又は複数の合成段階の間の
あらゆる種類の化学反応に対して感受性でないように、
保護成分と反応する基である。

官能化され又は誘導体化されたオリゴヌクレオチド鎖の
「安定」とは、立体的障害の実質的な不存在、及びほと
んどのプローブに基礎を置く用途での化学的安定性を意
味する。

「低級アルキル」又は「低級アルコキシ」は、約１〜６
個、より典型的には約１〜３個の炭素原子を有するアル
キル置換基及びアルコキシ置換基をそれぞれ意味する。

２．官能化試薬の構造本発明のプローブを製造するために使用されるスルヒド
リル官能化試薬、すなわち共有結合オリゴヌクレオチド
−ＨＲＰ接合体は、一端にホスホラミダイト成分を有
し、該成分が親水性のスペーサーを介して、保護されて
いるか又は保護されていないスルヒドリル成分を有する
他端に連結されている、実質的に線状の試薬である。こ
れらの官能化試薬は一般に次の構造式：〔式中、Ｒは保護されているか又は保護されていないアミノ、ス
ルヒドリル又はヒドロキシ成分であり；Ｒ^*は水素、−CH₂OH、又は次の式：（式中、Ｘ¹，Ｘ²，Ｘ³，Ｘ⁴，Ｘ⁵及びＸ⁶は同一でも又
は異っていてもよく、そして水素、低級アルキル及び低
級アルコキシから成る群から選択される）で表わされる
置換基であり；Ｒ¹及びＲ²は独立に水素及び低級アルキル基から成る群
から選択され；Ｒ³はβ−シアノエチル又はメチルであり；Ｑ成分は次の式： −Ｏ−，−NH−，−Ｓ−，及びから成る群から選択され、そして同一でも異っていても
よく；ｎ′，ｎ″及びｎは２〜10の範囲（２及び10を含む）
の整数であり；そしてｎは２〜30の範囲（２及び30を含む）の範囲の整数であ
る〕により表わされる。

構造式（４）：（式中、Ｒ，Ｒ^*，Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³及びｎは前記の通りで
ある）は特に好ましい態様の一例である。親水性スペー
サー鎖は、上に示す場合においては、例えばポリエチレ
ングリコールから形成されるポリエーテル連結である。
〔一般構造式（４）に含まれる他の態様において、スペ
ーサー鎖はポリエチレングリコール等、又はテキサコ・
ケミカル社(Texaco Chemical Co.)により販売されてい
るJEFFANINES（商標）のごときポリ（オキシアルアルキ
レンアミン）から形成することもできる。

官能化試薬を任意の位置でオリゴヌクレオチド鎖にカッ
プリングすることが望まれる場合、一般に、ヌクレオシ
ドホスホラミダイトを該鎖にカップリングすることがで
き、Ｒ成分は保護されたスルヒドリル成分である。保護
基は、スルヒドリル成分が、スルホラミダイトカップリ
ング段階のあいだに、すなわち試薬のホスホラミダイト
基がオリゴヌクレオチド鎖上のヒドロキシル成分と反応
する間に、無傷であるように選択される。この反応のた
めの条件は、例えばBeaucage及びCaruthers,Tetrahedro
n Lett.22：1859-1862(1981)に記載されているいわゆる
「ホスホラミダイト」ルートを介してＤＮＡを合成する
常法において使用されるものである。

特に好ましいスルヒドリル保護基の例は、次のＲ：又はで表わされる。

上に例示した保護基は単なる例に過ぎず、上記の「保
護」の基準に合致する限り任意のスルヒドリル保護基を
用いることができると理解すべきである。

ホスホラミダイト基：により定義される官能化試薬の他端は、ほとんどの場合
に成長しつつある又は完成したオリゴヌクレオチド鎖の
末端５′−ヒドロキシル基にカップリングするように選
択される。前記のように、Ｒ¹及びＲ²は水素又は低級ア
ルキルであり、そして同一でも異っていてもよく、特に
好ましい態様においてはＲ¹及びＲ²の両者がイソプロピ
ルである。Ｒ³はメチル又はβ−シアノエチルであり、
特に好ましい態様においてはＲ³はβ−シアノエチルで
ある。カップリング手段としてのホスホラミダイトの使
用はＤＮＡ合成の分野においてよく知られており、さら
に詳細な記載のためにはBeaucage及びCaruthers(1981)
（前掲）に言及しなければならないであろう。

スペーサー鎖（９）：は親水性鎖であり、ここでｎ，ｎ′，ｎ″及びｎは前
記の値を有する整数である。

式（４）で表わされる好ましい態様において、スペーサ
ー鎖は、ポリエーテル成分：であり、ここでｎは典型的には２〜30、さらに典型的に
は２〜20であり、しかしながらある場合、すなわち誘導
体化成分とオリゴヌクレオチド鎖との間の増加した距離
が望まれる場合には30より大であることができる。

ｎの最適値は、スペーサー鎖の長さにそって約８個以上
の合計炭素原子を有するスペーサー鎖を提供する。スペ
ーサー鎖の長さは本発明の試薬の有効性に非常に関連し
ており、スルヒドリルとオリゴヌクレオチド鎖との間の
距離が大きくなれば、（１）ＤＮＡへの試験のカップリ
ングを促進し、（２）ハイブリダイゼーション妨害しそ
して官能化又は誘導体化されたオリゴヌクレオチド鎖を
不安定化するであろう立体障害を回避し、そして（３）
誘導体化されたスルヒドリル成分の運動の自由度を増強
するように「溶液」タイプの環境を刺激する。スペーサ
ー鎖が親水性であるという事実はまた水性媒体中での官
能化又は誘導体化されたオリゴヌクレオチド鎖の溶解性
を増強する。

Ｒ^*は水素、−CH₂OH、又は（３）により示される芳香族
置換基である。Ｒ^*が（３）である場合、これは、クロ
モゲン陽イオン：が放出後にモニターできるように選択される。すなわ
ち、ＤＮＡへの官能化試薬のカップリングの後、脱保護
が溶液中に陽イオン(11)をもたらすであろう。特に好ま
しい置換基の例はジメトキシトリチル(DMT)、すなわち
Ｒ^*が−CH₂−Ｏ−DMTである。

好ましい態様においては、構造式（２）及び（４）によ
り示されるように、Ｒ^*がホスホラミダイト基に隣接し
た炭素原子に結合しているが、式（２）に示されるよう
に、Ｒ^*がスペーサー鎖にそっての１又は複数の他の炭
素原子に結合していてもよい。

３．オリゴヌクレオチド鎖を官能化するための新規な試
薬の使用一般に、新規な官能化試薬とヒドロキシ基含有化合物と
の間のカップリング反応は次のスキーム：スキームＩにより表わされる。スキームＩにおいてＸは典型的には
オリゴヌクレオチド鎖である。反応条件は、前に記載さ
れるように、そして特にBeaucage及びCaruthers(1981)
（前掲）により記載されているような、ＤＮＡ合成への
ホスホラミダイトルートにおいて使用されるものと同じ
である。

化合物(12)は次の様にして脱保護される。Ｒ^*が式(3)で
表わされる場合、非保護ヒドロキシへの転換は酸で処理
することにより行われる。「Ｒ」における保護されたス
ルヒドリル置換基は、例えば硝酸銀で処理することによ
り行われる。

オリゴヌクレオチドの多官能化は複数のＲ^*部位〔Ｒ^*は
−CH₂OH、又は式（３）で表わされる〕を使用すること
により可能である。酸脱保護の後、脱保護されたヒドロ
キシル部位での反応によりさらに官能化することができ
る。すなわち、官能化されたオリゴヌクレオチド(13)：の場合、例えばＲ^*の脱保護、及び標準的ホスホラミダ
イトカップリング法を用いての該脱保護により生じた−
CH₂OH，−OH成分におけるさらなる官能化が次の式(1
4)：で表わされる化合物をもたらす。

オリゴヌクレオチド鎖にそっての複数のヒドロキシル基
における多数官能化もまた同じ化学的方法を用いて可能
である。

４．官能化試薬の合成本発明者らは新規試薬への種々のルートを開発した。簡
単のため、官能化試薬の合成を一般構造式（４）によっ
てではなく例示構造式（６）により検討しよう。しかし
ながら、記載される合成方法は一般に、（４）により表
わされる化合物に実質的に同様に適用されることが理解
されるべきである。合成されるべき官能化試薬がアミン
官能化試薬である第一の態様において、スキームIIは次
の通りである。

段階（１）は、当業界においてよく知られているMitsun
obu反応を示す。要約すれば、この反応は化合物(15)，
(16)，(17)及び(18)の混合物を用い、極性有機溶剤中で
少なくとも数時間、好ましくは一夜行われる（実施例１
を参照のこと）。化合物(19)が単離され、そして次のよ
うにしてホスホラミダイト（ここで、Ｘはハロゲン、好
ましくは塩素である）にカップリングされる。モル過剰
のホスホラミダイトが化合物(19)に、適当な溶剤、やは
り好ましくは極性有機溶剤中で、不活性雰囲気下で添加
される。化合物(20)は、例えばカラムクロマトグラフィ
ーにより単離される。

アミン官能化試薬を合成するための他の方法であって、
スルヒドリル官能化試薬を得るためにも使用できるもの
は次のスキームIIIにより表わされる。

スキームIIIにおいて、段階１ａ−１ｃ及び１ａ′−１
ｂ′は中間体(21)への代替できるルートを示す。段階１
ａ−１ｃにおいて、保護されたジオール(21)は、ポリエ
チレングリコール(15)とアリルブロマイドとの反応（こ
の反応は室温において、少なくとも約数時間、好ましく
は一夜行われる）による(19)の生成；常用の既知の条件
下での(19)と四酸化オスミウムとの反応によるジオール
(20)の生成；及び２，２−ジメトキシプロパンとの反応
による該ジオールの保護、により生成される。段階１
ａ′−１ｂ′はトシル化グリコール（21′）とソルケタ
ール陰イオンとの反応を介して(21)をもたらす。段階２
はスキームIIに示したMitsunobu反応を示し、ここでＲ
は前に定義した通りであり、他方段階３の酸処理はジオ
ールを脱保護する。段階４−１はクロモゲン成分(11)
（ここでＹは(11)により表わされる）を導入し、そして
段階４−２はホスホラミデートを導入する。両段階４−
１及び４−２における「Ｘ」はハロゲン脱離基、好まし
くは塩素である。

スルヒドリル官能試薬の製造のために特異的な第三の合
成法はスキームIVにより示される。

スキームIV スキームIVにおいて、段階１は低温、好ましくは０℃以
下において行われ、そしてトリフェニルホスフィン、ジ
イソプロピルアゾジカルボキシレート及びＳ−トリチル
メルカプタンを一夜反応せしめる。中間体(24)が精製さ
れ、そしてホスホラミデートが段階（２）において添加
され、そして(25)が高収率で得られる。ここで、構造式
（４）の「Ｒ」は−Ｓ−Ｃφ₃（常にφ＝フェニル）と
して示されるが、実際に任意の保護されたスルヒドリル
成分であることができる。

５．ＨＲＰによる誘導体化上記の試薬を用いて製造される官能化されたオリゴヌク
レオチド鎖はプローブを基礎とする用途において主とし
て有用である。すなわち、オリゴヌクレオチドにスルヒ
ドリルを導入する主たる目的はその部位において、標識
された種による誘導体化を可能にすることである。本発
明は西洋ワサビパーオキシダーゼ酵素による誘導体化に
向けられる。

本発明の誘導体化されたオリゴヌクレオチドはＨＲＰに
共有結合により接合したオリゴヌクレオチド鎖を含んで
成る抗合体であり、この抗合体は次の構造式(26)：（式中、Ｒ^*，Ｑ，ｎ，ｎ′，ｎ″及びｎは化合物
（２）について前に定義した通りであり、そしてＸはオ
リゴヌクレオチド鎖である）により表わされる。

オリゴヌクレオチド鎖の長さは典型的には２〜100モノ
マーユニットの範囲である。接合体が対立遺伝子特異的
オリゴヌクレオチド(ASO)として使用される場合。鎖中
のモノマーユニットの数は好ましくは約13〜21である。

１つの具体例において、この様な接合体は次の構造式(2
7)：（式中、Ｒ^*，Ｘ及びｎは前記の通りである）により表わされる。式(27)の接合体はオリゴマーＸへの
スルヒドリル官能化試薬（４）のカップリングにより生
ずる。

式(28)により示される共有結合接合体(28)はスキームＶ
により例示される方法により製造される。

スキームＶ mal−sac−HNSA、すなわち４−ヒドロキシ−３−ニトロ
ベンゼンスルホン酸ナトリウム塩〔HNSA〕のＮ−マレイ
ミド−６−アミノカプロイル〔mal-sac〕誘導体、及び
対応するmal−sac−HNSA HRP複合体(28)は実施例６及び
７に後記する。

チオール化オリゴヌクレオチド(29)は実施例８に記載す
るようにして製造される。典型的には、トリチルリチオ
オリゴヌクレオチドを、スキームＶの反応において使用
する直前に誘導体化する。

mal−sac HRP複合体(28)を単純な混合により、好ましく
は室温以下でチオール化オリゴヌクレオチド(29)にカッ
プリングさせる。反応混合物を室温において、例えば約
０℃において、少なくとも一夜、そして好ましくは少な
くとも数日間保持し、この時点で共有結合ＨＲＰ接合体
(26)を単離しそして好ましくはクロマトグラフィーによ
り精製する。

プローブに基礎を置く用途において使用する前に、接合
体を、約5.5〜約7.5、好ましくは約6.0のpHに維持され
たリン酸緩衝液（場合によっては酸を添加する）に、約
−10℃〜約30℃（但し溶液が凍結しないようにする）、
最適には約４℃の温度にて保持する。

ハイブリダイゼーションにおいて使用するため、接合体
溶液は通常、ハイブリダイゼーション緩衝液により希釈
され（最終濃度は用途に依存する）、そして標準的ハイ
ブリダイゼーション技法（例えば、Maniatisら、Molecu
lar Cloning、ニューヨーク、Cold Spring Harbor Labor
atory,1982)に従って使用される。一般的方法は当業界
においてよく知られており、そして典型的には、（１）
注目の分析対象のヌクレオチド配列に対して実質的に相
補的な、すなわちハイブリダイゼーションを可能にする
ために十分なだけ相補的な共有結合接合体を用意し；
（２）溶液中で注目の分析対象を共有結合接合体と接触
せしめ；そして（３）生成する核酸複合体の存在を、Ｈ
ＲＰ活性を測定することにより検出する、ことを含む。

一般に、共有結合複合体は固体支持体に結合した分析対
象にハイブリダイズし、そして次にその上で検出され
る。

要約すると、プローブに基礎を置く用途における本発明
の新規なＨＲＰ接合体の移点は多い。主たる利点は比較
的長い親水性のスペーサー鎖であり、これは、ＨＲＰと
オリゴヌクレオチドとの間の最適な距離を提供し、ＨＲ
Ｐの十分な生物学的活性が保持されることを保証し、そ
してハイブリダイゼーションの効率を増強する。新規な
接合体はまた、「Ｒ^*」成分のため、１つのオリゴヌク
レオチドの複数誘導体化、すなわち、末端対末端連結し
ているか又はオリゴヌクレオチド鎖内の種々の点で接合
している２個以上の「スペーサー−ＨＲＰ」の結合を許
容する。最後に、他の酵素／オリゴマー接合体、例えば
アルカリホスファターゼ系とは異り、迅速な発色によっ
て検出の容易さが増強される。

本発明をその好ましい特定の態様と関連させて記載した
が、前記の記載及び実施例は例示的なものであり、本発
明の範囲を限定するものではないと理解される。他の観
点、利点、及び本発明の範囲での変更は当業者に明らか
であろう。

実施例１．（ａ）テトラエチレングリコールとフタリミドとの反応
〔スキームII、段階（１）を参照のこと〕テトラエチレングリコール(38.85g,200mmole)及びトリ
フェニルホスフィン(52.46g,200mmole)を200ｍの乾燥
ＴＨＦに溶解し、そしてフタリミド(29.43g,200mmole)
を加えた。100ｍの乾燥ＴＨＦ中ジエチルアゾジカル
ボキシレート(DEAD)の溶液を、凍却及び撹拌しながら反
応混合物に滴加した。反応混合物を室温にて一夜撹拌し
た。次に、溶剤を減圧下で除去し、そして残渣を250ｍ
の水と250ｍのジエチルエーテルとの間で分配し
た。水性層を200ｍのジエチルエーテルにより５回洗
浄し、そして真空乾燥した。残渣をトルエンの共沸蒸留
（３×100ｍ）により乾燥した。次に、得られた25.89
g SiO₂カラム上で溶離剤として酢酸エチルを用いて精製
した。生成物画分を集め、そしてシロップ状(11.75g；3
6.3mmole；18.2%)に濃縮し、これを一夜結晶化させた。

（ａ）において得られた生成物の構造は、¹H-NMRによ
り、であると確認された。

（ｂ）アリル誘導体の合成〔スキームIII、段階（１
ｂ）を参照のこと〕 100ｍの乾燥ＴＨＦ中段階（ａ）で得られたアルコー
ル(4.67g,14.4mmole)の溶液にNaH(520mg,21.67mmole)を
加えた。この混合物を１時間撹拌し、そして次にアリル
ブロマイド(1.9ｍ，2.61g,21.67mmole)を加えた。こ
の懸濁液を一夜撹拌し、この時点で濾過し、そして溶剤
を減圧下で除去した。残渣をSiO₂カラム上で溶離剤とし
て酢酸エチルとヘキサンとの混合物(70：30)を用いて精
製した。目的の生成物を含有する画分をプールし、そし
て2.84g(7.82mmole,54.3％）のシロップ状に濃縮した。
元素分析は次の通りであった。

計算値：Ｃ 62.80；Ｈ 6.93；Ｎ 3.85 測定値：Ｃ 62.49；Ｈ 6.99；Ｎ 3.82。

得られた生成物の提案される構造は、であった。

(c)対応するジオールの合成〔スキームIII、段階（１
ｂ）を参照のこと〕 180ｍのＤＭＦ／水（８：１）中段階（ｂ）で得られ
たアリルエーテル(2.84g,7.82mmol)及びＮ−メチルモル
ホリンＮ−オキサイド(1.83g,15.63mmole)の溶液に四酸
化オスミウム（ｔ−ブタノール中25mg／ｍの溶液8.13
ｍ；800μmole)を加えた。生ずるコハク色の溶液を室
温にて撹拌した。48時間後、水（10ｍ）中ナトリウム
ハイドロサルファイト(2.13g)の溶液を反応混合物に加
えた。形成される黒色沈澱及び懸濁液を１時間撹拌し
た。この混合物を濾過し、そして減圧下で濃縮した。残
渣をSiO₂カラム上で溶離剤として塩化メチレンとメタノ
ールとの混合物を用いて精製した。元素分析は次の通り
であった。

生成物の提案される構造は、であった。

（ｄ）ＤＭＴによる標識前記（ｃ）において得られたジオール（１ｇ，2.25mmol
e）を無水ピリジン（２×15ｍ）と共蒸発せしめた。
次に、乾燥残渣を25ｍの無水ピリジンに溶解した。こ
の溶液にDMT-Cl(0.92g,2.75mmole)を加えた。反応を室
温にて行い、そして生成物の出現までＴＬＣ(CH₃Cl：Me
OH 約97：３）によりモニターした。

１時間後、10ｍのメタノールを添加し、そして反応混
合物をさらに10分間撹拌した。次に、10ｍの氷水によ
り反応を停止せしめ、そして酢酸エチル（２×75ｍ）
で抽出した。

有機層を５％NaHCO₃(50ｍ）で１回、及び飽和NaCl溶
液で２回洗浄し、そしてNa₂SO₄で乾燥した。生成物を減
圧下で油状残渣になるまで蒸発させた。

残渣を上記の溶剤系を用いてクロマトグラフ処理した。
最終生成物をさらに精製することなく段階（ｅ）におい
て使用した。収率：理論量の86.3％（実際量1.51g／理
論量1.75g）。この段階で得られた提案される構造は、であった。

（ｅ）ホスホラミダイトの製造段階（ｄ）において得られた生成物(1.0g,1.4mmole)を1
0ｍの酸不含有クロロホルムに溶解し、そして乾燥ア
ルゴンによりレフレッシュされた。250ｍ丸底フラス
コに入れた。この溶液に、0.72g(5.6mmole)の〔(CH₃)₂-
CH〕₂−Ｎ−Etを加えた。次に、ホスホラミダイト： 0.66g(2.8mmole)を注射器を用いて２分間にわたって加
えた。反応を室温にてそしてアルゴンのもとで行った。
１時間後、混合物を50ｍの酢酸エチルと共に250ｍ
の分液漏斗に移し、そして飽和NaCl溶液により４回抽出
した。有機層をNa₂SO₄で乾燥し、そして真空下で油状残
渣まで蒸発せしめた。この残渣を酢酸エチル中１％Et₃N
によりクロマトグラフ処理した。収率：理論量の48.4％
（実際量0.61g／理論量1.26g)。

実施例２．実施例１に記載したのと実質的に同じ方法に従ったが、
しかしこの場合テトラエチレングリコール出発物質を最
初にフタリミドと反応させなかった。

（ａ）ペンタエチレングリコールのアリル誘導体の合成 100ｍの乾燥ＴＨＦ中ペンタエチレングリコール(5.65
g,20mmole)の溶液にｔ−ブタノールのカリウム塩(2.24
g,20mmole)を添加した。この混合物を30分間撹拌した。
そして18−クラウン−６(53mg,0.2mmole)を添加した。
混合物をさらに30分間撹拌し、そして次にアリルブロマ
イド(2.42g,1.73ｍ，20mmole)を加えた。臭化カリウ
ムと考えられる白色沈澱が認められ、そして撹拌を一夜
続けた。反応混合物をワットマンＧＦＢフィルターを通
して濾過し、８ｇのSiO₂に吸着せしめ、そして溶剤とし
て塩化メチレンとアセトンとの混合物（１：１）を用い
てSiO₂カラム上で分画した。プールされた画分が4.28g
(13.28mmole,66.4％）の生成物をもたらした。元素分析
は次の通りであった。

計算値：Ｃ 55.88；Ｈ 9.83 測定値：Ｃ 55.56；Ｈ 9.76。

生成物の提案される構造は、であった。

（ｂ）対応するジオールの合成アセトンと水との混合物（８：１）270ｍ中段階
（ａ）において調製したアリルエーテル(4.28g,13.28mm
ole)の溶液にＮ−メチルモルホリン(3.11g,4.6ｍ，2
6.55mmole,２当量）及びこれに続いて四酸化オスミウム
（ｔ−ブタノール中25mg／ｍ；338mg;13.5ｍ；1.33
mmole(0.1当量）を加えた。この反応混合物を一夜撹拌
した。次の朝、15ｍの水中ナトリウムハイドロサルフ
ァイト(3.62g)の溶液を加えた。45分間の撹拌の後、懸
濁液をワットマンＧＦＢフィルターを通して濾過した。
溶剤を蒸発せしめ、残渣をメタノール中に入れ、そして
懸濁液を濾過した。濾液をコハク色のシロップ状に濃縮
し、このシロップを次にSiO₂上で溶離剤として塩化メチ
レン、メタノール及び酢酸の混合物(80：20：５）を用
いて精製した。生成物を含有する画分を濃縮して3.3g
(9.26mmole、収率69.7％）の生成物を得た。

この生成物の提案される構造は、であった。

（ｃ）段階（ｂ）において調製したトリオール(3.3g,9.
26mmole)を60ｍのアセトンに入れ、そして硫酸第二銅
(45ｇ，28.20mmole)を加えた。生ずる青味がかった懸濁
液に60ｍのH₂SO₄を添加し、この時点で溶液が黄色に
変った。フラスコに栓をし、そして一週末にわたって撹
拌した。次に、懸濁液をワットマンＧＦＢフィルターを
通して濾過し、そして濾液を2.5ｇのCa(OH)₂中で１時間
処理した。懸濁液を再び濾過し、そして濾液を濃縮しそ
してSiO₂カラム上で精製した。カラムにクロロホルム／
メタノール(97：３）を通し、そして次に再びクロロホ
ルム／メタノール（８：１）を用いた。カラム画分をプ
ールし、3.03g(7.64mmole,82.5％）の生成物を得た。

生成物の提案される構造は、であった。

実施例３．の合成を次の様にして行った。

(a)ヘキサエチレングリコール(10.0g,35.40mmole)を無
水ピリジン（３×25ｍ）と共に共蒸発せしめ、そして
次に100ｍのそれに溶解した。この溶液にDMT-Cl(13.1
7g,38.94mmole)を加えた。反応を室温にて行い、そして
生成物が出現するまでＴＬＣ(CHCl₃：MeOH 約８：１)
によりモニターした。２時間後、25ｍのメタノールを
添加し、そして反応混合物をさらに15分間撹拌した。次
に、この反応を50ｍの氷水により停止せしめ、そして
酢酸エチル（３×150ｍ）により抽出した。有機層を
５％NaHCO₃(２×100ｍ）及び飽和NaCl（２×100ｍ
）により洗浄し、Na₂SO₄により乾燥し、そして次に油
状残渣（黄味がかった色）にまで蒸発せしめた。この油
状残渣をシリカゲルカラム(400g)上でクロマトグラフ処
理した。カラムをまずCHCl₃／MeOH（約97：３）によ
り、次にCHCl₃／MeOH（約90：10)により溶出した。画分
を一緒にし、そして蒸発乾燥して油状残渣を得た。得ら
れた物質は次の構造：を有するものと予想され、そしてさらに精製することな
く、対応するホスホラミダイトの合成において使用し
た。

（ｂ）2.０ｇ(3.40mmole)の（ａ）において得た化合
物、1.６ｇ(6.80mmole)のホスホラミダイト：及び1.76g(13.60mmole)の〔(CH₃)₂-CH〕−Ｎ−Etを用い
て実施例１（ｅ）の方法を反復した。生成物の元素分析
は、C₄₂H₆₁N₂O₁₀PxH₂Oについて予想した通りであった。

計算値：Ｃ 63.49；Ｈ 7.93；Ｎ 3.52 測定値：Ｃ 63.36；Ｈ 7.95；Ｎ 4.11。

収率：理論量の85.4％(2.28g／2.67g)。

実施例４． (a)化合物：〔化合物(26)、スキームIV、ステップ（１）を参照のこ
と〕の合成を次の様にして行った。75ｍの乾燥ＴＨＦ
中トリフェニルホスフィン(7.87g,30mmole)の０℃の溶
液に撹拌しながらアゾジカルボキシレート(NCOOCH(C
H₃))₂(6.07g,30mmole)を加えた。１時間後、10ｍの乾
燥ＴＨＦ中テトラエチレングリコール(5.83g,30mmole)
の溶液を加えた。溶解したすべての物質が淡黄色溶液を
与えた。１時間の後、20ｍの乾燥ＴＨＦ中メルカプタ
ンφ₃C-SHの溶液を、冷去及び撹拌しながら滴加した。
反応混合物を一夜撹拌し、そして溶剤を減圧下に除去し
た。残渣をSiO₂カラムに適用し、そして塩化メチレン及
びこれに続き塩化メチレンとCH₃CNとの混合物（２：
１）を用いて分画した。物質をSiO₂上で溶離剤としてCH
₃CNを用いて再クロマトグラフィー処理し、そして生成
物をφＰ＝０から、小（約15ｍ）画分を取ることによ
り取り出した。画分をプールし、5.22g(11.53mmole,38.
4％全体収率、理論量の77％）を得た。元素分析の結果
は次の通りであった。

計算値：Ｃ 71.65；Ｈ 7.12；Ｓ 7.08 測定値：Ｃ 71.32；Ｈ 7.21；Ｓ 7.15。

（ｂ）次に、対応するホスホラミダイト：の合成を、実施例１（ｅ）に記載した方法に従って、段
階(a)の反応生成物(4.22g,9.30mmole)、ホスホラミダイ
ト： (4.40g,18.60mmole)、及び〔(CH₃)₂CH〕₂N-Et(4.81g,3
7.20mmole)を用いて行った。収率：理論量の75.3％(4.5
7g／6.07g)。

実施例５． (a)化合物：の合成を次の様にして行った。75ｍの乾燥ＴＨＦ中ト
リフェニルホスフィン(7.87g,30mmole)の０℃の溶液
に、撹拌しながらジイソプロピルアゾジカルボキシレー
ト(NCOOCH(CH₃))₂(6.07g,30mmole)を加えた。１時間
後、10ｍの乾燥ＴＨＦ中テトラエチレングリコール
(5.83g,30mmole)の溶液を加えた。溶解したすべての物
質が淡黄色溶液を与えた。１時間後、20ｍの乾燥ＴＨ
Ｆ中メルカプタンφ₃C-SHの溶液を、冷却及び撹拌しな
がら滴加した。反応混合物を一夜撹拌し、そして溶剤を
減圧下で除去した。残渣をSiO₂カラムに適用し、そして
塩化メチレン及びそれに続き塩化メチレンとCH₃CNとの
混合物（２：１）を用いて分画した。物質をSiO₂上で溶
離剤としてCH₃CNを用いて再クロマトグラフ処理し、そ
して生成物をφ₃P＝０から、小（約15ｍ）画分を取る
ことにより取り出した。画分をプールし、5.22g(11.53m
mole;全体収率38.4％；理論量の77％）を得た。元素分
析は次の通りであった。

(b)ホスホラミダイト：の製造段階(a)で得られた生成物(4.22g,9.30mmole)を10ｍの
酸不含有クロロホルムに溶解し、そしてアルゴンにより
レフレッシュされた250ｍ丸底フラスコに入れた。こ
の溶液に0.72g(5.6mmole)の〔(CH₃)₂CH〕₂N-Etを加え
た。次に、ホスホラミダイト： (0.66g,2.8mmole)を注射器を用いて２分間にわたり加え
た。室温にてアルゴンのもとで反応を行った。１時間
後、混合物を50ｍの酢酸エチルと共に250ｍの分液
漏斗に移し、そして飽和NaCl溶液により４回抽出した。
有機層をNa₂SO₄で乾燥し、そして真空下で油状残渣にま
で蒸発せしめた。この残渣を酢酸エチル中１％Et₃Nによ
りクロマトグラフ処理した。

実施例６． mal-sac-HNSAエステルの製造１モル当量(2.24g)の４−ヒドロキシ−３−ニトロベン
ゼンスルホン酸ナトリウム塩(HNSA)を１モル当量(2.06
g)のジシクロヘキシルカルボジイミド及び１モル当量
(2.10g)のＮ−マレイミド−６−アミノカプロン酸と25
ｍのジメチルホルムアミド中で室温にて混合した。ジ
シクロヘキシル尿素の白色沈澱が生成した。この沈澱を
濾去し、そして母液に300ｍのジエチルエーテルを加
えた。約10分間〜４時間後、母液からゴム状の固体が沈
澱した。この固体は58％の活性HNSAエステル及び42％の
遊離HNSAを含有していることが見出された。

少量の沈澱を10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解し、そし
て406nmでの吸光を測定することにより分析を行った。
この読みが未反応の遊離HNSAの量を与え、これが粗HNSA
エステル中の挟雑物質である。非常に少量の濃強塩基
（５Ｎ NaOH）の添加がこのエステルを加水分解した。
第二の読みを取った。第二の読みから第一の読みを差引
いた差がもとの物質中のエステルの量を与えた。生成目
的のため、前記固体をＤＭＦに溶解し、LH20セファデッ
クスカラムに上に置き、そしてＤＭＦで溶出することに
よりエステルを挟雑遊離HNSAから分離した。精製の進行
を、溶出溶剤としてクロロホルム、アセトン及び酢酸
（６：３：１＝ｖ：ｖ：ｖ）を用いる薄層クロマトグラ
フィーによりモニターした。生成物は、アミンと反応す
るその活性によりmal-sac HNSAとしてポジティブに同定
された。生成した粗エステルの量は理論量の約30％であ
ると算定され、生成された物質は99％のエステルから成
っていた。

こうして得られたエステルは水に十分に溶解することが
見出され、そして親核物質が添加されなければ数時間に
わたり水中で安定であることが見出された。精製された
エステルは乾燥状態で貯蔵されれば長期間安定であるこ
とが見出された。

実施例７．mal-sac HNSAエステルと西洋ワサビパーオキ
シダーゼ(HRP)との接合体の製造 mal-sac HNSAエステルとＨＲＳとのアミドを次の様にし
て製造した。

合計40mg(1.０μmole)のＨＲＰ（シグマ・ケミカル社）
を0.５ｍの0.１Ｍリン酸緩衝液(pH7.０）に溶解し、
全アミン濃度を3.７×10^-3Ｍとした。次に、実施例６Ａ
のデーターから計算して５mg(1.１×10^-5mole)の実施例
５Ａのmal-sac HNSAエステルを0.５ｍのＨＲＰ溶液に
溶解した。この混合物を室温にて撹拌し、そしてＨＲＰ
画分(2.8ｍ）をファルマシアＧ−25カラム上に集め溶
剤として0.１Ｍリン酸緩衝液(pH6.０）を使用した。

実施例８．ＨＲＰ−オリゴヌクレオチド接合体の製造バイオサーチ8630DNAシンセサイザーで合成した次の19-
mer：d(TGTTTGCCTGTTCTCAGAC)を用いてチオール官能化
オリゴマーを調製した。

実施例１（ｂ）で得られたスルヒドリル官能化試薬をオ
リゴマーの溶液と混合し、そして標準的ホスホラミダイ
トカップリング条件〔例えば、Beaucage及びCaruthers
(1981)、前掲〕下でそれにカップリングさせた。

トリチルチオ・オリゴマーを、分取用ＰＲＰ−カラム、
及び次の溶剤系〔ここで、溶剤「Ａ」はCH₃CNであり、
そして「Ｂ」は0.１Ｍ TEAA(pH7.２）中５％CH₃CNであ
る〕：（１）Ａ：10％→40％、15分間；（２）Ａ：40％
→100％、15分間；及び（３）Ａ：100％、５分間、を用
いて精製した。トリチルチオ・オリゴマーは約20分後に
溶出した。

こうして得られた精製トリチルチオ・オリゴマーを、硝
酸銀及びジチオスレイトール〔0.１Ｍ TEAA(pH6.５）
中それぞれ0.１Ｍ及び0.15Ｍ〕を用いて脱トリチル化し
た。次に、ジトリチル化オリゴマーをＧ−25(NAP-10)カ
ラムに通し、真空濃縮して約100μとし、そして次の
接合反応においてすぐに使用した。

実施例７において調製したmal-sac HRP複合体(700μ
）をチオオリゴマーに分配して最終容量800μとし
た。個々の反応容器を室温にて約１時間、そして次に約
４℃にて約２日間保持し、そしてこの時点で４種類の接
合体を取り出し、そしてDEAE Nucleogenカラム上で次の
溶剤勾配（「Ｂ」は20mM Na₂PO₄(pH６）；「Ｃ」は20mM
Na₂PO₄＋１Ｍ NaCl（pH６）を意味する〕：（１）
Ｂ：０→100％、30分間；（２）Ｃ：100％、10分間；及
び（３）Ｃ：100％→０％、５分間、を用いて精製し
た。残りの未接合ＨＲＰ及びオリゴマーはそれぞれ約２
分間後及び約15〜40分間後（オリゴマーのサイズに依存
する）に溶出し、他方接合体は同様に約15〜40分間後
（やはりオリゴマーのサイズに依存する）に溶出した。
生成物の同一性は、オリゴマー(260nm)及びＨＲＰのヘ
ム基(402nm)のピーク吸光をモニターして紫外線分光法
により確認した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者オーケス，フレッドティー. アメリカ合衆国，ニューヨーク 14617, ロチェスター，スタントンレイン 216

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の構造式：（式中、Ｒ^*は水素又は−CH₂OHであり；ｎ′，ｎ″及びｎは２〜10（２及び10を含む）の範囲
の整数であり；ｎは２〜30（２及び30を含む）の範囲の整数であり；そ
してＸはオリゴヌクレオチド鎖である）で表わされる、オリゴヌクレオチド鎖と西洋ワサビパー
オキシダーゼとの共有結合接合体。
【請求項２】Ｒ^*が水素である請求項１の接合体。
【請求項３】対立遺伝特異的オリゴヌクレオチドとして
有用であり、そして前記オリゴヌクレオチド鎖が約13〜
約21のモノマーユニットの長さを有する請求項１に記載
の接合体。
【請求項４】次の構造式：（式中、Ｒ^*は水素又は−CH₂OHであり；ｎは２〜30（２及び30を含む）の範囲の整数であり；そ
してＸはオリゴヌクレオチド鎖である）で表わされる、オリゴヌクレオチド鎖と西洋ワサビパー
オキシダーゼとの共有結合接合体。
【請求項５】Ｒ^*が水素である請求項４の接合体。
【請求項６】対立遺伝特異的オリゴヌクレオチドとして
有用であり、そして前記オリゴヌクレオチド鎖が約13〜
約21のモノマーユニットの長さを有する請求項４に記載
の接合体。
【請求項７】次の構造式：（式中、Ｒ^*は水素又は−CH₂OHであり；ｎ′，ｎ″及びｎは２〜10（２及び10を含む）の範囲
の整数であり；ｎは２〜30（２及び30を含む）の範囲の整数であり；そ
してＸはオリゴヌクレオチド鎖である）で表わされる、オリゴヌクレオチド鎖と西洋ワサビパー
オキシダーゼとの共有結合接合体の製造方法であって、次の構造：を有する官能化されたオリゴヌクレオチドをカップリン
グ条件下でmal-sac-HNSAエステルとＨＲＰとの複合体と
反応せしめる；段階を含んで成る方法。
【請求項８】前記官能化されたオリゴヌクレオチド鎖が
次の構造式：により示されるものである請求項７に記載の方法。