JPH062056B2 - オリゴヌクレオチドと酵素の結合物およびその製造方法 - Google Patents
オリゴヌクレオチドと酵素の結合物およびその製造方法Info
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- JPH062056B2 JPH062056B2 JP2239167A JP23916790A JPH062056B2 JP H062056 B2 JPH062056 B2 JP H062056B2 JP 2239167 A JP2239167 A JP 2239167A JP 23916790 A JP23916790 A JP 23916790A JP H062056 B2 JPH062056 B2 JP H062056B2
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- enzyme
- oligonucleotide
- amino group
- link
- reactive amino
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ＤＮＡハイブリッド形成またはポリメラー
ゼ連鎖反応で有用なオリゴヌクレオチドと酵素の共有結
合物に関する。
ゼ連鎖反応で有用なオリゴヌクレオチドと酵素の共有結
合物に関する。
生物学的物質中に存在する特定の核酸、関連する生物体
および遺伝子の特徴について試験するための一本鎖ＤＮ
ＡまたはＲＮＡプローブ類の使用は周知である。このよ
うなプローブ類が効率的でないことが見い出されている
領域としては、食品、血液および感染体に関する他の生
物学的被検体の診断上の試験、ならびに遺伝疾患および
遺伝子の異常を伴うガンのような特定疾患の存在の診断
が挙げられる。無同位体的に標識された合成オリゴヌク
レオチド類は、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡハイブリッド形
成アッセイおよび、より最近では、米国特許第4,683,19
5号および同4,683,202号明細書に記載されるポリメラー
ゼ連鎖反応として普通知られている増幅手段に広く使用
されている。
および遺伝子の特徴について試験するための一本鎖ＤＮ
ＡまたはＲＮＡプローブ類の使用は周知である。このよ
うなプローブ類が効率的でないことが見い出されている
領域としては、食品、血液および感染体に関する他の生
物学的被検体の診断上の試験、ならびに遺伝疾患および
遺伝子の異常を伴うガンのような特定疾患の存在の診断
が挙げられる。無同位体的に標識された合成オリゴヌク
レオチド類は、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡハイブリッド形
成アッセイおよび、より最近では、米国特許第4,683,19
5号および同4,683,202号明細書に記載されるポリメラー
ゼ連鎖反応として普通知られている増幅手段に広く使用
されている。
プローブまたはプライマー類の使用は、特定条件下でそ
のプローブとプライマーが相補的なヌクレオチド類を有
する核酸と水素結合を介してハイブリッドを形成しうる
ことが根本的な原理である。次に、ハイブリッド形成産
物は直接または適切な試薬を使用する増幅工程後適当に
検出することができる。
のプローブとプライマーが相補的なヌクレオチド類を有
する核酸と水素結合を介してハイブリッドを形成しうる
ことが根本的な原理である。次に、ハイブリッド形成産
物は直接または適切な試薬を使用する増幅工程後適当に
検出することができる。
初期のプローブは、32Ｐ標識ヌクレオシド三リン酸のよ
うな放射性同位体で標識されていた。しかしながら、そ
れらは多くの用途に適さず、そして安全性や認可を考慮
しさらに保存中に標識が自然崩壊するため一般には避け
られている。
うな放射性同位体で標識されていた。しかしながら、そ
れらは多くの用途に適さず、そして安全性や認可を考慮
しさらに保存中に標識が自然崩壊するため一般には避け
られている。
ヨーロッパ特許公開第278220号及び米国特許第4,780,40
5号公報に記載されるように、前記のような短所を持た
ずプローブ類に適する標識を見い出すべく研究が続けら
れてきた。例えば、ヨーロッパ特許公開第304934号公報
に記載されているように、標識オリゴヌクレオチドに対
する標識類として酵素標識が最とも一般的に使用される
ようになってきた。
5号公報に記載されるように、前記のような短所を持た
ずプローブ類に適する標識を見い出すべく研究が続けら
れてきた。例えば、ヨーロッパ特許公開第304934号公報
に記載されているように、標識オリゴヌクレオチドに対
する標識類として酵素標識が最とも一般的に使用される
ようになってきた。
国際出願公開第89／02932号公報は、共有結合を形成す
るためのオリゴヌクレオチドに対する西洋ワサビペルオ
キシダーゼの結合方法を記載する。この結合物の生成で
は、メルカプト機能化オリゴヌクレオチドがマレイミド
機能化西洋ワサビペルオキシダーゼと反応されている。
この方法は当該技術分野の進歩を示すものであるが、メ
ルカプト機能化オリゴヌクレオチドの酸化生成物のよう
な好ましくない副生成物を避け、ならびに時間のかかる
複雑な調製工程を避けるようなさらなる改良が望まれて
いる。さらに、チオール機能化オリゴヌクレオチドは不
安定で保存期間を制限した。最高の効率を発揮するに
は、それが調製された直後にそれを使用しなければなら
なかった。
るためのオリゴヌクレオチドに対する西洋ワサビペルオ
キシダーゼの結合方法を記載する。この結合物の生成で
は、メルカプト機能化オリゴヌクレオチドがマレイミド
機能化西洋ワサビペルオキシダーゼと反応されている。
この方法は当該技術分野の進歩を示すものであるが、メ
ルカプト機能化オリゴヌクレオチドの酸化生成物のよう
な好ましくない副生成物を避け、ならびに時間のかかる
複雑な調製工程を避けるようなさらなる改良が望まれて
いる。さらに、チオール機能化オリゴヌクレオチドは不
安定で保存期間を制限した。最高の効率を発揮するに
は、それが調製された直後にそれを使用しなければなら
なかった。
従って、改良された収率と安定性を有する酵素標識オリ
ゴヌクレオチド結合物を提供しうる方法を入手すること
は非常に有益であろう。また、苛酷なオリゴヌクレオチ
ド試薬の副反応を回避可能にすることも望まれるであろ
う。
ゴヌクレオチド結合物を提供しうる方法を入手すること
は非常に有益であろう。また、苛酷なオリゴヌクレオチ
ド試薬の副反応を回避可能にすることも望まれるであろ
う。
前述した既知方法に関連する課題は、下記工程を含んで
なるオリゴヌクレオチドと酵素の共有結合物を製造する
方法によって解決される。
なるオリゴヌクレオチドと酵素の共有結合物を製造する
方法によって解決される。
すなわち、 Ａ．反応性アミノ基または反応性アミノ基に転化しうる
基のいずれかを有する酵素と、縮合反応によって前記反
応性アミノ基と反応し、かつ、次式 Ｒ*−LINK1−Ｓ−BLOCK （上式中、Ｒ*は前記反応性アミノ基と反応しうる基で
あり、 −LINK1−は、二価の有機部分であり、そして −BLOCKはメルカプト基を非求核性にするようにそのメ
ルカプト基と反応しうる化合から誘導されるものであっ
て、その後除去される基を表わす）で示されるブロック
されたメルカプト置換有機化合物とを反応させ、次式 Ｘ−NH−LINK1−Ｓ−BLOCK （上式中、Ｘ−NH−は水素原子が反応性アミノ基から除
去された前記酵素である）で示される中間体Ａを生成す
る工程、 Ｂ．中間体Ａから−BLOCKを除去して、次式 Ｘ−NH−LINK1−SH で示される試薬を生成する工程、 Ｃ．次式 （上式中、−LINK2−は、１個以上のオキシ、チオ、イ
ミノ、カルボニルイミノ、イミノカルボニル、イミノカ
ルボニルオキシ、ホスフェートまたはウレイレン基で中
断または停止されていてもよい炭化水素鎖を表わし、そ
して は、水酸基が末端ホスフェートの３′または５′末端で
それから除去されたオリゴヌクレオチド鎖を表わす）で
示される活性化オリゴヌクレオチド誘導体を供給する工
程、ならびに Ｄ．工程Ｃで供給された前記活性化オリゴヌクレオチド
誘導体と工程Ｂで生成された試薬を反応させて、次式 （上式中、Ｘ−NH，−LINK1−，−LINK2−および は前記で定義したとおりである）で示される結合物を生
成する工程。
基のいずれかを有する酵素と、縮合反応によって前記反
応性アミノ基と反応し、かつ、次式 Ｒ*−LINK1−Ｓ−BLOCK （上式中、Ｒ*は前記反応性アミノ基と反応しうる基で
あり、 −LINK1−は、二価の有機部分であり、そして −BLOCKはメルカプト基を非求核性にするようにそのメ
ルカプト基と反応しうる化合から誘導されるものであっ
て、その後除去される基を表わす）で示されるブロック
されたメルカプト置換有機化合物とを反応させ、次式 Ｘ−NH−LINK1−Ｓ−BLOCK （上式中、Ｘ−NH−は水素原子が反応性アミノ基から除
去された前記酵素である）で示される中間体Ａを生成す
る工程、 Ｂ．中間体Ａから−BLOCKを除去して、次式 Ｘ−NH−LINK1−SH で示される試薬を生成する工程、 Ｃ．次式 （上式中、−LINK2−は、１個以上のオキシ、チオ、イ
ミノ、カルボニルイミノ、イミノカルボニル、イミノカ
ルボニルオキシ、ホスフェートまたはウレイレン基で中
断または停止されていてもよい炭化水素鎖を表わし、そ
して は、水酸基が末端ホスフェートの３′または５′末端で
それから除去されたオリゴヌクレオチド鎖を表わす）で
示される活性化オリゴヌクレオチド誘導体を供給する工
程、ならびに Ｄ．工程Ｃで供給された前記活性化オリゴヌクレオチド
誘導体と工程Ｂで生成された試薬を反応させて、次式 （上式中、Ｘ−NH，−LINK1−，−LINK2−および は前記で定義したとおりである）で示される結合物を生
成する工程。
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明書において使用する場合、「誘導化メルカプト」
の語は、ブロックされた（すなわち、保護された）メル
カプト基を称する。このメルカプト基は、本明細書で開
示されるような有機スペーサー鎖によって得られる試薬
の酵素部分から一定の間隔を保たれる。
の語は、ブロックされた（すなわち、保護された）メル
カプト基を称する。このメルカプト基は、本明細書で開
示されるような有機スペーサー鎖によって得られる試薬
の酵素部分から一定の間隔を保たれる。
「ブロックされた」メルカプト基とは、「ブロッキン
グ」基が存在する限り化学反応から保護されるものを称
する。このような「ブロッキング」基はその後除去また
は開裂されてメルカプト基の反応を可能にする。
グ」基が存在する限り化学反応から保護されるものを称
する。このような「ブロッキング」基はその後除去また
は開裂されてメルカプト基の反応を可能にする。
この発明によって提供される共有結合物は、次の一般式
で示される。
で示される。
上式中、Ｘ−NH−は、反応性アミノ基または反応性アミ
ノ基に転化しうる基のいずれかであって、その反応性ア
ミノ基から水素原子が除去された酵素を表わす。「反応
性アミノ基」とは、利用可能で適当な試薬（後述）と容
易に反応するアミノ基を意味する。
ノ基に転化しうる基のいずれかであって、その反応性ア
ミノ基から水素原子が除去された酵素を表わす。「反応
性アミノ基」とは、利用可能で適当な試薬（後述）と容
易に反応するアミノ基を意味する。
もともと反応性アミノ基を有するる酵素がこの発明の実
施に際して利用することができ、限定されるものでない
が、これらの酵素としてはペルオキシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼおよびウレアーゼが挙げられる。最初の４種
の酵素が好ましく、そのうちペルオキシダーゼが最とも
好ましいものである。
施に際して利用することができ、限定されるものでない
が、これらの酵素としてはペルオキシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼおよびウレアーゼが挙げられる。最初の４種
の酵素が好ましく、そのうちペルオキシダーゼが最とも
好ましいものである。
また別に、酵素は何等かの方法で化学的に変性して反応
性アミノ基を供給してもよい。しかしながら、この方法
は、酵素が適切な検出可能性を維持しそしてその活性を
持続しうるためには、その酵素部分が適当な基質との反
応性を持続するような方法で行われねばならない。
性アミノ基を供給してもよい。しかしながら、この方法
は、酵素が適切な検出可能性を維持しそしてその活性を
持続しうるためには、その酵素部分が適当な基質との反
応性を持続するような方法で行われねばならない。
酸素は、その反応性アミノ基と反応しうるメルカプト置
換有機化合物から誘導された二価の有機部分を表わす−
LINK1−Ｓ−を介して結合物中のマレイミド部分（すな
わち、 ）に連結される。従って、メルカプト置換有機化合物
は、活性化カルボキシル基、酸無水物基活性化エステル
基または酸ハロゲン化基１個以上を有する。−LINK1−
部分は、１個以上のカルボニル、オキシまたは後に−LI
NK2−を定義するために使用するような他の非炭化水素
部分によって中断されていてもよい鎖中に二価の脂肪族
基（直鎖または飽和炭素環）、芳香族基（例、フェニレ
ン）または複素環式基を有するいずれか適当な二価の有
機部分を表わす。一般に、−LINK1−は28〜2000の範囲
内にある分子量を有する。好ましくは、−LINK1−は、
メルカプト置換酸無水物、例えばＳ−メルカプト無水コ
ハク酸から誘導される。
換有機化合物から誘導された二価の有機部分を表わす−
LINK1−Ｓ−を介して結合物中のマレイミド部分（すな
わち、 ）に連結される。従って、メルカプト置換有機化合物
は、活性化カルボキシル基、酸無水物基活性化エステル
基または酸ハロゲン化基１個以上を有する。−LINK1−
部分は、１個以上のカルボニル、オキシまたは後に−LI
NK2−を定義するために使用するような他の非炭化水素
部分によって中断されていてもよい鎖中に二価の脂肪族
基（直鎖または飽和炭素環）、芳香族基（例、フェニレ
ン）または複素環式基を有するいずれか適当な二価の有
機部分を表わす。一般に、−LINK1−は28〜2000の範囲
内にある分子量を有する。好ましくは、−LINK1−は、
メルカプト置換酸無水物、例えばＳ−メルカプト無水コ
ハク酸から誘導される。
さらに本発明の結合物を特定すると、−LINK2−は、オ
キシ、チオ、イミノ、カルボニルイミノ（−CONH−）、
イミノカルボニル（−NHCO−）、イミノカルボニルオキ
シ（−NHCOO−）、ホスフェートまたはウレイレン（−N
HCONH−）基１個以上によって中断または停止されてい
てもよい二価の炭化水素鎖を表わす。一般に、この炭化
水素鎖は、28〜2000の分子量を有し、そして１個以上の
低級アルキル（炭素原子１〜３個、直鎖もしくは分枝
鎖）または低級ヒドロキシアルキル（炭素原子１〜３
個、直鎖もしくは分枝鎖）で置換されていてもよい。好
ましくは、この炭化水素鎖は、少なくとも１個のオキシ
レン基によって中断されている。より好ましくは、それ
がオリゴヌクレオチド末端上でのアルキレンオキシ基に
より停止されており、その逆の末端上でアルキレン基
（例、メチレンまたはエチレン）によって停止されてい
る。
キシ、チオ、イミノ、カルボニルイミノ（−CONH−）、
イミノカルボニル（−NHCO−）、イミノカルボニルオキ
シ（−NHCOO−）、ホスフェートまたはウレイレン（−N
HCONH−）基１個以上によって中断または停止されてい
てもよい二価の炭化水素鎖を表わす。一般に、この炭化
水素鎖は、28〜2000の分子量を有し、そして１個以上の
低級アルキル（炭素原子１〜３個、直鎖もしくは分枝
鎖）または低級ヒドロキシアルキル（炭素原子１〜３
個、直鎖もしくは分枝鎖）で置換されていてもよい。好
ましくは、この炭化水素鎖は、少なくとも１個のオキシ
レン基によって中断されている。より好ましくは、それ
がオリゴヌクレオチド末端上でのアルキレンオキシ基に
より停止されており、その逆の末端上でアルキレン基
（例、メチレンまたはエチレン）によって停止されてい
る。
前記結合物の構造中、 は、水酸基が末端ホスフェートの３′または５′末端で
それから除去されたオリゴヌクレオチド鎖を表わす。好
ましくは、水酸基が５′末端で除去されたものである。
従って、分析、治療または配列決定の目的でプローブ、
プライマーまたは他の酵素標識された分子として使用す
るためにいずれかのオリゴヌクレオチドを結合すること
ができる。
それから除去されたオリゴヌクレオチド鎖を表わす。好
ましくは、水酸基が５′末端で除去されたものである。
従って、分析、治療または配列決定の目的でプローブ、
プライマーまたは他の酵素標識された分子として使用す
るためにいずれかのオリゴヌクレオチドを結合すること
ができる。
この発明の共有結合物は、次の構造を有することができ
る。
る。
上式中、Ｘ−NH−は前記で定義したような酵素を表わ
し、 Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3およびＲ4は独立して水素、炭素原子１〜
３個のアルキル（例、メチル、エチル、ｎ−プロピルも
しくはｉ−プロピル）または炭素原子１〜３個のヒドロ
キシアルキル、（例、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキ
シエチルおよび当業者に自明の他の基）であり、ｍは２
〜12の正の整数であり、ｎは１〜50の正の整数であり、
そして は、前記で定義したように水酸基が除去されたオリゴヌ
クレオチド鎖を表わす。
し、 Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3およびＲ4は独立して水素、炭素原子１〜
３個のアルキル（例、メチル、エチル、ｎ−プロピルも
しくはｉ−プロピル）または炭素原子１〜３個のヒドロ
キシアルキル、（例、ヒドロキシメチル、２−ヒドロキ
シエチルおよび当業者に自明の他の基）であり、ｍは２
〜12の正の整数であり、ｎは１〜50の正の整数であり、
そして は、前記で定義したように水酸基が除去されたオリゴヌ
クレオチド鎖を表わす。
より好ましくは、前記構造のＲ1，Ｒ2，Ｒ3およびＲ
4は、独立して水素、メチルまたはヒドロキシメチルで
あり、ｍは２であり、そしてｎは１〜15である。
4は、独立して水素、メチルまたはヒドロキシメチルで
あり、ｍは２であり、そしてｎは１〜15である。
ある結合物では、酵素がペルオキシダーゼであり、オリ
ゴヌクレオチドが配列 ５′−GAGTGATGAGGAAGAGGAGGGTG−３′ を有し、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3およびＲ4がそれぞれ水素であ
り、ｍが２であり、そしてｎが１〜15である。有用な結
合物は次の構造を有する。
ゴヌクレオチドが配列 ５′−GAGTGATGAGGAAGAGGAGGGTG−３′ を有し、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3およびＲ4がそれぞれ水素であ
り、ｍが２であり、そしてｎが１〜15である。有用な結
合物は次の構造を有する。
上式中、Ｘ−NH−がペルオキシダーゼに由来し、そして
Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，ｍ，ｎおよび が直前に定義したようなものである。
Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，ｍ，ｎおよび が直前に定義したようなものである。
この発明の結合物は、所定の安定性を有する各種中間体
を経て誘導体化酵素およびオリゴヌクレオチドと連結部
分との反応を伴う一連の工程を使用して製造され、かつ
好収率で実施されるが好ましくない副生成物は与えな
い。
を経て誘導体化酵素およびオリゴヌクレオチドと連結部
分との反応を伴う一連の工程を使用して製造され、かつ
好収率で実施されるが好ましくない副生成物は与えな
い。
この発明の第一の工程では、反応性アミノ基（前記で定
義したような）を有する酵素がブロックされた（保護さ
れた）メルカプト置換有機化合物と反応される。他方、
酵素が必要な反応性アミノ基を持たない場合には、反応
性アミノ基に転化することができる基をそれが有するこ
とができる。メルカプト基は、この工程中で早く反応し
すぎないようにブロックされる。この有機化合物は次の
構造を有する。
義したような）を有する酵素がブロックされた（保護さ
れた）メルカプト置換有機化合物と反応される。他方、
酵素が必要な反応性アミノ基を持たない場合には、反応
性アミノ基に転化することができる基をそれが有するこ
とができる。メルカプト基は、この工程中で早く反応し
すぎないようにブロックされる。この有機化合物は次の
構造を有する。
Ｒ*−LINK1−Ｓ−BLOCK 上式中、Ｒ*は反応性アミノ基と反応しうる基である。
ある例では、Ｒ*が縮合によって有機化合物を放出す
る。他の例では、それが化合物を放出することなく、ア
ミノ基との反応によって活性になる部位から除去される
かも知れない（例えば、酸無水物の開環の場合）。
ある例では、Ｒ*が縮合によって有機化合物を放出す
る。他の例では、それが化合物を放出することなく、ア
ミノ基との反応によって活性になる部位から除去される
かも知れない（例えば、酸無水物の開環の場合）。
限定されるものでないが、Ｒ*の代表例としては、ハロ
ゲン（クロロ、ブロモもしくはヨード）、スルホネート
（例えば、ｐ−トルエンスルホネート、ｐ−ブロモベン
ゼンスルホネート、ｐ−ニトロベンゼンスルホネートも
しくはメタンスルホネート）、−OCOR〔式中、Ｒは脂肪
族（例えば、メチル、エチル、ｉ−プロピルもしくはペ
ンチル）、芳香族（例えば、フェニルもしくはトルイ
ル）または複素環（例えば、ピリジン）〕、カルボン
酸、アシルハライド、アミド、エステル（直鎖、分枝鎖
もしくは環状基を有する脂肪族または前記で定義したよ
うな芳香族）および酸無水物（例えば、アセチックベン
ゾイック、無水コハク酸および無水フタル酸）が挙げら
れる。好ましくは、Ｒ*は酸無水物であり、最とも好ま
しくは環中に原子６個までを有する脂肪族環状酸無水物
残基である。
ゲン（クロロ、ブロモもしくはヨード）、スルホネート
（例えば、ｐ−トルエンスルホネート、ｐ−ブロモベン
ゼンスルホネート、ｐ−ニトロベンゼンスルホネートも
しくはメタンスルホネート）、−OCOR〔式中、Ｒは脂肪
族（例えば、メチル、エチル、ｉ−プロピルもしくはペ
ンチル）、芳香族（例えば、フェニルもしくはトルイ
ル）または複素環（例えば、ピリジン）〕、カルボン
酸、アシルハライド、アミド、エステル（直鎖、分枝鎖
もしくは環状基を有する脂肪族または前記で定義したよ
うな芳香族）および酸無水物（例えば、アセチックベン
ゾイック、無水コハク酸および無水フタル酸）が挙げら
れる。好ましくは、Ｒ*は酸無水物であり、最とも好ま
しくは環中に原子６個までを有する脂肪族環状酸無水物
残基である。
前記有機化合物中の−LINK1−基は前記で定義したとお
りである。
りである。
−BLOCK基は、メルカプト基と反応することができ、そ
して−BLOCKが何等かの方法によって除去されてしまう
までメルカプト基を不活化することができる化合物から
誘導される。限定されるものでないが、代表的な−BLOC
K部分としては、式−COR′で示され、この式中Ｒ′は分
子量15〜200を有する脂肪族（直鎖、分枝鎖もしくは環
状）、芳香族または複素環式基、例えばメチル、エチ
ル、フェニルまたはピリジルが挙げられる。他の有用な
−BLOCK基は、チオピリジル、２−カルボキシ−４−ニ
トロフェニルチオ、トリフェニルメチルまたはベンゾイ
ルである。好ましくは、−BLOCKは、−COR′（Ｒ′がメ
チルまたはフェニル）で示される基である。
して−BLOCKが何等かの方法によって除去されてしまう
までメルカプト基を不活化することができる化合物から
誘導される。限定されるものでないが、代表的な−BLOC
K部分としては、式−COR′で示され、この式中Ｒ′は分
子量15〜200を有する脂肪族（直鎖、分枝鎖もしくは環
状）、芳香族または複素環式基、例えばメチル、エチ
ル、フェニルまたはピリジルが挙げられる。他の有用な
−BLOCK基は、チオピリジル、２−カルボキシ−４−ニ
トロフェニルチオ、トリフェニルメチルまたはベンゾイ
ルである。好ましくは、−BLOCKは、−COR′（Ｒ′がメ
チルまたはフェニル）で示される基である。
前記有機化合物と本明細書で定義されるような酵素の反
応は、一般に、次式 Ｘ−NH−LINK1−Ｓ−BLOCK （上式中、Ｘ−NH−は水素原子が除去された反応性アミ
ノ基を有する酵素である）で示される結果物としての中
間体を適切な収率で得るのに十分な温度と時間で大気圧
下にて実施される。一般的に温度は０〜37℃の範囲内に
あり、的するpH条件は６〜９の範囲内にある。しかしな
がら、これらの条件は使用される酵素および有機化合物
に応じて変動するであろう。例えば、pHおよび温度は活
性を維持するように酵素に対して適切であらねばならな
い。この有機化合物は水に少なくとも部分的に溶解もし
くは分散性であり、あるいは分散もしくは酵素との反応
を促進するような水混和性溶媒中に供給される。このよ
うな溶媒は、酵素の反応性を害しない量で使用されねば
ならない。
応は、一般に、次式 Ｘ−NH−LINK1−Ｓ−BLOCK （上式中、Ｘ−NH−は水素原子が除去された反応性アミ
ノ基を有する酵素である）で示される結果物としての中
間体を適切な収率で得るのに十分な温度と時間で大気圧
下にて実施される。一般的に温度は０〜37℃の範囲内に
あり、的するpH条件は６〜９の範囲内にある。しかしな
がら、これらの条件は使用される酵素および有機化合物
に応じて変動するであろう。例えば、pHおよび温度は活
性を維持するように酵素に対して適切であらねばならな
い。この有機化合物は水に少なくとも部分的に溶解もし
くは分散性であり、あるいは分散もしくは酵素との反応
を促進するような水混和性溶媒中に供給される。このよ
うな溶媒は、酵素の反応性を害しない量で使用されねば
ならない。
しかしながら、得られた中間体はチオ基にブロッキング
基が結合しているので、そのままでは利用できない。次
いで、それを除去して次式 Ｘ−NH−LINK1−SH （上式中、Ｘ−NH−および−LINK1−は前記で定義した
とおりである）で示される反応性試薬を生成する。ブロ
ッキング基の除去は、一般に、ヒドロキシルアミンとエ
チレンジアミン四酢酸含有リン酸緩衝液(pH7.4)で好ま
しい化合物を処理することによって行われる。特定のブ
ロッキング基を除去する他の条件は、当業者にとって自
明であろう。
基が結合しているので、そのままでは利用できない。次
いで、それを除去して次式 Ｘ−NH−LINK1−SH （上式中、Ｘ−NH−および−LINK1−は前記で定義した
とおりである）で示される反応性試薬を生成する。ブロ
ッキング基の除去は、一般に、ヒドロキシルアミンとエ
チレンジアミン四酢酸含有リン酸緩衝液(pH7.4)で好ま
しい化合物を処理することによって行われる。特定のブ
ロッキング基を除去する他の条件は、当業者にとって自
明であろう。
次に、活性化オリゴヌクレオチド誘導体が反応に供され
る。この誘導体は次式 （上式中、−LINK2−および は前記で定義したとおりである）で示される。
る。この誘導体は次式 （上式中、−LINK2−および は前記で定義したとおりである）で示される。
この反応性オリゴヌクレオチド誘導体は、一般に次のよ
うに供給することができる。適当なアミノエチレングリ
コール試薬（所定の鎖長を有する）を、200℃溶媒不存
在下で無水フタル酸と反応させる。次に、得られた生成
物を、20〜25℃にて塩化メチレン中でホスフィン試薬と
反応させる。次に、自動化シンセサイザーと標準的な手
段を使用してコントロールド・ポアー・ガラス(control
led pore glass)に結合された適当なオリゴヌクレオチ
ドと前記生成物を反応させ、遊離アミノ基を有する誘導
体化されたオリゴヌクレオチドを生成する。この誘導体
化されたオリゴヌクレオチドをスルホスクシンイミジル
−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−
カルボキシレートと反応させて前記式で示した活性化オ
リゴヌクレオチド誘導体を生成する。
うに供給することができる。適当なアミノエチレングリ
コール試薬（所定の鎖長を有する）を、200℃溶媒不存
在下で無水フタル酸と反応させる。次に、得られた生成
物を、20〜25℃にて塩化メチレン中でホスフィン試薬と
反応させる。次に、自動化シンセサイザーと標準的な手
段を使用してコントロールド・ポアー・ガラス(control
led pore glass)に結合された適当なオリゴヌクレオチ
ドと前記生成物を反応させ、遊離アミノ基を有する誘導
体化されたオリゴヌクレオチドを生成する。この誘導体
化されたオリゴヌクレオチドをスルホスクシンイミジル
−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−
カルボキシレートと反応させて前記式で示した活性化オ
リゴヌクレオチド誘導体を生成する。
最後に、前記活性化オリゴヌクレオチド誘導体をブロッ
クされていない酵素試薬と反応させて目的の結合物を生
成する。この反応の反応条件は、リン酸緩衝溶液(pH7.
4)中４℃で15時間が一般的であるが、これらの条件は種
々の試薬について変動してもよい。
クされていない酵素試薬と反応させて目的の結合物を生
成する。この反応の反応条件は、リン酸緩衝溶液(pH7.
4)中４℃で15時間が一般的であるが、これらの条件は種
々の試薬について変動してもよい。
ある実施態様では、オリゴヌクレオチドと酵素との共有
結合物の製造方法は次の工程を含んでなる。
結合物の製造方法は次の工程を含んでなる。
Ａ．反応性アミノ基、有する酵素をＳ−アセチルメルカ
プト無水コハク酸と反応させて、次式 〔上式中、Ｘ−NH−は、水素原子が除去された反応アミ
ノ基を有する酵素を表わし、そして Ｒ1は水素、炭素原子１〜３個のアルキルまたは炭素原
子１〜３個のヒドロキシアルキルを表わす（これらの基
は前記で定義したとおりである）〕 で示される中間体を生成する工程、 Ｂ．工程Ａで生成された中間体をヒドロキシルアミンと
反応させて、次式 （上式中、Ｘ−NH−およびＲ1は前記で定義したとおり
である）で示される反応性メルカプト置換中間体を生成
する工程、 Ｃ．次式 （上式中、 は、水酸基が末端ホスフェートからその５′末端で除去
されたオリゴヌクレオチド鎖を表わし、Ｒ2，Ｒ3および
Ｒ4は、独立して水素、炭素原子１〜３個のアルキルま
たは炭素原子１〜３個のヒドロキシアルキルであり、ｍ
は２〜12の正の整数であり、そしてｎは１〜50の正の整
数である）で示される機能化オリゴヌクレオチド反応体
を供給する工程、 Ｄ．工程Ｃで供給された前記反応体とスルホスクシンイ
ミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレートを反応させて活性化オリゴヌク
レオチド誘導体を生成する工程、ならびに Ｅ．工程Ｄで生成された前記活性化オリゴヌクレオチド
誘導体と工程Ｂで生成された中間体を反応させて、次式 （上式中、Ｘ−NH−，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，ｍ，ｎおよ
び は前記で定義したとおりである） で示される結合物を生成する工程。
プト無水コハク酸と反応させて、次式 〔上式中、Ｘ−NH−は、水素原子が除去された反応アミ
ノ基を有する酵素を表わし、そして Ｒ1は水素、炭素原子１〜３個のアルキルまたは炭素原
子１〜３個のヒドロキシアルキルを表わす（これらの基
は前記で定義したとおりである）〕 で示される中間体を生成する工程、 Ｂ．工程Ａで生成された中間体をヒドロキシルアミンと
反応させて、次式 （上式中、Ｘ−NH−およびＲ1は前記で定義したとおり
である）で示される反応性メルカプト置換中間体を生成
する工程、 Ｃ．次式 （上式中、 は、水酸基が末端ホスフェートからその５′末端で除去
されたオリゴヌクレオチド鎖を表わし、Ｒ2，Ｒ3および
Ｒ4は、独立して水素、炭素原子１〜３個のアルキルま
たは炭素原子１〜３個のヒドロキシアルキルであり、ｍ
は２〜12の正の整数であり、そしてｎは１〜50の正の整
数である）で示される機能化オリゴヌクレオチド反応体
を供給する工程、 Ｄ．工程Ｃで供給された前記反応体とスルホスクシンイ
ミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレートを反応させて活性化オリゴヌク
レオチド誘導体を生成する工程、ならびに Ｅ．工程Ｄで生成された前記活性化オリゴヌクレオチド
誘導体と工程Ｂで生成された中間体を反応させて、次式 （上式中、Ｘ−NH−，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，ｍ，ｎおよ
び は前記で定義したとおりである） で示される結合物を生成する工程。
この態様では、最とも好ましくは、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3およ
びＲ4が水素であり、ｍが２であり、ｎが１〜15であ
り、Ｘ−NH−がペルオキシダーゼから誘導される。
びＲ4が水素であり、ｍが２であり、ｎが１〜15であ
り、Ｘ−NH−がペルオキシダーゼから誘導される。
例１：ペルオキシダーゼとオリゴヌクレオチド結合物の 製造 一本鎖オリゴヌクレオチドに共有結合した西洋ワサビペ
ルオキシダーゼを有する結合物は、本例によって製造さ
れた。
ルオキシダーゼを有する結合物は、本例によって製造さ
れた。
材 料 本例で使用したオリゴヌクレオチドは、Ａ，Ｔ，Ｇおよ
びＣが４種の標準的なデオキシリボヌクレオシド三リン
酸組成を表わす場合に下記 ５′−GAGTGATGAGGAAGAGGAGGGTG−３′ 示す配列を有していて、その５′水酸基を介して−LINK
2−に結合した。
びＣが４種の標準的なデオキシリボヌクレオシド三リン
酸組成を表わす場合に下記 ５′−GAGTGATGAGGAAGAGGAGGGTG−３′ 示す配列を有していて、その５′水酸基を介して−LINK
2−に結合した。
各種の材料および装置は次のように入手した。ビオサー
チ8700 DNAシンセサイザー(Biosearch 8700 DNA Synthe
sizer)はMilligen／Biosearchから、コントロールド・
ポアー・ガラス(controlled pore glass)支持体はBiose
archから、スペクトロポア(Spectro Por−商標−）２透
析バッグはSpectrum Medical Ind.(Los Angeles, Calif
ornia)から、攪拌セルコンセントレーターはAmicon (Da
nvers, Massachusetts)から、PD−10およびNAP−10カラ
ムはPharmacia(Uppsala, Sweden)から、そしてDEAE−ア
ガロースカラムはWatersから入手した。
チ8700 DNAシンセサイザー(Biosearch 8700 DNA Synthe
sizer)はMilligen／Biosearchから、コントロールド・
ポアー・ガラス(controlled pore glass)支持体はBiose
archから、スペクトロポア(Spectro Por−商標−）２透
析バッグはSpectrum Medical Ind.(Los Angeles, Calif
ornia)から、攪拌セルコンセントレーターはAmicon (Da
nvers, Massachusetts)から、PD−10およびNAP−10カラ
ムはPharmacia(Uppsala, Sweden)から、そしてDEAE−ア
ガロースカラムはWatersから入手した。
調 製 第１部：メルカプト置換酵素試薬の調整 ４℃で炭酸ナトリウム溶液（13.4ml、０．１モル濃度、
pH9.5）で西洋ワサビペルオキシダーゼ（100mg、乾燥重
量）を溶解し、次いで乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド中Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸溶液（17.4mg
／mlの300μ）と４℃以下で１時間反応させた。脱イ
オン蒸留水で10分間予め湿潤したスペクトロポア２透析
バツグ中にこの混合物をピペットで移した。次に、反応
混合物容量の50倍を使用するリン酸緩衝溶液(pH7.4)中
にバッグを入れ、そして約４時間４℃でゆっくり攪拌し
た。アミコンコンセントレーター(Amicon concentrato
r)を使用して前記溶液を目的中間体20〜30mg／mlになる
まで濃縮した。
pH9.5）で西洋ワサビペルオキシダーゼ（100mg、乾燥重
量）を溶解し、次いで乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド中Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸溶液（17.4mg
／mlの300μ）と４℃以下で１時間反応させた。脱イ
オン蒸留水で10分間予め湿潤したスペクトロポア２透析
バツグ中にこの混合物をピペットで移した。次に、反応
混合物容量の50倍を使用するリン酸緩衝溶液(pH7.4)中
にバッグを入れ、そして約４時間４℃でゆっくり攪拌し
た。アミコンコンセントレーター(Amicon concentrato
r)を使用して前記溶液を目的中間体20〜30mg／mlになる
まで濃縮した。
この中間体(pH7.4のリン酸緩衝溶液１ml中41.85mg含有
溶液1.34ml)を、リン酸緩衝液（0.1モル濃度、pH7.4）
中ヒドロキシルアミン（1.2ml、0.25モル濃度）および
エチレンジアミン四酢酸（0.001モル濃度）含有溶液と2
0〜25℃で２時間反応させた。得られた生成物を、PD−1
0カラムと溶離液としてリン酸緩衝溶液(pH7.4)を使用す
るクロマトグラフィーによって精製した。次に生成物
（約54mg）は、下記第３部でそのまま使用した。
溶液1.34ml)を、リン酸緩衝液（0.1モル濃度、pH7.4）
中ヒドロキシルアミン（1.2ml、0.25モル濃度）および
エチレンジアミン四酢酸（0.001モル濃度）含有溶液と2
0〜25℃で２時間反応させた。得られた生成物を、PD−1
0カラムと溶離液としてリン酸緩衝溶液(pH7.4)を使用す
るクロマトグラフィーによって精製した。次に生成物
（約54mg）は、下記第３部でそのまま使用した。
第２部：活性化オリゴヌクレオチド誘導体の調製 アミノトリエチレングリコール(100g)と無水フタル酸(1
00g)を一緒に混合し、窒素下で攪拌しながら手際よく20
5℃まで加熱し、次いで室温まで冷却した。結果物であ
る生成物は油状物として得られるが徐々に固形化した。
この物質を酢酸エチル(250ml)から再結晶して白色結晶
生成物118ｇを得た。構造はＮＭＲスペクトルで確認し
た。
00g)を一緒に混合し、窒素下で攪拌しながら手際よく20
5℃まで加熱し、次いで室温まで冷却した。結果物であ
る生成物は油状物として得られるが徐々に固形化した。
この物質を酢酸エチル(250ml)から再結晶して白色結晶
生成物118ｇを得た。構造はＮＭＲスペクトルで確認し
た。
この生成物（５ｇ）を塩化メチレン(50mlに溶解し、
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３当量、9.3m
l）、次いでクロロ−２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジ
イソプロピルアミノホスフィン（1.1当量、4.65ｇ）を
加え、混合物を20〜25℃で30分間攪拌した。反応混合物
を酢酸エチル（50ml、２度）で抽出し、水(50ml)で２度
洗浄し、次いでロータリーエバポレーターを使用して濃
縮して油状物（8.1ｇ）を得た。この物質はＮＭＲおよ
びマススペクトル分析によると95％の純度であった。そ
れは、次の工程でそのまま使用した。この生成物（アセ
トニトリル70ml中４ｇ溶液500μ）を、自動シンセサ
イザー、コントロールド・ポアー・ガラスおよび前述と
同様な手段を使用してアセトニトリル中前述のオリゴヌ
クレオチド（１マイクロモル濃度）と反応させた。水酸
化アンモニウムによる加水分解からなる最終工程でコン
トロールド・ポアー・ガラスからオリゴヌクレオチドを
採取し、アミンを脱ブロック化してアミノ誘導体化オリ
ゴヌクレオチド試薬を生成した。
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３当量、9.3m
l）、次いでクロロ−２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジ
イソプロピルアミノホスフィン（1.1当量、4.65ｇ）を
加え、混合物を20〜25℃で30分間攪拌した。反応混合物
を酢酸エチル（50ml、２度）で抽出し、水(50ml)で２度
洗浄し、次いでロータリーエバポレーターを使用して濃
縮して油状物（8.1ｇ）を得た。この物質はＮＭＲおよ
びマススペクトル分析によると95％の純度であった。そ
れは、次の工程でそのまま使用した。この生成物（アセ
トニトリル70ml中４ｇ溶液500μ）を、自動シンセサ
イザー、コントロールド・ポアー・ガラスおよび前述と
同様な手段を使用してアセトニトリル中前述のオリゴヌ
クレオチド（１マイクロモル濃度）と反応させた。水酸
化アンモニウムによる加水分解からなる最終工程でコン
トロールド・ポアー・ガラスからオリゴヌクレオチドを
採取し、アミンを脱ブロック化してアミノ誘導体化オリ
ゴヌクレオチド試薬を生成した。
この試薬(260nmにてOD 55)を脱イオン蒸留水500μに
溶解し、４℃まで冷却した。炭酸ナトリウム溶液（１モ
ル濃度溶液50μ、pH８）を加えて反応混合物を緩衝化
した。スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド
メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド100μ中11.25mg）と水(100
μ）を加え、反応混合物を４℃で１時間回転させた。
得られた生成物を、NAP−10カラムと溶離液としてリン
酸緩衝溶液(pH7.4)を使用して精製した。
溶解し、４℃まで冷却した。炭酸ナトリウム溶液（１モ
ル濃度溶液50μ、pH８）を加えて反応混合物を緩衝化
した。スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド
メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド100μ中11.25mg）と水(100
μ）を加え、反応混合物を４℃で１時間回転させた。
得られた生成物を、NAP−10カラムと溶離液としてリン
酸緩衝溶液(pH7.4)を使用して精製した。
約50 ODの生成物が得られた。
第３部：誘導体化オリゴヌクレオチドと酵素試薬の反応 前述のように調製したメルカプト置換酵素試薬（緩衝溶
液3.5ml中約54mg）に前述の活性化オリゴヌクレオチド
誘導体〔リン酸緩衝溶液（pH7.4）1.5ml中約50 OD〕を
加えた。アミコンコンセントレーターを使用して総量約
0.5mlまで減少させた。この反応混合物を４℃で15時間
回転させた後、トリフ（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン緩衝液(0.02モル濃度、pH８）で５mlまで希釈し、そ
して溶離液として、最初にトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン緩衝液（pH８）、次に塩化ナトリウム（１
モル濃度）を含有するその緩衝液（0.02モル濃度）を使
用するDEAE−アガロースカラムによりクロマト処理し
た。吸収の比（Ａ260／Ａ403)が約3.2を有する画分を合
わせ、本発明の目的とするペルオキシダーゼとオリゴヌ
クレオチド共有結合物について1.5 OD／mlの濃度でリン
酸緩衝溶液（pH7.5）中に保存した。
液3.5ml中約54mg）に前述の活性化オリゴヌクレオチド
誘導体〔リン酸緩衝溶液（pH7.4）1.5ml中約50 OD〕を
加えた。アミコンコンセントレーターを使用して総量約
0.5mlまで減少させた。この反応混合物を４℃で15時間
回転させた後、トリフ（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン緩衝液(0.02モル濃度、pH８）で５mlまで希釈し、そ
して溶離液として、最初にトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン緩衝液（pH８）、次に塩化ナトリウム（１
モル濃度）を含有するその緩衝液（0.02モル濃度）を使
用するDEAE−アガロースカラムによりクロマト処理し
た。吸収の比（Ａ260／Ａ403)が約3.2を有する画分を合
わせ、本発明の目的とするペルオキシダーゼとオリゴヌ
クレオチド共有結合物について1.5 OD／mlの濃度でリン
酸緩衝溶液（pH7.5）中に保存した。
例２〜６：各種結合物の調製 これらの例は、例１と同様に実施して種々のオリゴヌク
レオチドを有する種々の結合物を調製した。これらのオ
リゴヌクレオチドは、それらの配列によると次のごとく
列挙される。
レオチドを有する種々の結合物を調製した。これらのオ
リゴヌクレオチドは、それらの配列によると次のごとく
列挙される。
例２： ５′−UTTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC−３′ 例３： ５′−TAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAAGGAGAAGCC−
３′ 例４： ５′−ACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT−３′ 例５： ５′−GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT−３′ 例６： ５′−ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGT−３′ 〔発明の効果〕 この発明は、ＤＮＡもしくはＲＮＡアッセイまたは増幅
工程で使用するための酵素標識オリゴヌクレオチド結合
物を調製する単純で迅速な手段を提供する。この発明の
方法を使用して高収率のオリゴヌクレオチドと酵素の結
合物が得られる。また、この方法で最とも重要な試薬と
解される活性化オリゴヌクレオチド誘導体が保存され
る。このものは、その調製に時間がかかりそして経費が
かかるので有意である。酸化による好ましくない副反応
生成物もまた減少する。反応性アミノ基を有する酵素
は、単純で安価な手段でチオール誘導体に転化すること
ができる。試薬が副反応によって損失する場合には意味
をもたなくなるのでこの試薬は過剰に使用することがで
きる。
３′ 例４： ５′−ACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT−３′ 例５： ５′−GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT−３′ 例６： ５′−ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGT−３′ 〔発明の効果〕 この発明は、ＤＮＡもしくはＲＮＡアッセイまたは増幅
工程で使用するための酵素標識オリゴヌクレオチド結合
物を調製する単純で迅速な手段を提供する。この発明の
方法を使用して高収率のオリゴヌクレオチドと酵素の結
合物が得られる。また、この方法で最とも重要な試薬と
解される活性化オリゴヌクレオチド誘導体が保存され
る。このものは、その調製に時間がかかりそして経費が
かかるので有意である。酸化による好ましくない副反応
生成物もまた減少する。反応性アミノ基を有する酵素
は、単純で安価な手段でチオール誘導体に転化すること
ができる。試薬が副反応によって損失する場合には意味
をもたなくなるのでこの試薬は過剰に使用することがで
きる。
これらの利点は、国際公開第89／02932号公報の教示に
従うチオール置換オリゴヌクレオチドの使用を避けるこ
とによって達成される。
従うチオール置換オリゴヌクレオチドの使用を避けるこ
とによって達成される。
逆に反応性チオール基は誘導体化酵素に付加され、次い
で活性化オリゴヌクレオチド誘導体と反応される。
で活性化オリゴヌクレオチド誘導体と反応される。
Claims (4)
- 【請求項１】次式 （上式中、Ｘ−NH−は、反応性アミノ基または反応性ア
ミノ基に転化しうる基のいずれかであって、その反応性
アミノ基から水素原子が除去された酵素を表わし、 −LINK1−は、二価の有機部分を表わし、 −LINK2−は、１個以上のオキシ、チオ、イミノ、カル
ボニルイミノ、イミノカルボニル、イミノカルボニルオ
キシ、ホスフェートまたはウレイレン基で中断または停
止されていてもよい二価の炭化水素鎖を表わし、そして は、水酸基が、末端ホスフェートの３′または５′末端
でそれから除去されたオリゴヌクレオチド鎖を表わす）
で示される酵素とオリゴヌクレオチドの共有結合物。 - 【請求項２】次式 （上式中、Ｘ−NH−は、水素原子が除去された反応性ア
ミノ基を有する酵素を表わし、 Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3およびＲ4は、独立して水素、炭素数１〜
３個のアルキルまたは炭素数１〜３個のヒドロキシアル
キルを表わし、 ｍは、２〜12の正の整数であり、 ｎは、１〜50の正の整数であり、そして は、水酸基が末端ホスフェートの３′または５′末端で
それから除去されたオリゴヌクレオチド鎖を表わす）で
示される酵素とオリゴヌクレオチドの共有結合物。 - 【請求項３】Ａ．反応性アミノ基または反応性アミノ基
に転化しうる基のいずれかを有する酵素と、縮合反応に
よって前記反応性アミノ基と反応し、かつ、次式 Ｒ*−LINK1−Ｓ−BLOCK （上式中、Ｒ*は前記反応性アミノ基と反応しうる基で
あり、 −LINK1−は二価の有機部分であり、そして −BLOCKはメルカプト基を非求核性にするようにそのメ
ルカプト基と反応しうる化合から誘導されるものであっ
て、その後除去される基を表わす）で示されるブロック
されたメルカプト置換有機化合物とを反応させ、次式 Ｘ−NH−LINK1−Ｓ−BLOCK （上式中、Ｘ−NH−は水素原子が反応性アミノ基から除
去された前記酵素である）で示される中間体Ａを生成す
る工程、 Ｂ．中間体Ａから−BLOCKを除去して、次式 Ｘ−NH−LINK1−SH で示される試薬を生成する工程、 Ｃ．次式 （上式中、−LINK2−は、１個以上のオキシ、チオ、イ
ミノ、カルボニルイミノ、イミノカルボニル、イミノカ
ルボニルオキシ、ホスフェートまたはウレイレン基で中
断または停止されていてもよい炭化水素鎖を表わし、そ
して は、水酸基が末端ホスフェートの３′または５′末端で
それから除去されたオリゴヌクレオチド鎖を表わす）で
示される活性化オリゴヌクレオチド誘導体を供給する工
程、ならびに Ｄ．工程Ｃで供給された前記活性化オリゴヌクレオチド
誘導体と工程Ｂで生成された試薬を反応させて、次式 （上式中、Ｘ−NH，−LINK1−，−LINK2−およ は前記で定義したとおりである）で示される結合物を生
成する工程、を含んでなるオリゴヌクレオチドと酵素の
共有結合物の製造方法。 - 【請求項４】Ａ．反応性アミノ基を有する酵素をＳ−ア
セチルメルカプト無水コハク酸と反応させて、次式 （上式中、Ｘ−NH−は、水素原子が除去された反応性ア
ミノ基を有する前記酵素を表わし、そして Ｒ1は水素、炭素原子１〜３個のアルキルまたは炭素原
子１〜３個のヒドロキシアルキルを表わす）で示される
中間体を生成する工程、 Ｂ．工程Ａで生成された中間体をヒドロキシルアミンと
反応させて、次式 （上式中、Ｘ−NH−およびＲ1は前記定義のとおりであ
る）で示される反応性メルカプト置換中間体を生成する
工程、 Ｃ．次式 （上式中、 は、水酸基が末端ホスフェートからその５′末端で除去
されたオリゴヌクレオチド鎖を表わし、Ｒ2，Ｒ3および
Ｒ4は、独立して水素、炭素原子１〜３個のアルキルま
たは炭素原子１〜３個のヒドロキシアルキルであり、ｍ
は２〜12の正の整数であり、そしてｎは１〜50の正の整
数である）で示される機能化オリゴヌクレオチド反応体
を供給する工程、 Ｄ．工程Ｃで供給された前記反応体とスルホスクシンイ
ミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボキシレートを反応させて活性化オリゴヌク
レオチド誘導体を生成する工程、ならびに Ｅ．工程Ｄで生成された前記活性化オリゴヌクレオチド
誘導体と工程Ｂで生成された中間体を反応させて、次式 （上式中、Ｘ−NH−，Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，ｍ，ｎおよ
び は前記で定義したとおりである）で示される結合物を生
成する工程、を含んでなるオリゴヌクレオチドと酵素の
共有結合物の製造方法。
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