JPH09507742A

JPH09507742A - Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａから得られるグルコアミラーゼプロモーターおよび異種ポリペプチドの生産におけるその使用

Info

Publication number: JPH09507742A
Application number: JP7506829A
Authority: JP
Inventors: アレンラッドフォード，; ジョンハワードパリッシュ，
Original assignee: University of Leeds
Current assignee: University of Leeds
Priority date: 1993-08-13
Filing date: 1994-08-15
Publication date: 1997-08-12
Also published as: CA2169377A1; WO1995005474A2; GB9316883D0; AU7388994A; WO1995005474A3; CA2169377C; EP0714445A1; US5834191A; AU687852B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、糸状菌類における異種ペプチドの生産を加工するための方法および組換え手段に関する。本発明は、グルコアミラーゼ遺伝子中に制限部位を提供するためのグルコアミラーゼ遺伝子の遺伝的操作を含み、その結果上記遺伝子のプロモーター配列を異種ペプチドに結合し得、それによって上記ペプチドの生産が、グルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター配列の制御下にある。

Description

【発明の詳細な説明】 Neurospora crassaから得られるグルコアミラーゼプロモーターおよび異種ポリペプチドの生産におけるその使用本発明は、より特定すれば、しかし限定されないが、異種ペプチド生産のための発現カセットおよび発現/分泌カセットの方法および組換え手段に関する。本発明の方法および手段は、糸状菌類そしてより特定すればアカパンカビ(Neurosp ora crassa)のバイオテクノロジー的利用由来のペプチドなどの生産において特定の用途を有する。糸状菌類は、十分量のタンパク質、特に加水分解酵素を分泌する。これら酵素の多くは、抗生物質および有機酸の生産、デンプンの糖化、グルコース異性体化、ワインおよびフルーツジュースの処理、およびセルロースおよびリグニンの分解のような工業的プロセスにおいて用いられている(Bennett 1985；Bu'LockおよびKristiansen 1987)。そのような酵素の遺伝子のプロモーターおよびシグナル配列は、異種遺伝子発現のための宿主として糸状菌類を開発するための操作の標的を代表する。この技術の可能性は、Aspergillus属を特に参照してレビューされている(Van den Hondelら 1991)。本明細書で用いられる用語「異種遺伝子発現」は、特定の宿主で存在しないまたは一般的でない遺伝子の発現を意味する。 Neurospora属は、異種遺伝子発現のための宿主としてその可能な開発を目的とする研究についていくつかの利点を有している。より特定すれば、Neurospora crassa種は、すべての糸状菌類の中で最も完全に研究され、および特徴付けられ(Perkins DD[1992]genetics 130：687-700でレビューされている)、他の任意の種に比べ、より多くの遺伝子が特徴付けられそしてより多くの遺伝子がクローン化されている。それは、増殖要求性が単純で非常に増殖が速い。それは広範な炭素源および窒素源上で増殖し、そして単一の、ビオチンについての複合体増殖要求性を有する。それは液体培地中または固体培地上で増殖する。それは、毒性の二次代謝物を生産せず、そして事実、伝統的な東洋のヒト食品微生物である。 Neurosporaは、実際、固体培地中で増殖し、そしてポリサッカライド炭素源を利用するために効率的な分泌酵素系を有する。これらは、デンプンで誘導される場合分泌される主要なタンパク質であるグルコアミラーゼを含む。野生型Neuros poraで分泌されるタンパク質は、培養後の培地で約１g/lのレベルに達し、グルコアミラーゼは、デンプンで誘導されたとき、分泌タンパク質全体の約20％を占める。グルコアミラーゼについては、炭素カタボライトリプレッション、および基質またはそのような基質の特定の部分加水分解生成物による誘導の２種の制御成分についての証拠がある。グルコアミラーゼは、以下のいくつかの菌類からクローン化され、および特徴付けられている：Aspergillus awamori(Nunbergら、1984)、A.awamori var.kawa chi(Hayashidaら、1989)、A.niger(Boelら、1984)、A.oryzae(Hataら、1991)、A .shirousami(Shibuyaら、1990)、Humicola grisea var．thermoidea(Berkaら、私信)、Rhizopus oryzae(Ashikariら、1986)、Saccharomyces cerevisiae(Pardo ら、1988)、S.diastaticus(Yamashitaら、1985)、S.fibuligera(Itohら、1987) 、およびS.occidentalis(Dohmenら 1990)。グルコアミラーゼ(エクソ-1,4-x-D-グルカングルコヒドロラーゼ、EC 3.2.1.3 )は、種々の糸状菌類により大量に分泌される。それらはデンプンならびにその他のポリおよびオリゴサッカライドの非還元末端から単一のグルコース単位の除去を触媒する。工業的プロセスにおけるそれらの使用は、デンプンからのグルコースシロップの生産(Kennedyら 1988)、および日本における酒（コメのワイン）の発酵を含む。上記の糸状菌類Aspergillus種における異種発現系は、通常、発現を駆動するためにそれらのグルコアミラーゼプロモーター、外来ペプチドを分泌するためにそれらのシグナル配列、および終結のためにそれらの3'フランキング領域を使用する(Archerら 1990；Wardら 1990、1992)。 Koh-Luarら(1989)は、種々の炭素源上で増殖するNeurospora crassaの培養上清を分析し、そして最も多量に存在するタンパク質は、約69kDaのグルコアミラーゼであったことを示した。このタンパク質は精製され、そしてこのグルコアミラーゼのN-末端配列が決定された。グルコアミラーゼ遺伝子の高発現および分泌特性は、それを異種遺伝子発現における使用のための魅力的な候補にする。グルコアミラーゼプロモーターは、グルコアミラーゼのオープンリーディングフレームとは別に使用され得、従って、プロモーターの高い転写レベルおよび細胞外炭素に応答する制御を利用し得る。高度に分泌されるグルコアミラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームは、 Neurospora crassaの分泌経路中へ外来タンパク質を向けるためにグルコアミラーゼプロモーターと組み合わせて使用され得る。この場合、グルコアミラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレーム全体または一部分が、外来遺伝子にフレームを合わせて結合され得る。本明細書で、本発明者らは、Neurospora crassaのグルコアミラーゼ遺伝子gla -1のDNA配列をフランキング配列とともに報告し、そしてそのアミノ酸配列をその他のグルコアミラーゼと比較する。上記遺伝子のDNA配列構造を得、本発明者らは、予期せぬ非常に高いレベルの、制御されたプロモーターを特徴付け、そして炭素カタボライトリプレッションおよびデンプンまたはその代謝物のようなポリサッカライド基質によるその誘導の鍵となる特徴を決定した。この情報により、本発明者らは、この高レベル制御プロモーターを、任意の他の予め選択されたペプチドとともに含む発現カセットおよび発現/分泌カセットを遺伝的に改変する立場にある。このペプチドの生産の制御は、このプロモーターの抑制および誘導特徴に従う。従って、本発明者らは、炭素異化代謝物(catabolite)の存在または非存在に従いこのペプチドの生産を選択的にコントロールし得る。この技術が遺伝子工学工業において非常に重要であることは明白である。何故なら、それが二次代謝物を産生することなく、非常に効率的および安価な方法で予め決定されたペプチドの選択的な生産を可能にするからである。さらに、Neur osporaは、酵母のようでなく、他の糸状子嚢菌類のように、哺乳動物のグリコシル化と類似の方法でタンパク質をグリコシル化する傾向にあり、生物学的活性にグリコシル化を必要とする任意の異種産生される哺乳動物ペプチドが実際に生物学的に活性であるという合理的な予測が存在する。さらに、Neurosporaは、一般にゲノム中の非相同(heterologous)の位置に、少なくとも栄養増殖的に安定に組み込まれる形質転換配列をもって高効率で形質転換され得る。さらに、本発明者らはまた、異種遺伝子発現のためのベクターとして遺伝子の有用性を改善するグルコアミラーゼコード領域の改変を本明細書で報告する。本発明の第１の局面によれば、それ故、図１に示されるDNA配列構造、または機能的に等価なヌクレオチド配列であるその部分を有する制御プロモーターが提供される。本発明の第２の局面によれば、図１に示されるDNA配列構造、またはその部分を有する、そして特に、図１に示されるDNA配列構造の最初の1000ヌクレオチドの配列構造、またはその部分を有する制御プロモーターおよび上流アクティベーターが提供される。好ましくは、図１に示されるDNA配列構造は、図１に示されるアミノ酸配列のタンパク質、または図１に示されるアミノ酸配列を実質的に有する等価な生物学的活性のタンパク質をコードする。図１に示されるDNA配列構造は、タンパク質グルコアミラーゼをコードするので、本発明の制御プロモーターは、グルコアミラーゼ遺伝子の発現をコントロールするプロモーターであるという結論になる。本発明の第３の局面によれば、先に記載のような制御プロモーターがさらにリンカーを有し、それによってこのプロモーターと所望のタンパク質をコードする予め選択された遺伝子との連結が促進される制御プロモーターが提供される。さらになお、本発明の局面によれば、先に記載のDNA配列構造を取り込むベクターまたはプラスミド(pPS8)が提供される。好ましくは、上記ベクターまたはプラスミドは、ヌクレオチド98のBamHI部位とヌクレオチド1002のHindIII部位との間に位置する上記DNA配列構造の904ヌクレオチドのフラグメントを取り込んでいる。さらになお、本発明の局面によれば、少なくとも先に記載の制御プロモーター DNA配列および異種ペプチドをコードする予め選択された遺伝子を含む発現カセットが提供される。好ましくは、発現カセットはまた上流アクティベーター配列を含む。好ましくは、さらになお上記発現カセットは、理想的には、ヒグロマイシン耐性をコードする遺伝子である、Neurosporaにおいて選択可能なマーカーを含む。好ましくは、さらになお上記の発現カセットは、理想的には、E.coli由来の複製起点、およびまた好ましくはE.coliで選択可能なマーカー、例えば、アンピシリン耐性をコードする遺伝子を含む。好ましくは、さらになお上記の発現カセットは、マルチクローニング部位を取り込み、それによって任意の予め選択された遺伝子配列の挿入が転写融合により取り込まれ得る。さらになお、本発明の局面によれば、任意の、１つまたは先に述べた発現特徴の組み合わせを取り込み、そして分泌シグナルをコードするDNA配列構造をさらに取り込む発現/分泌カセットが提供される。好ましくは、上記発現/分泌カセットは、異種ペプチドのコード配列に翻訳レベルで融合される先に記載のDNA配列を含む。好ましくは、３種の異なる発現/分泌カセットが提供される。多重クローニング部位オリゴヌクレオチドは、それぞれリーディングフレームが異なり、異種ペプチドのコード配列に、フレームが合った翻訳融合を許容する。これは、合成の多重クローニング部位オリゴヌクレオチドの末端を適切に設計することより達成される。発現/分泌カセットの提供が、異種ペプチドが発現されそして次いで培養培地中に分泌されることの両方を可能にすることは、当業者に明らかである。しかし、このことは、製造され得るペプチドの範囲を制限するが、利点は、この方法を用いて製造され得るこれらペプチドの精製を容易にすることである。本発明の好ましい実施態様において、選択される異種ペプチドは、インスリン、ヒト成長ホルモン、インターロイキン、または実際任意の他の適切なペプチドのような医学的または薬学的ペプチドである。さらになお、本発明の局面によれば、発現カセットおよび/または発現/分泌カセット(本発明の実施を可能にするために以下に記載のような構築物またはプラスミドとも称される)が提供される。本発明の好ましい実施態様では、図３に示されるようなプラスミドpGla-XhoI が提供される。さらになお本発明の実施態様では、図５に示されるようなプラスミドpGla-Mro Iが提供される。さらになお本発明の実施態様では、図６に示されるようなプラスミドpGEが提供される。さらになお本発明の実施態様では、図８に示されるようなプラスミドpGSが提供される。本発明のさらに好ましい構築物またはプラスミドは、中間体と呼ばれ、そして上記のプラスミドを提供するために単離または組み合わせのいずれかで用いられるプラスミドを含み、例えば、中間体構築物は、構築物pGEを製造するために用いられるプラスミドpGla XL-、pGla XLX、およびpGla MXLXを含み、そして他の中間体構築物は、構築物pGSを製造するために用いられるpGla-XhoIを含む。さらになお本発明の別の局面によれば、本明細書で記載される構築物またはプラスミドを製造するためのプライマーが提供され、そのプライマーは図４に示される。より短いプライマー配列が本発明を実施するために使用され得ること、または図４に記載されるプライマー内の１つまたはそれ以上の塩基の置換が使用され得、ハイブリダイゼーションが達成され得ることは当業者に明らかである。従って、より短いプライマー配列または少数の内部塩基置換を有する配列が、本発明を実施するために使用され得、そして本明細書で記載される方法を用いるこの目的に容易に試験され得ると結論付けられる。さらになお本発明の別の局面によれば、糸状菌類を形質転換する方法が提供され、この方法は、組換え技術を用いて、少なくとも１つの、先に記載の発現カセットおよび/または分泌/発現カセットを菌類に挿入することを包含する。本発明の好ましい実施態様では、上記糸状菌類はNeurospora crassaである。さらになお本発明の別の局面によれば、本発明に従う、少なくとも１つの発現カセットおよび/または発現/分泌カセットを含む糸状菌類が提供される。好ましくは、上記糸状菌類はNeurospora crassaである。さらになお本発明の別の局面によれば、少なくとも１つの糸状菌類から、予め選択された異種ペプチド生産方法が提供され、この方法は以下の工程を包含する： a)先に記載の発現カセットまたは発現/分泌カセットのいずれかを提供する工程。 b)予め選択された糸状菌類種を、少なくとも１つの上記カセットで形質転換する工程。 c)上記形質転換された菌類を培養する工程；および d)上記異種ペプチドを回収する工程。本発明を、今や、本明細書の以下の図面を参照して、実施例のみにより記載する。図１は、グルコアミラーゼ遺伝子のDNA配列構造、およびタンパク質グルコアミラーゼの対応するアミノ酸配列構造を示す。グルコアミラーゼのリーディングフレームを大文字で、その翻訳を下にともに示す。非翻訳領域は小文字で示す。ヌクレオチドの番号付けは、ATGのAが＋１であることを基礎にする。アミノ酸の番号付けは括弧内にある。推定のプロモーター要素は太線で下線を引いた。イントロンの機能的ドメインは太文字である。タンパク質のリーダー配列は太文字であり、シグナル切断部位は矢印で示す。Lys-Arg(Kex2)プロペプチドプロセッシング部位には下線を引いた。推定のポリアデニル化シグナルにも太線で下線をひいた。図２は、プラスミドpPS8を示す図である。図３は、プラスミドpGla-XhoIのDNA配列構造を示す。図４は、グルコアミラーゼ遺伝子の最後のコドンでMroI部位の作製に用いられたプライマーを示す。図５は、プラスミドpGla-MroIのDNA配列構造を示す。図６は、プラスミドpGEのDNA配列構造を示す。図７は、グルコアミラーゼ遺伝子における第２番目のKex-2部位に対するSalI 部位の相対的位置を示す。図８は、プラスミドpGSのDNA配列構造を示し；そして図９は、試験されたすべての発現ベクターからのDSPAの最も高い収量を示す。グルコアミラーゼ遺伝子のクローニング Neurosporaグルコアミラーゼ遺伝子gla-1のクローン化および配列決定を、他の種由来の遺伝子の配列アラインメント、ネステッド(nested)PCRプライマーの設計、およびベクターλJ1中のNeurosporaゲノムライブラリーからのゲノムクローンを同定するために用いられたPCRによるフラグメントの生産のような、従来法により実施した。クローンをpBluescript中にサブクローン化し、そしてサンガーのジデオキシ法により配列決定した。この遺伝子は、グリコシル化されていない、分子量66,575Daの626個のアミノ酸の推定されるタンパク質をコードする。これは、既知の分泌タンパク質のN末端と比較したとき、35個のアミノ酸のリーダーペプチドを含む。本発明者らは、翻訳開始コドンの938塩基対上流を配列決定した。ATGコドンに関して-101の位置にTATAボックスが存在した。実際の配列はTATATAAであり、そして真核生物のコンセンサスはTATA(A/T)TAである。いくつかの可能な、完全ではないけれども、CAATボックスが、TATAボックスの上流に存在し、最も機能しそうなCAATボックスは、ATG開始コドンに対して-133にある(CATCAATAT)。真核生物コンセンサス配列はGG(C/T)CAATCTである。翻訳の開始点は、開始AUGに関して、位置-3のプリンに非常に強い要求性を有することが示されている。必須プロモーター領域の単離プロモーター、制御領域、およびおそらくまた任意のUAS(上流アクティベーター配列)が、決定された配列の最初の938ヌクレオチドに含まれている。これは、クローンの残りとともに、本発明者らのプラスミドpPS8に含まれている。ヌクレオチド98のBamHI部位と、ヌクレオチド1002のHindIII部位との間の904のヌクレオチドフラグメントは、プロモーターの主要な部分および遺伝子産物のシグナルペプチドのN末端主要部分を含み、容易にサブクローン化され得、そして適切なレポーター遺伝子でプロモーターおよびデンプン制御活性について試験され得る。ヌクレオチド1002で適切な制限部位が、この遺伝子のオープンリーディングフレームのN末端部分内で同定され、そして適切な構築物が、レポーター遺伝子を用いて、以下に記載されるようにプロモーター活性および制御機能を研究するために作製された。プラスミドpPS8 図２はpPS8プラスミドの図である。２重線で示される、左上部の２つのClaI部位の間の約２kb部分はベクターpBluescriptである。pBluescriptをその多重クローニング部位中の単一のClaI部位で切断すること、およびグルコアミラーゼ遺伝子を含むNeurospora ClaIフラグメントを挿入することで構築物が得られる。円弧でラベルした外側のgla遺伝子は、N-末端からC-末端に伸びる遺伝子のコード領域のおおよその位置を示す。プロモーター領域は、12時の位置にあるClaI部位とコード領域のN-末端との間の約１kbの上流領域にある。数字は、制限フラグメントのおおよそのサイズを、ヌクレオチド対で示す。BamHI、HindIIIおよびEcoR Iに対する制限部位を、参考としてNeurospora挿入物中に示す。レポーター遺伝子の選択２種の自明なレポーター遺伝子の選択が存在する。これらの第１番目は、良く特徴付けられた、プラスミドpNom123中で利用可能なGUS(β-グルクロニダーゼ）レポーター遺伝子である。これは、そのNeurosporaで選択可能なマーカーとして hphヒグロマイシン耐性遺伝子を有する。それに代わるレポーター遺伝子は、Neu rospora tyrチロシナーゼ構築物pTry103である。プロモーターの必須配列の単離特定のプロモーターの特徴は既に配列相同性により同定されている。これらは、これらプロモーターの特徴についてのコンセンサス配列に対するそれらの類似性の故、ヌクレオチド804-812の推定のCAATボックス(実際の配列はCATCAATAT)およびヌクレオチド838-844のTATAボックス(実際の配列はTATATAA)を含む。Asperg illus α-アミラーゼのプロモーター配列との相同性により同定される他の特徴は、約75％の配列相同性を有する、Neurospora gla-1配列のヌクレオチド301-34 0領域である。これは、UAS、または他の必須の特徴であり得る。２つの転写起点がまた、ヌクレオチド885およびヌクレオチド892で、プライマー伸長により同定されている。必須プロモーターの限定の実験調査は、サブクローン化したブロモーター-レポーター遺伝子構築物の切断、およびサブクローンの５'-末端からにおける欠失により行われた。これは、利用可能な制限部位に条件付けられる特定の制限フラグメントの欠失、またはエクソヌクレアーゼ分解のいずれか含む。いずれの場合においても、短縮化された「プロモーター」を、レポーター構築物に再連結し、そして残存プロモーター活性および制御について試験した。必須プロモーターの限定の実験調査は、サブクローン化プロモーター-レポーター遺伝子構築物の切断、およびサブクローンの５'-末端からにおける欠失により行われた。これは、マングビーン(mung bean)エクソヌクレアーゼ消化を用いて行った。あるいは、それは、一組(nested)の欠失のセットを提供するように、適切な任意の制限部位を用いて実施され得る。これらの欠失、または短縮化されたプロモーター配列は、レポーター構築物に再連結され、そして残存プロモーター活性および制御について試験した。発現カセットの構築プラスミドpGla-XhoI、pGla-MroI、pGEの寄託がなされ、そして寄託の詳細は、本明細書に滞りなく添付される。すべてのDNA改変酵素は、New England BiolabまたはBoehringer Mannheimから購入した。プラスミドは、DH-5a E.coli細胞に形質転換した。小胞体中に外来タンパク質を標的することにおいて使用するグルコアミラーゼ遺伝子の改変は、グルコアミラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレーム中の都合の良い制限部位の挿入を必要とし、そしてより好ましくは、この制限部位は、グルコアミラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームの最後のコドンに位置した。制限部位tggccaは、Boehringer Mannheimにより販売される制限酵素Mro IおよびNew England Biolabsにより販売されるBspEIにより認識され、最初の例においてグルコアミラーゼ遺伝子の最後のコドンに配置された。制限部位tggcca は、以後本明細書ではMroIと称される。MroI部位を加工するために、PCRプライマーを作製した。５'プライマーは、グルコアミラーゼオープンリーディングフレームの位置2163の単一のPpumI部位を包含する（図３参照）。MroI部位を含む３'プライマーは、gla遺伝子の３'末端でハイブリダイズする（図４参照）。 MroI部位を有するグルコアミラーゼを２工程の手順で作製した。１．５'上流PCRフラグメントを増幅し、そしてpNEB 193ベクター中のSmaI部位中にクローン化した。PCRフラグメントの方向を正しくし、そこで５'PpuI部位がpN EB193のポリリンカー上のEcoRI部位の近位にあった。適切なクローンをpMroと名付けた。 pMroI：Eco Sac，PpumI PCR MroI AscI、XbaI、HindIII ２．次いで、gla遺伝子の残りを、グルコアミラーゼクローンpGIa-XhoIの消化により挿入した。このプラスミドpGIa-XhoIは、完全gla遺伝子を含むが、下流の配列決定はされておらず、そして転写されない領域が欠失していた。pGIa-XhoIを、制限酵素SacIおよびPpumIで消化した。このフラグメントを、pMroIのSac/Ppum I部位中に連結した。pGla-XhoIのSacI部位は、リンカー由来であり、そしてグルコアミラーゼのコード領域由来ではなく、その結果グルコアミラーゼ配列は欠失していなかった（図５参照）。 pGla-Mro：Sac，GlaI PpumI Mro，AscI ect．グルコアミラーゼ遺伝子は、ポリアデニル化部位を含めないで、1943塩基のメッセージを転写する。発現構築物は、発現されるべきcDNAに融合されるとき、より長いメッセージの転写を必要とする。より長いオープンリーディングフレームは、元の、より短い構築物より効率悪く転写され得る。転写効率を増加する試みにおいて、本発明者らは、グルコアミラーゼオープンリーディングフレームから 1575bpを欠失させ、プラスミドpGE:(プラスミドグルコアミラーゼ、EcoRI、図６参照)を作製した。１．構築物pGla -XhoIを、ClaIおよびXbaIで消化し、そしてE.coliポリメラーゼＩ(クレノウフラグメント)を用いて粘着末端を平滑にし、５'ポリリンカーを除去した。次いで、DNAを再環状化し、そしてコンピテントなE.coli細胞DH5a中に形質転換した。本発明者らは、この構築物をpGla XL-と名付けた。２．本発明者らは、次いで、グルコアミラーゼ遺伝子中のBsaAI部位にXbaIリンカーを添加した。構築物pGla XL-中の位置3542のBsaAI部位は、グルコアミラーゼの終止コドンから13塩基対離れている。BsaAIを用いた完全消化は、３つのフラグメントを生じ得、結果としてBsaAIを用いたpGla XL-の部分消化を実施した。pGla XL-のサイズに相当する直鎖化バンドをゲル精製した。ゲル精製したフラグメントに、200ngの８bp XbaIリンカーおよび400単位のT4リガーゼを添加した。クローンを、位置3542のBsaAI部位中へのXbaIリンカーの挿入についてスクリーニングした。適切に同定されたクローンを、pGla XLXと再命名した。３．クローンpMro(上記)を、PpumIおよびXbaIを用いて消化した。放出されたフラグメントを、PpumI/XbaI部位でpGla XLX中に連結した。正確なクローンを制限消化で同定し、そしてpGLA MXLXと再命名した。４．クローンpGla MXLXを、次いで、EcoRIとMroIで消化し、1575bpのグルコアミラーゼオープンリーディングフレームを放出した。粘着末端をE.coliポリメラーゼＩ(クレノウフラグメント)を用いて充填することにより平滑にした。新しい発現構築物をpGE(プラスミドグルコアミラーゼ、EcoRI、図６参照)と再命名した。この構築物は、グルコアミラーゼ開始コドンから359bpの、グルコアミラーゼ遺伝子内のEcoRI部位で、グルコアミラーゼ標的のための融合部位を含む。本発明者らは、第２のグルコアミラーゼ短縮型融合発現カセットを作製した。この構築物は、pGla-XhoI中の位置1133として(図１参照)、グルコアミラーゼオープンリーディングフレーム中の最初のSalI部位で融合結合部を含む。SalI部位を、これが、Lys₃₄-Arg₃₅で第２のkex-2部位のすぐ後にあるので選択した(図５参照)。kex-2部位は、多くの菌類システムで、プロペプチドの除去のためのタンパク質分解性切断の部位として見い出されている(Stoneら、1993でレビューされている)。１．クローンpGla MXLXを、制限酵素SalIおよびMroIを用いて消化した。粘着末端を、E.coli DNAポリメラーゼＩ(クレノウフラグメント)を用いて平滑にした。消化されたDNAを、400単位のT4 DNAリガーゼとともに連結した。適切なクローンを制限分析により同定した。クローンはpGSと命名した(プラスミドグルコアミラーゼ、SalI)、図８参照。Neurosporaへの形質転換標準形質転換を方法論的に用いて、細胞壁分解酵素Novozym234(Radfordら[198 1]Molec Gene Genet 184，567-569)を用いて、NeurosporaスフェロプラストにDN A構築物の形質転換を成し遂げた。DSPA生産グルコアミラーゼ発現ベクターを用いて、吸血コウモリ(Desmonas salivaris) の唾液腺から分泌される哺乳動物血栓溶解タンパク質を発現した。タンパク質DS PA(Desmonas salivarisプラスミノーゲン活性化因子)は、フィブリンに結合して内因性プラスミノーゲンを活性化し、フィブリン分解を導く抗凝固因子(anti-co agulant)である。DSPAのcDNAは、Berlix Biosciences Brisbane，CA.により研究の目的のために、本発明者に与えられた。本発明者らは、種々のベクターにDSPAクローンを加工した。グルコアミラーゼベクターを用いるにあたり、本発明者らは、５'側のDSPAシグナル配列をMroI部位で置き換え、発現pGla -MroIおよびpGEへのクローニングを容易にした。MroI 部位の後に、本発明者らは、kex-2タンパク質分解部位を置き、DSPAからグルコアミラーゼタンパク質を除去した。発現ベクターを選択マーカーとともにNeuros pora crassaスフェロプラストに同時形質転換した。図９では、本発明者らは、いくつかの発現ベクターにより生産されたDSPAのレベルが分かる。四角で囲まれた試料は、グルコアミラーゼベクターにより生産されたDSPAのレベルを示す。pGATE-TFは、発現ベクターpGla-MroIに総合的な融合タンパク質としてDSPA遺伝子を含む。pGATEcoは、短縮型グルコアミラーゼベクターpGEに融合したDSPA遺伝子を有する。形質転換体の選択形質転換体は、ヒグロマイシン耐性の１次選択により、pNom123(GUSレポーター遺伝子)について選択された。GUS活性の発現を、X-gluc基質における青色の発色により次の工程で検出した。 pTyr103を用いる場合、推定のプロモーター挿入物を有する派生したプラスミドは、独立した選択マーカーを持たない。これらは、選択マーカーを有する第二のプラスミドとともに同時形質転換された。このプロセスは、約50％の非選択プラスミドの同時組み込みを生じた。多数の同時選択プラスミドが、適切であるが、実施例は、Nourosporaのクローン化されたpyri-4遺伝子を含み、ピリジミン要求性受容株の相補性により形質転換体を選択するpFB6(BuxtonおよびRadford[198 4]Molec Gene Genet 190，403-405)である。こうして選択した形質転換体は、栄養増殖培養におけるチロシナーゼ活性の発現によりgla-1プロモーター領域由来のプロモーター活性を示した。チロシナーゼは、生活環の有性期(sexual phase) で唯一正常に活性である。チロシナーゼ活性を再度、供給したL-チロシンを黒色メラニン色素に、またはL-DOPAを可溶性赤色色素に転化することにより、比色的に検出される。 L-DOPAからの赤色およびX-glucからの青色は、両方とも定量的にアッセイし得る。生産物のタイプこのプロセスは、広域なペプチド生産物のNourosporaにおける発現および発酵槽規模の生産に適しており、特に、生物活性のためにグリコシル化を必要とする哺乳動物のペプチドに適切である。高価な医学的および薬学的ペプチド(例えば、インスリン、ヒト成長ホルモン、インターロイキンなど)の生産に特に適している。生産方法 Neurosporaは、通気液体発酵槽または固体状態の発酵のいずれかで、大規模な発酵条件でよく増殖する。それは、大きな範囲の安価な炭素および窒素源で増殖し、そして微量のビオチンのみについての複合体要求性を有する。生産の制御グルコアミラーゼ遺伝子およびそのプロモーターは、デンプンまたはマルトースにより誘導され得、そしてグルコースにより抑制され得る。グルコアミラーゼは、適切に誘導される場合、Neurosporaにおいて主要な分泌タンパク質でありえる(Koh-Laurら[1989]Enz Microb Technol 11)。派生した発現および発現／分泌カセットは、このような制御を有するかまたは有さない様にするために設計され得る。特定の組換え生産物のために、構成的な生産は、所望され得、そして制御配列を有さないカセットが用いられ得る。他の組換え生産のために、誘導された短い発現期は、有用または所望され得る。このような場合において、生産は、バイオマスの対数増殖期の間(菌糸体)、炭素源としてのグルコースでの増殖により最初に抑制され得、その後、グルコースの枯渇または除去および誘導炭素源(デンプンまたはマルトース)の添加により、誘導された発現期に導かれ得る。要旨本発明者らは、Nourospora crassaのグルコアミラーゼ遺伝子を、異種遺伝子発現のためのベクターとしてその有用性を改良するために改変した。本発明者らは、グルコアミラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームの最後のコドンに有用な制限酵素部位を添加し、総合的な融合発現構築物pGla -MroIを作製した( 図３参照)。さらに、本発明者らは、グルコアミラーゼ遺伝子オープンリーディングフレームの1575塩基対を欠失することにより、グルコアミラーゼ発現のための転写物のサイズを減少した。このようにして、プラスミドpGEを作製した(図６参照)。さらに、本発明者らは、グルコースアミラーゼの終止コドンから13塩基対の制限部位を加工し、グルコアミラーゼ遺伝子のポリアデニル化部位に近接する目的のcDNAを置いた。最後に、本発明者らは、グルコアミラーゼシグナル、プロペプチド、およびポリアデニル化部位を含む発現カセットを作製した。この発現カセットは、プラスミドpGSである(図８参照)。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年６月２０日【補正内容】発現カセットの構築プラスミドpGla-XhoI、pGla-MroI、pGEの寄託がなされ、そして寄託の詳細は、以下の通りである： pGla-XhoI − ATCC寄託番号75858、pGla-MroI − ATCC寄託番号75859；および pGE - ATCC寄託番号75860。すべてのDNA改変酵素は、New England BiolabまたはBoehringer Mannheimから購入した。プラスミドは、DH-5a E.coli細胞に形質転換した。小胞体中に外来タンパク質を標的することにおいて使用するグルコアミラーゼ遺伝子の改変は、グルコアミラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレーム中の都合の良い制限部位の挿入を必要とし、そしてより好ましくは、この制限部位は、グルコアミラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームの最後のコドンに位置した。制限部位tggccaは、Boehringer Mannheimにより販売される制限酵素Mro IおよびNew England Biolabsにより販売されるBspEIにより認識され、最初の例においてグルコアミラーゼ遺伝子の最後のコドンに配置された。制限部位tggcca は、以後本明細書ではMroIと称される。MroI部位を加工するために、PCRプライマーを作製した。５'プライマーは、グルコアミラーゼオープンリーディングフレームの位置2163の単一のPpumI部位を包含する(図３参照)。MroI部位を含む3' プライマーは、gla遺伝子の３'末端でハイブリダイズする(図４参照)。 MroI部位を有するグルコアミラーゼを２工程の手順で作製した。１．５'上流PCRフラグメントを増幅し、そしてpNEB 193ベクター中のSmaI部位中にクローン化した。PCRフラグメントの方向を正しくし、そこで５'PpumI部位がp NEB193のポリリンカー上のEcoRI部位の近位にあった。適切なクローンをpMroと名付けた。 pMroI：Eco Sac，PpumI PCR MroI AscI、XbaI、HindIII ２．次いで、gla遺伝子の残りを、グルコアミラーゼクローンpGIa-XhoIの消化により挿入した。このプラスミドpGIa-XhoIは、完全gla遺伝子を含むが、下流の配列決定はされておらず、そして転写されない領域が欠失していた。pGIa-XhoIを、制限酵素SacIおよびPpumIで消化した。このフラグメントを、pMroIのSac/Ppum I部位中に連結した。pGla-XhoIのSacI部位は、リンカー由来であり、そしてグルコアミラーゼのコード領域由来ではなく、その結果グルコアミラーゼ配列は欠失していなかった(図５参照)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．アカパンカビ(Neurospora crassa)のタンパク質グルコアミラーゼをコードする遺伝子の制御プロモーター配列を少なくとも含み、そして図１に示されるDN A配列構造またはその部分を有し、そして少なくとも１つの制限部位をさらに含み、それによって異種ペプチドのコード配列が該遺伝子中に導入され得、異種ペプチドが該プロモーター配列の制御下で製造され得る、構築物。２．前記プロモーター配列が、図１に示される開始コドンATGに対して位置-101 にあるTATAボックスを含む上流アクティベーターを含む、請求項１に記載の構築物。３．前記プロモーター配列が、図１に示される開始コドンATGに対して位置-133 にあるCAATボックスを含む上流アクティベーターを含む、請求項１に記載の構築物。４．前記プロモーター配列が、図１に示されるDNA配列構造の最初の938ヌクレオチドを含む、請求項３に記載の構築物。５．プラスミドpPS8を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の構築物。６．プラスミドpGla-Xhol(ATCC寄託番号75858)を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の構築物。７．プラスミドpGla-Mrol(ATCC寄託番号75859)を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の構築物。８．プラスミドpGE(ATCC寄託番号75860)を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の構築物。９．プラスミドpGla XL-を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の構築物。 10．プラスミドpGla XLXを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の構築物。 11．プラスミドpGla MXLXを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の構築物。 12．プラスミドpGSを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の構築物。 13．前記構築物がNeurosporaで選択可能なマーカーをさらに含む、請求項１〜12 のいずれかに記載の構築物。 14．前記マーカーがヒグロマイシン耐性を提供する、請求項13に記載の構築物。 15．前記構築物が、E.coliで選択可能なマーカーをさらに含む、請求項５〜14のいずれかに記載の構築物。 16．前記マーカーがアンピシリン耐性をコードする遺伝子である、請求項15に記載の構築物。 17．前記構築物が、分泌シグナルをコードするDNA配列構造をさらに含む、請求項１〜16のいずれかに記載の構築物。 18．前記DNA配列構造が、異種ペプチドのコード配列に翻訳的に融合している、請求項18に記載の構築物。 19．請求項１〜18に記載の構築物の少なくとも１つを、組換え技術を用いて糸状菌類中に挿入する工程を包含する、糸状菌類を形質転換する方法。 20．前記糸状菌類がNeurospora crassaである、請求項19に記載の方法。 21．請求項１〜18のいずれかに記載の構築物が挿入された糸状菌類。 22．前記菌類がNeurospora crassaである、請求項21に記載の方法。 23．少なくとも１つの糸状菌類から予め選択された異種ペプチドを生産する方法であって、以下の工程を包含する方法： a)請求項19に記載の方法に従って、１つまたはそれ以上の構築物を提供する工程、 b)該構築物の少なくとも１つで糸状菌類の予め選択された種を形質転換する工程、 c)該形質転換された菌類を培養する工程；および d)該構築物で提供される異種ペプチドを回収する工程。 24．前記糸状菌類がNeurospora crassaである、請求項23に記載の方法。 25．図４に示される配列構造またはその部分の少なくとも１つを含む、本発明を実施するためのプライマー。