JPH06319579A - ヒアルロン酸の製造法 - Google Patents
ヒアルロン酸の製造法Info
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- JPH06319579A JPH06319579A JP11449593A JP11449593A JPH06319579A JP H06319579 A JPH06319579 A JP H06319579A JP 11449593 A JP11449593 A JP 11449593A JP 11449593 A JP11449593 A JP 11449593A JP H06319579 A JPH06319579 A JP H06319579A
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- Japan
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- hyaluronic acid
- culture
- molecular weight
- producing
- fructose
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- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 医薬品、化粧品などに有用なヒアルロン酸を
工業的により効率よく、安価に製造する方法を提供す
る。 【構成】 ヒアルロン産を生産する能力を有する微生物
をグルコースおよびフラクトースを主たる炭素源として
含有する培地に培養し、培養物中に高分子量のヒアルロ
ン酸を生成蓄積させ、該培養物からヒアルロン酸を採取
することを特徴とするヒアルロン酸の製造法。
工業的により効率よく、安価に製造する方法を提供す
る。 【構成】 ヒアルロン産を生産する能力を有する微生物
をグルコースおよびフラクトースを主たる炭素源として
含有する培地に培養し、培養物中に高分子量のヒアルロ
ン酸を生成蓄積させ、該培養物からヒアルロン酸を採取
することを特徴とするヒアルロン酸の製造法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒアルロン酸の製造方法
に関する。ヒアルロン酸は医薬品、化粧品として有用な
物質である。
に関する。ヒアルロン酸は医薬品、化粧品として有用な
物質である。
【０００２】
【従来の技術】ヒアルロン酸を製造する方法として、ニ
ワトリのトサカ，牛の眼の硝子体または臍帯などの組織
から抽出する方法が従来より知られている。しかし、こ
れらの組織にはヒアルロン酸が微量にしか存在しておら
ず、しかも精製工程が複雑であるなど、工業的に有利な
方法ではない。
ワトリのトサカ，牛の眼の硝子体または臍帯などの組織
から抽出する方法が従来より知られている。しかし、こ
れらの組織にはヒアルロン酸が微量にしか存在しておら
ず、しかも精製工程が複雑であるなど、工業的に有利な
方法ではない。
【０００３】一方、発酵法によるヒアルロン酸の製造方
法として、グルコースを主たる炭素源とし、ヒアルロン
酸生産能を有する微生物を用いる方法（特公平4-12960
号公報、特開昭62-32893号公報）などが知られている。
しかし、発酵法によってヒアルロン酸を製造すると、抽
出法で製造されたヒアルロン酸に比べて一般に分子量が
低く、品質が劣る。このため、培養液のｐＨを7.5 〜9.
0 に制御することにより高分子量のヒアルロン酸を製造
する方法が知られている（特開昭63-28398号公報）。
法として、グルコースを主たる炭素源とし、ヒアルロン
酸生産能を有する微生物を用いる方法（特公平4-12960
号公報、特開昭62-32893号公報）などが知られている。
しかし、発酵法によってヒアルロン酸を製造すると、抽
出法で製造されたヒアルロン酸に比べて一般に分子量が
低く、品質が劣る。このため、培養液のｐＨを7.5 〜9.
0 に制御することにより高分子量のヒアルロン酸を製造
する方法が知られている（特開昭63-28398号公報）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安価
で効率よく高分子量のヒアルロン酸を製造する方法を提
供することにある。
で効率よく高分子量のヒアルロン酸を製造する方法を提
供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、ヒアル
ロン酸を生産する能力を有する微生物をグルコースおよ
びフラクトースを主たる炭素源として含有する培地に培
養し、培養物中に高分子量のヒアルロン酸を生成蓄積さ
せ、該培養物からヒアルロン酸を採取することを特徴と
するヒアルロン酸の製造法を提供することができる。
ロン酸を生産する能力を有する微生物をグルコースおよ
びフラクトースを主たる炭素源として含有する培地に培
養し、培養物中に高分子量のヒアルロン酸を生成蓄積さ
せ、該培養物からヒアルロン酸を採取することを特徴と
するヒアルロン酸の製造法を提供することができる。
【０００６】なお、本発明によって提供できるヒアルロ
ン酸は、極限粘度法による平均分子量が３００万以上の
ヒアルロン酸であることを特徴とする。以下に本発明を
詳細に説明する。本発明に使用される微生物としては、
ヒアルロン酸を菌体外に蓄積する菌株であれば，いずれ
も使用可能であるが、特にランセフィールド（Lancefie
ld）による血清学的分類［バージーズ・マニュアル・オ
ブ・デタミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's M
anual of Determinative Bacteriol.)491.(1974)］のＡ
群およびＣ群のストレプトコッカス属菌種、たとえばス
トレプトコッカス・ビオゲネス、ストレプトコッカス・
エキ、ストレプトコッカス・エキシミリス、ストレプト
コッカス・ディスガラクティアエ、ストレプトコッカス
・ズーエピデミクスなどが用いられる。これらのなかで
もストレプトコッカス・ズーエピデミクス（Streptococ
cus zooepidemicus）ＮＣＴＣ7023が特に好適である。
ン酸は、極限粘度法による平均分子量が３００万以上の
ヒアルロン酸であることを特徴とする。以下に本発明を
詳細に説明する。本発明に使用される微生物としては、
ヒアルロン酸を菌体外に蓄積する菌株であれば，いずれ
も使用可能であるが、特にランセフィールド（Lancefie
ld）による血清学的分類［バージーズ・マニュアル・オ
ブ・デタミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's M
anual of Determinative Bacteriol.)491.(1974)］のＡ
群およびＣ群のストレプトコッカス属菌種、たとえばス
トレプトコッカス・ビオゲネス、ストレプトコッカス・
エキ、ストレプトコッカス・エキシミリス、ストレプト
コッカス・ディスガラクティアエ、ストレプトコッカス
・ズーエピデミクスなどが用いられる。これらのなかで
もストレプトコッカス・ズーエピデミクス（Streptococ
cus zooepidemicus）ＮＣＴＣ7023が特に好適である。
【０００７】本発明に用いる培地としては、炭素源、窒
素源、無機物その他の栄養物を適当に含有する培地なら
ば、合成培地、天然培地のいずれの培地でもよい。炭素
源としては、グルコース、フラクトース、シュクロー
ス、廃糖蜜、澱分加水分解物などを用いることができる
が、本発明ではグルコースおよびフラクトースが必須成
分として必要である。グルコースおよびフラクトースを
培養液中へ添加する場合、グルコースの濃度を３％（Ｗ
／Ｖ）（以下、同じ）未満、およびフラクトースの濃度
を３％以上となるように培養液中へ添加すると、高分子
量のヒアルロン酸が高収量で得られる。また、グルコー
スおよびフラクトースを培養液中へ添加する場合、一度
に多量を添加するよりも少量ずつ分割して適時添加した
方が良い結果が得られる。
素源、無機物その他の栄養物を適当に含有する培地なら
ば、合成培地、天然培地のいずれの培地でもよい。炭素
源としては、グルコース、フラクトース、シュクロー
ス、廃糖蜜、澱分加水分解物などを用いることができる
が、本発明ではグルコースおよびフラクトースが必須成
分として必要である。グルコースおよびフラクトースを
培養液中へ添加する場合、グルコースの濃度を３％（Ｗ
／Ｖ）（以下、同じ）未満、およびフラクトースの濃度
を３％以上となるように培養液中へ添加すると、高分子
量のヒアルロン酸が高収量で得られる。また、グルコー
スおよびフラクトースを培養液中へ添加する場合、一度
に多量を添加するよりも少量ずつ分割して適時添加した
方が良い結果が得られる。
【０００８】窒素源としては、ペプトン、ポリペプト
ン、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、ブレイン・ハート・インヒュージョン、馬血清
などの有機栄養源の添加が望ましく、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、アンモニア
などを併用することもできる。無機塩としては、たとえ
ば塩化ナトリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、
硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム、炭酸カル
シウムなどを用いることができる。その他の微量要素と
して、各種ビタミン、たとえばチアミン、ニコチン酸、
ビオチン、パントテン酸などを用いることができる。
ン、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水
分解物、ブレイン・ハート・インヒュージョン、馬血清
などの有機栄養源の添加が望ましく、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、アンモニア
などを併用することもできる。無機塩としては、たとえ
ば塩化ナトリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、
硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム、炭酸カル
シウムなどを用いることができる。その他の微量要素と
して、各種ビタミン、たとえばチアミン、ニコチン酸、
ビオチン、パントテン酸などを用いることができる。
【０００９】培養は、振盪培養、通気攪拌培養などの好
気的条件下で行われる。温度は２５〜４２℃、好ましく
は３０〜３８℃、培地のｐＨは５〜９に保持され、培養
は通常２〜４日間で終了する。なお、ヒアルロン酸は主
として菌体外に蓄積する。培養終了後、培養液よりヒア
ルロン酸を採取するには、培養液から菌体などの沈殿物
を除去し、通常の方法、たとえば有機溶媒沈殿法、イオ
ン交換処理法などを用いて行えばよい。
気的条件下で行われる。温度は２５〜４２℃、好ましく
は３０〜３８℃、培地のｐＨは５〜９に保持され、培養
は通常２〜４日間で終了する。なお、ヒアルロン酸は主
として菌体外に蓄積する。培養終了後、培養液よりヒア
ルロン酸を採取するには、培養液から菌体などの沈殿物
を除去し、通常の方法、たとえば有機溶媒沈殿法、イオ
ン交換処理法などを用いて行えばよい。
【００１０】以下に本発明の実施例を示す。
【００１１】
実施例 ストレプトコッカス・ズーエピデミクスＮＣＴＣ7023を
ブレイン・ハート・インフュージョン寒天培地（日水製
薬社製）で３７℃、１６時間培養した菌体を、グルコー
ス１％、ペプトン１．５％、酵母エキス０．５％、コー
ンスチープリカー１％、グルタミン酸ナトリウム０．３
％、リン酸一水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム
０．０５％、チオ硫酸ナトリウム０．１％、炭酸カルシ
ウム２％からなる培地（ｐＨ７．０）３００ｍｌを含む
２Ｌ容三角フラスコをオートクレーブで殺菌したものに
植菌し、３７℃，２００ｒｐｍで１８時間振盪培養し
た。得られた種培養液１５０ｍｌをグルコース２．５
％、フラクトース３．５％、ペプトン１．５％、酵母エ
キス０．５％、コーンスチープリカー０．５％、リン酸
一水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０５
％、チオ硫酸ナトリウム０．１％からなる発酵培地（ｐ
Ｈ７．２）３Ｌを入れた５Ｌ容のジャーファーメンター
をオートクレーブ殺菌したものに接種し、３７℃、通気
量０．３ｖｖｍ、攪拌数２００ｒｐｍの条件下、水酸化
ナトリウムでｐＨを７．０に調節しながら培養した。
ブレイン・ハート・インフュージョン寒天培地（日水製
薬社製）で３７℃、１６時間培養した菌体を、グルコー
ス１％、ペプトン１．５％、酵母エキス０．５％、コー
ンスチープリカー１％、グルタミン酸ナトリウム０．３
％、リン酸一水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム
０．０５％、チオ硫酸ナトリウム０．１％、炭酸カルシ
ウム２％からなる培地（ｐＨ７．０）３００ｍｌを含む
２Ｌ容三角フラスコをオートクレーブで殺菌したものに
植菌し、３７℃，２００ｒｐｍで１８時間振盪培養し
た。得られた種培養液１５０ｍｌをグルコース２．５
％、フラクトース３．５％、ペプトン１．５％、酵母エ
キス０．５％、コーンスチープリカー０．５％、リン酸
一水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム０．０５
％、チオ硫酸ナトリウム０．１％からなる発酵培地（ｐ
Ｈ７．２）３Ｌを入れた５Ｌ容のジャーファーメンター
をオートクレーブ殺菌したものに接種し、３７℃、通気
量０．３ｖｖｍ、攪拌数２００ｒｐｍの条件下、水酸化
ナトリウムでｐＨを７．０に調節しながら培養した。
【００１２】培養液を塩酸でｐＨ６．０に調整後、蒸留
水で５倍量に希釈し、遠心分離により菌体を除去した。
得られた培養液上清に２倍量のエタノールを加え、ヒア
ルロン酸ナトリウムを析出させた。これを濾別した後、
得られたヒアルロン酸ナトリウムを水に溶解し、これに
セチルピリジニウムクロライドを加え、生じた沈澱を濾
取し、水に再溶解後、再びエタノールによる析出操作を
繰り返した。こうして得られたヒアルロン酸ナトリウム
を室温で減圧乾燥したところ、培養液１Ｌ当り４．９ｇ
のヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
水で５倍量に希釈し、遠心分離により菌体を除去した。
得られた培養液上清に２倍量のエタノールを加え、ヒア
ルロン酸ナトリウムを析出させた。これを濾別した後、
得られたヒアルロン酸ナトリウムを水に溶解し、これに
セチルピリジニウムクロライドを加え、生じた沈澱を濾
取し、水に再溶解後、再びエタノールによる析出操作を
繰り返した。こうして得られたヒアルロン酸ナトリウム
を室温で減圧乾燥したところ、培養液１Ｌ当り４．９ｇ
のヒアルロン酸ナトリウムが得られた。
【００１３】得られたヒアルロン酸ナトリウムを０．２
Ｍ塩化ナトリウム溶液として極限粘度法により平均分子
量を算出した。分子量は、日局一般試験法２８：粘度測
定法により比粘度を測定し、各濃度に対する還元粘度を
Ｍ塩化ナトリウム溶液として極限粘度法により平均分子
量を算出した。分子量は、日局一般試験法２８：粘度測
定法により比粘度を測定し、各濃度に対する還元粘度を
【００１４】
【数１】
【００１５】で算出し、還元粘度を縦軸に、対応する濃
度（ｇ／１００ｍｌ）を横軸にとってグラフを書き、各
点を結ぶ線の延長と縦軸の交点を極限粘度（η）とし、
次の式（Biochim. Biopys. Acta.,42,476,(1960)）によ
り算出した。
度（ｇ／１００ｍｌ）を横軸にとってグラフを書き、各
点を結ぶ線の延長と縦軸の交点を極限粘度（η）とし、
次の式（Biochim. Biopys. Acta.,42,476,(1960)）によ
り算出した。
【００１６】
【数２】
【００１７】この結果、得られたヒアルロン酸ナトリウ
ムの平均分子量は３１０万であった。 比較例１−２ 培地中の炭素源をグルコース６％とフラクトース６％に
する以外は実施例と同様にした結果を第１表に示す。
ムの平均分子量は３１０万であった。 比較例１−２ 培地中の炭素源をグルコース６％とフラクトース６％に
する以外は実施例と同様にした結果を第１表に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】
【発明の効果】本発明によれば工業的に安価に効率よく
高分子量のヒアルロン酸を製造することができる。
高分子量のヒアルロン酸を製造することができる。
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒアルロン酸を生産する能力を有する微
生物をグルコースおよびフラクトースを主たる炭素源と
して含有する培地に培養し、培養物中に高分子量のヒア
ルロン酸を生成蓄積させ、該培養物からヒアルロン酸を
採取することを特徴とするヒアルロン酸の製造法。 - 【請求項２】 培養液中に生成蓄積した高分子量のヒア
ルロン酸が極限粘度法による平均分子量が３００万以上
のヒアルロン酸である請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11449593A JPH06319579A (ja) | 1993-05-17 | 1993-05-17 | ヒアルロン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11449593A JPH06319579A (ja) | 1993-05-17 | 1993-05-17 | ヒアルロン酸の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06319579A true JPH06319579A (ja) | 1994-11-22 |
Family
ID=14639194
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11449593A Pending JPH06319579A (ja) | 1993-05-17 | 1993-05-17 | ヒアルロン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06319579A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2216412A2 (en) | 2006-07-06 | 2010-08-11 | Reliance Life Sciences Pvt., Ltd. | Process for production and purification of high molecular weight hyaluronic acid |
| US8003851B2 (en) | 2005-08-25 | 2011-08-23 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Plant producing hyaluronic acid |
-
1993
- 1993-05-17 JP JP11449593A patent/JPH06319579A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8003851B2 (en) | 2005-08-25 | 2011-08-23 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Plant producing hyaluronic acid |
| EP2216412A2 (en) | 2006-07-06 | 2010-08-11 | Reliance Life Sciences Pvt., Ltd. | Process for production and purification of high molecular weight hyaluronic acid |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20030624 |