JPH0439998B2

JPH0439998B2 -

Info

Publication number: JPH0439998B2
Application number: JP5488089A
Authority: JP
Inventors: Masamichi Hashimoto; Susumu Chiba; Haruhisa Saegusa; Hiroyuki Kitagawa; Teruzo Myoshi
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 1989-03-09
Filing date: 1989-03-09
Publication date: 1992-07-01
Also published as: JPH02234689A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は、醗酵法によるヒアルロン酸の製造法
に関する。さらに詳しくは、栄養要求性が部分的
に解除されたストレプトコツカス・エキを培養
し、ヒアルロン酸を生成蓄積せしめることを特徴
とするヒアルロン酸の製造法に関する。〔従来の技術〕従来ヒアルロン酸はニワトリのトサカ、牛の眼
の硝子体又は臍帯等より抽出によつて得られてい
た。しかしながら抽出法によるヒアルロン酸製造
は、分離精製が非常に繁雑等の課題を有してい
た。その課題を改良するために、ヒアルロン酸を生
産する能力を有する微生物を培養し、その培養液
から直接ヒアルロン酸を採取する方法が提案され
てきたが収量のバラツキがあり、生産性が不安定
であつた。本発明者らも先にヒアルロン酸生産を工業的に
実施すべく種々研究を行つた結果、栄養要求性が
部分的に解除されたストレプトコツカス・エキの
変異株FM・100が親株よりも高収量で、しかも
収量のバラツキが少なく安定的にヒアルロン酸を
生成することを見い出した（特開昭63−123392号
公報）。〔発明が解決しようとする課題〕しかしストレプトコツカス・エキの変異株
FM・100を用いてヒアルロン酸生産を行うに際
し、長期間にわたつて何回も培養を行なう場合、
あるいは、培養液の一部を残し、そこに新たな培
地を添加し培養を継続する半連続培養を行なう場
合、ヒアルロン酸の収量が徐々に低下し、バラツ
キも大きく、安定なヒアルロン酸の製造を行うこ
とが困難であつた。〔課題を解決するための手段〕本発明者らは、かかる課題を解決すべく、種々
研究を行なつた結果、ストレプトコツカスエキの
変異株FM・100から、更に栄養要求性が解除さ
れた株として誘導された変異株FM・300（微工研
条寄第2319号）がヒアルロン酸の生産安定性の面
で大きく改善されていることを見い出し、本発明
を完成するに至つた。すなわち本発明は、ストレプトコツカス・エキ
（Streptococcus equi）の変異株FM・300（微工
研条寄第2319号）を培養し、ヒアルロン酸を生成
蓄積せしめることを特徴とする該ヒアルロン酸の
製造方法である。以下、本発明について具体的に説明する。本発明の栄養要求性が部分的に解除されたスト
レプトコツカス・エキFM・300（微工研条寄第
2319号）は、ヒアルロン酸生成能を有するストレ
プトコツカス・エキFM・100の突然変異株の中
から取得することが出来る。例えば、ストレプトコツカス・エキFM・100
を用い、ポリペプトン1.5％、酵母エキス0.5％、
グリコース２％の培地にて、33℃で培養し、対数
増殖期の菌を、低温で遠心分離により集菌し、生
理食塩水を用いて、無菌的に３回洗浄する。Ｎ−
メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
50μg／mlを含むPH5.0、0.05Mリン酸緩衝液中、
30℃で１時間振盪したのち、氷冷する。ついで、
生理食塩水を用いて、低温で菌体を３回洗浄した
後、ポリペプトン1.5％、酵母エキス0.5％、グル
コース２％の培地で、33℃、３時間培養し、また
生理食塩水を用いて、低温で菌体を３回洗浄す
る。表１に示す人工合成培地で、33℃、７日間液
体培養し、増殖してきた培養液をさらに、新しい
同じ人工合成培地にうえつぎ、この操作を３回く
りかえす。次に寒天を含む同じ組成の培地上に塗布し、コ
ロニーを分離し、ストレプトコツカス・エキ
FM300を得る。本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所
に、微工研条寄第2319号として受託されている。
ストレプトコツカスFM・300はストレプトコツ
カス・エキFM・100から更にスレオニン及びフ
エニルアラニンの栄養要求性が解除され、ストレ
プトコツカス・エキFM・100が生育できない表
１に示す培地成分だけからなる人工合成培地によ
く生育することができる。

〔実施例〕

次に実施例により、本発明を詳しく説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。実施例１グルコース２％、リン酸第１カリウム0.2％、
硫酸マグネシウム７水塩0.05％、チオ硫酸ソーダ
0.1％、ポリペプトン1.0％酵母エキス0.5％からな
るPH8.5の培地 1lに同一培地からなるストレプ
トコツカス・エキFM・300の前培養液10mlを接
触し、通気量1.5vvm（volume volume minute）、
攪拌200回転／分、温度33℃でカ性ソーダでPHを
8.5にコントロールしながら培養し、15時間後に、
グルコース２％を分添し、グルコースが全部消費
された時点で培養液900mlを抜き出した。さらに
グルコース２％、リン酸第１カリウム0.2％、硫
酸マグネシウム７水塩0.05％、チオ硫酸ソーダ
0.1％、ポリペプトン1.0％酵母エキス0.5％からな
るpH8.5の培地900mlを添加し、通気量1.5vvm、
攪拌200回転／分、温度33℃でカ性ソーダでPHを
8.5にコントロールしながら培養し、５時間後に、
グルコース２％を分添し、グルコースが全部消費
された時点で培養液900mlを抜き出した。上記の半連続操作をあと４回くりかえし、計６
バツチ行つた結果を表２に示す。培養液は塩酸でPH４に調整後、蒸留水で２倍希
釈し、遠心分離により除菌した。得られた除菌液
をエチルアルコールを加え、ヒアルロン酸ソーダ
を析出せしめる。これをろ別した後、水に溶解
し、セチルピリジニウムクロライドを加え、生じ
た沈殿をろ取し、２％食塩水に再溶解後、再びエ
チルアルコールによる析出をくり返す。得られた
ヒアルロン酸ソーダを室温で減圧乾燥して、白色
のヒアルロン酸ソーダを得た。得られたヒアルロン酸ソーダは、赤外線吸収ス
ペクトル、Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル、ストレ
プトミセスのヒアルロニダーゼによる分解実験で
ヒアルロン酸ソーダであることが確認された。

【表】比較例１ストレプトコツカス・エキFM・100を実施例
１と同様にして６回半連続培養したが、得られた
ヒアルロン酸ソーダはそれぞれ、7.1g，5.0g，
4.5g，4.0g，2.5g，2.0gであり収量は実施例１に
比較して、低く、またばらついていた。実施例２グルコース２％、リン酸第１カリウム0.2％、
硫酸マグネシウム７水塩0.05％、チオ硫酸ソーダ
0.1％、ポリペプトン1.0％酵母エキス0.5％からな
るpH8.5の培地 1lに同一培地からなるストレプ
トコツカス・エキFM・300の前培養液10mlを接
触し、通気量1.5vvm、攪拌200回転／分、温度33
℃でカ性ソーダでPHを8.5にコントロールしなが
ら培養し、15時間後に、グルコース２％を分添
し、グルコースが全部消費された時点で培養を停
止した。培養液を塩酸でPH４に調整後、蒸留水で２倍希
釈し、遠心分離により除菌した。得られた除菌液
をエチルアルコールを加え、ヒアルロン酸ソーダ
を析出せしめる。これをろ別した後、水に溶解
し、セチルピリジニウムクロライドを加え、生じ
た沈殿をろ取し、２％食塩水に再溶解後、再びエ
チルアルコールによる析出をくり返す。得られた
ヒアルロン酸ソーダを室温で減圧乾燥して、培養
液1lあたり7.7gの白色ヒアルロン酸ソーダを得
た。得られたヒアルロン酸ソーダは、赤外線吸収ス
ペクトル、Ｃ−13核磁気共鳴スペクトル、ストレ
プトミセスのヒアルロニダーゼによる分解実験で
ヒアルロン酸ソーダであることが確認された。上記と同様の培養を14回くりかえし、全部で15
バツチ行なつた結果を表３に示す。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ヒアルロン酸生産のために数
多く繰り返し培養を行つたり、半連続培養を行つ
ても、ヒアルロン酸を高収率で、しかも収量にほ
とんどばらつきなく、安定に生産することができ
る。また菌株管理も容易である。本発明によつて製造されたヒアルロン酸は、化
粧品、医療品に配合して使用できる。

Claims

【特許請求の範囲】

１ストレプトコツカス・エキ
（Streptococcusequi）の変異株FM・300（微工研
条寄第2319号）を培養し、ヒアルロン酸を生成蓄
積せしめることを特徴とする該ヒアルロン酸の製
造方法。