JPH06319584A - 抗ｍ−ｃｓｆモノクロ−ナル抗体と、この抗体を産生 するハイブリド−マ - Google Patents
抗ｍ−ｃｓｆモノクロ−ナル抗体と、この抗体を産生 するハイブリド−マInfo
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- JPH06319584A JPH06319584A JP5106731A JP10673193A JPH06319584A JP H06319584 A JPH06319584 A JP H06319584A JP 5106731 A JP5106731 A JP 5106731A JP 10673193 A JP10673193 A JP 10673193A JP H06319584 A JPH06319584 A JP H06319584A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 マウスＭ−ＣＳＦとヒトＭ−ＣＳＦの共通構
造を認識する抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体と、この
抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド
−マ。 【効果】 マウスＭ−ＣＳＦとヒトＭ−ＣＳＦをを同一
の抗体で認識することが可能となり、たとえばＭ−ＣＳ
Ｆについての各種免疫学的試験等を行なう場合に、予め
動物実験をマウスで実施し、直ちにその結果をヒトに応
用することができる。
造を認識する抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体と、この
抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド
−マ。 【効果】 マウスＭ−ＣＳＦとヒトＭ−ＣＳＦをを同一
の抗体で認識することが可能となり、たとえばＭ−ＣＳ
Ｆについての各種免疫学的試験等を行なう場合に、予め
動物実験をマウスで実施し、直ちにその結果をヒトに応
用することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、マウスおよびヒトの
マクロファージ・コロニー刺激因子（Macrophage Colon
y Stimulatiing Factor.以下Ｍ−ＣＳＦと記載する）を
共に認識する抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体と、この
抗体を産生するハイブリド−マに関するものである。
マクロファージ・コロニー刺激因子（Macrophage Colon
y Stimulatiing Factor.以下Ｍ−ＣＳＦと記載する）を
共に認識する抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体と、この
抗体を産生するハイブリド−マに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】Ｍ−ＣＳＦは、従来より、白血球機能の
促進により感染症の予防および治療に有効であること
［ジャ−ナル・オブ・イムノロジ−（Journal of Immun
ology)、第１３１巻、第２９８３ペ−ジ、１９８３年。
ジャ−ナル・オブ・イムノロジ−（Journal of Immunol
ogy)、第１２２巻、第１１３４ペ−ジ、１９７９年。ジ
ャ−ナル・オブ・イムノロジ−（Journal of Immunolog
y)、第１３０巻、第７９５ペ−ジ、１９８３年] および
その分化誘導活性から骨髄性白血病の治癒に効果がある
こと［インタ−ナショナル・ジャ−ナル・オブ・キャン
サ−（International Journal of Cancer)、第３０巻、
第７７３ペ−ジ、１９８２年] 等が主に知られていた
が、この他にも、近年その多彩な役割が明らかになって
きている。例えば、妊娠中の胎盤の維持等にＭ−ＣＳＦ
が重要な役割を果たしていること［ネイチャ−（Natur
e）、第３３０巻、第４８４ペ−ジ、１９８７年。ジャ
−ナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Jour
nal of Experimental Medicine) 、第１６４巻、第９５
６ペ−ジ、１９８６年。バイオケミカ・アンド・バイオ
フィジカ・リサ−チ・コミュニケ−ション（Biochemica
and Biophysica ResearchCommunication)、第１７８
巻、第１０９９ペ−ジ、１９９１年] や、血管中のコレ
ステロ−ル代謝に重要な役割を果していること（特開平
２−２５８７２８）、あるいは破骨細胞への影響におい
てその骨吸収に大きく関与していること［ネイチャ−
（Nature）、第３４５巻、第４４２ペ−ジ、１９９０
年。ジャ−ナル・オブ・ボ−ン・アンド・ミネラル・リ
サ−チ（Journal of Bone and Mineral Research）、第
５巻（別冊２、要約）、第５３４ペ−ジ、１９９０年］
等が明らかになっている。
促進により感染症の予防および治療に有効であること
［ジャ−ナル・オブ・イムノロジ−（Journal of Immun
ology)、第１３１巻、第２９８３ペ−ジ、１９８３年。
ジャ−ナル・オブ・イムノロジ−（Journal of Immunol
ogy)、第１２２巻、第１１３４ペ−ジ、１９７９年。ジ
ャ−ナル・オブ・イムノロジ−（Journal of Immunolog
y)、第１３０巻、第７９５ペ−ジ、１９８３年] および
その分化誘導活性から骨髄性白血病の治癒に効果がある
こと［インタ−ナショナル・ジャ−ナル・オブ・キャン
サ−（International Journal of Cancer)、第３０巻、
第７７３ペ−ジ、１９８２年] 等が主に知られていた
が、この他にも、近年その多彩な役割が明らかになって
きている。例えば、妊娠中の胎盤の維持等にＭ−ＣＳＦ
が重要な役割を果たしていること［ネイチャ−（Natur
e）、第３３０巻、第４８４ペ−ジ、１９８７年。ジャ
−ナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（Jour
nal of Experimental Medicine) 、第１６４巻、第９５
６ペ−ジ、１９８６年。バイオケミカ・アンド・バイオ
フィジカ・リサ−チ・コミュニケ−ション（Biochemica
and Biophysica ResearchCommunication)、第１７８
巻、第１０９９ペ−ジ、１９９１年] や、血管中のコレ
ステロ−ル代謝に重要な役割を果していること（特開平
２−２５８７２８）、あるいは破骨細胞への影響におい
てその骨吸収に大きく関与していること［ネイチャ−
（Nature）、第３４５巻、第４４２ペ−ジ、１９９０
年。ジャ−ナル・オブ・ボ−ン・アンド・ミネラル・リ
サ−チ（Journal of Bone and Mineral Research）、第
５巻（別冊２、要約）、第５３４ペ−ジ、１９９０年］
等が明らかになっている。
【０００３】このように、Ｍ−ＳＣＦは個体内のほぼ全
領域において種々の重要な役割を果たしている因子であ
るが、また一方で、マウスおよびヒトのＭ−ＣＳＦ分子
をコ−ドしているＤＮＡの比較からは、両者の相同性が
アミノ酸で７８％、核酸では８０％にも及ぶことが明ら
かになっており［プロシ−ディング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proceedings of
the National Academy of Science of the United St
ates of America)、第８４巻、第１１５７ペ−ジ、１９
８７年］、Ｍ−ＳＣＦは進化の過程で種間を越えて保存
されている分子であると考えられている
領域において種々の重要な役割を果たしている因子であ
るが、また一方で、マウスおよびヒトのＭ−ＣＳＦ分子
をコ−ドしているＤＮＡの比較からは、両者の相同性が
アミノ酸で７８％、核酸では８０％にも及ぶことが明ら
かになっており［プロシ−ディング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proceedings of
the National Academy of Science of the United St
ates of America)、第８４巻、第１１５７ペ−ジ、１９
８７年］、Ｍ−ＳＣＦは進化の過程で種間を越えて保存
されている分子であると考えられている
【０００４】。
【発明が解決しようとする課題】上記のとおり、Ｍ−Ｃ
ＳＦは種間を超えて個体の維持に重要な役割を果す分子
であることが知られているが、その構造や生理活性の中
心的部位等については未だ十分に解明されていない。こ
のようなＭ−ＣＳＦ分子の解析に当っては、それが進化
の過程で種を超えて保存されてきたという事実から、異
種のＭ−ＣＳＦを共に認識するモノクローナル抗体を利
用し、共通の抗原結合部位を解析するこによって、Ｍ−
ＣＳＦ分子の活性構造を明らかにすることができるもの
と期待される。
ＳＦは種間を超えて個体の維持に重要な役割を果す分子
であることが知られているが、その構造や生理活性の中
心的部位等については未だ十分に解明されていない。こ
のようなＭ−ＣＳＦ分子の解析に当っては、それが進化
の過程で種を超えて保存されてきたという事実から、異
種のＭ−ＣＳＦを共に認識するモノクローナル抗体を利
用し、共通の抗原結合部位を解析するこによって、Ｍ−
ＣＳＦ分子の活性構造を明らかにすることができるもの
と期待される。
【０００５】また、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を用いて免疫学的
各種試験を行う場合にも、異種のＭ−ＣＳＦを共に認識
するモノクローナル抗体を利用することができれば、抗
体の効果を予め動物実験し、その結果を直接ヒトに応用
することが可能となる。このような理由から、異種のＭ
−ＣＳＦを共に認識するモノクローナル抗体へ関心は高
く、特にマウスとヒトのＭ−ＣＳＦは、上記のとおり一
次構造レベルでの相同性が高く、しかもそれぞれのＭ−
ＣＳＦがいずれもマウスＭ−ＣＳＦレセプターに結合す
る［ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー(Journal
of CellPhysiology) 、第１０４巻、第３５９ページ、
１９８０年］ことから、抗マウス／ヒトＭ−ＣＳＦモノ
クローナル抗体の可能性が検討されてきた。
各種試験を行う場合にも、異種のＭ−ＣＳＦを共に認識
するモノクローナル抗体を利用することができれば、抗
体の効果を予め動物実験し、その結果を直接ヒトに応用
することが可能となる。このような理由から、異種のＭ
−ＣＳＦを共に認識するモノクローナル抗体へ関心は高
く、特にマウスとヒトのＭ−ＣＳＦは、上記のとおり一
次構造レベルでの相同性が高く、しかもそれぞれのＭ−
ＣＳＦがいずれもマウスＭ−ＣＳＦレセプターに結合す
る［ジャーナル・オブ・セル・フィジオロジー(Journal
of CellPhysiology) 、第１０４巻、第３５９ページ、
１９８０年］ことから、抗マウス／ヒトＭ−ＣＳＦモノ
クローナル抗体の可能性が検討されてきた。
【０００６】しかしながら、従来報告された抗マウスＭ
−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体は、ヒトのＭ−ＣＳＦを認
識できないことが明らかにされ［ジャ−ナル・オブ・イ
ムノロジ−（Journal of Immunology)、第１４１巻、第
４８３ペ−ジ、１９８８年]、その後も、抗マウスＭ−
ＣＳＦモノクロ−ナル抗体が、ヒトＭ−ＣＳＦを認識し
たという報告はない。このため、アミノ酸や核酸の配列
レベルでは相同する部分の多いマウスおよびヒトＭ−Ｃ
ＳＦは、立体構造としてはやや異なる構造を有している
ものと推定され、それらを共に認識するモノクローナル
抗体の実現は困難であるとみなされてきた。
−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体は、ヒトのＭ−ＣＳＦを認
識できないことが明らかにされ［ジャ−ナル・オブ・イ
ムノロジ−（Journal of Immunology)、第１４１巻、第
４８３ペ−ジ、１９８８年]、その後も、抗マウスＭ−
ＣＳＦモノクロ−ナル抗体が、ヒトＭ−ＣＳＦを認識し
たという報告はない。このため、アミノ酸や核酸の配列
レベルでは相同する部分の多いマウスおよびヒトＭ−Ｃ
ＳＦは、立体構造としてはやや異なる構造を有している
ものと推定され、それらを共に認識するモノクローナル
抗体の実現は困難であるとみなされてきた。
【０００７】この発明は、以上のとおりの事情に鑑みて
なされたものであり、これまで存在しなかったマウスと
ヒトのＭ−ＣＳＦを共に認識する新しいモノクローナル
抗体と、この抗体を産生するハイブリドーマを提供する
ことを目的としている。
なされたものであり、これまで存在しなかったマウスと
ヒトのＭ−ＣＳＦを共に認識する新しいモノクローナル
抗体と、この抗体を産生するハイブリドーマを提供する
ことを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、マウスＭ−ＣＳＦとヒトＭ−Ｃ
ＳＦの共通構造を認識する抗Ｍ−ＣＳＦモノクローナル
抗体を提供する。またこの発明は、上記の抗Ｍ−ＣＳＦ
モノローナル抗体を産生するハイブリドーマをも提供す
る。
を解決するものとして、マウスＭ−ＣＳＦとヒトＭ−Ｃ
ＳＦの共通構造を認識する抗Ｍ−ＣＳＦモノクローナル
抗体を提供する。またこの発明は、上記の抗Ｍ−ＣＳＦ
モノローナル抗体を産生するハイブリドーマをも提供す
る。
【０００９】すなわち、この発明の発明者らは、上記の
課題について検討した結果、マウスおよびヒトＭ−ＣＳ
Ｆが共にマウスＭ−ＣＳＦレセプターに高い親和性を有
することに着目し、抗マウスＭ−ＣＳＦ抗体ではヒトＭ
−ＣＳＦを認識できなくとも、抗ヒトＭ−ＣＳＦ抗体で
はマウスＭ−ＣＳＦを認識できる可能性があるとの仮説
のもとに鋭意研究を重ね、この発明を完成させた。
課題について検討した結果、マウスおよびヒトＭ−ＣＳ
Ｆが共にマウスＭ−ＣＳＦレセプターに高い親和性を有
することに着目し、抗マウスＭ−ＣＳＦ抗体ではヒトＭ
−ＣＳＦを認識できなくとも、抗ヒトＭ−ＣＳＦ抗体で
はマウスＭ−ＣＳＦを認識できる可能性があるとの仮説
のもとに鋭意研究を重ね、この発明を完成させた。
【００１０】以下、この発明の構成について詳しく説明
する。 （１）ハイブリド−マの作出 この発明のモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−
マの作出方法は、公知の方法［ネイチャ−（Nature）、
第２５６巻、第４９５ペ−ジ、１９７５年] に従って、
たとえば次のとおりに行なうことができる。 １）動物の感作 ヒトＭ−ＣＳＦを抗原として使用し、これを完全フロイ
ンドまたは不完全フロインドのアジュバントと混和し、
１週間から数か月の間隔でラットまたはマウス等に１〜
４回程度注射し、動物を感作する。 ２）細胞融合 免疫された動物から摘出した脾臓細胞またはリンパ球Ｂ
細胞と骨髄腫細胞とを常法により融合させ、融合細胞を
得る。骨髄腫細胞としては公知のヒポキサンチン−グア
ニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ(Hypoxanth
ine-Guanine Phosphoribosyl Transferase. 以下ＨＧＰ
ＲＴと記載することがある）欠損マウスや、ラット骨髄
腫細胞等を用いることができる。細胞融合を行う方法は
いくつか知られているが、例えばポリエチレングリコ−
ル（以下ＰＥＧと記載することがある）を使用する方
法、電気融合による方法等を用いることができる。この
発明においては、これらいずれの方法でも融合細胞を得
ることができる。 ３）融合細胞の選択 前記の方法により得た融合細胞を適当な選択培地中で、
通常２〜４日毎に新鮮な培地と交換しながら、目的とす
る特異抗体産生細胞を選別する。例えばＨＧＰＲＴ欠損
骨髄腫細胞と融合されている細胞の場合には、選択培地
としてヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン培地
（ＨＡＴ培地）、ヒポキサンチン・アザセリン培地（Ｈ
Ａｚ培地）等を使用することができる。選別は、固相ま
たは液相放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結
合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等の公知の方法により行な
うことができる。 ４）クロ−ニング 前記で選別した特異抗体産生細胞を、一つのクロ−ンか
ら由来した均一な細胞集団とするため、公知の限外希釈
法等を用いて、クロ−ニング操作を行い、抗Ｍ−ＣＳＦ
モノクロ−ナル抗体を安定に産生する細胞株、いわゆる
ハイブリド−マを得る。
する。 （１）ハイブリド−マの作出 この発明のモノクロ−ナル抗体を産生するハイブリド−
マの作出方法は、公知の方法［ネイチャ−（Nature）、
第２５６巻、第４９５ペ−ジ、１９７５年] に従って、
たとえば次のとおりに行なうことができる。 １）動物の感作 ヒトＭ−ＣＳＦを抗原として使用し、これを完全フロイ
ンドまたは不完全フロインドのアジュバントと混和し、
１週間から数か月の間隔でラットまたはマウス等に１〜
４回程度注射し、動物を感作する。 ２）細胞融合 免疫された動物から摘出した脾臓細胞またはリンパ球Ｂ
細胞と骨髄腫細胞とを常法により融合させ、融合細胞を
得る。骨髄腫細胞としては公知のヒポキサンチン−グア
ニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ(Hypoxanth
ine-Guanine Phosphoribosyl Transferase. 以下ＨＧＰ
ＲＴと記載することがある）欠損マウスや、ラット骨髄
腫細胞等を用いることができる。細胞融合を行う方法は
いくつか知られているが、例えばポリエチレングリコ−
ル（以下ＰＥＧと記載することがある）を使用する方
法、電気融合による方法等を用いることができる。この
発明においては、これらいずれの方法でも融合細胞を得
ることができる。 ３）融合細胞の選択 前記の方法により得た融合細胞を適当な選択培地中で、
通常２〜４日毎に新鮮な培地と交換しながら、目的とす
る特異抗体産生細胞を選別する。例えばＨＧＰＲＴ欠損
骨髄腫細胞と融合されている細胞の場合には、選択培地
としてヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン培地
（ＨＡＴ培地）、ヒポキサンチン・アザセリン培地（Ｈ
Ａｚ培地）等を使用することができる。選別は、固相ま
たは液相放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結
合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等の公知の方法により行な
うことができる。 ４）クロ−ニング 前記で選別した特異抗体産生細胞を、一つのクロ−ンか
ら由来した均一な細胞集団とするため、公知の限外希釈
法等を用いて、クロ−ニング操作を行い、抗Ｍ−ＣＳＦ
モノクロ−ナル抗体を安定に産生する細胞株、いわゆる
ハイブリド−マを得る。
【００１１】以上のようにして得られたハイブリド−マ
は、マウスＭ−ＣＳＦとヒトＭ−ＣＳＦの共通構造を認
識する抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を産生するとい
う機能的特徴を有している。その代表的な例として、ラ
ットの脾臓細胞とラットの骨髄腫細胞とを融合して得た
ハイブリド−マを、ハイブリド−マＭＯ９３０２と命名
し、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託し、ＦＥＲＭ Ｐ−１３６１８なる受託番号を得た。
は、マウスＭ−ＣＳＦとヒトＭ−ＣＳＦの共通構造を認
識する抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を産生するとい
う機能的特徴を有している。その代表的な例として、ラ
ットの脾臓細胞とラットの骨髄腫細胞とを融合して得た
ハイブリド−マを、ハイブリド−マＭＯ９３０２と命名
し、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託し、ＦＥＲＭ Ｐ−１３６１８なる受託番号を得た。
【００１２】このハイブリド−マＭＯ９３０２は、次の
性質を有している。 ａ）由 来：ラット脾臓細胞（Ｌｏｕラット：実験
動物中央研究所から入手）とラット骨髄腫細胞（Ｙ３Ａ
ｇ１．２．３）［ネイチャ−（Nature）、第２７７巻、
第１３１ペ−ジ、１９７９年] との融合細胞であるハイ
ブリド−マ ｂ）形 態：非紡錘形であり、ほぼ球形を呈する ｃ）継代培養 ：可能 ｄ）機能的特徴：マウスＭ−ＣＳＦとヒトＭ−ＣＳＦの
共通構造を認識する抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を
産生する ｅ）細胞増殖性：付着および浮遊の双方において良好 ｆ）保存条件 ：１０％（重量）ＤＭＳＯ，９０％（重
量）ＦＣＳ中で−８０℃以下で保存する ｇ）血清要求性：通常１０％（重量）ＦＳＣ添加培地で
培養する （２）抗体の取得 この発明の抗体は、前記ハイブリド−マを組織培養フラ
スコで無血清培地、血清を含む通常の動物細胞用培地等
で培養した培養上清から、または２，６，１０，１４−
テトラメチルペンタデカン（プリスタン）を予め投与し
たマウス等の動物にこのハイブリドーマを接種し、生体
内培養することによって得られた生体滲出液から公知の
方法により精製される。すなわち得られた培養上清また
は生体滲出液を通常の蛋白精製に用いられる生化学的手
法、たとえば硫酸アンモニウムによる塩沈法、カラムク
ロマトグラフィ−等により精製することができる。
性質を有している。 ａ）由 来：ラット脾臓細胞（Ｌｏｕラット：実験
動物中央研究所から入手）とラット骨髄腫細胞（Ｙ３Ａ
ｇ１．２．３）［ネイチャ−（Nature）、第２７７巻、
第１３１ペ−ジ、１９７９年] との融合細胞であるハイ
ブリド−マ ｂ）形 態：非紡錘形であり、ほぼ球形を呈する ｃ）継代培養 ：可能 ｄ）機能的特徴：マウスＭ−ＣＳＦとヒトＭ−ＣＳＦの
共通構造を認識する抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を
産生する ｅ）細胞増殖性：付着および浮遊の双方において良好 ｆ）保存条件 ：１０％（重量）ＤＭＳＯ，９０％（重
量）ＦＣＳ中で−８０℃以下で保存する ｇ）血清要求性：通常１０％（重量）ＦＳＣ添加培地で
培養する （２）抗体の取得 この発明の抗体は、前記ハイブリド−マを組織培養フラ
スコで無血清培地、血清を含む通常の動物細胞用培地等
で培養した培養上清から、または２，６，１０，１４−
テトラメチルペンタデカン（プリスタン）を予め投与し
たマウス等の動物にこのハイブリドーマを接種し、生体
内培養することによって得られた生体滲出液から公知の
方法により精製される。すなわち得られた培養上清また
は生体滲出液を通常の蛋白精製に用いられる生化学的手
法、たとえば硫酸アンモニウムによる塩沈法、カラムク
ロマトグラフィ−等により精製することができる。
【００１３】この発明の抗体は、このようにして得られ
たいくつかのモノクロ−ナル抗体のうち、ＥＬＩＳＡ法
を用いてマウスＭ−ＣＳＦおよびヒトＭ−ＣＳＦに共通
して反応することが確認されたラット由来の抗体である
ことを特徴としている。以上のようにして得られたこの
発明のモノクロ−ナル抗体は、次に示す理化学的性質を
有している。 ラット由来のγ−グロブリンのＩｇＧに属する ＩｇＧのＩｇＧ1 サブクラスに属する Ｌ鎖としてκ鎖を有する この発明のモノクロ−ナル抗体は、免疫学的各種実験、
例えば抗原抗体反応を利用したＭ−ＣＳＦの定量法、免
疫組織染色、ウエスタン・ブロッティング等に使用する
ことができるが、特にこれらに限定されるものではな
い。
たいくつかのモノクロ−ナル抗体のうち、ＥＬＩＳＡ法
を用いてマウスＭ−ＣＳＦおよびヒトＭ−ＣＳＦに共通
して反応することが確認されたラット由来の抗体である
ことを特徴としている。以上のようにして得られたこの
発明のモノクロ−ナル抗体は、次に示す理化学的性質を
有している。 ラット由来のγ−グロブリンのＩｇＧに属する ＩｇＧのＩｇＧ1 サブクラスに属する Ｌ鎖としてκ鎖を有する この発明のモノクロ−ナル抗体は、免疫学的各種実験、
例えば抗原抗体反応を利用したＭ−ＣＳＦの定量法、免
疫組織染色、ウエスタン・ブロッティング等に使用する
ことができるが、特にこれらに限定されるものではな
い。
【００１４】次に試験例を示してこの発明の作用効果を
実証する。 試験例１ この試験は、この発明のハイブリド−マが産生する抗体
のヒトＭ−ＣＳＦとの反応性を調べるために行った。実
施例２と同一の方法により製造したこの発明の抗体を１
μｇ／ｍｌの濃度でＥＬＩＳＡ用プラスチックプレ−ト
（ヌンク社製）に吸着させ、非特異反応を防止するため
のブロッキング操作を行った。次に、特開昭６４−２２
８９９号公報の実施例１記載の方法により人尿から調製
したヒトＭ−ＣＳＦを、７．８〜１２５Ｕ／ｍｌの濃度
で前記プラスチックプレ−トに添加し、３７℃で２時間
抗原抗体反応を行わせた。のち抗ヒトＭ−ＣＳＦポリク
ロ−ナル抗体を３７℃、１時間反応させ、さらにホ−ス
ラディッシュペルオキシダ−ゼ（ＨＲＰ）結合抗ラビッ
トＩｇＧ（ジャクソン社製）を反応させた。ＨＲＰに対
応する基質として、３，３´，５，５´−テトラメチル
ベンチジン（以下ＴＭＢと記載することがある）を用
い、室温で３０分反応させ、１Ｍリン酸を用いて反応を
停止し、プレ−トリ−ダ−（バイオ・ラッド社製）を用
いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
実証する。 試験例１ この試験は、この発明のハイブリド−マが産生する抗体
のヒトＭ−ＣＳＦとの反応性を調べるために行った。実
施例２と同一の方法により製造したこの発明の抗体を１
μｇ／ｍｌの濃度でＥＬＩＳＡ用プラスチックプレ−ト
（ヌンク社製）に吸着させ、非特異反応を防止するため
のブロッキング操作を行った。次に、特開昭６４−２２
８９９号公報の実施例１記載の方法により人尿から調製
したヒトＭ−ＣＳＦを、７．８〜１２５Ｕ／ｍｌの濃度
で前記プラスチックプレ−トに添加し、３７℃で２時間
抗原抗体反応を行わせた。のち抗ヒトＭ−ＣＳＦポリク
ロ−ナル抗体を３７℃、１時間反応させ、さらにホ−ス
ラディッシュペルオキシダ−ゼ（ＨＲＰ）結合抗ラビッ
トＩｇＧ（ジャクソン社製）を反応させた。ＨＲＰに対
応する基質として、３，３´，５，５´−テトラメチル
ベンチジン（以下ＴＭＢと記載することがある）を用
い、室温で３０分反応させ、１Ｍリン酸を用いて反応を
停止し、プレ−トリ−ダ−（バイオ・ラッド社製）を用
いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００１５】この試験の結果は、図１に示すとおりであ
る。図１の縦軸および横軸は、それぞれ吸光度および濃
度を示す。図１から明らかなように、この発明のハイブ
リド−マが産生する抗体は、ヒトＭ−ＣＳＦと反応し、
しかも７．８〜１２５Ｕ／ｍｌの濃度範囲において濃度
に比例して吸光度が増加し、良好な直線関係の得られる
ことが認められた。 試験例２ この試験は、この発明のハイブリド−マが産生するモノ
クロ−ナル抗体のマウスＭ−ＣＳＦとの反応性を調べる
ために行った。
る。図１の縦軸および横軸は、それぞれ吸光度および濃
度を示す。図１から明らかなように、この発明のハイブ
リド−マが産生する抗体は、ヒトＭ−ＣＳＦと反応し、
しかも７．８〜１２５Ｕ／ｍｌの濃度範囲において濃度
に比例して吸光度が増加し、良好な直線関係の得られる
ことが認められた。 試験例２ この試験は、この発明のハイブリド−マが産生するモノ
クロ−ナル抗体のマウスＭ−ＣＳＦとの反応性を調べる
ために行った。
【００１６】実施例２と同一の方法により製造したこの
発明の抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度でＥＬＩＳＡ用プラ
スチックプレ−ト（ヌンク社製）に吸着させ、非特異反
応を防止するためのブロッキング操作を行った。次に、
スタンレーの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Journal of Biological Chemistr
y）、第２５２巻、第４３０５ページ、１９７７年］に
より調製したマウスＭ−ＣＳＦを７．８〜５００Ｕ／ｍ
ｌの濃度で前記プラスチックプレ−トに添加し、３７℃
で２時間抗原抗体反応を行わせた。のち、既にマウスＭ
−ＣＳＦと反応することが明かとなっている抗ヒトＭ−
ＣＳＦポリクロ−ナル抗体［バイオキミカ・バイオフィ
ジカ・アクタ（Biochimica Biophysica Acta) 、第１１
３６巻、第２９７ペ−ジ、１９９２年] を、３７℃で１
時間反応させ、さらにホ−スラディッシュペルオキシダ
−ゼ（ＨＲＰ）結合抗ラビットＩｇＧ（ジャクソン社
製）を反応させた。ＨＲＰに対応する基質として、ＴＭ
Ｂを用い、室温で３０分反応させ、１Ｍリン酸を用いて
反応を停止し、プレ−トリ−ダ−（バイオ・ラッド社
製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
発明の抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度でＥＬＩＳＡ用プラ
スチックプレ−ト（ヌンク社製）に吸着させ、非特異反
応を防止するためのブロッキング操作を行った。次に、
スタンレーの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Journal of Biological Chemistr
y）、第２５２巻、第４３０５ページ、１９７７年］に
より調製したマウスＭ−ＣＳＦを７．８〜５００Ｕ／ｍ
ｌの濃度で前記プラスチックプレ−トに添加し、３７℃
で２時間抗原抗体反応を行わせた。のち、既にマウスＭ
−ＣＳＦと反応することが明かとなっている抗ヒトＭ−
ＣＳＦポリクロ−ナル抗体［バイオキミカ・バイオフィ
ジカ・アクタ（Biochimica Biophysica Acta) 、第１１
３６巻、第２９７ペ−ジ、１９９２年] を、３７℃で１
時間反応させ、さらにホ−スラディッシュペルオキシダ
−ゼ（ＨＲＰ）結合抗ラビットＩｇＧ（ジャクソン社
製）を反応させた。ＨＲＰに対応する基質として、ＴＭ
Ｂを用い、室温で３０分反応させ、１Ｍリン酸を用いて
反応を停止し、プレ−トリ−ダ−（バイオ・ラッド社
製）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００１７】この試験の結果は、図２に示すとおりであ
る。図２の縦軸および横軸は、それぞれ吸光度および濃
度を示す。図２から明らかなように、この発明のハイブ
リド−マが産生する抗体は、マウスＭ−ＣＳＦと反応
し、しかも７．８〜５００Ｕ／ｍｌの濃度範囲において
濃度に比例して吸光度が増加し、良好な直線関係の得ら
れることが認められた。
る。図２の縦軸および横軸は、それぞれ吸光度および濃
度を示す。図２から明らかなように、この発明のハイブ
リド−マが産生する抗体は、マウスＭ−ＣＳＦと反応
し、しかも７．８〜５００Ｕ／ｍｌの濃度範囲において
濃度に比例して吸光度が増加し、良好な直線関係の得ら
れることが認められた。
【００１８】次に実施例を示してこの発明をさらに詳述
するが、この発明は以下の実施例に限定されるものでは
ない。
するが、この発明は以下の実施例に限定されるものでは
ない。
【００１９】
実施例１（ハイブリド−マの作出） （１）動物の免疫 生理食塩水で希釈したヒトＭ−ＣＳＦとフロインドの完
全アジュバントとの１：１のエマルジョンを調製し、５
〜８週齢の雌のＬｏｕラット（実験動物中央研究所から
入手）の背部皮下および腹腔に、ラット一匹当たりＭ−
ＣＳＦとして１００〜２００μｇ（エマルジョン量とし
て０. ５〜１. ０ｍｌ）を投与した。追加免疫はフロイ
ンドの不完全アジュバントを用いて２〜３週間毎に行
い、Ｍ−ＣＳＦ投与量は１匹当たり５０〜１００μｇと
した。追加免疫終了１週間目に採血し、血清中の抗体価
をＥＬＩＳＡ法により測定し、抗体価の上昇がプラト−
に達し、さらにＥＬＩＳＡ法での抗体価がコントロ−ル
に比較して数万から数十万倍と十分に高い抗体価が認め
られるまで追加免疫を行った。 （２）細胞融合 高抗体価が認められたラット２匹にＭ−ＣＳＦ溶液を１
匹当たり１００μｇの割合で腹腔内投与し、４日後に脾
臓を摘出した。ラット骨髄腫細胞（Ｙ３Ａｇ１．２．
３）［ネイチャ−（Nature）、第２７７巻、第１３１ペ
−ジ、１９７９年] と前記ラット脾細胞とを細胞数比で
１：５の割合でＰＥＧ１５００を用いて融合した。１０
％（重量）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（大日本製薬社製）
を用いてＰＥＧを洗浄除去し、細胞をＨＡＴ培地（シグ
マ社製）に懸濁し、９６穴プレ−ト（ヌンク社製）に約
１０5 cells ／ウエルずつ分注し、３７℃、７％ＣＯ2
下で７日間培養した。 （３）スクリ−ニングおよびクロ−ニング 前記ハイブリド−マの増殖を終了した各ウエルの培地を
一部採取し、常法により抗体産生活性のスクリ−ニング
を行い、抗原に対して高い力価が認められるウエルにつ
いて限界希釈法によりクロ−ニングを行った。ラット腹
腔滲出細胞をフィ−ダ−細胞として用い、コロニ−形成
ウエルの培養上清の抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定
し、抗体産生の認められたウエルについて、前記と同様
の方法により再度クロ−ニングを行い、さらに前記と同
様の方法により培養し、産生された培養上清に含まれる
抗体の性質をＥＬＩＳＡ法により試験し、マウスＭ−Ｃ
ＳＦにも反応する抗ヒトＭ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体
を産生するハイブリド−マＭＯ９３０２を作出した。 実施例２（モノクロ−ナル抗体の取得） 実施例１で得たハイブリド−マ（ＭＯ９３０２）１×１
０5 を、無血清培地（味の素社製。ＡＳＦ１０４）５０
ｍｌで培養し、得られた培養上清５０ｍｌを市販のＩｇ
Ｇ精製用アフィニティ担体であるprotein G Sepharose
ff（ファルマシア社製）７ｍｌを充填したカラムに流速
２ｍｌで通液して吸着させ、のち担体の５倍量のリン酸
緩衝生理食塩水で洗浄し、０．０２Ｍグリシン塩酸緩衝
液（ｐＨ２．５）で吸着画分を溶出させた。前記一連の
操作を反復し、１，１００ｍｌの培養上清から約６３ｍ
ｇの抗体を得た。
全アジュバントとの１：１のエマルジョンを調製し、５
〜８週齢の雌のＬｏｕラット（実験動物中央研究所から
入手）の背部皮下および腹腔に、ラット一匹当たりＭ−
ＣＳＦとして１００〜２００μｇ（エマルジョン量とし
て０. ５〜１. ０ｍｌ）を投与した。追加免疫はフロイ
ンドの不完全アジュバントを用いて２〜３週間毎に行
い、Ｍ−ＣＳＦ投与量は１匹当たり５０〜１００μｇと
した。追加免疫終了１週間目に採血し、血清中の抗体価
をＥＬＩＳＡ法により測定し、抗体価の上昇がプラト−
に達し、さらにＥＬＩＳＡ法での抗体価がコントロ−ル
に比較して数万から数十万倍と十分に高い抗体価が認め
られるまで追加免疫を行った。 （２）細胞融合 高抗体価が認められたラット２匹にＭ−ＣＳＦ溶液を１
匹当たり１００μｇの割合で腹腔内投与し、４日後に脾
臓を摘出した。ラット骨髄腫細胞（Ｙ３Ａｇ１．２．
３）［ネイチャ−（Nature）、第２７７巻、第１３１ペ
−ジ、１９７９年] と前記ラット脾細胞とを細胞数比で
１：５の割合でＰＥＧ１５００を用いて融合した。１０
％（重量）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（大日本製薬社製）
を用いてＰＥＧを洗浄除去し、細胞をＨＡＴ培地（シグ
マ社製）に懸濁し、９６穴プレ−ト（ヌンク社製）に約
１０5 cells ／ウエルずつ分注し、３７℃、７％ＣＯ2
下で７日間培養した。 （３）スクリ−ニングおよびクロ−ニング 前記ハイブリド−マの増殖を終了した各ウエルの培地を
一部採取し、常法により抗体産生活性のスクリ−ニング
を行い、抗原に対して高い力価が認められるウエルにつ
いて限界希釈法によりクロ−ニングを行った。ラット腹
腔滲出細胞をフィ−ダ−細胞として用い、コロニ−形成
ウエルの培養上清の抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定
し、抗体産生の認められたウエルについて、前記と同様
の方法により再度クロ−ニングを行い、さらに前記と同
様の方法により培養し、産生された培養上清に含まれる
抗体の性質をＥＬＩＳＡ法により試験し、マウスＭ−Ｃ
ＳＦにも反応する抗ヒトＭ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体
を産生するハイブリド−マＭＯ９３０２を作出した。 実施例２（モノクロ−ナル抗体の取得） 実施例１で得たハイブリド−マ（ＭＯ９３０２）１×１
０5 を、無血清培地（味の素社製。ＡＳＦ１０４）５０
ｍｌで培養し、得られた培養上清５０ｍｌを市販のＩｇ
Ｇ精製用アフィニティ担体であるprotein G Sepharose
ff（ファルマシア社製）７ｍｌを充填したカラムに流速
２ｍｌで通液して吸着させ、のち担体の５倍量のリン酸
緩衝生理食塩水で洗浄し、０．０２Ｍグリシン塩酸緩衝
液（ｐＨ２．５）で吸着画分を溶出させた。前記一連の
操作を反復し、１，１００ｍｌの培養上清から約６３ｍ
ｇの抗体を得た。
【００２０】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって以下の効果が奏せられる。 （１）マウスおよびヒトのＭ−ＣＳＦを同一の抗体によ
り認識することが可能となる。 （２）マウスＭ−ＣＳＦとヒトのＭ−ＣＳＦの共通構造
を認識する抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を産生する
ハイブリドーマが提供される。 （３）この発明の抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を用
いて、予め動物実験をマウスで実施し、直ちにその結果
をヒトに応用することができる。
よって以下の効果が奏せられる。 （１）マウスおよびヒトのＭ−ＣＳＦを同一の抗体によ
り認識することが可能となる。 （２）マウスＭ−ＣＳＦとヒトのＭ−ＣＳＦの共通構造
を認識する抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を産生する
ハイブリドーマが提供される。 （３）この発明の抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を用
いて、予め動物実験をマウスで実施し、直ちにその結果
をヒトに応用することができる。
【図１】この発明の抗体とヒトＭ−ＣＳＦとの反応にお
けるヒトＭ−ＣＳＦ濃度と吸光度との関係を示す。
けるヒトＭ−ＣＳＦ濃度と吸光度との関係を示す。
【図２】この発明の抗体とマウスＭ−ＣＳＦとの反応に
おけるマウスＭ−ＣＳＦ濃度と吸光度との関係を示す。
おけるマウスＭ−ＣＳＦ濃度と吸光度との関係を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｕ 9284−4Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/20 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (3)
- 【請求項１】 マウスＭ−ＣＳＦとヒトＭ−ＣＳＦの共
通構造を認識する抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体。 - 【請求項２】 マウスＭ−ＣＳＦとヒトＭ−ＣＳＦの共
通構造を認識する抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を産
生するハイブリド−マ。 - 【請求項３】 ハイブリド−マがＦＥＲＭ Ｐ−１３６
１８である請求項２のハイブリド−マ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5106731A JPH06319584A (ja) | 1993-05-07 | 1993-05-07 | 抗ｍ−ｃｓｆモノクロ−ナル抗体と、この抗体を産生 するハイブリド−マ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5106731A JPH06319584A (ja) | 1993-05-07 | 1993-05-07 | 抗ｍ−ｃｓｆモノクロ−ナル抗体と、この抗体を産生 するハイブリド−マ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06319584A true JPH06319584A (ja) | 1994-11-22 |
Family
ID=14441086
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5106731A Pending JPH06319584A (ja) | 1993-05-07 | 1993-05-07 | 抗ｍ−ｃｓｆモノクロ−ナル抗体と、この抗体を産生 するハイブリド−マ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06319584A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008500806A (ja) * | 2004-01-07 | 2008-01-17 | カイロン コーポレイション | Ｍ−ｃｓｆ特異的モノクローナル抗体およびその使用 |
| US7728113B2 (en) | 2003-09-10 | 2010-06-01 | Amgen Fremont Inc. | Methods of treating arthritic conditions with antibodies to M-CSF |
-
1993
- 1993-05-07 JP JP5106731A patent/JPH06319584A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7728113B2 (en) | 2003-09-10 | 2010-06-01 | Amgen Fremont Inc. | Methods of treating arthritic conditions with antibodies to M-CSF |
| US9718883B2 (en) | 2003-09-10 | 2017-08-01 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies to M-CSF |
| US10280219B2 (en) | 2003-09-10 | 2019-05-07 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies to M-CSF |
| JP2008500806A (ja) * | 2004-01-07 | 2008-01-17 | カイロン コーポレイション | Ｍ−ｃｓｆ特異的モノクローナル抗体およびその使用 |
| US9079956B2 (en) | 2004-01-07 | 2015-07-14 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | M-CSF specific monoclonal antibody and uses thereof |
| US9522186B2 (en) | 2004-01-07 | 2016-12-20 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | M-CSF specific monoclonal antibody and uses therof |
| US9926371B2 (en) | 2004-01-07 | 2018-03-27 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | M-CSF specific monoclonal antibody and uses thereof |
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