JPH06339389A - 新規な大腸菌宿主を利用したタンパク又はポリペプチドの製造方法 - Google Patents
新規な大腸菌宿主を利用したタンパク又はポリペプチドの製造方法Info
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- JPH06339389A JPH06339389A JP31225393A JP31225393A JPH06339389A JP H06339389 A JPH06339389 A JP H06339389A JP 31225393 A JP31225393 A JP 31225393A JP 31225393 A JP31225393 A JP 31225393A JP H06339389 A JPH06339389 A JP H06339389A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 外来性のタンパク又はポリペプチド（以下、
目的タンパクという）を発現し得るベクターで宿主であ
る大腸菌を形質転換し、その形質転換体を培養して目的
タンパクを製造する方法において、目的タンパクを分解
する酵素を欠損した大腸菌を宿主とすることを特徴とす
る方法。 【効果】 上記特定の酵素を欠損している大腸菌を宿主
として使用することにより、菌体内で同じ発現量であり
ながら、目的タンパクを高収率で得ることができる。ま
た、目的タンパクが菌体破砕後も分解されないため、抽
出精製段階の簡素化・効率化を計ることができる。
目的タンパクという）を発現し得るベクターで宿主であ
る大腸菌を形質転換し、その形質転換体を培養して目的
タンパクを製造する方法において、目的タンパクを分解
する酵素を欠損した大腸菌を宿主とすることを特徴とす
る方法。 【効果】 上記特定の酵素を欠損している大腸菌を宿主
として使用することにより、菌体内で同じ発現量であり
ながら、目的タンパクを高収率で得ることができる。ま
た、目的タンパクが菌体破砕後も分解されないため、抽
出精製段階の簡素化・効率化を計ることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、外来性のタンパク又は
ポリペプチド（以下、単にタンパクと略す）を高発現し
うるベクターの宿主として新規な大腸菌を用い、得られ
た形質転換体からタンパクを高収率で得る方法を提供す
る。具体的には、ヒト免疫インターフェロン分解活性を
欠失した新規な大腸菌を用い、この大腸菌を宿主とした
形質転換体からヒト免疫インターフェロン活性をもつタ
ンパクを効率良く得る方法を提供する。
ポリペプチド（以下、単にタンパクと略す）を高発現し
うるベクターの宿主として新規な大腸菌を用い、得られ
た形質転換体からタンパクを高収率で得る方法を提供す
る。具体的には、ヒト免疫インターフェロン分解活性を
欠失した新規な大腸菌を用い、この大腸菌を宿主とした
形質転換体からヒト免疫インターフェロン活性をもつタ
ンパクを効率良く得る方法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】近年、遺伝子工学、とりわけ組換えＤＮ
Ａ技術の急速な進歩に伴ない、それまで、生物体からの
分離・精製に頼っていた多くの生理活性タンパクを微生
物を用いて大量に生産させることが可能となった。これ
により、従来は、その存在が知られるのみであった生理
活性タンパクを医薬品あるいは農薬などの薬剤に使用す
ることも可能となってきた。
Ａ技術の急速な進歩に伴ない、それまで、生物体からの
分離・精製に頼っていた多くの生理活性タンパクを微生
物を用いて大量に生産させることが可能となった。これ
により、従来は、その存在が知られるのみであった生理
活性タンパクを医薬品あるいは農薬などの薬剤に使用す
ることも可能となってきた。
【０００３】又、組換え技術に関しては、これまで、い
かに効率良く目的物質を生産させるかという点に多くの
工夫がなされ、改良技術が提案されてきた。例えば、ベ
クターの改良、新しいホストーベクター系の開発、培地
・培養条件の改良、更に最近では、プロテインエンジニ
アリングを用いたより安定なアミノ酸配列をもつタンパ
クの開発などが行なわれている。
かに効率良く目的物質を生産させるかという点に多くの
工夫がなされ、改良技術が提案されてきた。例えば、ベ
クターの改良、新しいホストーベクター系の開発、培地
・培養条件の改良、更に最近では、プロテインエンジニ
アリングを用いたより安定なアミノ酸配列をもつタンパ
クの開発などが行なわれている。
【０００４】然しながら、高発現される生理活性タンパ
クも、その形質転換体からの抽出・精製段階には、多く
の工程を要しているのが現状である。有用物質を生産す
る形質転換体から該物質を容易に、かつ効率良く抽出・
精製する技術を確立することが、産業上有用であること
は言をまたない。
クも、その形質転換体からの抽出・精製段階には、多く
の工程を要しているのが現状である。有用物質を生産す
る形質転換体から該物質を容易に、かつ効率良く抽出・
精製する技術を確立することが、産業上有用であること
は言をまたない。
【０００５】組換え微生物（形質転換体）が生産する目
的タンパクを抽出・精製するにおいては、通常まず培養
微生物を殺菌剤を用いて死菌とした後（抽出工程を完全
に密閉して行なうことができる場合、この工程は除かれ
ることもある）、菌体を破砕し、その破砕懸濁液を遠心
分離して、その上清又は沈渣のいずれかを精製過程に付
すという形式で行なわれている。しかし、一般に、該上
清または沈渣からの抽出液はプロテアーゼ活性が強いた
め、目的タンパクが分解されることが多い。
的タンパクを抽出・精製するにおいては、通常まず培養
微生物を殺菌剤を用いて死菌とした後（抽出工程を完全
に密閉して行なうことができる場合、この工程は除かれ
ることもある）、菌体を破砕し、その破砕懸濁液を遠心
分離して、その上清又は沈渣のいずれかを精製過程に付
すという形式で行なわれている。しかし、一般に、該上
清または沈渣からの抽出液はプロテアーゼ活性が強いた
め、目的タンパクが分解されることが多い。
【０００６】例えば、ヒト免疫インターフェロン（以
下、ｈＩＦＮ−γと略す）を大腸菌を用いて生産する場
合、菌体により生産されたｈＩＦＮ−γを抽出する際、
菌体を破砕すると、本来目的としている１４６アミノ酸
より成るペプチドのＣ末端側が切断された１３１アミノ
酸より成るペプチドが多く得られる。このＣ末端側の切
断を抑え、１４６アミノ酸よりなるペプチドとして得る
ためにこれまで、プロテアーゼインヒビターを添加して
分解を抑える（米国特許第４，４７６，０６９号）、蛋
白変性剤を用いて、目的ペプチドも含めた菌体タンパク
を菌体破砕と同時に凝集・沈澱させた後、精製する（特
開昭５９−１６１３２１号）等の技術が開示され、本出
願人も先に銅又は亜鉛の塩とポリエチレンイミンとを併
用してｈＩＦＮ−γを効率良く抽出・精製する方法を開
発している。
下、ｈＩＦＮ−γと略す）を大腸菌を用いて生産する場
合、菌体により生産されたｈＩＦＮ−γを抽出する際、
菌体を破砕すると、本来目的としている１４６アミノ酸
より成るペプチドのＣ末端側が切断された１３１アミノ
酸より成るペプチドが多く得られる。このＣ末端側の切
断を抑え、１４６アミノ酸よりなるペプチドとして得る
ためにこれまで、プロテアーゼインヒビターを添加して
分解を抑える（米国特許第４，４７６，０６９号）、蛋
白変性剤を用いて、目的ペプチドも含めた菌体タンパク
を菌体破砕と同時に凝集・沈澱させた後、精製する（特
開昭５９−１６１３２１号）等の技術が開示され、本出
願人も先に銅又は亜鉛の塩とポリエチレンイミンとを併
用してｈＩＦＮ−γを効率良く抽出・精製する方法を開
発している。
【０００７】一方、近年、目的とするタンパクを細胞外
（ベリプラズム又は培地中）に分泌・生産させることに
より、抽出液中の不純物を少なくし、或いはプロテアー
ゼによる分解をできるだけ少なくし、目的物質の精製を
容易にしようとする試みもなされているが、効率良く分
泌させる技術や、分泌過程でおこる前駆体の正しいプロ
セシング（通常、分泌ペプチド又はタンパクはその前駆
体が何らかの分解過程を経て分泌される）などにおい
て、未だ実用化できる迄には至っていない。
（ベリプラズム又は培地中）に分泌・生産させることに
より、抽出液中の不純物を少なくし、或いはプロテアー
ゼによる分解をできるだけ少なくし、目的物質の精製を
容易にしようとする試みもなされているが、効率良く分
泌させる技術や、分泌過程でおこる前駆体の正しいプロ
セシング（通常、分泌ペプチド又はタンパクはその前駆
体が何らかの分解過程を経て分泌される）などにおい
て、未だ実用化できる迄には至っていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする問題点】本発明者らは、大腸
菌で発現されるｈＩＦＮ−γが、特に培養菌体からの抽
出工程において分解され易いという問題点に鑑み、鋭意
研究の結果、ある特定のプロテアーゼ活性を欠損した大
腸菌を宿主として用いることにより上記の問題を解決し
うることを見出し、本発明を完成するに至った。
菌で発現されるｈＩＦＮ−γが、特に培養菌体からの抽
出工程において分解され易いという問題点に鑑み、鋭意
研究の結果、ある特定のプロテアーゼ活性を欠損した大
腸菌を宿主として用いることにより上記の問題を解決し
うることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
【問題点を解決するための手段】本発明の宿主として使
用できる目的変異体はジイソプロピルフルオロフォスフ
ェイト、フェニルメチルスルフォニルフルオライド、Ｎ
−α−トシル−Ｌ−リシルクロロメチルケトン、Ｎ−ト
シル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン、エチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ロイペプチン、アン
チパイン、α2 −マクログロブリンおよびキモスタチン
によって阻害されず、塩化亜鉛および塩化銅で阻害され
るプロテアーゼ活性が欠損した大腸菌であり、更に好ま
しくはヒト免疫インターフェロン活性を有するポリペプ
チドを分解するプロテアーゼ活性が欠損している大腸菌
である。
用できる目的変異体はジイソプロピルフルオロフォスフ
ェイト、フェニルメチルスルフォニルフルオライド、Ｎ
−α−トシル−Ｌ−リシルクロロメチルケトン、Ｎ−ト
シル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン、エチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ロイペプチン、アン
チパイン、α2 −マクログロブリンおよびキモスタチン
によって阻害されず、塩化亜鉛および塩化銅で阻害され
るプロテアーゼ活性が欠損した大腸菌であり、更に好ま
しくはヒト免疫インターフェロン活性を有するポリペプ
チドを分解するプロテアーゼ活性が欠損している大腸菌
である。
【００１０】本発明に使用できる目的の変異株は次のよ
うにして得られる。
うにして得られる。
【００１１】まず、組換え微生物の宿主となる大腸菌に
変異誘導処理を施す。次に、例えばこの変異誘導処理を
施した菌体を培養し、菌体破砕液（ｌｙｓａｔｅ）に、
対象となるタンパクを添加後、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）でそ
のタンパクの分解の有無を解析することにより、目的タ
ンパク（例えばｈＩＦＮ−γ）分解活性の欠損した変異
株を選択できる。もし大腸菌が目的タンパクを高生産す
る形質転換体である場合は、該形質転換体の破砕液又は
菌体の培養液そのものを直接ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析す
ることによっても目的とする変異株を得ることができ
る。この様にして得られた突然変異株を宿主として目的
タンパク（ｈＩＦＮ−γ）発現ベクターを導入し、形質
転換を行ない、得られた形質転換株を培養して目的タン
パク（ｈＩＦＮ−γ）を生産させ、この培養菌体を破砕
し、目的タンパク（ｈＩＦＮ−γ）を抽出・精製する。
本発明では、宿主が目的タンパク（ｈＩＦＮ−γ）分解
活性を欠損しているため、プロテアーゼインヒビターや
蛋白変性剤を抽出工程で全く用いなくても、目的タンパ
ク（ｈＩＦＮ−γ）は分解されることなく得られる。
変異誘導処理を施す。次に、例えばこの変異誘導処理を
施した菌体を培養し、菌体破砕液（ｌｙｓａｔｅ）に、
対象となるタンパクを添加後、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）でそ
のタンパクの分解の有無を解析することにより、目的タ
ンパク（例えばｈＩＦＮ−γ）分解活性の欠損した変異
株を選択できる。もし大腸菌が目的タンパクを高生産す
る形質転換体である場合は、該形質転換体の破砕液又は
菌体の培養液そのものを直接ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析す
ることによっても目的とする変異株を得ることができ
る。この様にして得られた突然変異株を宿主として目的
タンパク（ｈＩＦＮ−γ）発現ベクターを導入し、形質
転換を行ない、得られた形質転換株を培養して目的タン
パク（ｈＩＦＮ−γ）を生産させ、この培養菌体を破砕
し、目的タンパク（ｈＩＦＮ−γ）を抽出・精製する。
本発明では、宿主が目的タンパク（ｈＩＦＮ−γ）分解
活性を欠損しているため、プロテアーゼインヒビターや
蛋白変性剤を抽出工程で全く用いなくても、目的タンパ
ク（ｈＩＦＮ−γ）は分解されることなく得られる。
【００１２】以下、ｈＩＦＮ−γタンパクの分解活性を
欠損した大腸菌およびそれを宿主としたｈＩＦＮ−γ発
現ベクターによる形質転換体について詳述するが、本発
明の範囲は、前に述べた性質をもつ分解酵素を欠損した
大腸菌であれば、この限りでないことは言うまでもな
い。
欠損した大腸菌およびそれを宿主としたｈＩＦＮ−γ発
現ベクターによる形質転換体について詳述するが、本発
明の範囲は、前に述べた性質をもつ分解酵素を欠損した
大腸菌であれば、この限りでないことは言うまでもな
い。
【００１３】尚、本発明により得られた新規大腸菌は、
ＳＢＭ２８２と命名され、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研条寄第１０９７号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０
９７）として寄託されている。
ＳＢＭ２８２と命名され、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研条寄第１０９７号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０
９７）として寄託されている。
【００１４】
【実施例】実 施 例 １．プロテアーゼ活性欠損株の分離 ｈＩＦＮ−γ生産菌であるＷ３１１０（Ｍ２５）／ｐＩ
Ｎ５Ｔ４（特開昭６０−２４１８７に開示されたプラス
ミドｐＩＮ５ＧＩＦ５４上のアンピシリン耐性遺伝子
（Ａｐr ）をテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃr ）に
置き換えたプラスミドｐＩＮ５Ｔ４で形質転換された大
腸菌）をＬＢ培地（０．５％酵母エキス、１％バクト−
トリプトン、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中、３７
℃で一晩培養し、菌体を１０，０００ｒｐｍ、５分間遠
心分離して菌体を集菌した後、Ｍ９培地（０．１％ＮＨ
4 Ｃｌ、０．６％Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．３％ＫＨ2 ＰＯ
4 、０．０５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に調整したもの
に、１Ｍ ＭｇＳＯ4 を２ｍｌ／ｌ、２０％グルコース
を１０ｍｌ／ｌ、１Ｍ ＣａＣｌ2 を０．１ｍｌ／ｌ加
える）で菌体を洗浄し、同培地に懸濁した。これに変異
誘導剤としてニトロソグアニジン（以下ＮＴＧと略す）
を、５０μｇ／ｍｌの濃度となる様に添加し、３０分間
放置した後、１０，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して
菌体を集菌した。この菌体をＬＢ培地を用いて洗浄した
後、同培地に植菌した。これを３７℃で一晩培養した
後、プレートに出現したコロニーを、ＬＢ培地５００ｍ
ｌを入れたチューブに１白金耳ずつ植菌し、３７℃で一
晩培養した。１０，０００ｒｐｍ５分間遠心分離後、Ｌ
ｙｓｏｚｙｍｅ−ＥＤＴＡ溶液（５００μｇ／ｍｌ Ｌ
ｙｓｏｚｙｍｅ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）２００μｌを加
え、凍結溶融法により菌体を破砕した。これに１ｍｇ／
ｍｌの濃度に調整したｈＩＦＮ−γ溶液１００μｌを加
え、３７℃、１時間インキュベートし、ＳＤＳサンプル
溶液（１０％グリセリン、５％２−メルトカプトエタノ
ール、２３％ＳＤＳ、６２．５ｍＭトリス−塩酸バッフ
ァー、ｐＨ６．８）１５０μｌを加え、１００℃５分間
処理した後、１０，０００ｒｐｍ １０分間遠心分離
し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、１４６アミノ酸か
らなるｈＩＦＮ−γ（分子量約１８，０００）の残存量
を検討した。この様にして、約２，０００株のうちか
ら、ｈＩＦＮ−γ分解活性のない変異株を１株得た。
Ｎ５Ｔ４（特開昭６０−２４１８７に開示されたプラス
ミドｐＩＮ５ＧＩＦ５４上のアンピシリン耐性遺伝子
（Ａｐr ）をテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃr ）に
置き換えたプラスミドｐＩＮ５Ｔ４で形質転換された大
腸菌）をＬＢ培地（０．５％酵母エキス、１％バクト−
トリプトン、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中、３７
℃で一晩培養し、菌体を１０，０００ｒｐｍ、５分間遠
心分離して菌体を集菌した後、Ｍ９培地（０．１％ＮＨ
4 Ｃｌ、０．６％Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．３％ＫＨ2 ＰＯ
4 、０．０５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に調整したもの
に、１Ｍ ＭｇＳＯ4 を２ｍｌ／ｌ、２０％グルコース
を１０ｍｌ／ｌ、１Ｍ ＣａＣｌ2 を０．１ｍｌ／ｌ加
える）で菌体を洗浄し、同培地に懸濁した。これに変異
誘導剤としてニトロソグアニジン（以下ＮＴＧと略す）
を、５０μｇ／ｍｌの濃度となる様に添加し、３０分間
放置した後、１０，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して
菌体を集菌した。この菌体をＬＢ培地を用いて洗浄した
後、同培地に植菌した。これを３７℃で一晩培養した
後、プレートに出現したコロニーを、ＬＢ培地５００ｍ
ｌを入れたチューブに１白金耳ずつ植菌し、３７℃で一
晩培養した。１０，０００ｒｐｍ５分間遠心分離後、Ｌ
ｙｓｏｚｙｍｅ−ＥＤＴＡ溶液（５００μｇ／ｍｌ Ｌ
ｙｓｏｚｙｍｅ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）２００μｌを加
え、凍結溶融法により菌体を破砕した。これに１ｍｇ／
ｍｌの濃度に調整したｈＩＦＮ−γ溶液１００μｌを加
え、３７℃、１時間インキュベートし、ＳＤＳサンプル
溶液（１０％グリセリン、５％２−メルトカプトエタノ
ール、２３％ＳＤＳ、６２．５ｍＭトリス−塩酸バッフ
ァー、ｐＨ６．８）１５０μｌを加え、１００℃５分間
処理した後、１０，０００ｒｐｍ １０分間遠心分離
し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、１４６アミノ酸か
らなるｈＩＦＮ−γ（分子量約１８，０００）の残存量
を検討した。この様にして、約２，０００株のうちか
ら、ｈＩＦＮ−γ分解活性のない変異株を１株得た。
【００１５】この分解活性の欠損変異がプラスミド由来
のものではなく宿主由来の変異であることを確かめるた
め、次にプラスミドのキュアリング（ｃｕｒｉｎｇ）を
行なった。即ち、プラスミド（ｐＩＮ５Ｔ４）上にある
遺伝子によってテトラサイクリン耐性を示す上記変異株
を、テトラサイクリンを含まない培地で培養し、テトラ
サイクリン感受性（Ｔｃｓ）株となった株を選択し、プ
ラスミドの脱落を確認した。この株について、既述のよ
うに菌体破砕液にｈＩＦＮ−γタンパクを加えＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより、ｈＩＦＮ−γタンパクの分解の有無を
調べた結果、全く分解活性はみられなかった。この結果
は、本変異株が宿主染色体の変異によるものであること
を示している。次に、このプラスミドが脱落した株に再
び、ｈＩＦＮ−γを発現する様遺伝子の組込まれたプラ
スミドであるｐＩＮ５Ｔ４）（既述）を常法に従って形
質転換した。テトラサイクリン耐性をマーカーとして、
形質転換株を選択し、その形質転換株の菌体破砕・抽出
液におけるｈＩＦＮ−γの分解の有無をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで調べた結果、ｈＩＦＮ−γは全く分解されていなか
った。
のものではなく宿主由来の変異であることを確かめるた
め、次にプラスミドのキュアリング（ｃｕｒｉｎｇ）を
行なった。即ち、プラスミド（ｐＩＮ５Ｔ４）上にある
遺伝子によってテトラサイクリン耐性を示す上記変異株
を、テトラサイクリンを含まない培地で培養し、テトラ
サイクリン感受性（Ｔｃｓ）株となった株を選択し、プ
ラスミドの脱落を確認した。この株について、既述のよ
うに菌体破砕液にｈＩＦＮ−γタンパクを加えＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより、ｈＩＦＮ−γタンパクの分解の有無を
調べた結果、全く分解活性はみられなかった。この結果
は、本変異株が宿主染色体の変異によるものであること
を示している。次に、このプラスミドが脱落した株に再
び、ｈＩＦＮ−γを発現する様遺伝子の組込まれたプラ
スミドであるｐＩＮ５Ｔ４）（既述）を常法に従って形
質転換した。テトラサイクリン耐性をマーカーとして、
形質転換株を選択し、その形質転換株の菌体破砕・抽出
液におけるｈＩＦＮ−γの分解の有無をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで調べた結果、ｈＩＦＮ−γは全く分解されていなか
った。
【００１６】尚、キュアリングした変異株であるＷ３１
１０（Ｍ２５）は、ＳＢＭ２８２と命名され、工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１０９７）。又、変異誘導処理による変異株の作
製・選択は、ベクターの導入されていない大腸菌に変異
誘導処理を施し、目的の変異株を選択し、これに目的タ
ンパク発現ベクターを導入しても得ることができる。
１０（Ｍ２５）は、ＳＢＭ２８２と命名され、工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されている（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１０９７）。又、変異誘導処理による変異株の作
製・選択は、ベクターの導入されていない大腸菌に変異
誘導処理を施し、目的の変異株を選択し、これに目的タ
ンパク発現ベクターを導入しても得ることができる。
【００１７】２．変異誘導処理で得られた変異株の性質 次に、実施例の上記１に示した変異誘導処理により得ら
れたｈＩＦＮ−γ分解活性欠損変異株が、どの様なプロ
テアーゼを欠損している株であるかを調べた。その結
果、以下に示す様に、一般的トリプシン様酵素阻害剤を
用いても阻害されず、一方、銅の塩や亜鉛の塩によって
は阻害される様なプロテアーゼ活性が欠損している変異
株であった。変異処理をしない親株（Ｗ３１１０）を宿
主とした、ｈＩＦＮ−γを生産する形質転換体であるＷ
３１１０／ｐＩＮ５Ｔ４を、ＬＢ培地１００ｍｌの入っ
た５００ｍｌ容マイヤーフラスコで３７℃１晩培養した
後、８，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して集菌し
た。得られた湿菌体１ｇを５０ｍＭトリス−塩酸バッフ
ァー（ｐＨ７．５）３０ｍｌに懸濁後、フレンチプレス
ホモジナイザーを用いて２０，０００ｐｓｉでホモジナ
イズし、８，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。
れたｈＩＦＮ−γ分解活性欠損変異株が、どの様なプロ
テアーゼを欠損している株であるかを調べた。その結
果、以下に示す様に、一般的トリプシン様酵素阻害剤を
用いても阻害されず、一方、銅の塩や亜鉛の塩によって
は阻害される様なプロテアーゼ活性が欠損している変異
株であった。変異処理をしない親株（Ｗ３１１０）を宿
主とした、ｈＩＦＮ−γを生産する形質転換体であるＷ
３１１０／ｐＩＮ５Ｔ４を、ＬＢ培地１００ｍｌの入っ
た５００ｍｌ容マイヤーフラスコで３７℃１晩培養した
後、８，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して集菌し
た。得られた湿菌体１ｇを５０ｍＭトリス−塩酸バッフ
ァー（ｐＨ７．５）３０ｍｌに懸濁後、フレンチプレス
ホモジナイザーを用いて２０，０００ｐｓｉでホモジナ
イズし、８，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した。
【００１８】第１表に示す種々のプロテアーゼ阻害物質
を、各最終濃度になる様溶解した０．１Ｍトリス−塩酸
バッファー（ｐＨ７．５）７００μｌに上記上清５０μ
ｌを加え、これにｈＩＦＮ−γ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）２
５０μｌを加えた後、３７℃１時間インキュベーション
した。この溶液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ｈＩＦＮ
−γ分解の有無を検討した。その結果を第１表に示し
た。
を、各最終濃度になる様溶解した０．１Ｍトリス−塩酸
バッファー（ｐＨ７．５）７００μｌに上記上清５０μ
ｌを加え、これにｈＩＦＮ−γ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）２
５０μｌを加えた後、３７℃１時間インキュベーション
した。この溶液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ｈＩＦＮ
−γ分解の有無を検討した。その結果を第１表に示し
た。
【００１９】
【表１】 第１表に掲げた物質中、ｈＩＦＮ−γ分解活性を阻害し
たのはＣｕＣｌ2 及びＺｎＣｌ2 のみで、一般にトリプ
シン様酵素の阻害剤と考えられている他の物質ではｈＩ
ＦＮ−γ分解活性は阻害されなかった。
たのはＣｕＣｌ2 及びＺｎＣｌ2 のみで、一般にトリプ
シン様酵素の阻害剤と考えられている他の物質ではｈＩ
ＦＮ−γ分解活性は阻害されなかった。
【００２０】３．菌体破砕後のｈＩＦＮ−γ分解の経時
変化 次に、野生株を宿主とした形質転換体Ｗ３１１０／ｐＩ
Ｎ５Ｔ４と上記変異株を宿主とした形質転換株Ｗ３１１
０（Ｍ２５）／ｐＩＮ５Ｔ４について、ｈＩＦＮ−γ生
産性と、各形質転換株培養菌体の破砕後のｈＩＦＮ−γ
分解の経時的変化の検討を行なった。
変化 次に、野生株を宿主とした形質転換体Ｗ３１１０／ｐＩ
Ｎ５Ｔ４と上記変異株を宿主とした形質転換株Ｗ３１１
０（Ｍ２５）／ｐＩＮ５Ｔ４について、ｈＩＦＮ−γ生
産性と、各形質転換株培養菌体の破砕後のｈＩＦＮ−γ
分解の経時的変化の検討を行なった。
【００２１】即ち、Ｗ３１１０／ｐＩＮ５Ｔ４及びＷ３
１１０（Ｍ２５）／ｐＩＮ５Ｔ４を先述と同様に培養・
集菌し、バッファーに懸濁した。この懸濁液（Ｗ）、懸
濁液をフレンチプレスにより菌体破砕後遠心分離した沈
澱（Ｐ）、及び、遠心分離後０，１５，３０，６０分後
の各上清について、既述のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、
分解されないｈＩＦＮ−γタンパク（分子量約１８，０
００）量と分解されたタンパク（分子量約１６，００
０）量とを検討した。結果を第１図に示した。
１１０（Ｍ２５）／ｐＩＮ５Ｔ４を先述と同様に培養・
集菌し、バッファーに懸濁した。この懸濁液（Ｗ）、懸
濁液をフレンチプレスにより菌体破砕後遠心分離した沈
澱（Ｐ）、及び、遠心分離後０，１５，３０，６０分後
の各上清について、既述のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、
分解されないｈＩＦＮ−γタンパク（分子量約１８，０
００）量と分解されたタンパク（分子量約１６，００
０）量とを検討した。結果を第１図に示した。
【００２２】Ｗ３１１０／ｐＩＮ５Ｔ４については、１
５分以内に上清で５０％が、６０分以内にはほぼ１００
％のｈＩＦＮ−γが分離されているのに対し、Ｗ３１１
０（Ｍ２５）／ｐＩＮ５Ｔ４では、６０分後でも分解は
ほとんど見られず、分子量約１８，０００のｈＩＦＮ−
γは安定に保たれていた。又、ｈＩＦＮ−γの生産者に
は差は認められなかった。
５分以内に上清で５０％が、６０分以内にはほぼ１００
％のｈＩＦＮ−γが分離されているのに対し、Ｗ３１１
０（Ｍ２５）／ｐＩＮ５Ｔ４では、６０分後でも分解は
ほとんど見られず、分子量約１８，０００のｈＩＦＮ−
γは安定に保たれていた。又、ｈＩＦＮ−γの生産者に
は差は認められなかった。
【００２３】４．変異株を用いた形質転換体からのｈＩ
ＦＮ−γの抽出・精製 Ｗ３１１０／ｐＩＮ５Ｔ４及びＷ３１１０（Ｍ２５）／
ｐＩＮ５Ｔ４を、３０リットル容ジャーファーメンター
中、２０リットルＬＢ培地で３０℃３６時間培養した。
得られた培養液を８，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離
して集菌した。この湿菌体各１Ｋｇを２０ｍＭトリス−
塩酸バッファー（ｐＨ７．５）７，０００ｍｌに懸濁
し、これをマントンゴーリン社製ホモジナイザーＭ１５
を用いて８，０００ｐｓｉで菌体破砕した。尚、Ｗ３１
１０／ｐＩＮ５Ｔ４については、２０ｍＭトリス−塩酸
バッファーの代わりに、１ｍＭ ＺｎＣｌ2 を含む同バ
ッファーを用いた。この破砕液を、７，０００ｒｐｍ、
２０分間遠心分離して得られた上清に１５％ポリエチレ
ンイミン（ｐＨ８．０、ＨＣｌで調整）を最終濃度０．
７５％となる様に加え、１０分間攪拌後、４℃２時間放
置し、生じた沈澱を７，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分
離して除去した。この上清により、以下の様にしてｈＩ
ＦＮ−γを精製した。
ＦＮ−γの抽出・精製 Ｗ３１１０／ｐＩＮ５Ｔ４及びＷ３１１０（Ｍ２５）／
ｐＩＮ５Ｔ４を、３０リットル容ジャーファーメンター
中、２０リットルＬＢ培地で３０℃３６時間培養した。
得られた培養液を８，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離
して集菌した。この湿菌体各１Ｋｇを２０ｍＭトリス−
塩酸バッファー（ｐＨ７．５）７，０００ｍｌに懸濁
し、これをマントンゴーリン社製ホモジナイザーＭ１５
を用いて８，０００ｐｓｉで菌体破砕した。尚、Ｗ３１
１０／ｐＩＮ５Ｔ４については、２０ｍＭトリス−塩酸
バッファーの代わりに、１ｍＭ ＺｎＣｌ2 を含む同バ
ッファーを用いた。この破砕液を、７，０００ｒｐｍ、
２０分間遠心分離して得られた上清に１５％ポリエチレ
ンイミン（ｐＨ８．０、ＨＣｌで調整）を最終濃度０．
７５％となる様に加え、１０分間攪拌後、４℃２時間放
置し、生じた沈澱を７，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分
離して除去した。この上清により、以下の様にしてｈＩ
ＦＮ−γを精製した。
【００２４】即ち、上記上清を、２０ｍＭ Ｎ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−３−プロパンスルフ
ォン酸バッファー（ＥＰＰＳバッファー）ｐＨ８．６で
平衡化したＱＡＥセファデックスＡ−２５（ファルマシ
ア社製）カラムにかけて得られた素通り画分を、０．１
％２−メルトカプトエタノール（２−ＭＥ）を含む２０
ｍＭトリス−塩酸バッファーｐＨ７．４で平衡化したＣ
ＭセファロースＣＬ６Ｂ（ファルマシア社製）カラム
に、この素通り画分をかけ吸着した画分を、０〜０．５
ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出し、インターフェロン
活性の高い区分を集めた。なお、インターフェロン活性
は特開昭５８−２０１９９５号公報に記載した方法に準
じて測定した。続いてこの画分に５０％飽和となる様に
硫酸アンモニウムを添加し、塩析を行い、７，０００ｒ
ｐｍ、２０分間遠心分離して沈澱を得た。これを、０．
３Ｍ ＮａＣｌ及び０．１％ ２−ＭＥを含む２０ｍＭ
リン酸ナトリウムバッファー（ＰＳＢ）ｐＨ７．４に溶
解し、同バッファーで平衡化したセファクリルＳ−２０
０（ファルマシア社製）カラムにかけ、９９％以上の純
度を有する最終精製品を得た。Ｗ３１１０／ｐＩＮ５Ｔ
４とＷ３１１０（Ｍ２５）／ｐＩＮ５Ｔ４によって生産
されたｈＩＦＮ−γの最終収率は各々、５％、１２％で
あった。
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−３−プロパンスルフ
ォン酸バッファー（ＥＰＰＳバッファー）ｐＨ８．６で
平衡化したＱＡＥセファデックスＡ−２５（ファルマシ
ア社製）カラムにかけて得られた素通り画分を、０．１
％２−メルトカプトエタノール（２−ＭＥ）を含む２０
ｍＭトリス−塩酸バッファーｐＨ７．４で平衡化したＣ
ＭセファロースＣＬ６Ｂ（ファルマシア社製）カラム
に、この素通り画分をかけ吸着した画分を、０〜０．５
ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出し、インターフェロン
活性の高い区分を集めた。なお、インターフェロン活性
は特開昭５８−２０１９９５号公報に記載した方法に準
じて測定した。続いてこの画分に５０％飽和となる様に
硫酸アンモニウムを添加し、塩析を行い、７，０００ｒ
ｐｍ、２０分間遠心分離して沈澱を得た。これを、０．
３Ｍ ＮａＣｌ及び０．１％ ２−ＭＥを含む２０ｍＭ
リン酸ナトリウムバッファー（ＰＳＢ）ｐＨ７．４に溶
解し、同バッファーで平衡化したセファクリルＳ−２０
０（ファルマシア社製）カラムにかけ、９９％以上の純
度を有する最終精製品を得た。Ｗ３１１０／ｐＩＮ５Ｔ
４とＷ３１１０（Ｍ２５）／ｐＩＮ５Ｔ４によって生産
されたｈＩＦＮ−γの最終収率は各々、５％、１２％で
あった。
【００２５】
【発明の効果】以上に示した様に、本発明による方法を
用いれば、菌体内で同じ発現量でありながら目的タンパ
ク（ｈＩＦＮ−γ）を２倍以上の収率で得ることができ
る。又、目的タンパク（ｈＩＦＮ−γ）が菌体破砕後も
分解されないため、プロテアーゼインヒビターや蛋白変
性剤を用いる必要はなく、抽出・精製段階の簡素化・効
率化を計ることができる。
用いれば、菌体内で同じ発現量でありながら目的タンパ
ク（ｈＩＦＮ−γ）を２倍以上の収率で得ることができ
る。又、目的タンパク（ｈＩＦＮ−γ）が菌体破砕後も
分解されないため、プロテアーゼインヒビターや蛋白変
性剤を用いる必要はなく、抽出・精製段階の簡素化・効
率化を計ることができる。
【図１】ｈＩＦＮ−γタンパクの分解の経時的変化を調
べるためのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図中、Ｗは培養菌
体の破砕前懸濁液、Ｐは、該懸濁液を破砕・遠心処理し
て得られた沈澱物、０′，１５′，３０′，６０′はそ
れぞれ、菌体破砕後の遠心上清を０，１５，３０，６０
分間３７℃でインキュベーションした後の各種タンパク
のパターンを示す。ａはｈＩＦＮ−γのタンパクに相当
するバンド、ｂはｈＩＦＮ−γ分解物に相当するタンパ
クのバンドである。
べるためのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図中、Ｗは培養菌
体の破砕前懸濁液、Ｐは、該懸濁液を破砕・遠心処理し
て得られた沈澱物、０′，１５′，３０′，６０′はそ
れぞれ、菌体破砕後の遠心上清を０，１５，３０，６０
分間３７℃でインキュベーションした後の各種タンパク
のパターンを示す。ａはｈＩＦＮ−γのタンパクに相当
するバンド、ｂはｈＩＦＮ−γ分解物に相当するタンパ
クのバンドである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、外来性のタンパク又は
ポリペプチド（以下、単にタンパクと略す）を高発現し
うるベクターの宿主として新規な大腸菌を用い、得られ
た形質転換体からタンパクを高収率で得る方法を提供す
る。具体的には、ヒト免疫インターフェロン分解活性を
欠失した新規な大腸菌を用い、この大腸菌を宿主とした
形質転換体からヒト免疫インターフェロン活性をもつタ
ンパク等を効率良く得る方法を提供する。
ポリペプチド（以下、単にタンパクと略す）を高発現し
うるベクターの宿主として新規な大腸菌を用い、得られ
た形質転換体からタンパクを高収率で得る方法を提供す
る。具体的には、ヒト免疫インターフェロン分解活性を
欠失した新規な大腸菌を用い、この大腸菌を宿主とした
形質転換体からヒト免疫インターフェロン活性をもつタ
ンパク等を効率良く得る方法を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】例えば、ヒト免疫インターフェロン（以
下、ｈＩＦＮ−γと略す）を大腸菌を用いて生産する場
合、菌体により生産されたｈＩＦＮ−γを抽出する際、
菌体を破砕すると、本来目的としている１４６アミノ酸
より成るペプチドのＣ末端側が切断された１３１アミノ
酸より成るペプチドが多く得られる。このＣ末端側の切
断を抑え、１４６アミノ酸よりなるペプチドとして得る
ためにこれまで、プロテアーゼインヒビターを添加して
分解を抑える（米国特許第４，４７６，０４９号）、蛋
白変性剤を用いて、目的ペプチドも含めた菌体タンパク
を菌体破砕と同時に凝集・沈澱させた後、精製する（特
開昭５９−１６１３２１号）等の技術が開示され、本出
願人も先に銅又は亜鉛の塩とポリエチレンイミンとを併
用してｈＩＦＮ−γを効率良く抽出・精製する方法を開
発している。
下、ｈＩＦＮ−γと略す）を大腸菌を用いて生産する場
合、菌体により生産されたｈＩＦＮ−γを抽出する際、
菌体を破砕すると、本来目的としている１４６アミノ酸
より成るペプチドのＣ末端側が切断された１３１アミノ
酸より成るペプチドが多く得られる。このＣ末端側の切
断を抑え、１４６アミノ酸よりなるペプチドとして得る
ためにこれまで、プロテアーゼインヒビターを添加して
分解を抑える（米国特許第４，４７６，０４９号）、蛋
白変性剤を用いて、目的ペプチドも含めた菌体タンパク
を菌体破砕と同時に凝集・沈澱させた後、精製する（特
開昭５９−１６１３２１号）等の技術が開示され、本出
願人も先に銅又は亜鉛の塩とポリエチレンイミンとを併
用してｈＩＦＮ−γを効率良く抽出・精製する方法を開
発している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】尚、本発明により得られた新規大腸菌は、
Escherichia coli ＳＢＭ２８２と命名され、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第１０９７号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１０９７）として寄託されている。
Escherichia coli ＳＢＭ２８２と命名され、工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第１０９７号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１０９７）として寄託されている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】
【実施例】実 施 例 １．プロテアーゼ活性欠損株の分離 ｈＩＦＮ−γ生産菌であるＷ３１１０（Ｍ２５）／ｐＩ
Ｎ５Ｔ４（特開昭６０−２４１８７に開示されたプラス
ミドｐＩＮ５ＧＩＦ５４上のアンピシリン耐性遺伝子
（Ａｐr ）をテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃr ）に
置き換えたプラスミドｐＩＮ５Ｔ４で形質転換された大
腸菌）をＬＢ培地（０．５％酵母エキス、１％バクト−
トリプトン、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中、３７
℃で一晩培養し、菌体を１０，０００ｒｐｍ、５分間遠
心分離して菌体を集菌した後、Ｍ９培地（０．１％ＮＨ
4 Ｃｌ、０．６％Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．３％ＫＨ2 ＰＯ
4 、０．０５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に調整したもの
に、１Ｍ ＭｇＳＯ4 を２ｍｌ／ｌ、２０％グルコース
を１０ｍｌ／ｌ、１Ｍ ＣａＣｌ2 を０．１ｍｌ／ｌ加
える）で菌体を洗浄し、同培地に懸濁した。これに変異
誘導剤としてニトロソグアニジン（以下ＮＴＧと略す）
を、５０μｇ／ｍｌの濃度となる様に添加し、３０分間
放置した後、１０，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して
菌体を集菌した。この菌体をＬＢ培地を用いて洗浄した
後、同培地に植菌した。これを３７℃で一晩培養した
後、プレートに出現したコロニーを、ＬＢ培地５００μ
ｌを入れたチューブに１白金耳ずつ植菌し、３７℃で一
晩培養した。１０，０００ｒｐｍ５分間遠心分離後、Ｌ
ｙｓｏｚｙｍｅ−ＥＤＴＡ溶液（５００μｇ／ｍｌ Ｌ
ｙｓｏｚｙｍｅ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）２００μｌを加
え、凍結溶融法により菌体を破砕した。これに１ｍｇ／
ｍｌの濃度に調整したｈＩＦＮ−γ溶液１００μｌを加
え、３７℃、１時間インキュベートし、ＳＤＳサンプル
溶液（１０％グリセリン、５％２−メルトカプトエタノ
ール、２３％ＳＤＳ、６２．５ｍＭトリス−塩酸バッフ
ァー、ｐＨ６．８）１５０μｌを加え、１００℃５分間
処理した後、１０，０００ｒｐｍ １０分間遠心分離
し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、１４６アミノ酸か
らなるｈＩＦＮ−γ（分子量約１８，０００）の残存量
を検討した。この様にして、約２，０００株のうちか
ら、ｈＩＦＮ−γ分解活性のない変異株を１株得た。
Ｎ５Ｔ４（特開昭６０−２４１８７に開示されたプラス
ミドｐＩＮ５ＧＩＦ５４上のアンピシリン耐性遺伝子
（Ａｐr ）をテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃr ）に
置き換えたプラスミドｐＩＮ５Ｔ４で形質転換された大
腸菌）をＬＢ培地（０．５％酵母エキス、１％バクト−
トリプトン、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中、３７
℃で一晩培養し、菌体を１０，０００ｒｐｍ、５分間遠
心分離して菌体を集菌した後、Ｍ９培地（０．１％ＮＨ
4 Ｃｌ、０．６％Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．３％ＫＨ2 ＰＯ
4 、０．０５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に調整したもの
に、１Ｍ ＭｇＳＯ4 を２ｍｌ／ｌ、２０％グルコース
を１０ｍｌ／ｌ、１Ｍ ＣａＣｌ2 を０．１ｍｌ／ｌ加
える）で菌体を洗浄し、同培地に懸濁した。これに変異
誘導剤としてニトロソグアニジン（以下ＮＴＧと略す）
を、５０μｇ／ｍｌの濃度となる様に添加し、３０分間
放置した後、１０，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して
菌体を集菌した。この菌体をＬＢ培地を用いて洗浄した
後、同培地に植菌した。これを３７℃で一晩培養した
後、プレートに出現したコロニーを、ＬＢ培地５００μ
ｌを入れたチューブに１白金耳ずつ植菌し、３７℃で一
晩培養した。１０，０００ｒｐｍ５分間遠心分離後、Ｌ
ｙｓｏｚｙｍｅ−ＥＤＴＡ溶液（５００μｇ／ｍｌ Ｌ
ｙｓｏｚｙｍｅ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）２００μｌを加
え、凍結溶融法により菌体を破砕した。これに１ｍｇ／
ｍｌの濃度に調整したｈＩＦＮ−γ溶液１００μｌを加
え、３７℃、１時間インキュベートし、ＳＤＳサンプル
溶液（１０％グリセリン、５％２−メルトカプトエタノ
ール、２３％ＳＤＳ、６２．５ｍＭトリス−塩酸バッフ
ァー、ｐＨ６．８）１５０μｌを加え、１００℃５分間
処理した後、１０，０００ｒｐｍ １０分間遠心分離
し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、１４６アミノ酸か
らなるｈＩＦＮ−γ（分子量約１８，０００）の残存量
を検討した。この様にして、約２，０００株のうちか
ら、ｈＩＦＮ−γ分解活性のない変異株を１株得た。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】尚、キュアリングした変異株であるＷ３１
１０（Ｍ２５)は、 Escherichia col i ＳＢＭ２８２と命
名され、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９７）。又、変異誘導処理
による変異株の作製・選択は、ベクターの導入されてい
ない大腸菌に変異誘導処理を施し、目的の変異株を選択
し、これに目的タンパク発現ベクターを導入しても得る
ことができる。
１０（Ｍ２５)は、 Escherichia col i ＳＢＭ２８２と命
名され、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９７）。又、変異誘導処理
による変異株の作製・選択は、ベクターの導入されてい
ない大腸菌に変異誘導処理を施し、目的の変異株を選択
し、これに目的タンパク発現ベクターを導入しても得る
ことができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】Ｗ３１１０／ｐＩＮ５Ｔ４については、１
５分以内に上清で５０％が、６０分以内にはほぼ１００
％のｈＩＦＮ−γが分離されているのに対し、Ｗ３１１
０（Ｍ２５）／ｐＩＮ５Ｔ４では、６０分後でも分解は
ほとんど見られず、分子量約１８，０００のｈＩＦＮ−
γは安定に保たれていた。又、ｈＩＦＮ−γの生産性に
は差は認められなかった。
５分以内に上清で５０％が、６０分以内にはほぼ１００
％のｈＩＦＮ−γが分離されているのに対し、Ｗ３１１
０（Ｍ２５）／ｐＩＮ５Ｔ４では、６０分後でも分解は
ほとんど見られず、分子量約１８，０００のｈＩＦＮ−
γは安定に保たれていた。又、ｈＩＦＮ−γの生産性に
は差は認められなかった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (3)
- 【請求項１】 ジイソプロピルフルオロフォスフェイ
ト、フェニルメチルスルフォニルフルオライド、Ｎ−α
−トシル−Ｌ−リシルクロロメチルケトン、Ｎ−トシル
−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン、エチレン
ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ロイペプチン、アンチパ
イン、α2 −マクログロブリンおよびキモスタチンによ
って阻害されず、塩化亜鉛および塩化銅で阻害されるプ
ロテアーゼ活性が欠損した大腸菌を宿主とした形質転換
体を培養して外来性タンパク又はポリペプチドを製造す
る方法。 - 【請求項２】 外来性タンパク又はポリペプチドがヒト
免疫インターフェロン活性を有することを特徴とする請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 形質転換体がＷ３１１０（Ｍ２５）／ｐ
ＩＮ５Ｔ４で表わされる請求項２記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31225393A JPH0763388B2 (ja) | 1993-12-13 | 1993-12-13 | 新規な大腸菌宿主を利用したタンパク又はポリペプチドの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31225393A JPH0763388B2 (ja) | 1993-12-13 | 1993-12-13 | 新規な大腸菌宿主を利用したタンパク又はポリペプチドの製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60295140A Division JPH0650985B2 (ja) | 1985-12-27 | 1985-12-27 | 新規な大腸菌宿主 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06339389A true JPH06339389A (ja) | 1994-12-13 |
| JPH0763388B2 JPH0763388B2 (ja) | 1995-07-12 |
Family
ID=18027015
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31225393A Expired - Fee Related JPH0763388B2 (ja) | 1993-12-13 | 1993-12-13 | 新規な大腸菌宿主を利用したタンパク又はポリペプチドの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0763388B2 (ja) |
-
1993
- 1993-12-13 JP JP31225393A patent/JPH0763388B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0763388B2 (ja) | 1995-07-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |