JPH063449B2 - 不均質免疫学的測定試験に用いるための安定な固定化ハプテン試薬及びその製造方法並びに用途 - Google Patents

不均質免疫学的測定試験に用いるための安定な固定化ハプテン試薬及びその製造方法並びに用途

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JPH063449B2
JPH063449B2 JP62308812A JP30881287A JPH063449B2 JP H063449 B2 JPH063449 B2 JP H063449B2 JP 62308812 A JP62308812 A JP 62308812A JP 30881287 A JP30881287 A JP 30881287A JP H063449 B2 JPH063449 B2 JP H063449B2
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Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 本発明は液体試験媒体中の分析対象物を測定するための
特異的結合試験及び該試験において用いられる試薬に関
する。特に、本発明は標識試薬の結合体と遊離体への分
離に、固定化されたハプテン試薬を用いるハプテン測定
のための不均質イムノアッセーに関する。
通常、測定すべき分析対象物、該分析対象物の特異的結
合相手及び標識試薬（分析対象物の結合相手と同一であ
っても異っていてもよい）の間の特異的結合相互作用が
関与する種々の不均質特異的結合試験が開発されてい
る。かかる試験を行う場合、標識試薬はその対応する結
合相手と結合して結合種となり、このような結合が行な
われない標識試薬はいずれも遊離種であり、この場合に
おける結合の程度が存在する分析対象物の量の関数であ
る。標識試薬の検知し得る応答が結合種及び遊離種にお
いて実質的に識別不能である場合は、存在する分析対象
物の量を効果的に測定するために、かかる結合種と遊離
種とを物理的に互いに分離することが必要である。した
がって、標識試薬の結合種と遊離種とが互いに分離され
たならば、標識試薬の特定の標識の活性を測定し、かか
る活性を存在する分析対象物の量に相関させることによ
ってどちらかのフラクションに存在する標識の量が、求
められる。
結合種と遊離種との物理的分離は種々の方法で行うこと
ができる。免疫学的測定試験として公知の不均質特異的
結合試験において、標識試薬は抗分析対象物抗体の標識
体である。かかる方式によれば、結合標識試薬からの遊
離標識試薬の分離は、遊離標識試薬の抗体と結合するこ
とになる、測定される分析対象物又はその類縁体の固定
化体を加えることによって行なわれる。例えば米国特許
第４，２００，４３６号は、測定すべき抗原に対する、
標識された１価の抗体の結合体と遊離体とを分離するた
めに、測定すべき抗原の固定化体を用いた抗原測定のた
めのイムノアッセーを開示している。抗原の固定化体
は、抗原を多糖類又はプラスチックのような固体支持体
又はキャリヤー材に化学的に結合させるか又は物理的に
吸着せしめることによって当該技術公知の方法により製
造される。
同様に、米国特許第４，５５１，４２６号は抗ジゴキシ
ン標識抗体の結合体及び遊離体を分離するために、ウア
バイン（ジゴキシンの類縁体）の固定化体を用いた、ハ
プテンジゴキシンのための不均質イムノアッセーを開示
している。ウアバインの固定化体は、ウアバインを直接
又は蛋白質、ポリアミノ酸もしくは合成リンカーのよう
なスペーサーアームを介してビーズ状アガロース、ビー
ズ状デキストラン、ポリアクリルアミドもしくはガラス
のような支持体材料に当該技術の方法によって結合せし
めることにより製造される。
しかしながら、かかる支持体材料並びに所望の分析対象
物又はその類縁体（リガンド）をかかる支持体材料へ結
合させる方法によれば、得られる試薬は比較的不安定な
ものとなり、上記のようなイムノアッセーに用いた場
合、試薬はリガンドを周囲液体へ実質的に放出するか又
は溶出させる。そのような不安定性は、リガンドの支持
体材料に対する非特異的結合のみならずリガンドと支持
体間の結合の不安定さの結果であると思われる。そのよ
うな結合の不安定さ及びリガンドの非特異的結合の結
果、かなりの量のリガンドが周囲媒体に徐々に放出され
るか又は溶出するようになる。リガンドの試験媒体中へ
の溶出は、主に、支持体材料の内部及び外部に非特異的
に結合した結果起る。該表面に非特異的に結合したリガ
ンドは、不便ではあるが、支持体材料を試験操作に供す
る前に水性洗浄溶液で洗浄することにより除去すること
ができる。しかしながら、内部に非特異的に結合したリ
ガンドを有効に除去するのは不可能であり、そのような
内在化せしめられたリガンドは支持体材料から液体試験
媒体中へ溶出する。そこで、リガンドと試験試料からの
分析対象物とを識別することは実質的に不可能となり、
その結果試験試料中に実際に存在する分析対象物の量の
測定が不正確になる。
ペプチド骨格構造と物理化学的に適合性を有する化学構
造の支持体材料、特に架橋ポリマー支持体の合成及び使
用もまた固体相ペプチドの合成に用いられることが記載
されている。特にペプチドをポリマーに結合せしめる方
法［Stahl等、j.Amer.Chem.Soc.第１０１（１８）巻、
５３８３頁（１９７９年）］及び、水性有機溶媒混合物
中での逆相懸濁重合を用いた種々のポリマーの架橋［Va
radarajan等、Biopolymers，第２２巻、８３９頁（１９
８３年）］が、かかる支持体材料に好ましい膨潤性を与
えて外部及び内部反応部位を増加させるために用いられ
ている。
したがって、本発明の目的は、水溶液中で安定で、かつ
ハプテンが周囲水溶液に徐々に放出されたり溶出するこ
とのない固定化されたハプテン試薬を提供することであ
る。
更に、本発明の目的は、非特異的に結合したハプテンが
実質的に内在しない、キャリヤー材の表面のみにハプテ
ン成分を実質的に共有結合（さもないとハプテンは周囲
媒体に徐々に放出されるか又は溶出する）せしめる方法
を提供することである。
本発明の他の目的はイムノアッセーに使用するための安
定な固定化されたハプテン試薬を提供して有効に固定化
を行いかつ標識試薬の遊離種をその結合種から分離する
ことである。
本発明のまた更なる目的は、液体試験試料中のハプテン
又はその結合性類縁体を正確に測定するための、分析上
非有意量の低い初期バックグラウンド信号を有する高感
受性の液体イムノアッセー法を提供することである。
［発明の概要］ 本発明は液体試料からハプテン又はその結合性類縁体を
測定するための特異的結合試験、特にイムノアッセーに
用いるための、水性環境下で実質的に安定な固定化され
たハプテン試薬（固定化ハプテン試薬）を提供する。固
定化ハプテン試薬はポリアクリルアミドゲル粒子及びそ
れに結合される複数のハプテン成分から成るキャリヤー
材料である。ゲル粒子はその内部及び外面上にそれぞれ
複数の外部及び内部官能性基を有し、ここで実質的に全
ての結合したハプテン成分は、水溶液、特にイムノアッ
セー試験媒体中で実質的に安定な連結基によって官能基
の外表面に共有結合せしめられ、キャリヤー材に非特異
的に結合したまま残存するハプテン成分の量は分析上非
有意量である。したがって、イムノアッセー実施中には
実質的に全てのハプテン成分がキャリヤー材に共有結合
した状態に留り、キャリヤー材から試験媒体中へ解離も
しくは溶出するハプテン成分は、もし存在するとしても
非有意量にすぎない。
また本発明によれば、ハプテン成分のゲル粒子への非特
異的結合、特にハプテン成分の、ゲル粒子の内部域への
非特異的結合を極小化する、安定な固定化ハプテン試薬
を製造する方法が提供される。上記方法は下記の工程か
ら成る： （ａ）ハプテン成分と、外表面及び内部に化学的に活性
な複数の官能基を有するポリアクリルアミドゲル粒子と
を、ゲル粒子が実質的に膨潤しない溶媒中、水溶液中で
実質的に安定な連結基によってゲル粒子の外表面の官能
基とハプテン成分との間に供給結合が形成される条件下
で反応させ； （ｂ）工程（ａ）で得られたゲル粒子を非膨潤溶媒で洗
浄し； （ｃ）工程（ｂ）で得られたゲル粒子を水性緩衝溶液で
洗浄し； （ｄ）該ゲル粒子とそれに結合する該ハプテン成分とか
ら成り、実質的に全ての結合ハプテン成分が、水溶液中
で実質的に安定な連結基によって外表面の官能基と共有
結合している、工程（ｃ）で得られた固定化ハプテン試
薬を単離する。
ゲル粒子は非膨潤溶媒の存在下にハプテン成分と反応さ
せた場合、実質的に非膨潤性を示し、したがって実質的
にハプテン成分不浸透であって、その共有結合は実質的
にゲル粒子の外表面官能基のみに限定される。工程
（ａ）においてゲル粒子の外表面に非特異的に結合され
るハプテン成分はいずれも工程（ｂ）及び（ｃ）それぞ
れの水性洗浄溶液によって除去される。
ハプテン又はその結合性類縁体と結合せしめられる標識
試薬をそのように結合していない標識試薬からすべて分
離することが必要な、ハプテン又はその結合性類縁体と
ハプテン又はその結合性類縁体の標識された結合相手で
ある標識試薬との間の結合が関与する不均質特異的結合
試験において固定化ハプテン試薬は特に有用である。試
験媒体からのハプテン又はその結合性類縁体に結合しな
い標識試薬はいずれも固定化ハプテン試薬のハプテンに
結合させることによって結合標識試薬から分離され、こ
の場合の結合の程度が液体試験試料中に存在するハプテ
ン又は結合性類縁体の関数である。
［好ましい実施態様の説明］ 本発明の固定化ハプテン試薬はハプテン又はその結合性
類縁体とハプテンもしくはその結合性類縁体の特異的結
合相手の標識体である標識試薬との結合が関与する従来
の不均質特異的結合試験法、特に不均質酵素イムノアッ
セーに用いることができる。更に、固定化ハプテン試薬
のハプテン成分は、生物系中に特異的結合相手が存在す
るハプテン又はその結合性類縁体を検出するためのかか
る特異的結合試験に用いるために変化させてもよく、ま
た合成することもできる。ハプテン又はその結合性類縁
体の特異的結合相手が抗ハプテン、例えばハプテンもし
くはそのフラグメントに対する抗体である場合に、かか
る特異的結合試験法を免疫学的測定方法という。
かかる不均質特異的結合試験法、特に免疫学的測定法に
よれば、検出されるハプテン又はその結合性類縁体を、
通常標識試薬と合わせることにより反応混合物が形成さ
れ、ここで標識試薬は測定すべきハプテンに結合され
る。次に、かかる結合の程度を測定して測定すべきハプ
テンに関係づけられる。測定されるハプテンに結合した
標識試薬（すなわち結合種）の量のそのように結合して
いない標識試薬（遊離種）の量に対する比率が存在する
ハプテンの量の関数である。結合種と遊離種両者の標識
試薬の標識から発せられる信号は識別不可能であるため
遊離種と結合種とを物理的に分離してどちらか一方に存
在する標識の量を単独に測定する必要があり、次にこの
測定値を存在するハプテンの量に関係づけることができ
る。
本発明の固定化ハプテン試薬は、遊離種が固定化ハプテ
ン試薬に結合することによって固定化されて所要の分離
工程が行なわれる特異的結合試験において、標識された
抗ハプテン抗体の遊離種を、そのような抗ハプテン抗体
の結合種から分離する際に特に有用である。特に、本発
明の固定化ハプテン試薬は適切な官能基を与えられたポ
リアクリルアミドゲル粒子のキャリヤー材とそれに結合
する複数のハプテン成分から成る。ゲル粒子は複数の外
部及び内部官能基を有し、実質的に全ての結合ハプテン
成分がゲル粒子の外表面基のみに連結基によって共有結
合される。連結基は水溶液、特にイムノアッセーの液体
試験媒体から成る水溶液中で実質的に安定な共有結合を
与え、ここでハプテン成分はイムノアッセー操作工程中
キャリヤー材に共有結合した状態に留って遊離種を結合
種から有効に分離する。水性環境下におけるかかる安定
性によってキャリヤー材からのハプテン成分の解離が防
止され、したがって、試験媒体環境中へのハプテン成分
の溶出が防止されることにより、以下により詳細に説明
するように試験の感受性及び正確度が増強されるものと
理解すべきである。
本発明の好ましい実施態様によれば、固定化ハプテン試
薬は液体試験試料からジゴキシンを検出するためのイム
ノアッセーにおいて特に有用である。標識試薬は通常当
該技術公知の方法によって得られ、酵素、好ましくはβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼで標識された、ジゴキシンに対
するモノクローナル抗体、好ましくはジゴキシンに対す
るモノクローナルＩｇＧ抗体のＦａｂ′フラグメントか
ら誘導される１価の酵素標識抗体フラグメントから成
る。好ましくは、標識試薬は本願と同日付で出願された
共に審査にかかっている米国特許出願、「実質的に純粋
な酵素−抗体単複合体（モノコンジュゲート）の製造」
（書類番号ＭＳ−１４７７）に記載の方法によって、電
気泳動法により電気泳動ポリアクリルアミドゲル上で精
製することにより単一の酵素成分に共有結合された単一
の１価の抗体フラグメント成分から成る実質的に純粋な
標識試薬の単複合体調製品が得られる。
ジゴキシンに対するイムノアッセーは、以下により詳細
に説明するように標識試薬、好ましくはその単複合体調
製品を、ジゴキシンを含有する試験試料と反応させてか
ら、アミン官能化されたポリアクリルアミドキャリヤー
材の外表面アミン基に連結基によって共有結合されたジ
ゴキシン又はその類縁体、例えばジギトキシゲニンから
成る本発明の固定化ハプテン試薬を加えることによって
行なう。かかる固定化ハプテン試薬のハプテン成分がジ
ゴキシン又はジゴキシンの類縁体、例えばジギトキシゲ
ニンである場合、液体試験試料からのジゴキシンは標識
試薬の抗体フラグメントに結合してその結合種を形成
し、試験試料からのジゴキシンに結合しない標識試薬の
遊離種はいずれも固定化ハプテン試薬に結合して固定化
された後結合種から分離される。この場合、結合種は溶
液中に残り、遊離種は沈降除去される。次に標識試薬の
結合種の酵素活性を測定することにより、試験試料中の
ジゴキシンの量が求められる。
本発明の他の好ましい実施態様によれば、固定化ハプテ
ン試薬は、本願と同日付で出願された共に審査にかかっ
ている米国特許出願「架橋ポリアクリルアミドスルフヒ
ドリルゲル及びそのスルフヒドリル官能性誘導体」（書
類番号ＭＳ−１４７８）」に記載されるようなポリアク
リルアミド−スルフヒドリル誘導キャリヤー材の外表面
のスルフヒドリル基に共有結合したグリコシル化ペプチ
ド配列、例えばヒトヘモグロビンのβ−サブユニット中
のグリコシル化Ｎ−末端ペプチド配列（グリコペプチ
ド）に対応するものから成る。標識試薬は、上記のよう
にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼで標識され、単複合体に精
製された、ヒトヘモグロビンのβ−サブユニット中のグ
リコシル化Ｎ−末端ペプチド配列に対して特異的なモノ
クローナル抗体から誘導された１価の抗体フラグメント
（欧州特許出願第１８５，８７０号参照）から成り、液
体試験試料中のＨｂＡｌｃの量は標識試薬の結合種の酵
素活性を測定することによって求められる。
かかるイムノアッセーにおける酵素活性の測定は、アリ
コート量の上澄みを取り、これを酵素標識に対する色原
体性基質、例えばレゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド、ｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド、、またより好ましくは、本願と同日付で出願さ
れた共に審査にかかっている米国特許出願「色原体性ア
クリジノン酵素基質」（書類番号ＭＳ−１４７０）に記
載されるような、β−Ｄ−ガラクトース残基で誘導され
た７−ヒドロキシ−９Ｈ−アクリジン−１−オン色原体
から成るβ−Ｄ−ガラクトシダーゼに対する色原体性ア
クリジノン酵素基質を含有する試薬パッド上に施すこと
によって行なう。酵素と色原体性基質との相互作用によ
って発生する検知可能な信号は、次に例えば反射光度計
によって測定され、液体試験試料中に存在するハプテン
の量に関係づけられる。
固定化ハプテン試薬 液体試験試料中に存在するハプテンの量を正確に測定す
るための高感受性イムノアッセーを与えるためには、キ
ャリヤー材に対するハプテン成分の非特異的結合を極小
化すべきであることが理解されるべきである。さもない
と、もしそのような非特異的結合ハプテン成分が存在し
た場合、キャリヤー材からハプテン成分が解離して徐々
にイムノアッセー液体試験媒体中に遊離ハプテン種とし
て放出されるか又は溶出することになり、遊離ハプテン
種は標識試薬への結合について試料からのハプテンと競
合する。したがって、かかる解離ハプテン成分に結合し
た標識試薬の標識はバックグラウンド信号を発生し、該
信号により試験試薬からのハプテンに結合した標識試薬
の標識によって与えらる信号の測定が妨害される結果、
液体試験試料から検出されるハプテンの測定が不正確に
なる。
したがって、本発明の主な特徴は、水溶液中で安定であ
って、適切な官能性を付与されたポリアクリルアミドゲ
ル粒子キャリヤー材の外表面のみに実質的に共有結合し
たハプテン成分から成り、上記キャリヤー材に非特異的
に結合するハプテン成分は、もし存在しても分析上非有
意量であるような固定化ハプテン試薬を提供することで
ある。
本発明によれば、非特異的に結合するハプテンは、ハプ
テン成分と適切に官能性を付与された又は誘導されたポ
リアクリルアミド樹脂とを、それらを安定に共有結合さ
せる連結基の存在下、非膨潤溶媒中で反応させることに
より許容し得る限度に制御することができ、水溶液中で
実質的に安定な固定化ハプテン試薬が得られる。
以下に、より詳細に述べるように、非膨潤溶媒は共有結
合の程度を実質的にキャリヤー材の外表面の官能基にの
み制限する。
（ａ）キャリヤー材 本発明の好ましい実施態様によれば、固定化ハプテン試
薬のキャリヤー材は、一般に水溶液中で膨潤性であっ
て、当該技術において公知の方法によって製造されるア
ミノエチル誘導ポリアクリルアミド樹脂である。かかる
方法によれば、まず、アクリルアミドとＮ，Ｎ′−メチ
レンビスアクリルアミドとの共重合によりポリアクリル
アミド樹脂を製造［S.Hjerten及びR.Mosbach.Anal.Che
m.第３巻，１０９頁（１９６２年）］し、適切な条件下
で架橋ポリアクリルアミド鎖を形成した後、無水エチレ
ン−ジアミンで処理［J.K.Inman及びH.M.Dintzis.Bioch
emistry.第８巻、４０７４頁（１９６９年）］すること
により、本発明の固定化ハプテン試薬のキャリヤー材と
して使用される、複数のアミン官能基から成るアミノエ
チル誘導ポリアクリルアミドゲルが得られる。上記のよ
うに、ポリアクリルアミド樹脂をアミン官能基によって
直接活性化することによって前者を誘導する以外にも、
アクリルアミド及びメチレンビスアクリルアミドを例え
ば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドもしくはＮ−ヒドロ
キシフタルイミドのアクリル酸エステルと共重合させて
から直ちにアミノヘキシル基のような第１級アミノ官能
基を有するハプテンと反応させて上記樹脂中の活性エス
テルを置換する［J.K.Inman.Methods in Enzymology、
第３４Ｂ巻、３０〜５８頁（１９７４年）；G.L.Stahl
等、J.Org.Chem、第４４巻、３４２４頁（１９７９
年）；G.L.Stahl等、J.Amer.Chem.Soc、第１０１巻、５
３８３頁（１９７９年）参照］ことによって本発明の固
定化ハプテン試薬を提供することができる。
アミノエチル誘導ポリアクリルアミドゲルは、ハプテン
をそこへ結合又は固定化させる高い能力、並びに低い非
特異的吸着性故に特に好ましい。更に、樹脂乾燥重量ｇ
当り通常約１．０〜２．０ｍｅｑの種々のアミノエチル
能を有するゲルも市販されている(Bio-Rad Laboratorie
s,Richmond Ca.,U.S.A.)。上記ゲルはまたpH２．０〜１
０．０の好ましいpH域を有し、このpH域より高いか又は
低いpH値においてはアミド側基が加水分解されやすい。
本発明の他の実施態様によれば、固定化ハプテン試薬の
キャリヤー材は官能基として複数のスルフヒドリル基を
有する新規なポリアクリルアミドスルフヒドリルゲル
（本願と同日付で出願された共に審査にかかっている米
国特許出願「架橋ポリアクリルアミドスルフヒドリルゲ
ル及びそのスルフヒドリル官能性誘導体（書類番号ＭＳ
−１４７８）」により詳細に記載されている）である。
ポリアクリルアミドスルフヒドリルゲルはアクリルアミ
ド、ビスアクリルアミド及びＮ，Ｎ′−ビスアクリリル
シスタミンの遊離基重合によって調製され、ＨｂＡｌＣ
として知られるグリコシル化された形態のヘモグロビン
のイムノアッセー測定用の固定化グリコペプチド試薬の
製造に特に有用である。ポリアクリルアミドスルフヒド
リゲルは同様に水溶液中で膨潤し得るものであることが
理解されるべきである。膨潤特性は用いるモノマー類の
比率、架橋度、特定の架橋基及び活性官能基によって制
御することができる。
一般に、ポリアクリルアミドゲル粒子の物理的構造は外
表面及び内部を画定する架橋ポリアクリルアミド鎖から
成り、ここでは、上記のようにゲル粒子が膨潤しない場
合はハプテン成分及び他の試薬の内部域へのアクセシビ
リティーは制限される。ゲル粒子の膨潤特性は、架橋ポ
リアクリルアミド鎖の網状構造の結果得られるもので、
通常多孔質のゲル粒子が得られる。したがって、ゲル粒
子が膨潤していない場合、ポリアクリルアミド鎖は架橋
基によって結束保持されることにより、ハプテン成分よ
り小さい又はハプテン成分を通過しない有効な孔径が得
られ、それにより、それらがゲル粒子の内部域へ浸透し
たり内在化するのが防止される。上記粒子は、以下によ
り詳細に説明するように更にそれらの外表面及び内部域
に、ハプテン成分と上記粒子との連結基による安定な共
有結合を形成するために必要な複数の化学的に活性な官
能基をそれぞれ有する。ハプテン成分と上記粒子の官能
基との間に共有結合が形成されない場合は、恐らくかか
るハプテン成分は非特異的結合相互作用、例えば、イオ
ン性及び疎水性結合相互作用等によって粒子に非特異的
に結合することが理解されるべきである。そのような、
ハプテン成分の粒子への非特異的結合により、キャリヤ
ー材からのかかる非特異的結合ハプテン成分の解離度が
大きくなり、イムノアッセー試験条件下又は他の水性環
境下での溶出又は徐放の度合も高くなる。
上記のように、水性環境下又は有機性能環境下のいずれ
においても、ハプテン成分と官能基との間には実質的に
安定な共有結合を形成し得るが、本発明により、ハプテ
ン成分のゲル粒子、より詳細にはゲル粒子の外表面への
みの非特異的結合を最少量にとどめるために本発明によ
る非膨潤溶媒を用いることが好ましい。特に、上記粒子
の親水性が実質的に高いために、望ましくないゲルの膨
潤が起り、水溶液中ではハプテン成分や他の試薬がゲル
粒子に浸透したり内在化する一方、有機溶媒又は水を少
量含むかもしくは全く含まない溶媒中においては実質的
に膨潤が起ることはなく、膨潤に伴うかかる浸透や内在
化も実質的には起らない。したがって、本発明による非
膨潤溶媒を用いることにより、ゲル粒子の膨潤が実質的
に防止され、それによって、ハプテン成分及び他の試薬
の粒子内への侵透又は内在化が極小化されることによっ
てハプテン成分の共有結合は実質的にゲル粒子の外表面
の官能基に対してのみに制限される。さもないと、その
ような内在化が起ることにより、上記のようにハプテン
成分とゲル粒子の内表面域に存在する官能基との間に望
ましくない共有結合が形成されることになる。また、そ
のような、ハプテン成分及び他の試薬の内在化により、
そのような内在化ハプテン成分は洗浄溶液によっては除
去することの困難な非特異的吸着を起す可能性が大きく
なり、これが後に、イムノアッセー実施中にゲル粒子か
ら溶出すると試験の感受性や正確度が低減される。
したがって、ハプテン成分のゲル粒子への固定化は、ジ
メチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセト
ン、塩素化炭化水素、環式及び非環式アルキルエーテル
等のような好ましくは水を殆ど又は全く含まない非膨潤
有機溶媒中で行い、それによりゲル粒子の膨潤が実質的
に無くなり、従って膨潤に伴うハプテン成分や他の試薬
のゲル粒子内への浸透又は内在化が実質的に無くなる。
粒径のわずかな増大によりハプテン成分や他の試薬を実
質的に通過しないゲル粒子が得られると共に、それらが
ゲル粒子内へ浸透するのを有効を防ぐことができるの
で、ハプテン成分の非特異的結合は実質的にゲル粒子の
外表面にのみ制御される。ゲル粒子の外表面に非特異的
に結合するハプテン成分はいずれも非膨潤洗浄溶液、次
いで適切に緩衝化されたリンス溶液又は洗浄溶液、例え
ば酸性食塩溶液によって有効に除去される。そのような
外表面の非特異的結合ハプテン成分の除去により、得ら
れた固定化ハプテン試薬は実質的に全てがゲル粒子の外
表面に共有結合しているハプテン成分から成る。したが
って上記試薬は、キャリヤー材に非特異的に結合するハ
プテン成分が非有意量である結果として水溶液中では実
質的に安定なものとなる。特に、本発明によれば、水溶
液、例えば実施例５に記載のリン酸塩−クロリド試験緩
衝液のような緩衝液中に静置した際に、ゲル粒子から解
離するのは樹脂１ｇ当りハプテン成分約１×１０-12モ
ル未満、より一般的には樹脂１ｇ当りハプテン成分約１
×１０-13モル未満、好ましくは樹脂１ｇ当りハプテン
成分約１×１０-14モル未満であり、イムノアッセー実
験中のハプテン成分の溶出は非有意量となり得ることが
理解されるべきである。
（ｂ）ハプテン成分 固定化ハプテン試薬のハプテン成分は測定すべきハプテ
ンであっても、また標識試薬であるその特異的結合相手
に結合し得るその類縁体であってもよく、上記ハプテン
又はその結合性類縁体は、本発明によりキャリヤー材粒
子の外表面官能基に共有結合することができる。
特に、生物系中に結合相手が存在するか又は結合相手を
合成することができるハプテンを測定するために本発明
の固定化ハプテン試薬のハプテン成分を選択することが
でき、例えばジゴキシン、ジギトキシゲニン、ジギトキ
シン、ジゴキシゲニン、１２−Ｏ−アセチルジゴキシゲ
ニン及びグリコシル化ペプチド配列、例えばヒトヘモグ
ロビンのβ−サブユニット中のグリコシル化Ｎ−末端ペ
プチド配列、並びにその他の一般薬剤類、代謝物、ホル
モン、ビタミン、毒素及び同様の有機化合物が挙げられ
るがそれらに制御されることはない。ハプテン性ホルモ
ンとしては、チロキシン及びトリヨードチロニンが挙げ
られる。ビタミンとしてはビタミンＡ、Ｂ、例えば
Ｂ12、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＫ、葉酸及びチアミンが挙げられ
る。薬剤としては、アミノグリコシド類、例えばゲンタ
マイシン、トブラマイシン、アミカシン、シソマイシ
ン、カナマイシン、ネチルマイシン、ペニシリン、テト
ラサイクリン、テラマイシン、クロロマイセチン、及び
アクチノマイセチンのような抗生物質；ヌクレオシド類
及びヌクレオチド類、例えばアデノシン二リン酸（ＡＤ
Ｐ），アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、フラビンモノヌ
クレオチド（ＦＭＮ）、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（ＮＡＤ）及びそのリン酸塩誘導体（ＮＡＤ
Ｐ），チミジン、グアノシン及びアデノシン；プロスタ
グランジン類；ステロイド類；例えばエストリオール及
びエストラジオールのようなエストロゲン類、ステロゲ
ン類、アンドロゲン類、及びアドレノコルチカルステロ
イド類；その他フェノバルビタール、フェニトレン、プ
リミドン、エトスクシミド、カルバマゼピン、バルプロ
エート、テオフィリン、カフェイン、プロプラノロー
ル、プロカインアミド、キニジン、アミトリプチウリ
ン、コルチゾール、デジプラミン、ジソピラミド、ドキ
セピン、ゴキソルビシン、ノルトリプチリン、メトトレ
キセート、イミプラミン、リドカイン、プロカインアミ
ド、Ｎ−アセチルプロカインアミド、アンフェタミン
類、カテコールアミン類、及び抗ヒスタミン類が挙げら
れる。毒素としてはアセチルＴ−２トキシン、アルファ
トキシン、コレラトキシン、シトリニン、サイトカラシ
ン類、スタフィロコッカルエンテロトキシンＢ、ＨＴ−
２トキシン等が挙げられる。
（ｃ）連結基 アミノエチル誘導ポリアクリルアミドゲル粒子を用いる
本発明の固定化ハプテン試薬の連結基は当該技術公知の
種々の連結基から選択することができ、例えば１，６−
ヘキサメチレンジアミン、６−アミノヘキサノール、
１，１２−ジアミノ−４，５−ジオキサドデカン、１，
１７−ジアミノ３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ
ヘプタデカン、ウシ血清アルブミン及び６−アミノカプ
ロン酸の二官能性残基が挙げられるが、これらに制限さ
れることはない。
同様に、上記のように新規なポリアクリルアミドスルフ
ヒドリルゲルを用いる本発明の固定化ハプテン試薬の連
結基は当該技術公知の種々の連結基からも選択すること
ができ、例えばビスマレイミド（１，１′［メチレンジ
−４，１−フェニレン］ビスマレイミド）、ビスマレイ
ミド−ヘキサン、及びビスマレイミド−ヘキサエチレン
グリコールの二官能性残基が挙げられるがそれらに制限
されることはない。
本発明により、パプテン成分とゲル粒子との間に安定な
共有結合を与えるための適切な連結基を選ぶ際に最も考
慮すべきことは、正しい配向間隔及び固定化ハプテン試
薬と標識試薬の遊離種との間の結合相互作用中にそれら
に立体障害が無いことである。特に固定支持体材料に緊
密に結合するハプテンは、生物体の活性部位がその分子
構造内の深部に位置しているため、標識試薬の特異的結
合相手との相互作用性が弱く、したがって結合相互作用
を起しにくい。一方、適切な長さのフレキシブルなスペ
ーサーアーム又は連結基を介してかかるハプテンを固定
支持体に結合させめることにより結合の実質的増加が起
るようである。しかしながら、実質的に長めのスペーサ
ーアームは液体試験試料中の物質を、疎水性結合相互作
用［P.O'Carra等、Biochem.Soc.Trans.、第１巻、２８９
〜２９０頁（１９７３年）］によって結合することが証
明されている。したがって、連結基が短すぎる場合、ハ
プテンはその特異性結合相手に結合せず、また長すぎる
と、非特異的結合効果が顕著になって標識試薬の結合種
のその遊離種からの分離選択率が低下する。
したがって、当業者は本発明の新規な特徴を実質的に無
視しないように上記の点を考慮すれば連結基を選択する
ことができる。安定な連結基を選択しかつ実質的に内在
化を防止するような方法でハプテン成分を結合すること
により、水容液中で実質的に安定な本発明の固定化ハプ
テン試薬が得られる。
特に、ハプテン成分とアミノエチル誘導ポリアクリルア
ミドゲル粒子との間の安定な共有結合は、上記のように
有機溶媒、好ましくは無水の有機溶媒のような非膨潤溶
媒の液体反応環境下でゲル粒子の外表面上のアミン基
と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化された、カ
ルボキシ官能化ハプテン成分との間にアミド結合を形成
することによって形成することができる。特に、ハプテ
ン成分は、まずクロロ蟻酸ｐ−ニトロフエニルで活性化
し、次にスペーサーアーム又は連結基としての６−アミ
ノカプロン酸でカルボキシ官能化する。次に、カルボキ
シ官能化ハプテン成分をＮ−ヒドロキシスクシンイミド
で活性化してそのエステルと成し、次にこのエステルを
ジメチルホルムアミドから成る無水有機液体反応環境下
でアミノエチル誘導ポリアクリルアミドゲルと反応させ
る。
特に、活性化されたハプテン成分のエステルはゲルと、
乾燥樹脂重量１ｇにつきハプテン成分約５０μモル〜
０．０００５μモル、好ましくは乾燥樹脂重量１ｇにつ
きハプテン成分０．０５μモル（この場合、反応混合物
中のハプテン成分の濃度はいずれも１０ｍＭ〜１μＭ、
好ましくは１０μＭである）の量で反応させる。ゲル粒
子の外表面に非特異的に結合するハプテン成分は、上記
のように有機洗浄溶液、次いで例えば２ＭＮａＣｌ及び
０．１Ｍ酢酸（pH２．３）溶液から成る洗浄水溶液によ
ってすべて除去され、この間及びその後のかかる固定化
ハプテン試薬を用いるイムノアッセーの実施中もアミン
基に共有結合せしめられたハプテン成分はアミン基と結
合したままである。
本発明の固定化グリコペプチド試薬の場合は、ヒトヘモ
グロビンのβ−サブユニットにおけるグリコシル化Ｎ−
末端ペプチド配列（例えばグリコペプチド）と、新規な
ポリアクリルアミドスルフヒドリルゲルとの間の安定な
共有結合は、ゲル粒子の外表面上のスルフヒドリル基と
活性化されたグリコペプチドとの間にスルフイド結合を
形成することによって形成することができる。特に、グ
リコペプチドは、まず連結基として１，１′−［メチレ
ン−４，１−フエニレン］ビスマレイミド、ビスマレイ
ミド−ヘキサン又はビスマレイミド−ヘキサエチレング
リコールのようなビスマレイミド化合物で活性化する。
次に活性化されたグリコペプチドは予め非膨潤溶媒中
で、例えばジチオトレイトールで還元したポリアクリル
アミドスルフヒドリルゲルと反応させることによりスル
フヒドリル官能基が与えられる。
試薬系（試薬キット） 本発明は更に、所望のイムノアッセー法を行うために必
要な主要要素をすべて含む試薬系を提供する。試薬系は
市販用の包装品形態で、試薬間に相容性のある組成物又
は混合物として、試験具の形態で、又はより一般的には
試験キットとして（つまり１以上の容器の組合わせ）、
必要な試薬の入った装置等として、通常はイムノアッセ
ー実施のための説明書と共に提供される。
特に、試薬系は少くとも（１）本発明の固定化ハプテン
試薬（２）標識されたハプテンの特異的結合相手、好ま
しくは、酵素で標識された、測定すべきハプテンに対す
るモノクローナル抗体から誘導された一価の抗体フラグ
メントから成る標識試薬、好ましくは上記のような実質
的に純粋なそのモノコンジュゲート（単複合体）から成
る。好ましくは、試薬系はまた、標識試薬の指示薬、好
ましくは上記のような標識試薬の標識が酵素であり、検
知可能な信号（これは測定して存在するハプテンの量に
関係づけることができる）を発する色原体性アクリジノ
ン酵素基質を含浸した試薬パッドから成る試験片のよう
な指示薬手段を含む。
特に、本発明を下記の実施例により説明するが、本発明
はそれらによって制限されるものではない。
実施例１ ジギトキシゲニンの合成及び精製 ジギトキシン（Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI.US
A.製品NO.ＪＭ０２６２４ＭＬ）７６５mg（１ミリモ
ル）及びエタノールと０．１Ｎ ＨＣｌとの１：１（ｖ
／ｖ）混合物４０mlから成る溶液を８０℃で６０分撹拌
してから室温に冷却した。溶媒を約１０mlまで減圧蒸発
した。溶媒は固体の白色沈澱を含んでいた。この混合物
クロロホルム２０mlずつで３回抽出した。抽出物を合わ
せて水２０mlで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶
媒を減圧蒸発すると白色の固体物質が得られた。
上記の白色固体物質をクロロホルムとエタノールとの
１：１（ｖ／ｖ）混合物４０ml中に溶解してからシリカ
ゲル（２００〜４００メッシュ）４０ｇの入ったフラッ
シュクロマトグラフィー用カラム（１２．５cm×６０c
m）に通し、ヘキサンと酢酸エチルとの１：１（ｖ／
ｖ）混合物で溶出した。カラムから溶出されたフラクシ
ョンを採取して薄層クロマトグラフィーによって分析
［クロロホルム／メタノール９：１（ｖ／ｖ）］し、ジ
ギトキシゲニン生成物を含有するフラクションを、ｐ−
アニスアルデヒドスプレー試薬（９５％エチルアルコー
ル９００ml、ｐ−アニスアルデヒド５０ml、濃縮硫酸５
０ml及び酢酸５０ml）を用い所望のジギトキシゲニン生
成物の存在を示す、加熱による青色発色を観察すること
によって測定した。生成物フラクションを合わせ、溶媒
を減圧蒸発することにより白色の固体物質が得られた。
次にこれをエタノールと水との１：１（ｖ／ｖ）混合物
から再結晶すると光沢のある白い結晶状のジギトキシゲ
ニン３００mgが得られた。
実施例２ 炭酸３−ジギトキシゲニニル−ｐ−ニトロフェニルの合
成 ジギトキシゲニン（実施例１に従って調製）７４９mg
（２ミリモル）の４−ジメチルアミノピリジン６１mg
（０．５ミリモル）を含む無水ピリジン２０ml中の反応
溶液を形成し、クロロ蟻酸ｐ−ニトロフェニル５２４mg
（２．６ミリモル）と共にアルゴン雰囲気下、室温で５
時間撹拌し、更にクロロ蟻酸ｐ−ニトロフェニル６０mg
（０．３ミリモル）を加えて同じ条件下で１５時間撹拌
することにより、活性化されたジギトキシゲニンを製造
した。溶媒を減圧蒸発した。残渣をクロロフォルム４ml
中に懸濁し、懸濁液を、シリカゲル（２３０〜４００メ
ッシュ）１００ｇの入ったフラッシュクロマトグラフィ
ー用カラム（３cm×６０cm）に通し、ヘキサンと酢酸エ
チルとの１：１（ｖ／ｖ）混合物で溶出した。カラムか
ら溶出されたフラクションを採取し、薄層クロマトグラ
フィーによって分析［クロロホルム／メタノール９：１
（ｖ／ｖ）］し炭酸３−ジギトキシゲニニル−ｐ−ニト
ロフェニルを含有するフラクションを、ｐ−アニスアル
デヒドスプレー試薬を用い、所望の生成物の存在を示
す、加熱による青色発色を観察することによって測定し
た。生成物フラクションを合わせ、溶媒を減圧蒸発する
ことにより固体生成物が得られた。次にこれをヘキサン
とクロロホルムとの混合物から再結晶すると淡黄色の結
晶状の炭酸３−ジギトキシゲニニル−ｐ−ニトロフェニ
ル２７９mgが得られた。
実施例３ ３−Ｏ−（５−カルボキシペンタン−１−カルバモイ
ル）ジギトキシゲニンの合成 炭酸３−ジギトキシゲニニル−ｐ−ニトロフェニル（実
施例２に従って調製）１．０８ｇ（２ミリモル）の無水
ピリジン５０ml中の反応溶液を形成し、ピリジンと水と
の１：１（ｖ／ｖ）混合物１０ml中の６−アミノカプロ
ン酸３１５mg（２．４ミリモル）及びトリエチルアミン
３３７μｌ（２．４ミリミル）溶液を徐々に５分間かけ
て加えながら室温で撹拌することにより、活性化ジギト
キシゲニンをカルボキシ官能化した。次に反応混合物を
室温で２１時間撹拌し、溶媒を減圧蒸発した。残渣を無
水トルエン２５ml中に溶解し、溶媒を減圧蒸発した。
残渣を塩化メチレンとメタノールと酢酸との２００：１
０：１（ｖ／ｖ）混合物５mlに溶解した後、シリカゲル
（２３０〜４００メッシュ）２００ｇの入ったフラッシ
ュクロマトグラフイー用カラム（５ｃｍ×６０ｃｍ）に
通し塩化メチレンとメタノールと酢酸との２００：１
０：１混合物で溶出した。カラムから溶出されたフラク
ションを採取し、薄層クロマトグラフイーで分析［塩化
メチレン／メタノール／酢酸２００：１０：１（ｖ／
ｖ）］し、３−Ｏ−（５−カルボキシペンタン−１−カ
ルバモイル）ジギトキシゲニンを含有するフラクション
をｐ−アニスアルデヒドスプレー試薬を用い、所望の生
成物の存在を示す、加熱による青色発色を観察すること
によって測定した。生成物フラクションを合わせ、溶媒
を減圧蒸発することにより明澄な油状物が得られた。次
にこれを無水エチルエーテル１０mlで再結晶すると白色
の固体生成物が得られ、これを取し、高真空化、４０
°Ｃで１時間乾燥すると３−Ｏ−（５−カルボキシペン
タン−１−カルバモイル）ジギトキシゲニン５６８mgが
発色固体として得られた。
実施例４ ３−Ｏ−（５−カルボキシペンタ−１−カルバモイル）
ジギトキシゲニンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドによ
る活性化 ３−Ｏ−（５−カルボキシペンタン−１−カルバモイ
ル）ジギトキシゲニン（実施例３に従って製造）６４ml
（１１７μモル）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（ＤＭＦ）２ml中反応溶液を形成し、アルゴン雰囲気
下、室温で撹拌し、トリエチルアミン２８μｌ（２００
μモル）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１５mg（１３
０μモル）及びＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド２７mg（１３０μモル）を加えることによりカルボキ
シ官能化ジギトキシゲニンのエステルを製造した。２４
時間後、沈澱したジシクロヘキシル尿素を去し、３−
Ｏ−（５−カルボキシペンタン−１−カルバモイル）ジ
ギトキシゲニンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルを含有する液をＤＭＦで希釈して１１．１１１mlと
した。この反応は通常完了することはない。
実施例５ アミノエチルＢＩＯ−ＧＥＬ Ｐ−２樹脂に共有結合し
た３−Ｏ−（５−カルボキシペンタン−１−カルバモイ
ル）ジギトキシゲニンのＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルの合成 まず、アミノエチルＢＩＯ−ＧＥＬ Ｐ−２樹脂（Bio-
Rad Laboratories,Richmond,CA.UAS;製品NO.２８９４５
アミン官能基１．３９ｍｅｑ／ｇ乾燥樹脂）２ｇのＤＭ
Ｆ１０ml中懸濁液を形成し、これを室温で４８時間イン
キュベートすることによりアミノエチル誘導ポリアクリ
ルアミドゲル粒子の外表面アミン基に共有結合したジギ
トキシゲニンから成る本発明の固定化ハプテン試薬を製
造した。アミノエチル誘導ＢＩＯ−ＧＥＬ Ｐ−２樹脂
のＤＭＦ溶液から上澄のアリコート１０mlを除去し、そ
の代わりに実施例４に従って調製したＤＭＦ中の活性化
ジギトキシゲニン１０mlを加えて、上記樹脂の乾燥重量
ｇ当り５０μモルの活性化ジギトキシゲニンを含む反応
溶液を形成し、回転ミキサー（転倒式撹拌）により室温
で４８時間緩やかに混合した。
同様に、上記操作に従って、樹脂乾燥重量ｇ当り５μモ
ル、０．５μモル及び０．０５μモルの活性化ジギトキ
シゲニンから成る反応溶液を、同様にして調製したＤＭ
Ｆ中のＢＩＯ−ＧＥＬ Ｐ−２樹脂の上澄み１．０ml、
０．１ml及び０．０１mlを除去し、その代わりに１．０
ml、０．１ml及び０．０１mlの実施例４に従って調製し
た活性化ジギトキシゲニンのＤＭＦ溶液をそれぞれ加え
ることにより調製した。
上記のようにして調製した、アミノエチル誘導ＢＩＯ−
ＧＥＬ Ｐ−２樹脂に共有結合したジギトキシゲニンか
ら成る本発明の固定化ハプテン試薬の４つの試料をそれ
ぞれ取し、ＤＭＦ１０mlづつで１０回、次に２Ｍ Ｎ
ａＣｌと０．１Ｍ酢酸（pH２．３）から成る緩衝化洗浄
溶液（以後「洗浄緩衝液」と呼ぶ）１０mlづつで５回洗
浄した。洗浄された試薬試料をカラムに注ぎ、床の１４
倍の量の洗浄緩衝液で洗浄した。洗浄された各試薬溶液
からのアルコート２〜３mlを小さいカラムに注ぎ、水５
０ml、次いで０．０５Ｍリン酸ナトリウム、０．０５Ｍ
塩化ナトリウム、０．００１Ｍ塩化マグネシウム、１０
０μｇ／mlウシ血清アルブミン及び０．０２％ナトリウ
ムアジドを含む試験緩衝液（pH７．４）（以後「試験緩
衝液」と呼ぶ）で洗浄し、最後に十分量の試験緩衝液に
再懸濁して、沈澱した樹脂の２倍の容量の懸濁液（つま
り臨界値５０％）を得た。次に、残りの洗浄された樹脂
試料７〜８mlを水６０mlで洗浄し、５０％臨界値から凍
結乾燥した。
実施例６ 実験結果 実施例５に従って調製した固定化ジギトキシゲニン試薬
樹脂とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＯＳ）で活性
化されていないカルボキシ官能ジギトキシゲニンを用い
て同様にして調製した対照のジギトキシゲニン樹脂と
を、本発明により調製した場合の固定化ジギトキシゲニ
ン試薬における共有結合と非特異的結合の程度を示すた
めに比較した。かかる対照を用いた理由は、ジギトキシ
ゲニンのＮＯＳ−エステルの形成が１００％完了に至る
ことは無く、そのため樹脂に非特異的に結合し得る非活
性化ジギトキシゲニンがなおも存在するからである。
ａ．ジギトキシゲニンの樹脂に対する共有結合の評価 実施例５に従ってアミノエチル誘導ＢＩＯ−ＧＥＬ Ｐ
−２樹脂２ｇのＤＭＦ１０ml懸濁液からまず上澄をそれ
ぞれ１０．０ml、１．０ml、及び０．０１ml除去し、そ
の代わりにそれぞれに対応する量の、実施例３に従って
調製した非活性化カルボキシ官能性ジギトキシゲニンの
溶液を加えることにより対照樹脂を調製した。次に、実
施例５と同様に操作して、アミノエチル誘導ＢＩＯ−Ｇ
ＥＬ Ｐ−２樹脂に非特異的に結合したジギトキシゲニ
ンから成る対照樹脂をそれぞれ調製した。実施例５に従
って調製した４種の固定化ジギトキシゲニン試薬樹脂及
び本実施例に従って調製した４種のジギトキシゲニン対
照樹脂をβ−ガラクトシダーゼ［例えば、IshikawaのJ.
Biochem.第９６巻、６５９頁（１９８４年）；Kato等の
J.Immunol.、第１１６巻、１５５４頁、（１９７６年６
月）；及びYoshitake等のEuro.J.Biochem.、第１０１
巻、３９５頁（１９７７年）参照］で標識されたジゴキ
シンに対するモノクローナル抗体の一価の抗体フラグメ
ント（Ｆａｂ′）［例えば、PorterのBiochem.、第７３
巻、１１９頁（１９５９年）；及びNisnoffのMethods M
ed.Res.、第１０巻、１３２頁（１９６４年）参照］
の、実施例５の試験緩衝液（pH７．４）中の１．０ｎＭ
溶液を標識試薬として用い、正常なヒト血清試験試料
（試験Ｉ）及びジゴキシン３００ｎｇ／mlを含有する正
常なヒト血清試験試料を対照試料として用いた不均質イ
ムノアッセーにより下記のイムノアッセーのプロトコー
ルに従ってそれぞれ評価した。
(i)試験Ｉ （１）標識試薬２００μｌ及び正常なヒト血清試料３０
μｌから成る第１の反応混合物を室温で５分間インキュ
ベートし； （２）本試験の工程（１）で得た第１の反応混合物１０
０μｌと樹脂１００μｌ（沈澱樹脂容量５０％樹脂混合
物、すなわち臨界値５０％、から得たもの）から成る第
２の反応混合物を室温で１０分間転倒回転し；更に （３）本試験の工程（２）で得た樹脂を１分間沈澱させ
て上澄のアリコート３０μｌのレゾルフィン−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド［Hhottman等のAnalytica Chemica
Acta、第１６３巻、６７頁（１９８４年）］が含浸した
試薬パッドに施して標識試薬のβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼの酵素活性を測定した。
(ii)試験II （１）標識試薬２００μｌとジゴキシン３００ｎｇ／ml
を含む正常なヒト血清試料３０μｌとから成る第１の反
応混合物を室温で５分間インキュベートし； （２）本試験の工程（１）の第１の反応混合物１００μ
ｌ及び樹脂１００μｌ（臨界値５０％）から成る第２の
反応混合物を室温で１０分間転倒回転（３０ｒｐｍ）
し；更に （３）本試験の工程（２）で得た樹脂を１分間沈澱させ
て上澄のアリコート３０μｌのレゾルフィン−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドが含浸した試薬パッドに施した。
β−Ｄ−ガラクトシダーゼとレゾルフィン−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドとの相互作用の結果得られた発色率
を、上澄の標識試薬、すなわち結合種のβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ活性を測定するために、試験パッドに試料を
施してから約６０〜８０秒の間に５６０ｎｍにおいて測
定した。反応性の測定（表１）を、多ポートインターフ
ェースを介してＨＰ−８５コンピューター(Hewlett-Pac
karad Company,Palo Alto,CA,USA)に接続したＳｅｒａ
ｌｙｚｅｒ 反射光度計(Miles Laboratories Inc.,Elk
hart IN.USA)で行った。この際。複合体(conjugate)の
樹脂粒子への結合の程度を、下記の等式： に従ってバックグラウンド信号（％バックグラウンド）
の量を計算することによって測定し、結果を表１にまと
めた。％バックグラウンド値が低いことは、溶出し得
る、非特異的に吸着されたハプテンが不存在の場合のみ
に起り得る、樹脂による複合体の良好な結合が行なわれ
たことの表明であると理解すべきである。
同様にして下記の試験操作に従って凍結乾燥樹脂を試験
した。
(i)試験III （１）標識試薬３７５μｌ及び正常なヒト血清試料３０
μｌから成る第１の反応混合物を室温で１０分間インキ
ュベートし； （２）本試験の工程（１）で得た第１の反応混合物２０
０μｌと凍結乾燥樹脂１０mgから成る第２の反応混合物
を室温で５分間渦動し；更に （３）本試験の工程（２）で得た樹脂を１分間沈澱させ
て上澄のアリコート３０μｌのレゾルフィン−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド［Hottman等のAnalytica Chemica A
cta、第１６３巻、６７頁（１９８４年）］を含浸した
試薬パッドに施して標識試薬のβ−Ｄ−ガラクトシダー
ゼの酵素活性を測定した。
(ii)試験IV （１）標識試薬３７５μｌと、ジゴキシン３００ｎｇ／
mlを含む正常なヒト血清試料３０μｌとから成る第１の
反応混合物を室温で１０分間インキュベートし； （２）本試験の工程（１）の第１の反応混合物２００μ
ｌ及び凍結乾燥樹脂１０mgから成る第２の反応混合物を
室温で５分間渦動し、更に （３）本試験の工程（２）で得た樹脂を１分間沈澱させ
て上澄のアリコート３０μｌのレゾルフィン−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドを含浸した試薬パッドに施した。
β−Ｄ−ガラクトシダーゼとレゾルフィン−β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼとの相互作用を結果得られた発色率を上
記のようにして測定した。
複合体の樹脂粒子への結合量を、下記の等式： に従ってバックグラウンド信号（％バックグラウンド）
の量を計算することによって測定し、結果を表２にまと
めた。
本発明の固定化ジギトキシゲニン試薬樹脂と対照樹脂と
のバックグラウンド信号における大きな差異は、ジギト
キシゲニン成分が安定な共有結合によって樹脂と強力に
結合したことを示すものである。遊離カルボン酸の形態
のハプテンで処理して複合体の一部に結合させた対照樹
脂の能力は、上記化合物が樹脂に非特異的に強く吸収さ
れていることを示している。上記遊離酸の形態のハプテ
ンの濃度が減少すると、かかる非特異的吸収もまた減少
する。そのような低いハプテン濃度において、凍結乾燥
体の形で最適に機能する本発明の固定化ハプテン試薬樹
脂（表２）が得られるのである。
ｂ．固定化ジギトキシゲニン試薬の安定性の評価 本発明に従って調製した固定化ジギトキシゲニン試薬か
らのジギトキシゲニンの溶出を、試験緩衝液（低反応性
の対照）１７０μｌ、試験緩衝液中の１５０ｎＭジゴキ
シン（高反応性の対照）、又は試験緩衝液の４℃で１週
間それぞれ保存した（保存後、樹脂をまず再懸濁し、上
澄みを除去する前に沈澱させた）樹脂乾燥ｇ当り５０μ
モル、５μモル、０．５μモル及び０．０５μモルのジ
ギトキシゲニンの上澄１７０μｌの試験試料を用いて試
験に従って評価した。
(i)正常なヒト血清試料３０μｌ及び複合体の６．７ｎ
Ｍ溶液３０μｌから成る第１の反応混合物を上記試験試
料の一つと混合し、室温で５分間インキュベートし； (ii)第１の反応混合物１００μｌと洗浄したばかりの上
記の臨界値５０％のSephadex Ｇ１０−ＢＳＡ−ウアバ
イン樹脂（デュポン試験試薬キットカタログNO.７０５
７９７０１、E.I.duPont de Nemours and Company,In
c.,Wilmington,DE,USAから得たもの）から成る第２の反
応混合物を室温で２０分間転倒回転（３０ｒｐｍ）し；
更に (iii)工程(ii)で得た樹脂を１分間沈澱させて上澄のア
リコート３０μｌとレゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシドを含浸した試薬パックに施して発色率をSeraly
zer 反射光度計で上記のように測定した。試験媒体中
に溶出したジギトキシゲニンによる複合体への結合の妨
害の量を下記の等式： ［式中、％バックグラウンド増加＝試料の％バックグラ
ウンド−低反応性対照の％バックグラウンド］ に従って測定し、その結果表３にまとめた。
上記結果は、樹脂１ｇ当り０．５μモル及び０．０５μ
モル、特に樹脂１ｇ当り０．０５μモルのジギトキシゲ
ニンの濃度に調製された樹脂からのジギトキシゲニンの
溶出、すなわち非特異的に吸着されたジギトキシゲニン
が極小化されたことを示している。上記のデータが示す
ように、僅かな量の溶出、特に０．５μモル／ｇ及び
０．０５μモル／ｇにおいては本発明に従って調製した
樹脂、すなわち上記のように、無水有機溶媒中で反応混
合物の希釈物を用いて調製した樹脂はジギトキシゲニン
と樹脂との間に実質的に安定な共有結合を有し、弱く又
は非特異的に結合するジギトキシゲニン（溶出したジギ
トキシゲニンの量はかかる高い希釈率においては実質的
に減少する）の量は僅少量となることが明確に示されて
いる。
ｃ．ジゴキシンに対する容量応答 本発明に従って調製したジギトキシゲニン０．０５μモ
ル／樹脂１ｇを緩衝溶液（２ＭＮａＣｌ及び０．１Ｍ酢
酸、pH２．３）次いで水で洗浄し、次に凍結乾燥法によ
り乾燥した。次に、標識試薬として、単一のβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ成分に共有結合したジゴキシンに対する
モノクローナル抗体から誘導された単一の一価抗体フラ
グメント（Ｆａｂ′）から成る実質的に純粋な単複合体
調製物を用いた、液体試験試料からのジゴキシンを測定
するためのイムノアッセーに上記凍結乾燥樹脂を用い
た。一価及び多価複合体、遊離β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ成分及び遊離Ｆａｂ′成分から成る複合体反応混合物
から単複合体を得、これを、本願と同日付で出願された
共に審査にかかっている米国特許出願「実質的に純粋な
酵素−抗体単複合体調製物」（書類番号ＭＳ−１４７
７）に記載のように電気泳動ポリアクリルアミドゲル上
で電気泳動法によって精製した。上記イムノアッセーに
おいては、色原体性酵素基質として、本願と同日付で出
願された共に審査にかかっている米国特許出願「色原体
性アクリジノン酵素基質」（書類番号ＭＳ−１４７０）
に記載の、７位がβ−Ｄ−ガラクトース残基で誘導され
た７−ヒドロキシ−９，９−ジメチル−９Ｈ−アクリジ
ン−２−オンから成るアクリジノン−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシドが用いられ、下記のようにして行った。
(i)単複合体の標識試薬０．３０ｎＭ溶液８７５μｌ
と、ジゴキシンを含む血清試験試料３５μｌとから成る
反応混合物を室温で６分間インキュベートし； (ii)工程(i)の反応混合物７８０μｌ及び凍結乾燥ジギ
トキシゲニン０．０５μモル／樹脂１ｇ３０mgから成る
反応混合物を多孔質プラスチックフィルターにより溶液
から分離して、更に (iii)工程(ii)の反応混合物の液からアリコート３０
μｌを取り、アクリジノン−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドを含浸した試薬片に施した。
β−Ｄ−ガラクトシダーゼとアクリジノン−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドとの相互作用の結果得られた発色率
を、液の単複合体標識試薬、すなわち結合種のβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼ活性（表４）を測定するために、試
験パッドに試料を施してから約６０〜８０秒の間に６３
０ｎｍにおいて測定した。表４に示したデータに基いて
得られた、ジゴキシンに対する用量応答を第１図に示
す。
表４ ジゴキシンに対する用量応答 ジゴキシン濃度ng／ml 応性x 103 0 1.01 0.6 1.71 1.2 2.31 2.4 3.59 3.6 4.79 5.0 6.28 実施例７ 架橋ポリアクリルアミド−スルフヒドリルコポリマーゲ
ル粒子の合成 アルゴン雰囲気下で、アクリルアミド（４０％）、ビス
アクリルアミド（１０％）及びＮ，Ｎ′−ビスアクリリ
ルシスタミン（３．４％）を水３０mlと混合した。混合
物の温度を４５〜５０℃に上昇させて固体をすべて溶解
した。Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジア
ミン１００μｌを加え、混合物を４０℃に冷却し、過硫
酸アンモニウム２５mgを加えた後、溶液を氷浴中で重合
させて塊状重合体を形成した。３時間後、容器から透明
な固体物質状の塊状重合体を取り出し、水と混合し、ブ
レンダー機で均質化してゲル懸濁液を得た。ゲル懸濁液
をまず８５メッシュのスクリーン（ＵＳＣ等級）に通
し、直径１５０μｍ未満のゲル粒子を得、次いで４００
メッシュのスクリーンに通し、直径３８〜１５０μｍの
粒子を得た。得られた３８〜１５０μｍの粒子を水で良
く洗浄し、ゲルを過し、エタノールで洗浄した後、最
後に真空吸引乾燥した。
実施例８ 固定化グリコペプチド試薬の合成 実施例７に従って調製したポリアクリルアミドゲルの外
表面スルフヒドリル官能基に共有結合したグリコペプチ
ドから成る固定化ハプテン試薬を下記のようにして調製
した。
（ａ）実施例７に従って調製した架橋ポリアクリルアミ
ドスルフヒドリルコポリマーゲル２．０ｇを、まずジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄（５ml×４回）し、
排水し、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）４００mg及びＤ
ＭＦ０．５mlと混合した。混合物を室温で撹拌し、時々
渦動させた。１時間後、液体を排し、ゲルをアルゴン雰
囲気下に保持し、洗浄液からＤＴＴが検出されなくなる
までアルゴンでパージしたＤＭＦで洗浄した。
（ｂ）別の容器に濃度１．０mg／１００μｌのグリコペ
プチド（欧州特許出願第１８５，８７０号に記載の、ヘ
モグロビンのβ−サブユニットにおけるグルコシル化Ｎ
−末端ペプチド配列）の水溶液８００μｌをビスマレイ
ミド−ヘキサエチレングリコール（ＤＭＦ１００μｌ中
１．０mg）の溶液及びＤＭＦ６００μｌと混合した。室
温にて１０分の後、上記溶液を、本実施例の工程（ａ）
で得た活性化ゲルに加えた。ゲル混合物を２時間撹拌
し、時々渦動させた。ゲルから排液し、ＤＭＦ（２ml×
２回）、２Ｍ ＮａＣｌと０．１Ｎ酢酸との溶液（５ml
×６回）、水（１５０ml）及びエタノール（１０ml×４
回）で洗浄した。次にゲルを減圧吸引乾燥すると、実質
的に架橋コポリマーゲル粒子の外表面スルフヒドリル官
能基にのみ共有結合したグリコペプチドから成る本発明
の固定化グリコペプチド試薬２．０ｇが得られた。
実施例９ 固定化グリコペプチド試薬の反応性試験 非結合標識（バックグラウンド）の量を測定するため
に、標識試薬としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼで標識さ
れた一価の抗体フラグメント（Ｆａｂ′）の単複合体調
製物を用いて、実施例８に従って調製した固定化グリコ
ペプチド試薬（樹脂）を評価した。一価の抗体フラグメ
ントはPorter及びNisonoff（上記参照）によって記載の
方法に従って、ヒトヘモグロビンのβ−サブユニットに
おけるグリコシル化Ｎ−末端ペプチド配列（アミノ酸８
個）に対して特異的なモノクローナル抗体から誘導し
（欧州特許出願第１８５，８７０号参照）、Ishikawa、K
ata等及びYoshitake等（上記参照）によって記載の方法
に従って、β−Ｄ−ガラクトシダーゼで標識した。一価
の抗体フラグメントβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ複合体
を、上記に引用した共に審査にかかっている米国特許出
願「実質的に純粋な酵素−抗体単複合体調製物」に記載
のように、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動法によ
って精製することにより、単一のＦａｂ′成分と単一の
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ成分とから成る実質的に純粋
な単複合体調製物が得られた。
（ａ）単複合体標識試薬２５０μｌの溶液に、緩衝液
（pH７．４、０．０５Ｍリン酸ナトリウム、０．０５Ｍ
塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、ウシ血清ア
ルブミン１００μｇ／ml及びナトリウムアジド０．０２
％）３０μｌを加え； （ｂ）本実施例の工程（ａ）で得た溶液のアリコート２
７０μｌに固定化グリコペプチド試薬（樹脂）１０〜２
０mgを混合し、懸濁液を室温で３０分間転倒回転し； （ｃ）樹脂を去し、液のアリコート３０μｌを、レ
ゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含浸した試
薬パッドに施した。
反応性の測定は前記のようにSeralyzer 反射光度計を
用いて行い、このようにして測定した反応性の樹脂の処
理を行なわない標識試薬の反応性に対する比率を％バッ
クグラウンドとして示す（表５参照）。
実施例１０ ＨｂＡｌｃ測定用のイムノアッセー （ａ）種々の濃度の変性血液、すなわちＨｂＡｌｃ（第
２図）３０μｌを標識試薬の溶液（実施例９）２５０μ
ｌに加え、混合物を室温で１０分間静置し； （ｂ）各混合物のアリコート２７０μｌの固定化グリコ
ペプチド試薬（実施例８）１５mgを混合し、室温で１０
分間転倒回転し； （ｃ）樹脂を去し、液３０μｌを、レゾルフィン−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含浸した試薬パッドに施
した。
反応性の測定は前記のようにSeralyzer 反射光度計を
用いて行ったところ、反応性は全血中に存在するＨｂＡ
ｌｃの濃度に正比例することが判明した（第２図参
照）。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ジギトキシゲニンを本発明の固定化ハプテン
試薬におけるハプテン成分として用いたイムノアッセー
において得られた、ジゴキシンに対する用量応答を示す
グラフである。 第２図は、全血試料中のグリコシル化されたヘモグロビ
ンＨｂＡｌｃの量を測定するためのイムノアッセーにお
ける、本発明の固定化されたグリコペプチド試薬の反応
性を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロナルド・ジー・サマー アメリカ合衆国、インヂアナ 46514、エ ルクハート、マール・ストリート 55745 (72)発明者 キン−ファイ・イップ アメリカ合衆国、インヂアナ 46514、エ ルクハート、クリークハブン・ドライブ 52294 (56)参考文献 特開 昭52−82723（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−214854（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−94268（ＪＰ，Ａ)

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】液体試験試料中のハプテン又はその結合性
    類縁体の特異的結合試験測定に使用するための安定な固
    定化ハプテン試薬の製造方法であって、 （ａ）ハプテン成分と、外表面及び内部に化学的に活性
    な複数の官能基を有するポリアクリルアミドゲル粒子と
    を、ゲル粒子が実質的に膨潤しない溶媒中、水溶液中で
    実質的に安定な連結基によってゲル粒子の外表面の官能
    基とハプテン成分との間に共有結合が形成される条件下
    で反応させ、 （ｂ）工程（ａ）で得られたゲル粒子を非膨潤性溶媒で
    洗浄し、 （ｃ）工程（ｂ）で得られたゲル粒子を水溶液で洗浄
    し、かつ （ｄ）該ゲル粒子とそれに結合する該ハプテン成分とか
    ら成る、工程（ｃ）で得られた固定化ハプテン試薬を単
    離する工程から成り、 ここで実質的に全てのハプテン成分を、ゲル粒子の外表
    面の官能基と共有結合させることを特徴とする製造方
    法。
  2. 【請求項２】非膨潤性溶媒が、有機溶媒である特許請求
    の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】該有機溶媒が、ジメチルホルムアミド、ジ
    メチルスルホキシド、アセトン、塩素化炭化水素並びに
    環式及び非環式アルキルエーテル類から成る群より選ば
    れる特許請求の範囲第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】ハプテン成分が、ジゴキシン、ジギトキシ
    ゲニン、ジギトキシン、ジゴキシゲニン及び１２−Ｏ−
    アセチルジゴキシゲニンから成る群より選ばれる特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】連結基が、１，６−ヘキサメチレンジアミ
    ン、６−アミノヘキサノール、１，１２−ジアミノ−
    ４，９−ジオキサドデカン、１，１７−ジアミノ−３，
    ６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン、６−
    アミノカプロン酸及びウシ血清アルブミンの二官能性残
    基から成る群より選ばれる特許請求の範囲第４項記載の
    方法。
  6. 【請求項６】連結基が、６−アミノカプロン酸の二官能
    性残基であり、ハプテン成分がジギトキシゲニンである
    特許請求の範囲第４項記載の方法。
  7. 【請求項７】ハプテン成分が、グリコシル化ペプチド配
    列である特許請求の範囲第１項記載の方法。
  8. 【請求項８】連結基が、１，１′−［メチレンジ−４，
    １−フェニレン］ビスマレイミド、ビスマレイミド−ヘ
    キサン及びビスマレイミド−ヘキサエチレングリコール
    の二官能性残基から成る群より選ばれる特許請求の範囲
    第７項記載の方法。
  9. 【請求項９】該グリコシル化ペプチド配列がヒトヘモグ
    ロビンのβ−サブユニットにおけるグリコシル化Ｎ−末
    端ペプチド配列に対応し、連結基がビスマレイミド−ヘ
    キサエチレングリコールである特許請求の範囲第７項記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂
    １ｇ当り約１×10-12モル未満のハプテンしか固定化ハ
    プテン試薬のゲル粒子から解離しない特許請求の範囲第
    １項記載の方法。
  11. 【請求項１１】水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂
    １ｇ当り約１×10-13モル未満のハプテンしか固定化ハ
    プテン試薬のゲル粒子から解離しない特許請求の範囲第
    １０項記載の方法。
  12. 【請求項１２】非膨潤状態のポリアクリルアミドゲル粒
    子が、実質的にハプテン成分不透過性である特許請求の
    範囲第１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】液体試験試料中のハプテン又はその結合
    性類縁体の特異的結合試験測定に使用するための安定な
    固定化ハプテン試薬であって、上記固定化ハプテン試薬
    が、ポリアクリルアミドゲル粒子とそれに結合する複数
    のハプテン成分から成り、該ゲル粒子は外表面及び内部
    に複数の官能基を有し、実質的に全ての該結合ハプテン
    成分が、水溶液中で実質的に安定な連結基によって該ゲ
    ル粒子の外表面の官能基と共有結合していることを特徴
    とする試薬。
  14. 【請求項１４】ハプテン成分が、ジゴキシン、ジギトキ
    シゲニン、ジギトキシン、ジゴキシゲニン及び１２−Ｏ
    −アセチルジゴキシゲニンから成る群より選ばれる特許
    請求の範囲第１３項記載の固定化ハプテン試薬。
  15. 【請求項１５】連結基が、１，６−ヘキサメチレンジア
    ミン、６−アミノヘキサノール、１，１２−ジアミノ−
    ４，９−ジオキサドデカン、１，１７−ジアミノ−３，
    ６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン、６−
    アミノカプロン酸及びウシ血清アルブミンの二官能性残
    基から成る群より選ばれる特許請求の範囲第１４項記載
    の固定化ハプテン試薬。
  16. 【請求項１６】連結基が６−アミノカプロン酸であり、
    ハプテン成分がジギトキシゲニンである特許請求の範囲
    第１４項記載の固定化ハプテン試薬。
  17. 【請求項１７】ハプテン成分が、グリコシル化ペプチド
    配列である特許請求の範囲第１３項記載の固定化ハプテ
    ン試薬。
  18. 【請求項１８】連結基が、１，１′−［メチレンジ−
    ４，１−フェニレン］ビスマレイミド、ビスマレイミド
    −ヘキサン及びビスマレイミド−ヘキサエチレングリコ
    ールの二官能性残基から成る群より選ばれる特許請求の
    範囲第１７項記載の固定化ハプテン試薬。
  19. 【請求項１９】該グリコシル化ペプチド配列が、ヒトヘ
    モグロビンのβ−サブユニットにおけるグルコシル化Ｎ
    −末端ペプチド配列に対応し、連結基がビスマレイミド
    −ヘキサエチレングリコールである特許請求の範囲第１
    ７項記載の固定化ハプテン試薬。
  20. 【請求項２０】水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂
    １ｇ当り約１×10-12モル未満のハプテンしか固定化ハ
    プテン試薬のゲル粒子から解離しない特許請求の範囲第
    １３項記載の固定化ハプテン試薬。
  21. 【請求項２１】水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂
    １ｇ当り約１×10-13モル未満のハプテンしか固定化ハ
    プテン試薬のゲル粒子から解離しない特許請求の範囲第
    ２０項記載の固定化ハプテン試薬。
  22. 【請求項２２】試験試料を、ハプテン又はその類縁体と
    結合し得る標識抗体試薬、次いで該抗体試薬と結合し得
    る固定化されたハプテンと接触させ、かつ試料中の該ハ
    プテン又はその類縁体に結合する標識抗体試薬の量を、
    固定化試薬に結合する標識抗体試薬の量と比較すること
    によって、測定される試験試料中のハプテン又はその類
    縁体の存在と関係づけられる、液体試験試料中のハプテ
    ン又はその類縁体を測定するための免疫学的測定試験法
    において、 固定化試薬として、ポリアクリルアミドゲル粒子とそれ
    に結合した複数のハプテン成分から成る実質的に安定な
    固定化ハプテン試薬を用い、該ゲル粒子が外表面及び内
    部に複数の官能基を有し、実質的に全ての該結合ハプテ
    ン成分が、水溶液中で実質的に安定な連結基によって該
    外表面の官能基と共有結合していることを特徴とする方
    法。
  23. 【請求項２３】ハプテン成分が、ジゴキシン、ジギトキ
    シゲニン、ジギトキシン、ジゴキシゲニン及び１２−Ｏ
    −アセチルジゴキシゲニンから成る群より選ばれる特許
    請求の範囲第２２項記載の試験方法。
  24. 【請求項２４】連結基が、１，６−ヘキサメチレンジア
    ミン、６−アミノヘキサノール、１，１２−ジアミノ−
    ４，９−ジオキサドデカン、１，１７−ジアミノ−３，
    ６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン、６−
    アミノカプロン酸及びウシ血清アルブミンの二官能性残
    基から成る群より選ばれる特許請求の範囲第２２項記載
    の試験方法。
  25. 【請求項２５】連結基が６−アミノカプロン酸であり、
    ハプテン成分がジギトキシゲニンである特許請求の範囲
    第２３項記載の試験方法。
  26. 【請求項２６】ハプテン成分が、グリコシル化ペプチド
    配列である特許請求の範囲第２２項記載の試験方法。
  27. 【請求項２７】連結基が、１，１′−［メチレンジ−
    ４，１−フェニレン］ビスマレイミド、ビスマレイミド
    −ヘキサン及びビスマレイミド−ヘキサエチレングリコ
    ールの二官能性残基から成る群より選ばれる特許請求の
    範囲第２６項記載の試験方法。
  28. 【請求項２８】該グリコシル化ペプチド配列がヒトヘモ
    グロビンのβ−サブユニットにおけるグリコシル化Ｎ−
    末端ペプチド配列に対応し、連結基がビスマレイミド−
    ヘキサエチレングリコールである特許請求の範囲第２６
    項記載の試験方法。
  29. 【請求項２９】水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂
    １ｇ当り約１×10-12モル未満のハプテンしか固定化ハ
    プテン試薬のゲル粒子から解離しない特許請求の範囲第
    ２２項記載の試験方法。
  30. 【請求項３０】水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂
    １ｇ当り約１×10-13モル未満のハプテンしか固定化ハ
    プテン試薬のゲル粒子から解離しない特許請求の範囲第
    ２９項記載の試験方法。
  31. 【請求項３１】（１）ハプテン又はその類縁体と結合し
    得る標識抗体試薬及び（２）該抗体試薬と結合し得るハ
    プテンが固定化された固定化試薬から成る、液体試験試
    料中のハプテン又はその類縁体を測定するための試薬キ
    ットであって、 固定化試薬として、ポリアクリルアミドゲル粒子とそれ
    に結合した複数のハプテン成分から成る実質的に安定な
    固定化ハプテン試薬を用い、該ゲル粒子は外表面及び内
    部に複数の官能基を有し、実質的に全ての該結合ハプテ
    ン成分が、水溶液中で実質的に安定な連結基によって該
    ゲル粒子の外表面の官能基と共有結合していることを特
    徴とする試薬キット。
  32. 【請求項３２】ハプテン成分が、ジゴキシン、ジギトキ
    シゲニン、ジギトキシン、ジゴキシゲニン及び１２−Ｏ
    −アセチルジゴキシゲニンから成る群より選ばれる特許
    請求の範囲第３１項記載の試薬キット。
  33. 【請求項３３】連結基が、１，６−ヘキサメチレンジア
    ミン、６−アミノヘキサノール、１，１２−ジアミノ−
    ４，９−ジオキサドデカン、１，１７−ジアミノ−３，
    ６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン、６−
    アミノカプロン酸及びウシ血清アルブミンの二官能性残
    基から成る群より選ばれる特許請求の範囲第３２項記載
    の試薬キット。
  34. 【請求項３４】連結基が６−アミノカプロン酸であり、
    ハプテン成分がジギトキシゲニンである特許請求の範囲
    第３２項記載の試薬キット。
  35. 【請求項３５】ハプテン成分が、グリコシル化ペプチド
    配列である特許請求の範囲第３１項記載の試薬キット。
  36. 【請求項３６】連結基が、１，１′−［メチレンジ−
    ４，１−フェニレン］ビスマレイミド、ビスマレイミド
    −ヘキサン及びビスマレイミド−ヘキサエチレングリコ
    ールの二官能性残基から成る群より選ばれる特許請求の
    範囲第３５項記載の試薬キット。
  37. 【請求項３７】該グリコシル化ペプチド配列が、ヒトヘ
    モグロビンのβ−サブユニットにおけるグリコシル化Ｎ
    −末端ペプチド配列に対応し、連結基がビスマレイミド
    −ヘキサエチレングリコールである特許請求の範囲第３
    ５項記載の試薬キット。
  38. 【請求項３８】水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂
    １ｇ当り約１×10-12モル未満のハプテンが固定化ハプ
    テン試薬のゲル粒子から解離する特許請求の範囲第３１
    項記載の試薬キット。
  39. 【請求項３９】水溶液中に１週間静置した場合に、樹脂
    １ｇ当り約１×10-13モル未満のハプテンが固定化ハプ
    テン試薬のゲル粒子から解離する特許請求の範囲第３８
    項記載の試薬キット。
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