JPH0638746A

JPH0638746A - アルカリリパーゼ、それを生産する微生物およびアルカリリパーゼ含有洗剤組成物

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Publication number: JPH0638746A
Application number: JP31147092A
Authority: JP
Inventors: Nobuaki Sakai; 伸晃酒井; Masahiro Suzuki; 雅博鈴木; Tatsuya Mizukoshi; 達也水越; Yukie Gotou; 志江後藤; Kazumi Tanaka; 計実田中; Michihiro Takama; 道裕高間; Norio Moriya; 則雄守屋
Original assignee: Showa Denko KK
Current assignee: Resonac Holdings Corp
Priority date: 1992-05-27
Filing date: 1992-10-27
Publication date: 1994-02-15
Anticipated expiration: 2015-07-31
Also published as: JP3072579B2

Abstract

(57)【要約】【構成】シュードモナス（Pseudomonas ）属に属する
細菌、その細菌が産生する以下の性質を有するアルカリ
リパーゼ及びそのリパーゼを含有する洗浄組成物。(1)
トリオレインエマルジョン（ＴＯＥ）を基質とした作用
ｐＨが４〜11.5、至適ｐＨが7.0 〜9.5 ；(2) ＴＯＥを
基質とした作用温度が１０〜８０℃、至適温度が５５〜
６５℃；(3) ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法に
よる分子量が28000 ±2000；(4) 等電点ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法による等電点が4.5 ±1.5 ；(5) 直
鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムによる活性阻
害が５０％以下。【効果】本発明アルカリリパーゼは界面活性剤、プロ
テアーゼ等の洗剤成分に対する安定性が高く、プロテア
ーゼと共に洗剤に配合して用いることもでき、また洗剤
成分による活性阻害が少なく、洗剤の洗浄力を増強でき
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なアルカリリパーゼ
およびそれを生産する微生物及び用途に関する。さらに
詳しくいえば、シュードモナス（Pseudomonas ）属細菌
の生産するアルカリ側に至適ｐＨを有する新規リパーゼ
およびそれを生産する微生物およびアルカリ性領域で脂
質類を加水分解することが出来る酵素を含有し、洗濯時
溶液がアルカリ性ｐＨを有する洗剤組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】リパーゼは、乳製品のフレーバー形成の
ための食品加工用酵素、消化剤としての医療用酵素、血
中脂質の測定のための診断用酵素、油脂の加水分解や改
質のための工業用酵素等として広範囲に使用されてい
る。近年は、さらに洗剤配合組成物してのリパーゼの用
途が注目されている。洗剤組成物にプロテアーゼを配合
して被洗浄物に付着したタンパク質その他汚垢を分解除
去することは、従来から知られている。また、セルラー
ゼを配合してセルロース繊維被洗浄物に付着した汚垢を
除去すること、あるいはアミラーゼ等の糖質分解酵素を
配合して被洗浄物に付着した糖質その他汚垢を分解除去
することも知られている。更に、近年においては、リパ
ーゼを配合して被洗浄物に付着した脂質類を分解除去し
洗浄効率を向上出来ることが知られている。この用途
は、アンドレー（H.Andree）らによる「洗浄剤成分とし
てのリパーゼ」（Lipase as detergent components）と
題する報文（Journal of Applied Biochemistry, 2, 21
8-229 (1980)）等に記載されている。

【０００３】好ましい洗剤配合用リパーゼは、通常の洗
濯条件では洗浄液のｐＨがアルカリ性領域にあるため、
アルカリ性ｐＨで機能するアルカリリパーゼである。ま
た、一般に脂質汚れは高温高アルカリ条件下では比較的
除去されやすいが、低温（６０℃以下）の洗浄では十分
に脂質汚れを除去出来ないことが知られている。従来よ
り主として低温洗濯が行われている我国はもとより、欧
米においても洗濯温度は低温化する傾向にあり、従っ
て、好ましい洗剤配合用リパーゼは、低温で十分に機能
するものである。また、好ましい洗剤配合用リパーゼ
は、界面活性剤等の洗剤成分や、多くの洗剤に含有され
ているプロテアーゼの存在下でも洗濯時に安定に機能を
発揮し得るものである。また、界面活性剤等の洗剤成分
による活性阻害が少なく、さらに、洗剤に配合した状態
で保存する時にも安定であるものである。以上のような
好ましい特性を有するリパーゼを配合してなる脂質汚れ
に対し高い洗浄効果を有する洗剤組成物の開発が望まれ
ている。

【０００４】微生物の生産するリパーゼは、シュードモ
ナス（Pseudomonas ）属、アルカリゲネス（Alcaligene
s ）属、アクロモバクター（Achromobacter ）属、ムコ
ール（Mucor ）属、キャンディダ（Candida ）属、フミ
コーラ（Humicola）属等に由来することが知られてい
る。しかしながら、これらから得られる大部分のリパー
ゼはその至適ｐＨが中性から微アルカリ性にあり、アニ
オン性界面活性剤に対する安定性が低い。さらには、ア
クロモバクター（Achromobacter ）属、キャンディダ
（Candida ）属、ムコール（Mucor ）属、フミコーラ
（Humicola）属の各リパーゼは、アニオン性界面活性剤
の共存下においてその活性を強く阻害される。

【０００５】また、シュードモナス（Pseudomonas ）属
に属する微生物がリパーゼを生産することは広く知られ
ており、シュードモナス（Pseudomonas ）属の菌株には
シュードモナス・フルオレッセンス（ Ps. fluorescen
s ）、シュードモナス・セパシア（ Ps. cepacia ）、
シュードモナス・フラギ（ Ps. fragi ）、シュードモ
ナス・アルカリゲネス（ Ps. alcaligenes ）、シュー
ドモナス・アエルギノサ（ Ps. aeruginosa）がある。
しかしこれらの菌株から得られる公知の酵素も前記の特
性を満足するものではない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、至適
ｐＨが高アルカリ側にあり、洗剤成分により活性がほと
んど阻害されることがなく、且つ界面活性剤やプロテア
ーゼ等の洗剤成分に対する安定性の高いアルカリリパー
ゼを提供しようとするものである。また、かかるアルカ
リリパーゼを含有する酵素含有洗剤組成物を提供するも
のである。さらにまた、前記アルカリリパーゼの他にプ
ロテアーゼを含んでなる、２種以上の酵素を含有する酵
素含有洗剤組成物を提供するものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の性
質を有するアルカリリパーゼを得るべく、多数の微生物
を分離、培養して検索した結果、東京都下の土壌より分
離した菌株であるシュードモナス・メンドシナ（ Pseud
omonas mendocina ）ＳＤ７０２株に代表されるシュー
ドモナス（Pseudomonas ）属に属する菌株が、洗浄剤組
成物配合用として有効な新規なアルカリリパーゼを生産
することを見出した。また、本発明者らは、シュードモ
ナス・メンドシナ（ Pseudomonas mendocina ）NCIMB1
0541株、またはNCIMB10542株、またはNCIMB10543株の培
養物より得られるリパーゼも前記のアルカリリパーゼと
同一の性質をもち、洗浄剤組成物配合用として有効なア
ルカリリパーゼであることを見出した。

【０００８】従来、種々の菌株により産生されたリパー
ゼおよびリパーゼ配合洗剤組成物が知られているが、シ
ュードモナス・メンドシナに由来するアルカリリパーゼ
およびシュードモナス・メンドシナに由来するアルカリ
リパーゼを配合した洗浄組成物は知られていない。本発
明者らは、シュードモナス・メンドシナが産生する新規
なアルカリリパーゼが洗剤配合用酵素として極めて有効
であることを見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００９】

【生産菌】本発明のアルカリリパーゼを製造するために
使用する微生物は、後記の性質を有するアルカリリパー
ゼを生産することができるシュードモナス（Pseudomona
s）属細菌であれば特に限定されない。この様な細菌
は、保存菌株中から、または自然界から新たに分離した
微生物中から選択することができる。またこれらの細菌
の、自然または人為的変異株であっても、後記の如き特
性を有するアルカリリパーゼの産生能を有する限り、当
然包含されるものである。細菌菌株は土壌その他の分離
源から常法に従って分離することができる。目的とする
菌株の選択は、被検微生物を例えば通常の細菌用培地中
で培養し、そして培養物（培地または菌体）中の高ｐＨ
常温条件下でのリパーゼ活性を常法に従って測定するこ
とにより行なうことができる。

【００１０】本発明の新規なリパーゼを生産するシュー
ドモナス（Pseudomonas ）属に属する菌株の一例とし
て、本発明者らが東京都下の土壌より分離したＳＤ７０
２株が挙げられる。

【００１１】このＳＤ７０２株は下記の性質を有する。（ａ）形態 (1) 細胞の形および大きさ：0.5 〜0.7 ×2.2 〜3.3 ミ
クロンの直状桿菌。 (2) 細胞の多形性：なし。 (3) 運動性：あり、極単毛を持つ。 (4) 胞子：なし。 (5) グラム染色：陰性。 (6) 抗酸性：なし。

【００１２】（ｂ）生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養：集落は拡散性でなめらか、色素
の産生はない。 (2) 肉汁寒天斜面培養：菌苔は拡散性で周辺はなめら
か、色素の産生はない。 (3) 肉汁液体培養：培地全体に生育し、沈殿が認められ
る。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養：培地上部にのみ生育し、液
化は認められない。 (5) リトマスミルク：微アルカリ性、凝固は認められな
い。

【００１３】（ｃ）生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：陽性。 (2) 脱窒反応：陰性。 (3) ＭＲテスト：陰性。 (4) ＶＰテスト：陰性。 (5) インドールの生成：陰性。 (6) 硫化水素の生成：陰性。 (7) デンプンの加水分解：陰性。 (8) クエン酸の利用：陽性。 (9) 無機窒素源の利用：硝酸塩、アンモニウム塩を利用
する。 (10)色素の生成：非水溶性色素を生成し、水溶性色素お
よび蛍光色素を生成しない。 (11)ウレアーゼ：陰性。 (12)オキシダーゼ：陽性。 (13)カタラーゼ：陽性。 (14)生育のｐＨ範囲：５〜１２．５。 (15)生育の温度範囲：５〜４３℃。 (16)酸素に対する態度：好気性。 (17)ＯＦテスト：酸化。 (18)糖類からの酸およびガスの産生：Ｄ−グルコース、
Ｄ−フラクトースおよびグリセリンから酸を産生する
が、ガスは産生しない；Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロ
ース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、シ
ョ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビット、イノシッ
トおよびデンプンからは酸、ガスいずれも生成しない。

【００１４】（ｄ）その他の性質 (1) 塩化ナトリウムの耐性：７％までのＮａＣｌ存在下
で生育する。 (2) 脂肪の分解：Tween 80、トリブチリン、トリアセチ
ン、植物油などを分解する。 (3) 炭素化合物の資化性：グルコースおよびゲラニオー
ルを資化する。デンプンを分解しない。ゼラチンを液化
しない。 (4) ビタミン要求性：陰性。 (5) ＰＨＢの蓄積：陰性。 (6) アルギニンジヒドラターゼ：陽性。 (7) フェニルアラニン脱アミノ酸反応：陰性。

【００１５】上記の菌学的性質を有する本菌の分類学上
の性質をバージーズ・マニュアル・オブ・システマチッ
ク・バクテオロジー（Bergey's Mannual of Systematic
Bacteriology, 1984 ）を参考にして他の菌株と比較し
た結果、本菌株はシュードモナス・メンドシナ（ Pseud
omonas mendocina ）と同定された。本菌株は工業技術
院微生物工業研究所に微工研菌寄第12944 号として寄託
されている。

【００１６】

【培養方法】本発明のアルカリリパーゼを生産するにあ
たってはシュードモナス（Pseudomonas ）属に属する本
アルカリリパーゼ生産菌を培地に培養する。培地の栄養
源としては、通常培養に用いられているものが広く利用
できる。炭素源としては同化できる炭素化合物またはこ
れを含有するものであればよく、例えば、ブドウ糖、グ
リセリン、油脂、コーンスティープリカー、Tween 系界
面活性剤などが用いられる。窒素源としても同化可能な
窒素化合物、またはこれを含有するものであればよく、
例えばアンモニウム塩、硝酸塩、大豆粉、肉エキス、コ
ーンスティープリカー、ファーマメディアなどが用いら
れる。また、無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム
塩などの塩類が使用される。

【００１７】培養条件は培地組成により多少異なるが、
生産の目的物であるアルカリリパーゼの生産に最も有利
な条件を選択する。培養温度は１０〜４０℃、好ましく
は２０〜３７℃の範囲であり、培養時間は８時間から１
００時間程度であり、アルカリリパーゼ生産が最高に達
したときに培養を終了すればよい。培地のｐＨは７〜9.
5 がアルカリリパーゼ生産に好適である。この様な培養
により、目的とするアルカリリパーゼは主として菌体外
（培養液中）に得られる。

【００１８】

【分離精製法】この様にして得られた培養液からのアル
カリリパーゼの採取は、リパーゼを採取するための常法
にしたがって分離、精製することにより行なうことがで
きる。すなわち、培養液からろ過法や遠心分離法などの
公知の適当な方法により菌体や培地固形物を分離して得
られる上清液またはろ液を分離し、この分離液を濃縮し
または濃縮することなく、可溶性塩類を添加して酵素を
沈殿させる塩析法、親水性有機溶媒を添加し酵素あるい
は夾雑物を沈殿させる有機溶剤沈殿法、イオン交換樹脂
等を用いた吸着脱離法、ゲルろ過法、安定補助剤を加え
てまたは安定補助剤なしに噴霧乾燥する方法、凍結乾燥
法等の分離もしくは精製手段を単独または複数組み合わ
せて用いることにより、アルカリリパーゼを得ることが
できる。

【００１９】

【酵素力価の測定方法】リパーゼ活性の測定は、本発明
においてはトリオレイン−ポリビニルアルコール（ＰＶ
Ａ）エマルジョンを基質とするＴＬＣ−ＦＩＤ測定法、
またはオリーブ油−ＰＶＡあるいはオリーブ油−アラビ
アゴムを基質とするｐＨスタット滴定法を用いて実施し
た。ＴＬＣ−ＦＩＤ測定法は具体的には以下の方法で行
なった。酵素液 0.1ml、１００mMトリス緩衝液（ｐＨ9.
0 ）0.4ml 、およびトリオレインエマルジョン0.5ml か
らなる混合液を共栓付き試験管中で３７℃にて１０分間
加熱して反応させ、反応停止液として１Ｎ塩酸0.2ml を
用いて反応を停止させた。ここでトリオレインエマルジ
ョンとしては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）２％水
溶液（ポバールＰＶＡ１１７（（株）クラレ商品名）：
ポバールＰＶＡ２０５（（株）クラレ商品名）９：１）
１５mlに1.5 ｇのトリオレインを加え、氷冷しながら18
000 rpm 、１０分間ホモジナイズしたものを用いた。反
応停止後、ｎ−ヘキサン２ml、イソプロピルアルコール
２ml、蒸留水１mlを加え、激しく撹拌し、静置後ヘキサ
ン層をサンプリングし、ＴＬＣ−ＦＩＤ法（ Minagawa
ら，Lipids, 18, 732, 1983 ）にてオレイン酸を定量し
た。活性の単位は１分間に１マイクロモルのオレイン酸
を生成する酵素量を１ユニット（Ｕ）とした。

【００２０】ｐＨスタット滴定法は具体的には以下の方
法にて行なった。基質のオリーブ油−アラビアゴムエマ
ルジョンは、オリーブ油１０ｇにアラビアゴム１０ｇ、
水１００ｇを加え、氷冷しながら25000 rpm で１０分間
ホモジナイズして調製した。またオリーブ油−ＰＶＡエ
マルジョンはオリーブ油１０ｇに前記ＰＶＡ２％水溶液
１００mlを加え、氷冷しながら18000 rpm で１０分間ホ
モジナイズして調製した。基質エマルジョン５ml、１１
０mM−ＮａＣｌを含む１０mMトリス緩衝液（ｐＨ9.0 ）
５ml、水4.5ml 、酵素液0.5ml の混合物を３０℃、ｐＨ
９にて反応せしめたときの脂肪酸生成速度を0.05ＮＮ
ａＯＨ水溶液の滴定速度より求めた。活性の単位は１分
間に１マイクロモルの脂肪酸を生成する酵素量である。

【００２１】また、プロテアーゼ活性は、特公昭60-551
18号に記載の力価測定法により測定し、活性の単位は、
nkatal（ナノカタール；nkatal＝１０^-9katal ）で表示
した。

【００２２】

【酵素の性質】本発明に属するアルカリリパーゼの一例
として、前記のシュードモナス・メンドシナ（ Pseudom
onas mendocina ）ＳＤ７０２株が生産するアルカリリ
パーゼについて、その性質を記載する。

【００２３】（１）作用グリセリドに作用し、そのエステル結合を加水分解す
る。

【００２４】（２）基質特異性各種グリセリド、エステルなどを広範囲にわたり加水分
解する。

【００２５】グリセリド基質としては、各グリセリド−
アラビアゴムエマルジョンを用いた。用いたエマルジョ
ンは各グリセリド１０ｇにアラビアゴム１０ｇ、水１０
０ｇを加え、氷冷しながら25000 rpm で１０分間ホモジ
ナイズしたものである。前記エマルジョン５ml、１１０
mM ＮａＣｌおよび２６mM ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏを含
む１０mMトリス緩衝液（ｐＨ9.0 ）５ml、水4.5ml 、酵
素液0.5ml の混合物を３０℃、ｐＨ９にて反応せしめた
ときの脂肪酸生成速度を0.05ＮＮａＯＨ水溶液を用い
たｐＨスタット滴定法により求めた。この脂肪酸生成速
度を各基質の分解力とした。トリオレインの分解力を１
００とすると、トリブチリン１０１、オリーブ油１０
０、大豆油１１３、綿実油１０１の相対活性を示す。

【００２６】また、エステルに対する分解力は、ｐ−ニ
トロフェニル脂肪酸エステルを基質とし、ｐＨ9.0 、３
０℃での加水分解反応により生じるｐ−ニトロフェノー
ルの比色（ＯＤ₄₀₅）より求めた。ｐＮＰＰ（ｐ−ニト
ロフェニルパルミテート）の分解力を１００とした場
合、ｐＮＰＶ（ｐ−ニトロフェニルバレレート）３４、
ｐＮＰＢ（ｐ−ニトロフェニルブチレート）１７の相対
活性を示す。

【００２７】（３）作用ｐＨおよび至適ｐＨトリオレインエマルジョンを基質として、前記のＴＬＣ
−ＦＩＤ法による力価測定法により、但し、ｐＨ4.0 〜
11.5の範囲（ただし緩衝液としては、100 mMε−アミノ
カプロン酸、100 mMビストリス（Bis(2-hydroxyethyl)i
minotris(hydroxymethyl)methane）、100 mMＴＡＰＳ
（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfon
ic acid ）混合緩衝液を塩酸またはＮａＯＨでｐＨ調
整）で異なるｐＨにおいて測定した、反応ｐＨと相対活
性の関係は図１に示すとおりであり、作用ｐＨは４〜1
1.5であり、至適ｐＨは7.0 〜9.5 である。

【００２８】（４）作用温度および至適温度の範囲トリオレインエマルジョンを基質として、３０〜８０℃
の範囲の反応温度にて行うこと以外は、前記のＴＬＣ−
ＦＩＤ法による力価測定法と同様の方法により測定した
反応温度と相対活性の関係は図２に示すとおりであり、
作用温度は１０〜８０℃、至適温度は５５〜６５℃であ
る。４０℃および７０℃においては、至適温度における
活性の約５０％の相対活性を示す。

【００２９】（５）温度安定性２０℃から７０℃の温度範囲の異なる温度でｐＨ８にて
１時間保温処理した後の残存活性を、前記のＴＬＣ−Ｆ
ＩＤ法による力価測定法で測定して求めた相対活性は図
３に示すとおりであり、３０℃および４０℃にて１時間
の処理ではほとんど失活しないが、７０℃では１時間の
処理ではほぼ失活する。

【００３０】（６）ｐＨ安定性ｐＨ３から１２のｐＨ範囲の異なるｐＨで３７℃にて１
時間処理した後の残存活性を前記ＴＬＣ−ＦＩＤ法で測
定したときの残存活性は図４に示すとおりであり、ｐＨ
３〜９で８０％以上の残存活性を有する。ただし処理時
の緩衝液は以下のものを使用した（ｐＨ３：グリシン−
塩酸；ｐＨ４〜５：酢酸−酢酸ナトリウム；ｐＨ６〜
７：リン酸；ｐＨ８〜９：トリス−塩酸；ｐＨ１０〜１
２：グリシン−ＮａＯＨ）。

【００３１】（７）分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（分子量標
準：チトクロームＣ（モノマー、ダイマー、トリマー、
テトラマー、ヘキサマー））により得られた分子量は28
000 ±2000である。

【００３２】（８）等電点等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により得られ
た等電点は4.5 ±1.5である。

【００３３】（９）洗剤成分による影響各種市販洗剤（４種）の標準使用濃度（1.2 〜５ｇ／リ
ットル）溶液および各種市販洗剤（４種）の標準使用濃
度溶液に代表的な洗剤用アルカリプロテアーゼであるＡ
ＰＩ−２１（特公昭60-55118号）を0.3nkat/mlの濃度で
添加した溶液中、５mMまたは2.5mM のＣａＣｌ₂・２Ｈ
₂Ｏを添加し、ｐＨ１０、３０℃の条件で本発明のアル
カリリパーゼを処理した後の残存活性をＴＬＣ−ＦＩＤ
法で測定した結果は表１に示すとおりであり、洗剤溶液
中での安定性が高い。

【００３４】

【表１】

【００３５】また、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナ
トリウム（ＬＡＳ）３００ppm 、５mMＣａＣｌ₂・２Ｈ
₂Ｏの溶液中、ｐＨ１０、３０℃におけるＳＤ７０２株
の生産したアルカリリパーゼの活性を、オリーブ油−Ｐ
ＶＡエマルジョンを基質としたｐＨスタット滴定法で測
定した場合の活性阻害は５０％以下であり、ＬＡＳによ
る活性阻害は非常に少ないことがわかる。

【００３６】さらに、各種市販洗剤（５種）の標準使用
濃度（1.2 〜５ｇ／リットル）溶液にアルカリプロテア
ーゼＡＰＩ−２１を0.3nkat/mlの濃度で添加した溶液
中、５mMまたは2.5mM のＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏを添加
し、ｐＨ１０、３０℃の条件でＳＤ７０２株の生産した
アルカリリパーゼの活性阻害性をオリーブ油−アラビア
ゴムエマルジョンを基質としたｐＨスタット滴定法で測
定した。結果は表２に示すとおりであり、各種市販洗剤
溶液中において活性阻害が少ない。

【００３７】

【表２】

【００３８】

【発明の効果】本発明のリパーゼは至適ｐＨが7.0 〜9.
5 と高く、また、界面活性剤、プロテアーゼ等の洗剤成
分に対する安定性が高く、さらには洗剤成分による活性
阻害が少ないため、洗浄条件下で油脂汚れを分解除去で
き、洗剤に配合して洗浄力の増強を図ることができる。

【００３９】

【実施例】次に本発明を実施例を挙げて説明するが、本
発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、
下記の説明中、特に記載がない限り％は重量を基準とす
るものである。

【００４０】実施例１：アルカリリパーゼ生産菌（ＳＤ
７０２株）の培養大豆粉２％、グルコース２％、リン酸
一水素二アンモニウム 0.1％、リン酸一水素二カリウム
0.5％、硫酸マグネシウム・７水和物 0.1％、炭酸ナト
リウム 0.3％の濃度の液体培地２mlを１８mm径の試験管
に取り、１２１℃、２０分間高圧蒸気滅菌した後、シュ
ードモナス・メンドシナ（ Pseudomonas mendocina ）
ＳＤ７０２菌株を１白金耳接種し、３５℃で２４時間、
１３０ rpmで培養した。培養後、遠心分離により菌体を
除去しアルカリリパーゼ液を得た。この液のリパーゼ活
性は５Ｕ／mlであった。

【００４１】実施例２：アルカリリパーゼ生産菌（ＳＤ
７０２株）の培養及びアルカリリパーゼの取得大豆粉２％、グルコース２％、リン酸一水素二アンモニ
ウム 0.1％、リン酸一水素二カリウム 0.5％、硫酸マグ
ネシウム・７水和物 0.1％、炭酸ナトリウム 0.3％、Tw
een 85 1.0％の濃度の液体培地２リットルを５リットル
培養槽に取り、１２１℃、２０分間高圧蒸気滅菌し、こ
れにあらかじめ培養しておいたシュードモナス・メンド
シナ（ Pseudomonas mendocina ）ＳＤ７０２菌株を接
種し、３５℃で２０時間、1000 rpmで通気撹拌培養を行
なった。培養後、遠心分離機で菌体を除去しアルカリリ
パーゼ液を得た。この液のリパーゼ活性は２０Ｕ／mlで
あった。このようにして得られたアルカリリパーゼ液か
らアセトン沈殿法にて３０〜５０％画分の沈殿を得、蒸
留水に溶かした後、硫酸アンモニウム沈殿法にて２０〜
４０％画分の沈殿を得た。この沈澱を１０mMトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、これを脱塩後、凍結乾燥
によりアルカリリパーゼ原末を得た。

【００４２】実施例３：アルカリリパーゼの精製実施例２で得られたアルカリリパーゼ原末を１０mMトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解させ、１０％硫酸アン
モニウムを含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７）に
て透析した後、Butyl-Toyopearl （東ソー（株）商品
名）での疎水性クロマトグラフィーを行ない、活性画分
をさらに同疎水性クロマトグラフィーにより分画し、活
性画分を得た。この活性画分を１mM塩化カルシウムを含
む１０mMトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ６）にて透析後、同
緩衝液で平衡化したDEAE-Cellulofine A-800（生化学工
業（株）商品名）でのイオン交換クロマト樹脂に吸着さ
せ、ＮａＣｌ溶液にて溶出し活性画分を得た。これを脱
塩後、凍結乾燥により精製酵素を得た。この凍結乾燥品
はポリアクリルアミドゲル電気泳動法により単一である
ことが確認された。

【００４３】実施例４〜６：NCIMB10541株、NCIMB10542
株、NCIMB10543株の培養およびアルカリリパーゼの取得大豆粉２％、グルコース２％、リン酸一水素二アンモニ
ウム 0.1％、リン酸一水素二カリウム 0.5％、硫酸マグ
ネシウム・７水和物 0.1％、炭酸ナトリウム 0.3％、Tw
een 85 1.0％の濃度の液体培地２リットルを５リットル
培養槽に取り、１２１℃、２０分間高圧蒸気滅菌し、こ
れらにあらかじめ培養しておいたシュードモナス・メン
ドシナ（ Pseudomonas mendocina ）NCIMB10541株、NC
IMB10542株、もしくはNCIMB10543株を接種し、３５℃で
２０時間、1000 rpmで通気撹拌培養を行なった。培養
後、培養液を遠心分離により菌体を除去しアルカリリパ
ーゼ液を得た。このようにしてNCIMB10541株、NCIMB105
42株、NCIMB10543株各々の培養液から得られたアルカリ
リパーゼ液のリパーゼ活性は各々１６Ｕ／ml、１２Ｕ／
ml、１６Ｕ／mlであった。このようにして得られた各々
のアルカリリパーゼ液からアセトン沈殿法にて３０〜５
０％画分の沈殿を得、蒸留水に溶かした後、硫酸アンモ
ニウム沈殿法にて２０〜４０％画分の沈殿を得た。この
沈澱を１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、
これを脱塩後、凍結乾燥によりアルカリリパーゼ原末を
得た。

【００４４】実施例７〜２４：洗濯評価−１実施例２で得られたアルカリリパーゼ原末を用いて洗浄
試験を行なった。汚垢布は、脱脂した綿布（１５cm×１
５cm）に、ベンゼンに溶解したトリオレイン７０mgを浸
ませ、乾燥させたものを用い、洗浄装置は、Terg-O-Tom
eterを用いた。塩化カルシウムを加えて所定のカルシウ
ム濃度にした蒸留水１リットルに各種市販洗剤を標準使
用濃度で溶解し、さらに、アルカリリパーゼを所定の濃
度になるように添加した。場合により、さらに、プロテ
アーゼＡＰＩ−２１（特公昭60-55118号）を所定の濃度
になるように添加した。洗濯液１リットル当たり４〜６
枚の前記トリオレイン汚垢布を入れ、２０℃〜３５℃の
洗濯温度にて、１２０rpmで３０分間洗浄した。洗浄
後、前記のカルシウム含有蒸留水１リットルで２回すす
ぎを行なった後、乾燥した。未洗浄と洗浄後の汚垢布の
トリオレイン量は、ｎ−ヘキサンで抽出後、前記ＴＬＣ
−ＦＩＤ法にて定量し、洗浄効率および酵素添加効果を
以下の計算式により求めた。洗浄効率（％）＝［（未洗浄汚染布のトリオレイン量−
洗浄後汚染布のトリオレイン量）／未洗浄汚染布ののト
リオレイン量］×１００酵素添加効果（％）＝酵素添加時の洗浄効率（％）−酵
素未添加時（洗剤のみ）の洗浄効率（％）

【００４５】その結果を表３に示す。

【００４６】

【表３】

【００４７】表３より、本アルカリリパーゼを配合した
洗浄組成物では、脂質汚れに対する洗浄効果が増強され
ていることが明かである。

【００４８】実施例２５〜２７：洗濯評価−２実施例４で得られたアルカリリパーゼ原末を用いて実施
例１１と同様の操作により洗浄試験を行なった。洗浄効
率および酵素添加効果を実施例７〜２４に示したのと同
じ計算式により求めた。その結果を表４に示す。

【００４９】

【表４】

【００５０】表４より、数種のシュードモナス・メンド
シナの菌株より得られたリパーゼを配合した洗浄組成物
においても、脂質汚れに対する洗浄効果が増強されるこ
とが明らかである。

【００５１】比較例１〜３：他のリパーゼの洗濯評価本アルカリリパーゼに替えて、特開昭48-62990号に記載
のフミコラ・ラヌギノザ（Humicola lanuginosa）由来
のリパーゼ、特開昭61-280274 号に記載のシュードモナ
ス・フラギ（ Pseudomonas fragi ）２２−３９Ｂ株由
来のリパーゼ、または、アクロモバクター（ Achromoba
cter sp. ）由来のリパーゼ（生化学工業）を添加し、
市販洗剤ＢまたはＦを使用して各々、実施例１１または
実施例１７と同様の操作で洗浄を行い酵素添加効果を求
めた。その結果を表５に示す。

【００５２】

【表５】

【００５３】表５より、本アルカリリパーゼを配合した
洗浄組成物との差は明白である。

【００５４】これらの結果より、本発明によるアルカリ
リパーゼ添加の場合は、無添加に比べ洗浄率で１０％以
上の向上が認められた。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＤ７０２株の生産するアルカリリパーゼの
反応ｐＨと相対活性との関係を示すグラフである。

【図２】ＳＤ７０２株の生産するアルカリリパーゼの
反応温度と相対活性との関係を示すグラフである。

【図３】ＳＤ７０２株の生産するアルカリリパーゼを
種々の温度にてｐＨ８で１時間処理した場合の残存活性
を示すグラフである。

【図４】ＳＤ７０２株の生産するアルカリリパーゼを
種々のｐＨにて３７℃で１時間保持した後の残存活性を
示すグラフである。

【手続補正書】

【提出日】平成５年７月２２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００２

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００２】

【従来の技術】リパーゼは、乳製品のフレーバー形成の
ための食品加工用酵素、消化剤としての医療用酵素、血
中脂質の測定のための診断用酵素、油脂の加水分解や改
質のための工業用酵素等として広範囲に使用されてい
る。近年は、さらに洗剤配合組成物としてのリパーゼの
用途が注目されている。洗剤組成物にプロテアーゼを配
合して被洗浄物に付着したタンパク質その他汚垢を分解
除去することは、従来から知られている。また、セルラ
ーゼを配合してセルロース繊維被洗浄物に付着した汚垢
を除去すること、あるいはアミラーゼ等の糖質分解酵素
を配合して被洗浄物に付着した糖質その他汚垢を分解除
去することも知られている。更に、近年においては、リ
パーゼを配合して被洗浄物に付着した脂質類を分解除去
し洗浄効率を向上出来ることが知られている。この用途
は、アンドレー（Ｈ．Ａｎｄｒｅｅ）らによる「洗浄剤
成分としてのリパーゼ」（Ｌｉｐａｓｅａｓｄｅｔ
ｅｒｇｅｎｔｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）と題する報文
（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ，２，２１８−２２９（１９８０））等
に記載されている。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２８】（４）作用温度および至適温度の範囲トリオレインエマルジョンを基質とし、３０〜８０℃の
温度範囲で反応させたこと以外は、前記のＴＬＣ−ＦＩ
Ｄ法による力価測定法と同様の方法により測定した反応
温度と相対活性の関係は図２に示すとおりであり、作用
温度は３０〜８０℃、至適温度は５５〜６５℃である。
４０℃および７０℃においては、至適温度における活性
の約５０％の相対活性を示す。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４０】実施例１：アルカリリパーゼ生産菌（ＳＤ
７０２株）の培養大豆粉２％、グルコース２％、リン酸一水素二アンモニ
ウム０．１％、リン酸一水素二カリウム０．５％、硫酸
マグネシウム・７水和物０．１％、炭酸ナトリウム０．
３％の濃度の液体培地２ｍｌを１８ｍｍ径の試験管に取
り、１２１℃、２０分間高圧蒸気滅菌した後、シュード
モナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｅｎ
ｄｏｃｉｎａ）ＳＤ７０２菌株を１白金耳接種し、３５
℃で２４時間、１３０ｒｐｍで培養した。培養後、遠心
分離により菌体を除去しアルカリリパーゼ液を得た。こ
の液のリパーゼ活性は５Ｕ／ｍｌであった。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４４】実施例７〜２４：洗濯評価−１実施例２で得られたアルカリリパーゼ原末を用いて洗浄
試験を行なった。汚垢布は、脱脂した綿布（１５ｃｍ×
１５ｃｍ）に、ベンゼンに溶解したトリオレイン７０ｍ
ｇを浸ませ、乾燥させたものを用い、洗浄装置は、Ｔｅ
ｒｇ−Ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒを用いた。塩化カルシウムを
加えて所定のカルシウム濃度にした蒸留水１リットルに
各種市販洗剤を標準使用濃度で溶解し、さらに、アルカ
リリパーゼを所定の濃度になるように添加した。場合に
より、さらに、プロテアーゼＡＰＩ−２１（特公昭６０
−５５１１８号）を所定の濃度になるように添加した。
洗濯液１リットル当たり４〜６枚の前記トリオレイン汚
垢布を入れ、２０℃〜３５℃の洗濯温度にて、１２０ｒ
ｐｍで３０分間洗浄した。洗浄後、前記のカルシウム含
有蒸留水１リットルで２回すすぎを行なった後、乾燥し
た。未洗浄と洗浄後の汚垢布のトリオレイン量は、ｎ−
ヘキサンで抽出後、前記ＴＬＣ−ＦＩＤ法にて定量し、
洗浄効率および酵素添加効果を以下の計算式により求め
た。洗浄効率（％）＝［（未洗浄汚染布のトリオレイン量−
洗浄後汚染布のトリオレイン量）／未洗浄汚染布のトリ
オレイン量］×１００酵素添加効果（％）＝酵素添加時の洗浄効率（％）−酵
素未添加時（洗剤のみ）の洗浄効率（％）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者後藤志江東京都大田区多摩川２−24−25 昭和電工株式会社生化学研究所内 (72)発明者田中計実東京都大田区多摩川２−24−25 昭和電工株式会社生化学研究所内 (72)発明者高間道裕東京都港区芝大門１−13−９昭和電工株式会社内 (72)発明者守屋則雄神奈川県川崎市川崎区大川町５−１昭和電工株式会社工学研究センター内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の性質を有するアルカリリパーゼ。（１）作用ｐＨおよび至適ｐＨトリオレインエマルジョンを基質とした場合の作用ｐＨ
が４〜11.5、至適ｐＨが7.0 〜9.5 である。（２）作用温度および至適温度トリオレインエマルジョンを基質とした場合の作用温度
が１０〜８０℃、至適温度が５５〜６５℃である。（３）分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定した
分子量が28000 ±2000である。（４）等電点等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって測定
した等電点が 4.5±1.5 である。（５）洗剤成分によるリパーゼ活性阻害直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムによる活性
阻害が５０％以下である。
【請求項２】シュードモナス（Pseudomonas ）属に属
する細菌の培養物より得られる請求項１記載のアルカリ
リパーゼ。
【請求項３】シュードモナス・メンドシナ（ Pseudom
onas mendocina ）に属する細菌の培養物より得られる
請求項１記載のアルカリリパーゼ。
【請求項４】シュードモナス・メンドシナ（ Pseudom
onas mendocina ）ＳＤ７０２株（微工研菌寄第12944
号）の培養物より得られる請求項１記載のアルカリリパ
ーゼ。
【請求項５】請求項１に記載のアルカリリパーゼを生
産するシュードモナス・メンドシナ（ Pseudomonas me
ndocina ）ＳＤ７０２株（微工研菌寄第12944 号）。
【請求項６】シュードモナス・メンドシナ（ Pseudom
onas mendocina ）の生産する請求項１に記載のアルカ
リリパーゼを含んでなることを特徴とする酵素含有洗剤
組成物。
【請求項７】シュードモナス・メンドシナ（ Pseudom
onas mendocina ）ＳＤ７０２株（微工研菌寄第12944
号）の生産する請求項１に記載のアルカリ性リパーゼを
含んでなることを特徴とする酵素含有洗剤組成物。
【請求項８】シュードモナス・メンドシナ（ Pseudom
onas mendocina ）細菌NCIMB10541株、またはNCIMB105
42株、またはNCIMB10543株の培養物より得られる請求項
１に記載のアルカリリパーゼを含んでなることを特徴と
する酵素含有洗剤組成物。
【請求項９】酵素添加物が無粉塵性粒剤として提供さ
れている請求項６乃至８のいずれかの項に記載の酵素含
有洗剤組成物。
【請求項１０】酵素添加物が液体またはスラリーとし
て提供されている請求項６乃至８のいずれかの項に記載
の酵素含有洗剤組成物。
【請求項１１】アルカリリパーゼの他にプロテアーゼ
を含有する請求項６乃至８のいずれかの項に記載の酵素
含有洗剤組成物。