JPH064034B2 - 微生物の培養方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物の培養方法に関し、さらに詳細にはビ
タミンＢ₁₂を効率よく生産するためのユウバクテリウム
属またはブチリバクテリウム属に属し、炭素源として少
くともメタノールを資化し、ビタミンＢ₁₂生産能を有す
る微生物の培養方法に係わる。

ビタミンＢ₁₂は、ＤＮＡやメチオニンなどの生合成に関
与し、生命現象の維持発現に重要な役割を演じており、
飼料添加剤としての用途の他に、悪性貧血およ慢性の神
経疾患などに優れた薬効があり、近年需要が増加する傾
向にある。本発明はこのビタミンＢ₁₂を効率よく生産す
るための微生物の培養方法に関する。

〔従来技術、発明が解決しようとする問題点〕

ビタミンＢ₁₂は、最初は抗貧血性ビタミンとして分類さ
れ、次いで１９５５年にホツジキン（Hodgkin）らによ
つて結晶構造が明らかにされた。１９７３年には、約７
０段階に及ぶ複雑な化学合成過程を経て合成されたが、
工程が複雑であつて実用的ではなく、現在では工業的に
はもつぱら微生物を使用する方法によつて生産されてい
る。

微生物によるビタミンＢ₁₂の生産については、プロピオ
ニバクテリウム属（Propionibacterium）および、シユ
ードモナス属（Pseudomonas）に属する微生物を、炭化
化物を基質として培養する方法、ノカルデイア属（Noca
rdia）およびアースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃ
ｔｅｒ）に属する微生物を、炭化水素を基質として培養
する方法ならびにメタン発酵菌、シユードモナス属、プ
ロタミノバクター属に属する細菌をメタノールを基質に
して培養する方法などが知られている（たとえば特公昭
５６−１１４３８および特開昭５０−１１１２８７な
ど）。

一方、メタノールは近年大量に安価に製造されることか
ら醗酵工業における安価でかつ安定して入手できる基質
として注目されている。しかしながら、これまでに報告
されている好気性メタノール資化性細菌を用いてのビタ
ミンＢ₁₂生産量は工業的には満足しうる量に達していな
い。これに対してメタノールを基質として微生物を培養
し、効率よくタアミンＢ₁₂を生産する方法が知られてい
る。たとえば、メタノール資化性を有する嫌気性微生物
であるメタノサルシナなどのメタン発酵菌、ユウバクテ
リウムリモスム（Eubacterium limosum）およびブチリ
バクテリウム メチロトロフイカム（Butyribacterium
methylotrophicum）などを使用する方法が知られてお
り、なかでもブチリバクテリウム メチロトロフイカム
はそのビタミンＢ₁₂含有量が高いことが報告されてい
る。

そこで本発明者らは、ブチリバクテリウム メチロトロ
フイカムについてメタノールを主炭素源として培養を試
みたところ、菌体中のビタミン含有量は高くはなるが、
十分に増殖しないうちに増殖が停止し、従つてビタミン
Ｂ₁₂の生産量が不十分となる。この増殖の停止は、消費
されたメタノールの約５０％以上が、酪酸および酢酸な
どの有機酸に転換され、これらの有機酸の蓄積による生
育阻害によるものであることを発見した。また、ブチリ
バクテリウム属に属する他のビタミンＢ₁₂生産菌および
ユウバクテリウム リモスムなどのユウバクテリウム属
に属するビタミンＢ₁₂生産菌についても同様であること
を発見した。

〔問題を解決するための手段、作用〕

本発明者らは、ユウバクテリウム属またはブチリバクテ
リウム属に属しメタノール資化性を有するビタミンＢ₁₂
生産菌の、これらの有機酸に起因する増殖の停止を解消
することにより菌体濃度を上昇せしめ、以つてビタミン
Ｂ₁₂の生産量を顕著に増大せしめることを目的に鋭意研
究を行なつてきた。その結果、前記のビタミンＢ₁₂生産
菌と、酢酸および／または酪酸などの有機酸分解能を有
する脱窒菌とを混合培養することによつて、培養液中に
一旦生成蓄積された酪酸および酢酸などの有機酸は脱窒
菌によつて分解され、培養液中の有機酸濃度をビタミン
Ｂ₁₂生産菌の生育阻害濃度未満に減少させることによ
り、前記のビタミンＢ₁₂生産菌のビタミンＢ₁₂の高含有
量を保持したまゝで菌体濃度を一段と向上せしめ、以つ
てビタミンＢ₁₂の生産性を向上せしめる本発明を完成す
るに至つた。

すなわち、本発明は、ユウバクテリウム属またはブチリ
バクテリラム属に属し、炭素源として少なくともメタノ
ールを資化しビタミンＢ₁₂生産能を有する細菌と、有機
酸分解能を有する脱窒菌とを混合培養することを特徴と
する微生物の培養方法である。

本発明で使用されるビタミンＢ₁₂生産菌はユウバクテリ
ウム属またはブチリバクテリウム属に属し、炭素源とし
て少なくともメタノールを資化し、ビタミンＢ₁₂生産能
を有する細菌であればよく、特に制限はない。

本発明で使用されるビタミンＢ₁₂生産菌の代表例として
は、それ自体公知のブチリバクテリウム メチロトロフ
イカム、ユウバクテリウム リモスムがある。また代表
菌株としてユウバクテリウム リモスム（Bergey's man
ual第８版）ＡＴＣＣ ８４８６、同ＡＴＣＣ １０８
２５、同ＤＳＭ ２５９３、および同ＤＳＭ ２５９４
ならびにブチリバクテリウム メチロトロフイカム（Cu
rrent Microbiology３、ｐ３８１−３８６（１９８
０））ＡＴＣＣ３３２６６を挙げることができる。これ
らのうち、ユウバクテリウム リモスムＡＴＣＣ ８４
８６が好ましい。

本発明で、培養液中に一旦生成、蓄積された有機酸を減
少させるために使用される微生物は、有機酸分解能を有
し、かつ、嫌気性であるばかりではなく、ビタミンＢ₁₂
生産菌の有機酸生成速度を上まわる有機酸分解能を有
し、メタノール耐性をも有していることが必要であり、
さらにはメタノールを資化しないことが好ましい。有機
酸分解能を有する微生物としてメタン生成菌および光合
成細菌などが知られている。しかしながら、メタン生成
菌は嫌気的ではあるが増殖がおそく、従つて生成された
有機酸を速やかに分解できないので実用的ではない。ま
た光合成細菌は好気的条件下では暗所で有機酸を分解す
るが嫌気的条件下で有機酸を分解させるには光が必要で
あることから、これまた実用的ではない。

前記のような要件を充足しうる微生物として脱窒菌が選
択された。なお、脱窒菌は「硝酸もしくは亜硝酸または
これらの塩を還元して窒素を発生させうる微生物」と定
義される。本発明に使用される脱窒菌は、前記の要件を
充足していればよく、特に制限はない。なお、ビタミン
Ｂ₁₂生産菌は、メタノールを炭素源として培養したとき
には、有機酸として酢酸、プロピオン酸、酪酸および吉
草酸などの各種の脂肪酸を副生するが、菌株によつて副
生する脂肪酸が異なるので、使用するビタミンＢ₁₂生産
菌の菌株によつて使用する脱窒菌を選択しなければなら
ない。たとえば、ユウバクテリウム リモスムおよびブ
チリバクテリウム メチロトロフイカムはいずれも有機
酸として酢酸および酪酸を副生するので脱窒菌としては
酢酸および酪酸に対して大きな分解能を有する脱窒菌を
使用しなければならない。このような脱窒菌の代表例と
してアルカリゲネス フエカリス Alcaligenes faecal
is（ＩＡＭ−１４４６）、シユードモナス スタツツエ
リー Pseudomonas stuzeri（ＩＦＯ−３７７３）、シ
ユードモナス デニトリフイカンス Pseudomonas deni
trificans（ＤＳＭ−１６５０）およびシユードモナス
プチダ Pseudomonas putida（ＡＴＣＣ−７９５）など
を挙げることができる。

本発明の混合培養で使用される倍地は、炭素源として少
なくともメタノールおよび脱窒菌が資化しうる炭素源、
窒素源として脱窒菌の窒素源である硝酸もしくは亜硝酸
またはこれらの塩−たとえば硝酸カリウム、硫酸アンモ
ニウム、亜硝酸カリウムおよび亜硝酸ナトリウムなど−
と、ビタミンＢ₁₂生産菌の窒素源である、たとえばアン
モニウム塩、ペプトン、酵母エキス、コーンステイープ
リカーおよび尿素などの窒素含有物質を少くとも含有し
ていなければならない。また、この培養液中にはＣＯ₂
および／またはＣＯ₃ ^--が存在していることが好まし
い。このＣＯ₂および／またはＣＯ₃ ^--としてメタノール
が分解されて生成したＣＯ₂が充当されるが、さらにＣ
Ｏ₂および／またはNaHCO₃のようなＣＯ₂発生剤を添加し
てもよい。

メタノールおよび窒素源のそれぞれの量は、使用される
ビタミンＢ₁₂生産菌の種類および脱窒菌の種類ならびに
窒素化合物の種類などによつて異なり、一概に特定しえ
ないが、実用上はそれぞれほぼつぎのような培養液濃度
になるような使用量とされる。

すなわち、メタノール濃度は通常５容量％以下であり、
特に１．５容量％以下が好ましい。脱窒菌が資化しうる
炭素源としては、酢酸および酪酸などの有機酸の他に、
グルコースおよびフラクトースなどの糖類などがあり、
これらの炭素源濃度を通常３重量％以下、好ましくは１
重量％以下を維持することが好ましい。

硝酸もしくは亜硝酸またはこれらの塩は、その使用に際
しては培養初期にたとえば、２ｇ／程度の生育を阻害
しない程度の低濃度とし、微生物の増殖に伴つて逐時添
加して濃度を高めることが好ましいこともある。また、
グリコースおよびフラクトースのようなビタミンＢ₁₂生
産菌が資化しうるメタノール以外の炭素源をさらに含有
させてもよく、また好ましい。

また、必要に応じてミネラル類、ビタミン類およびビタ
ミンＢ₁₂の前駆体などを含有させてもよく、また好まし
い。ミネラル類としては、たとえばりん酸塩類、マグネ
シウム塩類、カリウム塩類、カルシウム塩、マンガン塩
類、コバルト塩類、鉄塩類および亜鉛塩類などがある。
ビタミンＢ₁₂の前駆体としては、５，６−ジメチルベン
ズイミダゾール、コリン、およびベタインなどがある。
本発明の混合培養で使用される倍地として、ビタミンＢ
₁₂生産菌培養用のそれ自体公知の倍地または脱窒菌培養
用のそれ自体公知の倍地に若干の変更を加えて使用する
ことができる。すなわち、たとえば、ビタミンＢ₁₂生産
菌培養用の公知の倍地にビタミンＢ₁₂生産菌が資化でき
る量のメタノールおよび脱窒菌が必要とする量の硝酸も
しくは亜硝酸またはこれらの塩を新たに添加するかまた
は補充して使用することができる。また、脱窒菌培養用
の公知の倍地に、ビタミンＢ₁₂生産菌が資化できる量の
メタノールおよびビタミンＢ₁₂生産菌が必要とする窒素
含有物質を添加して使用することもできる。前記のビタ
ミンＢ₁₂生産菌培養用の倍地は、たとえば、ユウバクテ
リウム リモスムについては、たとえば、Eur.J.Bioche
m.vol１０９，１１５〜１１８（１９８０）に、また、
ブチリバクテリウム メチロトロフイカムについては、
たとえば、Curre.Microbiol vol3，３８１−３８６（１
９８０）にそれぞれ記載されている。

一方、脱窒菌培養用の倍地は、たとえば、J.Ferment.Te
chnol５８，No.３，２４３〜２４９（１９８０）に記載
されている。

培養温度および培養pHなどの培養条件については、ビタ
ミンＢ₁₂生産菌と脱窒菌では互に重複している範囲があ
るので、この重複している範囲から適宜選択すればよ
い。この重複する範囲の大きさは使用されるビタミンＢ
₁₂生産菌および脱窒菌のそれぞれの種類によつて異り、
一概には特定し得ないが、培養温度は実用上、通常は２
０〜４５℃程度、好ましくは２５〜３７℃程度とされ、
また、培養pHはpH５〜８程度、好ましくはpH６〜７．５
程度とされる。培養pHを一定に保つためには、用いる窒
素源の種類などによつても異なるが、必要に応じ培養液
に苛性ソーダ、炭酸ソーダ、アンモニア水などのアルカ
リ類や、硝酸、硫酸等の酸類を添加することができる。

また、培養液中に、培養液の還元状態を知るための検知
剤−たとえばレサズリンなど−を存在させることが好ま
しい。

培養方式としては、たとえば静置培養方式、窒素ガスや
炭酸ガスによる通気撹拌培養方式などを挙げることがで
きる。

ビタミンＢ₁₂生産菌と脱窒菌との混合は、ビタミンＢ₁₂
生産菌の培養開始時、培養初期乃至培養終期のいずれで
もよいが、ビタミンＢ₁₂生産菌の濃体濃度がＯＤ_660nm
が約２以上、好ましくは約２〜５のときに両者を混合す
ることが好ましい。

本発明における混合培養の開始時および培養期間中にお
ける脱窒菌とビタミンＢ₁₂生産菌との菌数比は使用され
る微生物の種類、培地組成および培養条件などによつて
異なり、一概には特定しえないが、実用上はビタミンＢ
₁₂生産菌に対する脱窒菌の菌数比は培養開始時乃至培養
初期においては通常は０．０１〜０．２程度、好ましく
は０．０２〜０．１程度とされ、培養期間中では通常は
０．０５〜０．５程度、好ましくは０．１〜０．３程度
であつて、しかも通常は混合培養開始時乃至培養初期に
おけるよりも大とされる。

混合培養によつて得られた混合培養液からのビタミンＢ
₁₂の回収は常法によつて行なうことが可能である。すな
わち、ビタミンＢ₁₂は本質的には菌体内に生成蓄積され
るため混合培養から遠心分離または過などの固液分離
手段により菌体を集める。ビタミンＢ₁₂をシアノ型ビタ
ミンＢ₁₂として回収分離する場合には菌体または菌体水
性懸濁液のpHを硫酸などの酸により酸性、好ましくはpH
４〜５に調整し、シアン化カリなどのシアン化合物を約
５０〜２００ppmとなるように添加した後、８５〜１２
０℃に加熱することにより抽出可能である。また、ビタ
ミンＢ₁₂をメチル型または補酵素型として回収する場合
には、菌体または菌体水性懸濁液から暗所でメタノー
ル、エタノールまたはアセトレなどの溶媒を用いて抽出
する。前記のビタミンＢ₁₂の分離回収に先立つて菌体ま
たは菌体水性懸濁液を超音波などで処理して菌体を破砕
してもよい。菌体から抽出されたこれらのビタミンＢ₁₂
は、所望によりフエノール抽出、イオン交換樹脂、セル
ロースなどを用いたカラムクロマトグラフイーによる方
法など、またはこれらを組み合わせて精製される。

〔実施例〕

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

以下の比較例および実施例において、ビタミンＢ₁₂の定
量は佐藤らの方法（ビタミン第５７巻第１１号第６０９
〜６１６頁１９８３）に準拠してラクトバチルス ライ
ヒマニ ＩＦＯ−３３７６を用いた微生物法により行な
つた。

また、培養液には検知剤であるレサズリンを添加し、レ
サズリンが無色を保つように培養液を還元状態に保つ
た。

比較例１ 第１表に示した組成の培地を使用し、培養経過と共に必
要に応じメタノール等を逐次添加した。

第１表 ＫＨ₂ＰＯ₄ ３ ｇ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ２ ｇ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.4ｇ Ｎａ₂ＣＯ₃ 1.0ｇ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ 0.5ｇ ＣＨ₃ＣＯＯＮａ・３Ｈ₂Ｏ 1.0ｇ Cysteine・Hcl 0.5ｇ CaCl₂・2H₂O 0.1ｇ 酵母エキス 10.0ｇ メタノール 10.0ml レサズリン（２％溶液） 0.1ml クエン酸鉄・ｘＨ₂Ｏ 60 mg ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 10 mg ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ 10 mg ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ 0.5mg ＫＩ １ mg （ＮＨ₄）₆Ｍｏ₇Ｏ₂₄・４Ｈ₂Ｏ １ mg ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ 10 mg Ｈ₃ＢＯ₃ １ mg ＮｉＳＯ₄・６Ｈ₂Ｏ １ mg ビチオン 50 μｇ 葉酸 10 μｇ チアミン塩酸塩 10 ｍｇ リボフラビン 100 μｇ ナイアシン 100 μｇ パントテン酸カルシウム ５ mg ｐ−アミノ安息香酸 100 μｇ チオクト酸 100 μｇ 水 １ 第１表に示した液体培地（NaHCO₃を除く）７５０mlを１
容培養槽に入れ、１２０℃で２０分間滅菌した。窒素
気流下で冷却後、別に過滅菌したNaHCO₃を１ｇ／に
なるように添加した後、炭酸ガスを通気して培地pHを
７．５に調整した。

この培地に、第１表に示した液体培地を用いて１００ml
容三角フラスコに静置培養して得られたユーバクテリウ
ム リモスム ＡＴＣＣ８４８６の種母液（ＯＤ_660nm
＝約２）を約３０ml植菌し、培養温度３５℃で１５０rp
mでゆつくり撹拌し、窒素気流下で嫌気培養を行なつ
た。植菌後、ガスクロマトグラフイーにより培養液中の
メタノールを分析し、培養液中のメタノールがなくなら
ないように逐次メタノールを添加し、培養液中のメタノ
ール濃度を０．１〜０．９容量％程度に維持した。培養
開始後、約６０時間で菌体濃度は６．０ｇ／に達した
が、さらに培養を継続しても菌体濃度は増加しなかつた
ので、培養開始後、約７０時間で培養を中止した。この
ときの培養液中のビタミンＢ₁₂生産量は約２４mg／で
あつた。

比較例２ ユーバクテリウム リモスム ＡＴＣＣ ８４８６にか
えてブチリバクテリウム メチロトロフイカム ＡＴＣ
Ｃ ３３２６６を比較例１と同様にして培養した。

窒素気流下、培養開始後約５０時間で菌体濃度は６．９
ｇ／に達した。さらに培養を継続してもこれ以上菌体
濃度は増加しなかつたので培養開始後、約７０時間で培
養を中止した。このときの培養液中のビタミンＢ₁₂の生
産量は約２８mg／であつた。なお、培養液中のメタノ
ール濃度が０．１〜０．６％になるようにメタノールを
適時添加した。

実施例１ 比較例１の第１表に示された培地にさらに、ＫＮＯ₃を
３．０ｇ／になるように添加した培地 ７５０mlを１
容培養槽に張り込み、滅菌した。比較例１と同様にし
て調製したユーバクテリウム リモスム ＡＴＣＣ ８
４８６の種母液を約３０ml植菌し、培養を行なつた。一
方、混合培養に用いる脱窒菌の種母調製は以下のように
行なつた。

すなわち、KH₂PO₄２．０ｇ／、Na₂HPO₄5.0ｇ／、Mg
SO₄・7H₂O０．２ｇ／、KNO₃４．０ｇ／、酪酸ナト
リウム２．５ｇ／、酵母エキス ０．５ｇ／、クエ
ン酸鉄・xH₂O １０mg／、ZnSO₄・7H₂O １０mg／
、MnCl₂・4H₂O １０mg／、CaCl₂・2H₂O ２０mg／
および水１から成る培地 ６０mlを１００ml容三角
フラスコに入れ、シユードモナス スタツツエリー Ｉ
ＦＯ ３７７３を植菌し、嫌気ジヤーで３４℃で培養し
た。

ＯＤ_660nmが、約３に達した前記のユーバクテリウム
リモスム ＡＴＣＣ ８４８６の培養液全量にこのシユ
ードモナス スタツツエリー ＩＦＯ ３７７３の培養
液（ＯＤ_660nm＝約２）を約４０mlを植菌し、（ユーバ
クテリウム リモスムの菌数に対するシユードモナスス
タツツエリーの菌数比は約０．０４）培養温度 ３５
℃、培養pH７．５で培養を継続した。その後、培養液の
ＯＤ_660nmが約７になつた時点でNH₄NO₃７ｇを培養槽に
添加した。培養開始後、約６０時間で菌体濃度は７．２
ｇ／に達した。さらに培養を継続し培養開始後約７５
時間経過した時点で培養を止めた。このときの混合培養
液の菌体濃度は１２ｇ／、ビタミン生産量は約３９mg
／であり、比較例１に比してビタミンＢ₁₂生産量は顕
著に増加した。なお、ユーバクテリウム リモスムの菌
数に対するシユードモナス スタツツエリーの菌数の比
は培養期間中において逐次大きくなり培養終了時には約
1/6であつた。

なお、培養液中のメタノール濃度は比較例１と同様に
０．１〜０．９容量％程度になるように適時添加して培
養を行なつた。

実施例２ １培養槽に、比較例１の第１表に示された培地にさら
にKNO₃を３．０ｇ／添加した培地７５０mlを１容培
養槽に張り込み、１２０℃で２０分間滅菌した後、窒素
気流下で冷却した。この培地に比較例２と同様にして調
製したブチリバクテリウム メチロトロフイカムＡＴＣ
Ｃ ３３２６６の種母液約３０mlを植菌し、窒素気流下
で嫌気培養を行なつた。

一方、混合培養に使用する脱窒菌のシユードモナス プ
チダ ＡＴＣＣ ７９５の種母液は、菌をかえた以外は
実施例１と同様にして調製された。ＯＤ660nmが約３に
達した前記のブチリバクテリウム メチロトロフイカム
ＡＴＣＣ ３３２６６の培養液全量にＯＤ約２に、生
育したこのシユードモナス プチダ ＡＴＣＣ ７９５
の種母液を約４０ml植菌し、培養温度 ３４℃、pH７．
４で混合培養を開始した。なお培養開始時のブチリバク
テリウム メチロトロフイカムの菌数に対するシユード
モナス プチダの菌数比は約０．０３であつた。

培養pHは、pH７．５を保つように炭酸ガスを培養液中に
通気してpHをコントロールしながら培養した。培養液中
のメタノール濃度は０．１〜０．８容量％になるように
メタノールを逐時添加した。

培養液のＯＤ_660nmが約７になつた時点で、NH₄NO₃１０
ｇを培養液に添加した。NH₄NO₃水溶液を添加する際は充
分脱気し、溶存酸素を除去した後に添加した。培養開始
後約５５時間経過後の菌体濃度は８．１ｇ／であり、
更に培養を継続し、培養開始後約７０時間経過した時点
で培養を止めた。この時点の菌体濃度は１３ｇ／と比
較例２より菌体濃度が顕著に向上していた。なお、ビタ
ミンＢ₁₂生産菌のブチリバクテリウム メチロトロフイ
カムの菌数に対する脱窒菌のシユードモナス プチダの
菌数比は培養期間において逐次大きくなり、培養終了時
には約０．２であつた。

ビタミンＢ₁₂の生産量は約４８mg／であり比較例２に
比して顕著に向上していた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、飼料添加剤、医薬品として価値の高い
ビタミンＢ₁₂を安価なメタノールを炭素源として使用
し、容易に効率良く得ることが出来る。しかも撹拌動力
や酸素供給動などは本質的に不要であるので省エネルギ
ー的にも有利である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:40）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ユウバクテリウム属またはブチリバクテリ
   ウム属に属し、炭素源として少くともメタノールを資化
   しビタミンＢ₁₂生産能を有する細菌と、有機酸分解能を
   有する脱窒菌とをメタノールの存在下で混合培養するこ
   とを特徴とする微生物の培養方法。