JPH0641421B2 - 自己免疫疾患の予防治療用組成物及びその活性成分の取得法 - Google Patents

自己免疫疾患の予防治療用組成物及びその活性成分の取得法

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JPH0641421B2
JPH0641421B2 JP59190453A JP19045384A JPH0641421B2 JP H0641421 B2 JPH0641421 B2 JP H0641421B2 JP 59190453 A JP59190453 A JP 59190453A JP 19045384 A JP19045384 A JP 19045384A JP H0641421 B2 JPH0641421 B2 JP H0641421B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （発明の目的） 産業上の利用分野 本発明は、ある種の自己免疫リンパ球細胞株の膜から得
られた免疫原性物質又は加圧活性化細胞に基づく自己免
疫疾患の予防及び治療用の新規組成物に関する。
更に詳しくは、ある種のＴ細胞レセプタを含む特異的自
己免疫Ｔ細胞株から得られる膜蛋白をワクチン接種する
こと又は加圧活性化細胞を使用することに基づく自己免
疫病の予防及び治療用組成物に関する。
本発明はまたそのような活性成分を分離精製して取得す
る方法に関する。
従来の技術 自己免疫病の病原因子はヒトの正常構成成分を攻撃する
内因性リンパ球である。本発明者等は、長期細胞株とし
て、数多くの実験的自己免疫病の原因となる特定の自己
免疫Ｔリンパ球を増殖する研究に従事してきた（下記文
献参照：1.Ben-Nun,A.他，Eur.J.Immun.１１：１９５−
１９９（１９８１）；2.Ben-Nun,A.他，J.Immunol.１２
８：１４５０−１４５７（１９８２）；3.Ben-Nun,A.
他，同誌，１２９：３０３−３０８（１９８２）；4.Be
n-Nun,A.他，同誌，１２９：９１８（１９８２）；5.Ho
loshitz.J.et al.,Science,２１９：５６−５８（１９
８３）；6.Ben-Nun,A.他，Nature,２９２：６０−６１
（１９８１）；7.Ben-Nun,A.他，Eur.J.Im-munol.１
１：９４９−９５２（１９８１）；8.Maron,R.他，同
誌，１３１：２３１６−２３２０（１９８３）：9.Holo
shitz,J.他，同誌，１３１：２８１０−２８１３（１９
８３））。こうして得られた比較的純粋な自己免疫細胞
培養株によつて病理発生についての研究が促進され、自
己免疫の保菌者状態が明らかとなり、かつ、自己免疫に
対するワクチン接種手段ならびに自己免疫の治療手段が
提供されている（前記文献５−９参照）。
（発明の構成） 本発明は、自己免疫病の予防及び治療に使用される新規
組成物に関し、この組成物は、活性成分として、特異的
自己免疫Ｔリンパ球から得られるある種の膜物質又は加
圧活性化細胞を含有する。
本発明はさらに、上記リンパ球から膜物質を取得する方
法、そのようなリンパ球の加圧活性化、ワクチンの製法
ならびに上記活性成分を含有する製剤に関する。
本発明の他の特徴は以上の記載により明らかとなるであ
ろう。
自己免疫病は各人の組織に対してその免疫系が攻撃され
た結果生じる共通の特色を具えている。すべての自己免
疫病には、各々に特別な標的抗原を特異的に認識する自
己免疫リンパ球がある。
自己免疫病としては、慢性関節リウマチ、多発性硬化
症、真性糖尿病のうちある型のもの及び甲状腺炎が挙げ
られる。これらの疾病に対しては従来何ら特異的な治療
法は存しなかつた。
本発明者等は、実験動物に自己免疫病を起す原因となる
Ｔリンパ球を長期細胞株として増殖させることができる
ことを見出した。そのような自己免疫病としては、脳脊
髄炎、関節炎及び甲状腺炎が挙げられる。上記細胞は上
記特異的自己免疫病に対するワクチン注射用の有効な成
分であることが見出された。上記リンパ球を弱毒化して
注射したところ、上記の自己免疫病を発症しなかつた。
すなわち、該ワクチン注射はそれら動物を免疫するか、
あるいは上記疾病に対する感受性を低減する（病気はず
つと軽度であつた）のに非常に有効であつた。さらにそ
れら動物に上記の細胞を接種すると、非常に効果的な病
気治療となつた。
本発明によれば、活性成分として、ある種のＴ細胞レセ
プターを含む特異的自己免疫Ｔ細胞株から得られる物質
を含有する医薬製剤が提供される。本発明はまた、その
ようなＴリンパ球に高い静水圧をかけたのちにこの圧力
を徐々に解除し、その結果、高度の生物学的活性を保有
している膜物質を効果的に落屑することを特徴とする膜
物質の新規な製造分離法を提供する。この方法は又その
ような細胞に静水圧をかけた後これを徐々に解除するこ
とにより該細胞を活性化する方法である。
上記活性物質を取得する典型的な条件は、500−1500気
圧のオーダーに加圧することであり、加圧はおよそ５分
間にわたつて徐々に行われ、約10−45分間高いレベルの
圧力に保つた後、５−15分間にわたつてこれを徐々に解
除する。
細胞の加圧活性化は、これら細胞を約５分間で500−約1
000気圧の圧力となるように加圧し、その圧力を約５分
間維持した後、これを約５分間で徐々に解除することに
よつて行われる。
殆んど落屑（Shedding）は起らないが、おそらく膜構成
成分の横方向への変位によつて細胞が活性化される。上
記の如く落屑によつて得られた膜物質も加圧活性化され
た細胞も本発明のワクチンの活性物質として使用するこ
とができる。当該細胞はその生育能力を失わないで完全
に保有している。
こうして得られた物質はおよび１０７〜１０８個の活性
化細胞又は同数の細胞物質を含んでいる。ヒトのワクチ
ン注射には、そのような物質（得られた蛋白又は活性化
細胞）を約0.01−３mg使用する。ワクチン注射は約２週
間おいて２回行われる。
上記のような免疫処置はある種の自己免疫病の予防及び
治療に有効である。
該リンパ球を適当な緩衝液に懸濁し、気体媒体のない加
圧管に挿入して、フレンチプレスを使つて上記した条件
で圧力をかける。
得られた細胞懸濁液を約１５００ｒｐｍで遠心分離す
る。得られた上清を約１時間約１５００ｒｐｍで超遠心
分離すると膜フラグメントが沈澱する。加圧活性化細胞
を作る場合には、遠心分離によつてこれを集菌する。
実験モデル： 特別のイン・ビトロ自己免疫Ｔ細胞株が開発された（上
記文献１−９）。第Ｉ表はこれらのＴリンパ球株に関連
する三つの実験的自己免疫病を要約したものである。
実験的自己免疫脳脊髄膜炎（EAE）は、ラツトの遺伝的
感受性系統をミエリンの塩基性蛋白（BP）に対して免疫
することによつて、この系統に能動発症させることがで
きる（10.Paterson,P.Y.,Textbook of Immunopathology
（Miescher,P.及びMuller-Eberhand,H.J.編），第２
版，１７９−２１３，Grune & Stratton社刊（１９７
６），ニユーヨーク）。EAEは通常麻痺及び中枢神経系
の白色物質の細胞浸潤によつて特徴づけられる急性疾患
として発現する。末処置のラツトは急性EAEから通常
２、３日で自然に回復する。更に能動EAEを誘発する試
みに対しては抵抗性があることが判明している（上記文
献２）。ある条件では慢性あるは回帰性EAEも誘発する
ことができ、このような疾病は多くの点でヒトの多発性
硬化症と類似している。
実験的自己免疫甲状腺炎（EAT）は、Ｈ−２遺伝子感受
性マウスをアジユバント中マウスサイログロブリン（T
g）に対して免疫することによつて誘発することができ
る（11.Rose,N.R.他,J.Immunol.１０６：６９８−７０
８（１９７１））。EATは甲状腺の慢性炎症として発現
する。EAT病変に抵抗するマウス系統は、高力価のTgの
自己免疫抗体を作り出すことができる。EATはヒトに稀
でない自己免疫甲状腺炎（ハシモト甲状腺炎）のモデル
であるように思われる。
アジユバント関節炎（AA）は、一定の自己抗原ではな
く、完全フロインドアジユバント（CFA）中ミコバクテ
リウム・ツベルクロージス菌（Tb）に対してラツトを免
疫することによつて誘発される（12.Person,C.M.,J.Chr
onic Dis.１６：８６３−８７４（１９６３））点でEAE
やEATとは異なる。遺伝的感受性ラツトに接種２週間
後、ヒトの慢性関節リウマチに観察される特徴を思わせ
る亜急性多発性関節炎を発現する。関節炎はこの抗原に
対する免疫によつて誘発される（13.Trentham,D.E.他，
J.Clin.Invest.,６６：１１０９−１１１７（１９８
０））のでコラーゲン型IIがAAの標的自己抗原であるの
かもしれない。しかしながら、最近の研究によれば、AA
とコラーゲンII関節炎とは別の存在であることがわかつ
ている（14.Iizuka,Y.他，Arthritic Rheum.２５：１３
２５−１３３２（１９８２），15.Holosheitz,J.他，J.
Clin.Invest.,７３：２１１−２１５（１９８４））。
第Ｉ表には又、抗原特異的株細胞（line cells）の接種
によつて類似の自己免疫病変が誘発できることが示され
ている。この菌株細胞を生育し維持してこの病気を作り
出す詳細については上記文献１−５に記載されている。
その方法は要約すれば、選択された抗原で動物を初回刺
激し、放射線照射した同系補助細胞と一緒に、選択抗原
で培養することによつて特異的に反応する細胞を選択す
ることからなる。菌株細胞の増殖反応をトリガーするた
めには、この抗原を与える補助細胞は少くとも主要組織
適合性複合体（MHC）の部分において同系でなければな
らない（上記文献３及び４）。選択された株細胞は次い
で、抗原又は補助細胞の不存在下、調整培地で培養され
る。自己免疫病を伝達することができる安定な株はすべ
て、一般的なＴ細胞マーカー（マウスのThy１又はＷ３
／１３）に対して並びに細胞障害性／サプレツサー細胞
のLyt−２又はOx８標識に陽性な細胞を殆んど又は全く
もたない遅延型過敏症／ヘルパー細胞（Lyt−１又はｗ
３／２５）のマーカーに対して陽性であることが判明し
た。この株細胞のいずれもIgマーカーに対しては陽性で
はない。病気を伝達するには、Ｔリンパ球株は、レシピ
エント動物に接種する前にＴ細胞マイトジエンの特異抗
原で培養して活性化しなければならない。抗BP又は抗Tg
細胞をわずか１０４−１０５量１回接種するだけで、比
較的短時間に臨床的及び病理学的に顕著なEAE又はEATの
徴候をもたらすことができる。AAを生じさせるには、よ
り大量の株細胞（１０７）を使用し、レシピエントを比
較的強く放射線処理する（７５０Ｒ）必要がある。病気
を発症させるためには、レシピエントは少くともMHCの
部分においてこの株細胞と同系でなければならない。自
己免疫の特徴的病変は、標的臓器における免疫学的に特
異的な株細胞の蓄積を伴う。
Ｔリンパ球株細胞によつて作り出された病気における自
己抗原の役割を示す証拠は何もない。
本発明者等は又脳脊髄炎あるいは関節炎クローン細胞を
作り出すことに成功した。抗BPクローンをその親株より
も若干菌力性を弱める一方、その親よりもはるかに菌力
の強い抗Tbクローンを分離した。
自己免疫病に対するワクチン接種 第II表に、自己免疫病に抵抗性を生じる特異的ワクチン
として株細胞を使用する例を示す。
放射線療法を施したあるいはマイトマイシンＣで処置し
た抗BP株細胞はもはやEAEを作り出すことができなかつ
た。しかしながら、そのような弱毒化された株細胞を１
回静脈注射するだけで、BP／CPAにより能動免疫された
ラツトの約６５％に抵抗性がみられた。初期の実験によ
れば、これらラツトは抗BP細胞株の受身伝達によつて作
り出されたEAEになお感受性をもつていた。このこと
は、抵抗性のメカニズムが分化細胞に対してよりは事前
に生じた効果又は細胞に対してはより効果がないことを
示唆している（上記文献７）。しかしながら、本発明者
らは最近、株細胞のポジテイブトランスフアによつてEA
Eを予防することができること及び加圧処理した細胞を
使用して能動EAEを予防することができることを知つた
（未刊行）。これに対し、弱毒化した抗Tg株細胞を１回
静脈接種するだけで、Tg／CFAによつて誘発された活性E
ATを完全に抑制するばかりでなく、活性化抗Tg株細胞の
接種によつて伝達されるEATも予防することができるこ
とを見出した。従つて、原則として、自己免疫病に対す
る抵抗性は分化の初期相に限られるものではなく、疾病
のエフエクター相も含むものである。
膜蛋白による治療 自己免疫株細胞は、実験的自己免疫の予防治療剤として
有効であることが見出された。このアプローチは、特定
の治療形態が存しない自己免疫疾患の臨床的管理に役立
つかもしれない。臨床上は予防よりもむしろ治療に重点
がおかれるが、この違いは実際上はつきりしていない。
自己免疫病の重大な関心事は、進行性又は回帰性の疾患
の場合であり、自己免疫リンパ球の新しい波の分化を防
止することそれ自身が有効な治療となる。
第１図に株細胞１回接種によるAAの軽減状態を示す。こ
の実験において、能動的に誘発されたAAに罹患したラツ
ト群を、特異的抗Tb株細胞又は対照株細胞で治療した。
特異的抗Tb株細胞で治療したラツトは、病気が軽く進行
も遅かつた。
さらに、自己免疫リンパ球株を選択すべき自己抗原の同
定及び適用性についても配慮しなければならない。自己
抗原は種々の条件において未知であるか又は、その供給
が非常に限られている。それにも拘らず、AAモデルは、
外部起源の不完全にに特定された抗原混合物を使用して
さえ、適切な株細胞を作ることが可能であることを示唆
するものである。このような条件でなぜどうして特異的
な菌力をもつ自己免疫リンパ球が生じるかは不明である
が、事実である。
株細胞から得られる亜細胞物質あるいは抗原性を増強し
た細胞で治療を行う方が有利であり、膜蛋白が効果的に
使用できることが判明した。株細胞の膜蛋白は、ヒト赤
血球から血液グループの抗原を分離するのに使用された
新規な方法によつて作つた。この方法は、膜−脂質二重
層が硬化する際に膜蛋白の平衡位置が水性領域に移ると
いう仮説に基づいている。そして極端な脂質粘度で蛋白
がはがれ落ちる（shed）。原則として、各構成膜蛋白は
その膜からはがれ落ちる一定の脂質粘度限界値をもつて
いる。
膜を超硬化する最も効率的な方法は静水圧（500−1500
気圧）をかけることであり、この圧力はコレステロール
で前処理することによつて更に上げることができる。細
胞は一般にこのような処理をしても生存しており、はが
れ落ちた物質を遠心分離してサイズに応じて分画するこ
とができる。10,000ｇで１時間遠心分離後上清に残つた
物質は、分離された蛋白あるいはその小凝集体と思われ
る。この遠心分離によつて沈澱したものは、膜フラグメ
ントと蛋白の大凝集体とからなる。可溶性膜蛋白は、界
面活性剤を使用する従来法で分離される膜蛋白とは異な
り、一般にその活性をそのまま残している。
自己免疫病に対する免疫能力は次のフラクシヨンに見出
された。(i)加圧活性化細胞（おそらく特異的抗原レセ
プターの横方向への再配列と縦方向への変位による）(i
i)得られた可溶性蛋白(iii)膜フラクメント。
第III表に、加圧法によつて分離された膜フラクシヨン
が、特異抗原に対して自己免疫株細胞の反応を免疫学的
特異性をもつて阻止することを示す。
例えば、Zla抗BPから得られた膜フラクシヨンはBPに対
する未処置Zla株細胞の反応を阻止した。しかし、その
抗原に対する関節炎を起すZla株細胞の反応は阻止しな
かつた。逆に、関節炎を起すＡ２細胞から得られた膜フ
ラクシヨンは、未処置Ａ２株細胞の反応は阻止したが、
Zla株細胞の反応は阻止しなかつた。これらの結果は、
膜フラクシヨンが自己抗原に特異的な、生物学的に活性
なレセプターを含有することを示している。
第２図は、ラツトにZla株細胞の膜フラクシヨン各0.50
μｇを一週間毎に２回与え、二週間後ラツトに能動EAE
をおこした実験の結果を示す。
膜フラクシヨンで処置したラツトは対照ラツトにくらべ
て非常におだやかな麻痺にかかつただけであることがわ
かる。従つて、特異膜フラクシヨンを用いると病気の進
行を顕著に軽減することができた。
第IV表は、加圧活性化抗BP株細胞をワクチン接種したラ
ツトの結果を示す。
対照株細胞で処置したラツトはEAE感受性であつたが、
加圧活性化特異抗BP株細胞で処置したラツトは能動EAE
に対して完全に抵抗性をもつていることがわかる。これ
らのラツトは、未処置の抗BP株細胞で伝達されたEAEに
も抵抗性をもつていた（表示せず）。
自己免疫株細胞の膜蛋白を用いて治療することができる
自己免疫病の例： 実施例 ワクチンの製造 ミエリン塩基性蛋白に対するＴリンパ球株から得られた
細胞を使用した（Zla株）。これら細胞はラツトに実験
的自己免疫脳脊髄炎（EAE）をおこす。６×１０８個の
細胞をpH7.2のリン酸緩衝液（PBS）2.5ｍに懸濁して
無菌加圧室に入れた。溶液の表面に直接ふたを置き泡を
除く。フレンチプレスで徐々に（15分）加圧し1000気圧
にしてこの圧力を45分保つた。次いで徐々に（15分）大
気圧まで減圧した。この細胞を試験管に移し１５００ｒ
ｐｍで回転させて沈澱物を分離した。トリパンブルーイ
クスクルージヨンによつて試験したところ、細胞生育能
力は９０％以上であつた。次いで上清を１０００００ｇ
で１時間超遠心分離した。上清（２ｍPBS中約６００
μｇ蛋白）を採取し、下記インビトロ及びインビボ機能
試験に使用した。
インビトロ実験においては、Zla株細胞にその特異抗原
（0.2μｇ／ｍミエリン塩基性蛋白）を添加してこれ
を増殖させた。
細胞増殖は添加した放射性チミジンの１分当り個数で表
わした。得られた蛋白（上記）を３０μｇ／ｍ添加す
ると、細胞増殖は４０−６０％減少した。他のＴ株細胞
（関節炎を含む）から得られた蛋白を３０μｇ／ｍ使
用した場合、細胞増殖の効果は観察されなかつた。代表
的な実験結果を上記第III表に示した。この結果は、細
胞の表面に圧力をかけて得られた物質が誘発抗原に特異
的なレセプターを含んでいることを示す。本物質は該レ
セプターに対して免疫化を行うために使用することがで
き、自己免疫病を部分的にあるいは完全に阻止する。こ
のような実験は下記の如く行つた。
初めにZla株細胞の加圧によつて得られた可溶性蛋白0.5
μｇを一週間おきに２回接種することによつてラツトを
前免疫した。二週間後、アジユバント中BP抗原を投与し
た。１４日後対照群のラツトはすべて重篤はEAEを発症
したが、前処置したラツトは軽いEAE症状を呈したにす
ぎない。脳脊髄炎惹起量のBP抗原投与後の典型的プロフ
イルを第２図に示す。無関係な株（関節炎）を加圧して
得られた蛋白で前処置したラツトはEAEの発症に関して
は何の効果も示さなかつた。
（発明の効果） 自己免疫Ｔリンパ球細胞株から得られる膜物質又は加圧
活性化自己免疫Ｔリンパ球を活性成分として含む組成物
をワクチン接種することによつて、多発性硬化症、甲状
腺炎、ある型の糖尿病、強直性脊椎炎等の自己免疫病を
予防及び治療することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は株細胞による進行中の関節炎の治療を示す。CF
Aを接種して２０匹のルイスラツトに能動アジユバント
関節炎をおこした。臨床的関節炎の発症（矢印、１６
日）５日後、１群１０匹のラツトに活性化抗Tb株細胞
（黒丸）を１回静脈接種した。第２群のラツト１０匹は
無関係な対照株で処置した（白丸）。平均関節炎の評価
は上記文献（５）に記載の方法によつた。 第２図は、膜フラクシヨンの投与によつてEAEが軽減さ
れたことを示す。ラツトに、Zla株細胞（0.5μｇ、加圧
法によつて得られた）の膜フラクシヨンを一週おきに２
回接種した。二週間後、脳脊髄炎惹起量のEAEに変え
た。試験ラツトの臨床評価は白丸で、対照ラツトは黒丸
で示す。臨床評価：１……軽度、２……中程度、３……
重篤。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭53−139720（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−24133（ＪＰ，Ａ)

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】活性成分として、自己免疫Ｔリンパ球の細
    胞膜から得られる膜蛋白類又は加圧活性化自己免疫Ｔリ
    ンパ球を含有する自己免疫疾患の予防治療用医薬組成物
    であって、該膜蛋白類は、Ｔリンパ球を約５分間にわた
    って圧力を上昇させて500気圧から1500気圧の範囲の水
    圧で約10分間から45分間加圧し次いで５分間から15分間
    にわたって圧力を下げて得られる膜蛋白質がはがれ落ち
    たＴリンパ球含有系を次いで超遠心分離に付した後の上
    清から得られる分画である、上記医薬組成物。
  2. 【請求項２】膜蛋白類が、多発性硬化症、甲状腺炎、Ｉ
    型糖尿病、強直性脊椎炎及び慢性関節リウマチから選択
    された自己免疫疾患に特異的な自己免疫Ｔリンパ球から
    得られたものである特許請求の範囲第１項記載の医薬組
    成物。
  3. 【請求項３】自己免疫疾患のワクチン化に使用するため
    の特許請求の範囲第１項記載の医薬組成物。
  4. 【請求項４】活性成分が加圧活性化Ｔリンパ球である特
    許請求の範囲第１項記載の医薬組成物。
  5. 【請求項５】自己免疫疾患の予防治療用医薬組成物の製
    造方法であって、特定の疾患の患者から得られるＴリン
    パ球を、適当な緩衝液中で500気圧から1500気圧の範囲
    で加圧してそのような気圧で約10分間から45分間維持
    し、次いで５分間から15分間かけて徐々に圧力を解除
    し、遠心分離して細胞フラグメントを除き、次いで上清
    を超遠心分離し、上清から得られた物質、あるいはこの
    ようにして加圧活性化されたＴリンパ球を上記医薬組成
    物の活性成分として用いて医薬組成物を製造する上記方
    法。
  6. 【請求項６】用いられるＴリンパ球が自己免疫病の患者
    から選択される特許請求の範囲第５項に記載の方法。
  7. 【請求項７】フランスプレスで500〜1500気圧の圧力を
    かける特許請求の範囲第５項又は第６項記載の方法。
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