JPH0641479B2 - 核酸またはエンドトキシンの除去剤および除去方法 - Google Patents
核酸またはエンドトキシンの除去剤および除去方法Info
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- JPH0641479B2 JPH0641479B2 JP62077064A JP7706487A JPH0641479B2 JP H0641479 B2 JPH0641479 B2 JP H0641479B2 JP 62077064 A JP62077064 A JP 62077064A JP 7706487 A JP7706487 A JP 7706487A JP H0641479 B2 JPH0641479 B2 JP H0641479B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、核酸またはエンドトキシンを含む系から核酸
またはエンドトキシンを除去するための薬剤および方
法、特に蛋白質類と核酸またはエンドトキシンとを含む
系から核酸またはエンドトキシンを除去するための薬剤
および方法に関するものである。
またはエンドトキシンを除去するための薬剤および方
法、特に蛋白質類と核酸またはエンドトキシンとを含む
系から核酸またはエンドトキシンを除去するための薬剤
および方法に関するものである。
微生物やヒト、動物または植物組織などの細胞を培養し
て、細胞中の生理活性物質や蛋白質、酵素などの有用物
質が採取、生産されている。また、近年バイオテクノロ
ジーの進歩に伴い生理活性物質や有用蛋白質、ホルモン
などの蛋白質類を産生する遺伝子を組み込んだ発現ベク
ターを用いて形質転換した微生物を培養することによ
り、これら有用物質を効率的に大量生産する方法が広く
実用化されている。いずれの場合においても、一般的に
はまず培養後の細胞を機械的破砕法、超音波破壊法など
を用いて細胞壁または細胞膜を破壊し、次いで遠心分離
法などによって無細胞抽出液を得る。そしてこの無細胞
抽出液中の核酸等の不純物を除去した後、クロマトグラ
フィなどの分離手段により、所望の精製有用物質を生産
している。
て、細胞中の生理活性物質や蛋白質、酵素などの有用物
質が採取、生産されている。また、近年バイオテクノロ
ジーの進歩に伴い生理活性物質や有用蛋白質、ホルモン
などの蛋白質類を産生する遺伝子を組み込んだ発現ベク
ターを用いて形質転換した微生物を培養することによ
り、これら有用物質を効率的に大量生産する方法が広く
実用化されている。いずれの場合においても、一般的に
はまず培養後の細胞を機械的破砕法、超音波破壊法など
を用いて細胞壁または細胞膜を破壊し、次いで遠心分離
法などによって無細胞抽出液を得る。そしてこの無細胞
抽出液中の核酸等の不純物を除去した後、クロマトグラ
フィなどの分離手段により、所望の精製有用物質を生産
している。
従来、このような無細胞抽出液中に含まれる蛋白性有用
物質と核酸等の不純物の分離除去法としては、塩酸など
で抽出液のpHを酸性領域（4.1〜4.8）に調整することに
より主として蛋白性有用物質を沈殿する方法（特開昭53
-12496号）、硫酸アンモニウムを用いて塩析する方法
（特公昭48-43841号）、多価金属塩などを用いて凝集す
る方法（特開昭55-114290号）、プロタミン硫酸あるい
はストレプトマイシン硫酸を用いて核酸を凝集する方法
（特開昭55-114290号、生化学実験講座５巻、200〜201
頁）、またポリエチレンイミンを用いて核酸も凝集する
方法（特開昭57-146575号、特開昭58-152478号）などが
知られている。
物質と核酸等の不純物の分離除去法としては、塩酸など
で抽出液のpHを酸性領域（4.1〜4.8）に調整することに
より主として蛋白性有用物質を沈殿する方法（特開昭53
-12496号）、硫酸アンモニウムを用いて塩析する方法
（特公昭48-43841号）、多価金属塩などを用いて凝集す
る方法（特開昭55-114290号）、プロタミン硫酸あるい
はストレプトマイシン硫酸を用いて核酸を凝集する方法
（特開昭55-114290号、生化学実験講座５巻、200〜201
頁）、またポリエチレンイミンを用いて核酸も凝集する
方法（特開昭57-146575号、特開昭58-152478号）などが
知られている。
一方、前記抽出液中の所望の有用物質が医薬など直接人
体内に投与されるものである場合には特にエンドトキシ
ンの除去が問題となる。エンドトキシンは菌体内毒素と
も呼ばれ、特にグラム陰性菌例えば大腸菌由来のエンド
トキシンは強力な発熱性物質であり、注射などにより人
体内に運び込まれると悪寒や発熱を惹起する。従ってエ
ンドトキシンの効率の良い除去法が切望されている。
体内に投与されるものである場合には特にエンドトキシ
ンの除去が問題となる。エンドトキシンは菌体内毒素と
も呼ばれ、特にグラム陰性菌例えば大腸菌由来のエンド
トキシンは強力な発熱性物質であり、注射などにより人
体内に運び込まれると悪寒や発熱を惹起する。従ってエ
ンドトキシンの効率の良い除去法が切望されている。
従来、エンドトキシンを除去する方法として、酸化剤
（特開昭56-63924号）、加熱（特開昭54-51245号）、活
性炭（特開昭52-36887号）、イオン交換樹脂（特開昭52
-57314号）、合成吸着体（特開昭50-69220号、特開昭57
-183712号）、限外濾過膜（特公昭56-28156号）、逆浸
透膜（特開昭53-64948号）などによる除去方法が知られ
ている。また蛋白質とエンドトキシンとを含む液にアル
ミニウム塩および亜鉛塩を添加して、蛋白質を沈殿させ
る一方、エンドトキシンを上澄液側に残留させる方法も
知られている（特開昭57-35521号）。
（特開昭56-63924号）、加熱（特開昭54-51245号）、活
性炭（特開昭52-36887号）、イオン交換樹脂（特開昭52
-57314号）、合成吸着体（特開昭50-69220号、特開昭57
-183712号）、限外濾過膜（特公昭56-28156号）、逆浸
透膜（特開昭53-64948号）などによる除去方法が知られ
ている。また蛋白質とエンドトキシンとを含む液にアル
ミニウム塩および亜鉛塩を添加して、蛋白質を沈殿させ
る一方、エンドトキシンを上澄液側に残留させる方法も
知られている（特開昭57-35521号）。
しかしながら、前記核酸等の不純物の除去法において、
無細胞抽出液を低いpH領域で処理する方法、硫酸アンモ
ニウムを用いる方法、あるいは多価金属塩を用いる方法
は蛋白性有用物質を一旦沈殿させる方法であり、有用物
質をさらに精製するためには沈殿物を再溶解させる必要
がある上、分離効果も十分に満足のいくものではない。
さらに硫酸アンモニウムによる塩析法においてはその後
透析工程などを必要とし繁雑さを伴う。またプロタミン
硫酸やストレプトマイシン硫酸を用いる核酸除去方法は
試薬が高価なため工業的スケールでの処理法としては経
済性の面で適当でなく、異種蛋白質の混入や抗生物質の
残留などの面でも問題が残る。一方、ポリエチレンイミ
ンを用いる核酸凝集法はかなりの核酸除去効果がみられ
るものの、有害なポリエチレンイミンの分解物の残留の
恐れがあり適切な方法ではない。
無細胞抽出液を低いpH領域で処理する方法、硫酸アンモ
ニウムを用いる方法、あるいは多価金属塩を用いる方法
は蛋白性有用物質を一旦沈殿させる方法であり、有用物
質をさらに精製するためには沈殿物を再溶解させる必要
がある上、分離効果も十分に満足のいくものではない。
さらに硫酸アンモニウムによる塩析法においてはその後
透析工程などを必要とし繁雑さを伴う。またプロタミン
硫酸やストレプトマイシン硫酸を用いる核酸除去方法は
試薬が高価なため工業的スケールでの処理法としては経
済性の面で適当でなく、異種蛋白質の混入や抗生物質の
残留などの面でも問題が残る。一方、ポリエチレンイミ
ンを用いる核酸凝集法はかなりの核酸除去効果がみられ
るものの、有害なポリエチレンイミンの分解物の残留の
恐れがあり適切な方法ではない。
また、前記のエンドトキシンの除去法に関しては、例え
ば酸化剤や加熱による方法では液中のエンドトキシンは
除去されても共存している有用物質の変性失活を伴な
う。さらに、吸着法では有用物質とエンドトキシンとの
分離効率が十分ではない。一方膜法では有用物質が高分
子物質である場合に、分子量が100万以上であるエンド
トキシンとの分離は不可能であり、また設備費や装置の
維持の面で難点がある。さらにアルミニウム塩と亜鉛塩
による方法は、蛋白質を沈殿させて発熱性物質と分離す
るものであり、得られた蛋白質をさらに精製する場合に
は再溶解する工程が必要となる。
ば酸化剤や加熱による方法では液中のエンドトキシンは
除去されても共存している有用物質の変性失活を伴な
う。さらに、吸着法では有用物質とエンドトキシンとの
分離効率が十分ではない。一方膜法では有用物質が高分
子物質である場合に、分子量が100万以上であるエンド
トキシンとの分離は不可能であり、また設備費や装置の
維持の面で難点がある。さらにアルミニウム塩と亜鉛塩
による方法は、蛋白質を沈殿させて発熱性物質と分離す
るものであり、得られた蛋白質をさらに精製する場合に
は再溶解する工程が必要となる。
本発明は上記問題点を解決するためのもので、核酸また
は（および）エンドトキシンを効率よく、簡便かつ安全
に分離除去することが可能な核酸またはエンドトキシン
の除去剤および除去方法を提供することを目的としてい
る。
は（および）エンドトキシンを効率よく、簡便かつ安全
に分離除去することが可能な核酸またはエンドトキシン
の除去剤および除去方法を提供することを目的としてい
る。
本発明は次の核酸またはエンドトキシンの除去剤および
除去方法である。
除去方法である。
(1)低分子キトサンを有効成分として含有することを特
徴とする核酸またはエンドトキシンの除去剤。
徴とする核酸またはエンドトキシンの除去剤。
(2)低分子キトサンを用いて核酸またはエンドトキシン
を分離することを特徴とする核酸またはエンドトキシン
の除去方法。
を分離することを特徴とする核酸またはエンドトキシン
の除去方法。
本発明において用いられる低分子キトサンは天然のキチ
ンから得られるキトサンの低分子化物で、固有粘度0.01
〜５(dl/g)のもの、好ましくは0.03〜２(dl/g)のもの、
さらに好ましくは0.2〜１(dl/g)のものが適当である。
固有粘度0.01未満の場合ならびに５を超える場合は核酸
またはエンドトキシンの除去効率は低下する。また低分
子キトサンはpH４におけるコロイド当量２meq/g-蒸発残
分以上、特に４meq/g-蒸発残分以上のものが好ましい。
２meq/g-蒸発残分未満では、大量添加する必要があり好
ましくない。従って本発明において用いられる低分子キ
トサンとしては、固有粘度0.2〜１(dl/g)、pH４におけ
るコロイド当量４meq/g-蒸発残分以上のものが特に好ま
しい。
ンから得られるキトサンの低分子化物で、固有粘度0.01
〜５(dl/g)のもの、好ましくは0.03〜２(dl/g)のもの、
さらに好ましくは0.2〜１(dl/g)のものが適当である。
固有粘度0.01未満の場合ならびに５を超える場合は核酸
またはエンドトキシンの除去効率は低下する。また低分
子キトサンはpH４におけるコロイド当量２meq/g-蒸発残
分以上、特に４meq/g-蒸発残分以上のものが好ましい。
２meq/g-蒸発残分未満では、大量添加する必要があり好
ましくない。従って本発明において用いられる低分子キ
トサンとしては、固有粘度0.2〜１(dl/g)、pH４におけ
るコロイド当量４meq/g-蒸発残分以上のものが特に好ま
しい。
低分子キトサンの原料となるキトサンはカニやエビの甲
羅などからキチンをとりだし、アルカリで脱アセチル化
することにより得られる高分子物質である。このキトサ
ンに過酸化水素、亜硝酸イオン、アルカリ、酸などを加
えてグルコシド結合を切断することにより、低分子キト
サンを製造することができる。特に過酸化水素による切
断方法はキトサンのコロイド当量をほとんど低減するこ
となく行えるので好ましく、キトサンに対する過酸化水
素の添加濃度を適当に調節することにより、任意の固有
粘度の低分子キトサンが得られる。この方法では、キト
サンをアルカリ液中に懸濁させ、適量の過酸化水素を添
加して一定温度下に一定時間反応させ、濾過などにより
水分を除去して乾燥することにより低分子キトサンの粉
末を得ることができる。このときのキトサンの切断条件
はpH６〜12、過酸化水素濃度0.005〜10重量％、液温20
〜90℃、反応時間30〜500分程度が好ましい。
羅などからキチンをとりだし、アルカリで脱アセチル化
することにより得られる高分子物質である。このキトサ
ンに過酸化水素、亜硝酸イオン、アルカリ、酸などを加
えてグルコシド結合を切断することにより、低分子キト
サンを製造することができる。特に過酸化水素による切
断方法はキトサンのコロイド当量をほとんど低減するこ
となく行えるので好ましく、キトサンに対する過酸化水
素の添加濃度を適当に調節することにより、任意の固有
粘度の低分子キトサンが得られる。この方法では、キト
サンをアルカリ液中に懸濁させ、適量の過酸化水素を添
加して一定温度下に一定時間反応させ、濾過などにより
水分を除去して乾燥することにより低分子キトサンの粉
末を得ることができる。このときのキトサンの切断条件
はpH６〜12、過酸化水素濃度0.005〜10重量％、液温20
〜90℃、反応時間30〜500分程度が好ましい。
本発明の核酸またはエンドトキシン除去剤は上記のよう
な低分子キトサンを有効成分として含有するものであ
り、他の成分をさらに含有していてもよい。他の成分と
しては天然または合成の凝集剤、凝集助剤その他の添加
剤が配合可能である。
な低分子キトサンを有効成分として含有するものであ
り、他の成分をさらに含有していてもよい。他の成分と
しては天然または合成の凝集剤、凝集助剤その他の添加
剤が配合可能である。
本発明において除去の対象となるのは核酸またはエンド
トキシンであり、核酸およびエンドトキシンを一緒に除
去する場合も含まれる。本発明において除去とは、被処
理系から核酸またはエンドトキシンを分離除去すること
を意味し、被処理系に核酸またはエンドトキシンが不純
物として含まれている場合のほか、有価物として含まれ
ている場合もある。核酸またはエンドトキシンが不純物
として含まれている場合は、不純物としての核酸または
エンドトキシンを分離除去することにより、有価物を精
製、回収する。逆に核酸またはエンドトキシンが有価物
として含まれている場合は、これらを有価物として分離
し、精製、回収する。
トキシンであり、核酸およびエンドトキシンを一緒に除
去する場合も含まれる。本発明において除去とは、被処
理系から核酸またはエンドトキシンを分離除去すること
を意味し、被処理系に核酸またはエンドトキシンが不純
物として含まれている場合のほか、有価物として含まれ
ている場合もある。核酸またはエンドトキシンが不純物
として含まれている場合は、不純物としての核酸または
エンドトキシンを分離除去することにより、有価物を精
製、回収する。逆に核酸またはエンドトキシンが有価物
として含まれている場合は、これらを有価物として分離
し、精製、回収する。
核酸またはエンドトキシンの除去を行うべき被処理系と
しては特に制限されず、核酸またはエンドトキシンを含
む液が広く処理対象となる。核酸またはエンドトキシン
を不純物として含む被処理液としては、有価物である特
定の蛋白質類と核酸またはエンドトキシンとを含む液が
あり、この場合被処理液から核酸またはエンドトキシン
を分離除去し、有価物としての蛋白質類を精製する。
しては特に制限されず、核酸またはエンドトキシンを含
む液が広く処理対象となる。核酸またはエンドトキシン
を不純物として含む被処理液としては、有価物である特
定の蛋白質類と核酸またはエンドトキシンとを含む液が
あり、この場合被処理液から核酸またはエンドトキシン
を分離除去し、有価物としての蛋白質類を精製する。
上記の分離除去においては精製の対象とされる蛋白質類
は等電点３以上の可溶性の蛋白質または蛋白様物質を意
味し、例えばインターフェロン、癌壊死因子（ＴＮ
Ｆ）、リンホトキシン、インターロイキンなどのヒト細
胞由来抗癌物質、コロニー活性化因子、マクロファージ
活性化因子などの免疫系調節因子、アルブミン、γ−グ
ロブリン、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化
因子、スーパーオキサイドデスムターゼ、エリスロポエ
チンなどの血液組織由来蛋白質、インスリン、成長ホル
モン、ソマトスタチンなどのホルモン、その他菌体ある
いは細胞由来の各種酵素および生理活性ペプチドなどが
挙げられる。このような蛋白質類には新しく単離される
物質も含まれる。
は等電点３以上の可溶性の蛋白質または蛋白様物質を意
味し、例えばインターフェロン、癌壊死因子（ＴＮ
Ｆ）、リンホトキシン、インターロイキンなどのヒト細
胞由来抗癌物質、コロニー活性化因子、マクロファージ
活性化因子などの免疫系調節因子、アルブミン、γ−グ
ロブリン、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化
因子、スーパーオキサイドデスムターゼ、エリスロポエ
チンなどの血液組織由来蛋白質、インスリン、成長ホル
モン、ソマトスタチンなどのホルモン、その他菌体ある
いは細胞由来の各種酵素および生理活性ペプチドなどが
挙げられる。このような蛋白質類には新しく単離される
物質も含まれる。
これらの蛋白質類を含む被処理液としては、微生物やヒ
ト、動物または植物組織などの細胞を破壊した無細胞抽
出液などの抽出液あるいは培養液などがある。このほか
被処理液としては医薬用などに用いられる用水があり、
このような用水からエンドトキシンなどの不純物を分離
除去して精製し、注射液などに利用される。
ト、動物または植物組織などの細胞を破壊した無細胞抽
出液などの抽出液あるいは培養液などがある。このほか
被処理液としては医薬用などに用いられる用水があり、
このような用水からエンドトキシンなどの不純物を分離
除去して精製し、注射液などに利用される。
本発明の核酸またはエンドトキシン除去剤は上記のよう
な被処理液から核酸またはエンドトキシンを分離除去す
るために用いられる。核酸またはエンドトキシンの除去
方法は、被処理液に本発明の核酸またはエンドトキシン
除去剤を加え、生成する析出物を固液分離により除去す
る。この場合核酸またはエンドトキシンは低分子キトサ
ンと結合して不溶物となって沈殿するので、固液分離す
ることにより除去可能である。本発明の核酸またはエン
ドトキシンの除去剤は低分子キトサン１〜10重量％の水
溶液として被処理液に添加するのが好ましいが、粉末状
で添加してもよい。このほか低分子キトサンを担体に吸
着させてカラムに充填し、被処理液を通水して低分子キ
トサンを徐々に溶解させて核酸またはエンドトキシンを
沈殿させたり、あるいは低分子キトサンを担体に固定
し、被処理液を通水して核酸、またはエンドトキシンを
担体に吸着させて除去してもよく、除去の具体的な方法
は任意に選択可能である。
な被処理液から核酸またはエンドトキシンを分離除去す
るために用いられる。核酸またはエンドトキシンの除去
方法は、被処理液に本発明の核酸またはエンドトキシン
除去剤を加え、生成する析出物を固液分離により除去す
る。この場合核酸またはエンドトキシンは低分子キトサ
ンと結合して不溶物となって沈殿するので、固液分離す
ることにより除去可能である。本発明の核酸またはエン
ドトキシンの除去剤は低分子キトサン１〜10重量％の水
溶液として被処理液に添加するのが好ましいが、粉末状
で添加してもよい。このほか低分子キトサンを担体に吸
着させてカラムに充填し、被処理液を通水して低分子キ
トサンを徐々に溶解させて核酸またはエンドトキシンを
沈殿させたり、あるいは低分子キトサンを担体に固定
し、被処理液を通水して核酸、またはエンドトキシンを
担体に吸着させて除去してもよく、除去の具体的な方法
は任意に選択可能である。
以下に特定の蛋白質類含有細胞抽出液から核酸およびエ
ンドトキシンを分離除去する方法を例にとって除去方法
を具体的に説明する。この方法では蛋白質類含有無細胞
抽出液に低分子キトサンを加えて攪拌すると、核酸およ
びエンドトキシンが低分子キトサンとともに沈殿するの
で、これを常法に従って固液分離し、蛋白質類から核酸
およびエンドトキシンを分離除去する。
ンドトキシンを分離除去する方法を例にとって除去方法
を具体的に説明する。この方法では蛋白質類含有無細胞
抽出液に低分子キトサンを加えて攪拌すると、核酸およ
びエンドトキシンが低分子キトサンとともに沈殿するの
で、これを常法に従って固液分離し、蛋白質類から核酸
およびエンドトキシンを分離除去する。
無細胞抽出液に低分子キトサンを添加した後の液のpHは
等電点より若干高い値が好ましい。pHが８を超えると除
去効果が低減するので好ましくない。被処理液の塩濃度
が高いと除去効果が低減するので、被処理液の塩類濃度
が高い場合には、予めできるだけ塩類濃度を低減させて
処理するのが望ましい。例えば塩化ナトリウムの場合0.
5M以上では除去効果が低減する。処理時の液温は通常０
〜５℃に調整するのが望ましいが、特に制限されない。
低分子キトサンの添加率は、通常核酸（ＤＮＡおよびＲ
ＮＡ）に対して50〜200重量％程度がよい。
等電点より若干高い値が好ましい。pHが８を超えると除
去効果が低減するので好ましくない。被処理液の塩濃度
が高いと除去効果が低減するので、被処理液の塩類濃度
が高い場合には、予めできるだけ塩類濃度を低減させて
処理するのが望ましい。例えば塩化ナトリウムの場合0.
5M以上では除去効果が低減する。処理時の液温は通常０
〜５℃に調整するのが望ましいが、特に制限されない。
低分子キトサンの添加率は、通常核酸（ＤＮＡおよびＲ
ＮＡ）に対して50〜200重量％程度がよい。
低分子キトサンを被処理系中に添加すると、核酸、エン
ドトキシンおよびその他の不純物が低分子キトサンと結
合し、不純物を形成して沈殿する。精製の対象とされる
特定の蛋白質類は上清液に残存するので、上記の不純物
を容易に分離除去することができる。得られる特定の蛋
白質は、必要に応じさらに精製工程に付される。また低
分子キトサンに吸着された核酸またはエンドトキシンは
適当に処理することにより、有価物として回収すること
ができる。
ドトキシンおよびその他の不純物が低分子キトサンと結
合し、不純物を形成して沈殿する。精製の対象とされる
特定の蛋白質類は上清液に残存するので、上記の不純物
を容易に分離除去することができる。得られる特定の蛋
白質は、必要に応じさらに精製工程に付される。また低
分子キトサンに吸着された核酸またはエンドトキシンは
適当に処理することにより、有価物として回収すること
ができる。
天然キチンから得られるキトサンは、そのまま希酸に溶
解すると、固有粘度13(dl/g)前後の粘稠なカチオン性コ
ロイドが得られ、高濃度溶液の調製が不可能である。ま
たコロイド当量は５meq/g-蒸発残分前後で、十分な核酸
またはエンドトキシン除去効果を得るためには、被処理
液とほぼ等量のキトサン溶液の添加を必要とし、操作面
および経済面から実用性に欠ける。
解すると、固有粘度13(dl/g)前後の粘稠なカチオン性コ
ロイドが得られ、高濃度溶液の調製が不可能である。ま
たコロイド当量は５meq/g-蒸発残分前後で、十分な核酸
またはエンドトキシン除去効果を得るためには、被処理
液とほぼ等量のキトサン溶液の添加を必要とし、操作面
および経済面から実用性に欠ける。
しかしながら、このようなキトサンを化学的処理して得
られる低分子キトサンは高濃度溶液の調製が可能である
とともに、核酸およびエンドトキシンの除去効率が高
い。このため極めて少容量で高い核酸およびエンドトキ
シン除去効果が得られる。したがって細胞培養抽出液の
ような核酸およびエンドトキシンなどの不純物を大量に
含有する系から、これらの不純物を一緒に除去し、目的
とする特定の蛋白質類を効率よく、簡便に精製すること
が可能である。
られる低分子キトサンは高濃度溶液の調製が可能である
とともに、核酸およびエンドトキシンの除去効率が高
い。このため極めて少容量で高い核酸およびエンドトキ
シン除去効果が得られる。したがって細胞培養抽出液の
ような核酸およびエンドトキシンなどの不純物を大量に
含有する系から、これらの不純物を一緒に除去し、目的
とする特定の蛋白質類を効率よく、簡便に精製すること
が可能である。
このように本発明では低分子キトサンを含有する除去剤
を用いることによって、極めて効率よく核酸またはエン
ドトキシンを被処理系から除去することができる。そし
て蛋白質類を含む被処理液に対して本発明の除去剤を用
いることにより、特定蛋白質類を溶液状態に保ったまま
核酸およびエンドトキシンを除去することができ、工程
的に極めて簡素化される。また無細胞抽出液中の蛋白質
類の精製において本発明の除去剤を用いることにより、
少容量の添加で核酸またはエンドトキシンを効率よく除
去することができるので、後工程においてさらに精製す
る際にかかる負荷は最小限となる。このほか粘度の高い
核酸などを沈殿物として除去しうるので、その後の除菌
フィルターなどによる処理が可能となるばかりでなく、
クロマトグラフィなどによる精製も容易となる。また設
備費についても従来方法と比べるとはるかに低減され、
実用的価値は高い。
を用いることによって、極めて効率よく核酸またはエン
ドトキシンを被処理系から除去することができる。そし
て蛋白質類を含む被処理液に対して本発明の除去剤を用
いることにより、特定蛋白質類を溶液状態に保ったまま
核酸およびエンドトキシンを除去することができ、工程
的に極めて簡素化される。また無細胞抽出液中の蛋白質
類の精製において本発明の除去剤を用いることにより、
少容量の添加で核酸またはエンドトキシンを効率よく除
去することができるので、後工程においてさらに精製す
る際にかかる負荷は最小限となる。このほか粘度の高い
核酸などを沈殿物として除去しうるので、その後の除菌
フィルターなどによる処理が可能となるばかりでなく、
クロマトグラフィなどによる精製も容易となる。また設
備費についても従来方法と比べるとはるかに低減され、
実用的価値は高い。
以上の通り、本発明によれば、低分子キトサンを有効成
分として除去剤に用いるので、被処理系から核酸または
エンドトキシンを効率よく、簡便かつ安全に分離除去す
ることができる。
分として除去剤に用いるので、被処理系から核酸または
エンドトキシンを効率よく、簡便かつ安全に分離除去す
ることができる。
以下、本発明の実施例について説明する。
(A)低分子キトサン試料の製造： まずカニの甲羅からキチンをとり出し、NaOHで脱アセチ
ル化することによりキトサンを得た。次にこのキトサン
を30または67g/をpH11のNaOH溶液中に懸濁させ、70℃
に維持した。次いで攪拌下0.088〜14g/のH2O2（純
分）を添加し、110〜300分間反応させた後、粉末化し
た。得られた低分子キトサン（C-1〜C-9）の物性をキト
サンの物性とともに表−１に示す。
ル化することによりキトサンを得た。次にこのキトサン
を30または67g/をpH11のNaOH溶液中に懸濁させ、70℃
に維持した。次いで攪拌下0.088〜14g/のH2O2（純
分）を添加し、110〜300分間反応させた後、粉末化し
た。得られた低分子キトサン（C-1〜C-9）の物性をキト
サンの物性とともに表−１に示す。
表−１中、H2O2は35w/w%水溶液である。固有粘度〔η〕
は試料に同量の酢酸を添加して0.2〜10g/dlの水溶液と
し、この溶液を同容量の0.4N-CH3COOH+0.2N-CH3COONa溶
液と混合して〔η〕測定用の溶液を調製し、30℃でウベ
ローデ粘度計（希釈型）を用いて測定した値で、希釈に
は0.2N-CH3COOH+0.1N-CH3COONa溶液を用いた。またコロ
イド当量(C.E.)はpH４における値である。
は試料に同量の酢酸を添加して0.2〜10g/dlの水溶液と
し、この溶液を同容量の0.4N-CH3COOH+0.2N-CH3COONa溶
液と混合して〔η〕測定用の溶液を調製し、30℃でウベ
ローデ粘度計（希釈型）を用いて測定した値で、希釈に
は0.2N-CH3COOH+0.1N-CH3COONa溶液を用いた。またコロ
イド当量(C.E.)はpH４における値である。
上記試料のうち、キトサンは非常に粘度が高く、その希
塩酸溶液の調製限度は0.5w/v%溶液（pH６）であるが、C
-1〜C-5については３w/v%溶液、C-6〜C-8については５w
/v%溶液、C-9については10w/v%溶液を調製することが可
能である。
塩酸溶液の調製限度は0.5w/v%溶液（pH６）であるが、C
-1〜C-5については３w/v%溶液、C-6〜C-8については５w
/v%溶液、C-9については10w/v%溶液を調製することが可
能である。
上記で得られたキトサンおよび低分子キトサン（C-1〜C
-9）の所定量に同量の希塩酸を添加して溶解した後、Na
OHでpH6.0〜7.0に調製して0.5〜５w/v%含有試料を製造
し、以下の実験に供した。
-9）の所定量に同量の希塩酸を添加して溶解した後、Na
OHでpH6.0〜7.0に調製して0.5〜５w/v%含有試料を製造
し、以下の実験に供した。
(B)ヒト癌壊死因子（ＴＮＦ）ポリペプチド含有細胞培
養抽出液の調製： ヨーロッパ特許公開第155,549号の実施例２(2)に開示さ
れた方法に従って得たヒトＴＮＦポリペプチド含有大腸
菌(E.coli HB101/pHTR-91)の培養液を用い、この培養液
を遠心分離して集菌し、菌体を破砕したのち遠心分離
し、ヒト癌壊死因子（ＴＮＦ）ポリペプチドを含有する
上清液を得た。これを以下の実験に供した。
養抽出液の調製： ヨーロッパ特許公開第155,549号の実施例２(2)に開示さ
れた方法に従って得たヒトＴＮＦポリペプチド含有大腸
菌(E.coli HB101/pHTR-91)の培養液を用い、この培養液
を遠心分離して集菌し、菌体を破砕したのち遠心分離
し、ヒト癌壊死因子（ＴＮＦ）ポリペプチドを含有する
上清液を得た。これを以下の実験に供した。
(C)ヒトインターロイキン１(IL-1)ポリペプチド含有細
胞培養抽出液の調製： ヨーロッパ特許公開第188920号の実施例５(2)に開示さ
れた方法に従って得たヒトインターロイキン１(IL-1)ポ
リペプチド含有大腸菌(E.coli HB101/pHLP383)の培養液
を用い、この培養液を遠心分離して集菌し、菌体を破砕
したのち遠心分離しヒトインターロイキン１(IL-1)ポリ
ペプチドを含有する上清液を得た。これを除菌フィルタ
ー（Microflow、フローラボラトリーズ社製、商標、孔
径0.2μｍ）で濾過して後記(V)-(2)の実験に供した。
胞培養抽出液の調製： ヨーロッパ特許公開第188920号の実施例５(2)に開示さ
れた方法に従って得たヒトインターロイキン１(IL-1)ポ
リペプチド含有大腸菌(E.coli HB101/pHLP383)の培養液
を用い、この培養液を遠心分離して集菌し、菌体を破砕
したのち遠心分離しヒトインターロイキン１(IL-1)ポリ
ペプチドを含有する上清液を得た。これを除菌フィルタ
ー（Microflow、フローラボラトリーズ社製、商標、孔
径0.2μｍ）で濾過して後記(V)-(2)の実験に供した。
（Ｉ）キトサンの核酸分離効果： 前記(B)で得られた上清液（２ml）に対し、前記(A)で得
られた固有粘度〔η〕＝13.5のキトサンの0.5w/v%溶液
（pH３）を所定量添加攪拌し、氷冷下に１時間放置した
のち、冷却遠心機を用いて４℃、3000回転／分で10分間
遠心分離し、上清液を採取して上清液中に残存している
核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）および蛋白質濃度を測定した。
結果を表−２に示す。
られた固有粘度〔η〕＝13.5のキトサンの0.5w/v%溶液
（pH３）を所定量添加攪拌し、氷冷下に１時間放置した
のち、冷却遠心機を用いて４℃、3000回転／分で10分間
遠心分離し、上清液を採取して上清液中に残存している
核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）および蛋白質濃度を測定した。
結果を表−２に示す。
表−２の結果より、キトサン0.5w/v%溶液を上清液とほ
ぼ同量またはそれ以上添加することにより、核酸除去効
果が認められるが、溶液中に残存する蛋白質を回収する
には液量が多くなり、実用性に乏しい。また本試料（キ
トサン）は通常の希塩酸による溶解法では、0.5w/v%以
上の濃度にすると粘度が高く調製が困難であった。
ぼ同量またはそれ以上添加することにより、核酸除去効
果が認められるが、溶液中に残存する蛋白質を回収する
には液量が多くなり、実用性に乏しい。また本試料（キ
トサン）は通常の希塩酸による溶解法では、0.5w/v%以
上の濃度にすると粘度が高く調製が困難であった。
(II)低分子キトサン（C-1〜C-6）の核酸分離効果： 前記(B)で得られたロットの異なる上清液（２ml）に対
し、前記(A)で製造した低分子キトサン（C-1〜C-6）溶
液（pH４）を前記（Ｉ）と同じ条件で添加し、得られた
結果を表−３および表−４に示す。
し、前記(A)で製造した低分子キトサン（C-1〜C-6）溶
液（pH４）を前記（Ｉ）と同じ条件で添加し、得られた
結果を表−３および表−４に示す。
(III)低分子キトサン（C-7〜C-9）の核酸およびエンド
トキシン分離効果： 前記(A)で製造した低分子キトサン（C-7〜C-9）を希塩
酸に溶解したのち、6N水酸化ナトリウム溶液でpHを６に
調整し、低分子キトサンの最終濃度を５w/v%に調整し
た。
トキシン分離効果： 前記(A)で製造した低分子キトサン（C-7〜C-9）を希塩
酸に溶解したのち、6N水酸化ナトリウム溶液でpHを６に
調整し、低分子キトサンの最終濃度を５w/v%に調整し
た。
前記(B)で得られたヒトＴＮＦポリペプチド含有上清液
（２ml）に対して各低分子キトサン溶液を添加攪拌し、
氷冷下に約10分間放置後、冷却遠心機を用いて４℃、30
00回転／分で10分間遠心分離し、上清液を採取して核
酸、エンドトキシンおよびＴＮＦの定量を行った。結果
を表−５に示す。
（２ml）に対して各低分子キトサン溶液を添加攪拌し、
氷冷下に約10分間放置後、冷却遠心機を用いて４℃、30
00回転／分で10分間遠心分離し、上清液を採取して核
酸、エンドトキシンおよびＴＮＦの定量を行った。結果
を表−５に示す。
(IV)低分子キトサン(C-9)による各種細胞培養抽出液中
の核酸除去効果： 枯草菌(Bacillus subtilis ATCC 6633)、パン酵母(Sacc
haromyces cerevisiae)および大腸菌(Escherichia coli
K-12)凍結乾燥菌体2.5gあるいはシュードモナス菌(Pse
udomonas fluorescens ATCC 13430)の凍結乾燥菌体1.3g
を20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)50mlに懸濁し超音波
処理（トミー精工、モデルUR-200P)した。冷却遠心機を
用いて４℃、10,000回転／分で10分間遠心分離した上清
液をそれぞれ枯草菌、パン酵母、大腸菌、シュードモナ
ス菌抽出液として使用した。
の核酸除去効果： 枯草菌(Bacillus subtilis ATCC 6633)、パン酵母(Sacc
haromyces cerevisiae)および大腸菌(Escherichia coli
K-12)凍結乾燥菌体2.5gあるいはシュードモナス菌(Pse
udomonas fluorescens ATCC 13430)の凍結乾燥菌体1.3g
を20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)50mlに懸濁し超音波
処理（トミー精工、モデルUR-200P)した。冷却遠心機を
用いて４℃、10,000回転／分で10分間遠心分離した上清
液をそれぞれ枯草菌、パン酵母、大腸菌、シュードモナ
ス菌抽出液として使用した。
HeLa細胞(ATCC CCL2)に関しては、これを10v/v%ウシ胎
児血清を含むイーグルのミニマム・エッセンシャル培地
〔ポール著“セル アンド ティシュ カルチュア”；
“Cell and Tissue Culture”，E & S Livingstone Lt
d.(1970)参照〕に植えつけ、５v/v%の炭酸ガスを含む空
気中、37℃で48時間培養した。トリプシン処理により細
胞を剥離させ、遠心分離により細胞を集めたのち生理食
塩水に再懸濁した。そしてHeLa細胞懸濁液10ml（約２×
107個の細胞を含む）を超音波処理（トミー精工、モデ
ルUR-200P）したものをHela細胞抽出液として使用し
た。
児血清を含むイーグルのミニマム・エッセンシャル培地
〔ポール著“セル アンド ティシュ カルチュア”；
“Cell and Tissue Culture”，E & S Livingstone Lt
d.(1970)参照〕に植えつけ、５v/v%の炭酸ガスを含む空
気中、37℃で48時間培養した。トリプシン処理により細
胞を剥離させ、遠心分離により細胞を集めたのち生理食
塩水に再懸濁した。そしてHeLa細胞懸濁液10ml（約２×
107個の細胞を含む）を超音波処理（トミー精工、モデ
ルUR-200P）したものをHela細胞抽出液として使用し
た。
枯草菌、パン酵母、Hela細胞に関しては、その抽出液２
ml当りＴＮＦ溶液（７×107IRU/ml)0.1mlを加え、また
大腸菌、シュードモナス菌に関しては、その抽出液２ml
当りＴＮＦ溶液（１×108IRU/ml)0.1mlを加え５w/v%低
分子キトサン(C-9)溶液（pH６）を所定量添加攪拌した
のち、約10分間氷冷下に放置した。
ml当りＴＮＦ溶液（７×107IRU/ml)0.1mlを加え、また
大腸菌、シュードモナス菌に関しては、その抽出液２ml
当りＴＮＦ溶液（１×108IRU/ml)0.1mlを加え５w/v%低
分子キトサン(C-9)溶液（pH６）を所定量添加攪拌した
のち、約10分間氷冷下に放置した。
冷却遠心機を用いて４℃、3000回転／分で10分間遠心分
離して上清液を採取し、核酸の濃度およびＴＮＦ力価を
測定した。結果を表−６に示す。
離して上清液を採取し、核酸の濃度およびＴＮＦ力価を
測定した。結果を表−６に示す。
低分子キトサンが各種細胞培養液中において、優れた核
酸除去効果を示すことが判る。
酸除去効果を示すことが判る。
なおＴＮＦ溶液は前記ヨーロッパ特許公開第155,549号
の実施例５に開示された方法で得たヒトＴＮＦポリペプ
チド溶液を用いた。
の実施例５に開示された方法で得たヒトＴＮＦポリペプ
チド溶液を用いた。
（Ｖ）低分子キトサン(C-9)の核酸およびエンドトキシ
ン分離効果に対するpHの影響： 前記(B)で得られたヒトＴＮＦポリペプチド含有上清液
に1Mクエン酸を添加してpH７および６に調整し、pH７お
よび６に調整した５w/v%低分子キトサン(C-9)溶液を所
定量添加攪拌し、氷冷下に約10分間放置後、冷却遠心機
を用いて４℃、3000回転／分で10分間遠心分離し、上清
液を採取して核酸、エンドトキシンおよびＴＮＦの定量
を行った。結果を表−７に示す。
ン分離効果に対するpHの影響： 前記(B)で得られたヒトＴＮＦポリペプチド含有上清液
に1Mクエン酸を添加してpH７および６に調整し、pH７お
よび６に調整した５w/v%低分子キトサン(C-9)溶液を所
定量添加攪拌し、氷冷下に約10分間放置後、冷却遠心機
を用いて４℃、3000回転／分で10分間遠心分離し、上清
液を採取して核酸、エンドトキシンおよびＴＮＦの定量
を行った。結果を表−７に示す。
低分子キトサン処理をpH６で行うと、pH７で行った場合
に比較して核酸およびエンドトキシン除去効果が増大し
た。処理pHを５まで下げると除去効果はさらに高められ
たが、ＴＮＦ力価も減少した。
に比較して核酸およびエンドトキシン除去効果が増大し
た。処理pHを５まで下げると除去効果はさらに高められ
たが、ＴＮＦ力価も減少した。
(VI)低分子キトサン(C-9)のエンドトキシン分離効果に
対するpHの影響： 前記(C)の方法で得られたヒトIL-1ポリペプチド含有濾
液に1Mクエン酸を添加してpH７および５に調整し、pH７
および５に調整した５w/v%低分子キトサン(C-9)溶液を
所定量添加攪拌し、氷冷下に約10分間放置後、冷却遠心
機を用いて４℃、3000回転／分で10分間遠心分離し、上
清液を採取して、エンドトキシンおよびIL-1の定量を行
った。結果を表−８に示す。
対するpHの影響： 前記(C)の方法で得られたヒトIL-1ポリペプチド含有濾
液に1Mクエン酸を添加してpH７および５に調整し、pH７
および５に調整した５w/v%低分子キトサン(C-9)溶液を
所定量添加攪拌し、氷冷下に約10分間放置後、冷却遠心
機を用いて４℃、3000回転／分で10分間遠心分離し、上
清液を採取して、エンドトキシンおよびIL-1の定量を行
った。結果を表−８に示す。
低分子キトサン処理をpH５で行うと、pH７で行った場合
に比較してエンドトキシン除去効果が著しく向上し、IL
-1の残存率も80%以上であった。
に比較してエンドトキシン除去効果が著しく向上し、IL
-1の残存率も80%以上であった。
(VII)低分子キトサン(C-9)の核酸およびエンドトキシン
分離効果に対する塩濃度の影響： 前記(B)で得られたヒトＴＮＦポリペプチド含有上清液
２mlに塩化ナトリウムを添加溶解して各種塩濃度の試料
とし、これに５w/v%低分子キトサン(C-9)溶液（pH６）
を最終濃度0.3w/v%となるように添加攪拌し、氷冷下に
約10分間放置後、冷却遠心機を用いて４℃、3000回転／
分で10分間遠心分離し、上清液を採取して核酸、エンド
トキシンおよびＴＮＦの定量を行った。
分離効果に対する塩濃度の影響： 前記(B)で得られたヒトＴＮＦポリペプチド含有上清液
２mlに塩化ナトリウムを添加溶解して各種塩濃度の試料
とし、これに５w/v%低分子キトサン(C-9)溶液（pH６）
を最終濃度0.3w/v%となるように添加攪拌し、氷冷下に
約10分間放置後、冷却遠心機を用いて４℃、3000回転／
分で10分間遠心分離し、上清液を採取して核酸、エンド
トキシンおよびＴＮＦの定量を行った。
結果を表−９に示す。塩化ナトリウム濃度が0.5M以下の
試料では、低分子キトサンによる核酸およびエンドトキ
シンの除去効果が充分に発揮されたが、塩化ナトリウム
濃度が0.5M以上の試料ではその効果が低減する傾向が見
られた。
試料では、低分子キトサンによる核酸およびエンドトキ
シンの除去効果が充分に発揮されたが、塩化ナトリウム
濃度が0.5M以上の試料ではその効果が低減する傾向が見
られた。
(VIII)等電点の異なる各種蛋白質含有溶液に対する低分
子キトサン(C-9)の添加効果： 等電点の異なる蛋白質類を20mMトリス−塩酸緩衝液(pH
7.5)に溶解し、氷冷下に低分子キトサンC-9の５w/v%溶
液（pH６）を所定量添加混合したのち、約10分間氷冷下
に放置した。
子キトサン(C-9)の添加効果： 等電点の異なる蛋白質類を20mMトリス−塩酸緩衝液(pH
7.5)に溶解し、氷冷下に低分子キトサンC-9の５w/v%溶
液（pH６）を所定量添加混合したのち、約10分間氷冷下
に放置した。
４℃、3000回転／分で10分間の遠心分離により得られた
上清液中の蛋白質濃度を測定した。
上清液中の蛋白質濃度を測定した。
結果を表−10に示す。
(IX)各種蛋白質含有大腸菌Ｂ株培養抽出液における低分
子キトサン(C-9)の核酸およびエンドトキシン除去効
果： 大腸菌Ｂ株(Escherichia coli strain B.ATCC 11303)の
凍結乾燥菌体2.5gを20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)50m
lに懸濁し、超音波処理（トミー精工、モデルUP-200R）
した。冷却遠心機を用いて４℃、10,000回転／分で10分
間遠心分離した上清液を大腸菌Ｂ株抽出液として使用し
た。
子キトサン(C-9)の核酸およびエンドトキシン除去効
果： 大腸菌Ｂ株(Escherichia coli strain B.ATCC 11303)の
凍結乾燥菌体2.5gを20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)50m
lに懸濁し、超音波処理（トミー精工、モデルUP-200R）
した。冷却遠心機を用いて４℃、10,000回転／分で10分
間遠心分離した上清液を大腸菌Ｂ株抽出液として使用し
た。
上記の大腸菌Ｂ株抽出液２mlに対し、ペプチドとしてイ
ンスリンまたは成長ホルモン、酵素蛋白としてペプシン
またはトリプシン、蛋白質としてヒト血清アルブミンを
それぞれ20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)溶液として添
加した。低分子キトサンC-9を希酢酸に溶解し、6N水酸
化ナトリウム液でpH６に調整したのち、キトサン最終濃
度を５w/v%に調整した。先に調整した各種ペプチドまた
は蛋白質を含む大腸菌Ｂ株抽出液２mlに対し、pH６に調
整した５％低分子キトサンC-9溶液を0,50,75または100
μｌ添加攪拌し、氷冷下に約10分間放置後、冷却遠心機
を用いて４℃、3000回転／分で10分間遠心分離し、上清
液を採取して核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）、エンドトキシン
および予め大腸菌Ｂ株抽出液に添加したペプチドあるい
は蛋白質の濃度または活性を測定した。結果を表−11に
示す。
ンスリンまたは成長ホルモン、酵素蛋白としてペプシン
またはトリプシン、蛋白質としてヒト血清アルブミンを
それぞれ20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)溶液として添
加した。低分子キトサンC-9を希酢酸に溶解し、6N水酸
化ナトリウム液でpH６に調整したのち、キトサン最終濃
度を５w/v%に調整した。先に調整した各種ペプチドまた
は蛋白質を含む大腸菌Ｂ株抽出液２mlに対し、pH６に調
整した５％低分子キトサンC-9溶液を0,50,75または100
μｌ添加攪拌し、氷冷下に約10分間放置後、冷却遠心機
を用いて４℃、3000回転／分で10分間遠心分離し、上清
液を採取して核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）、エンドトキシン
および予め大腸菌Ｂ株抽出液に添加したペプチドあるい
は蛋白質の濃度または活性を測定した。結果を表−11に
示す。
表−11の結果より、大腸菌Ｂ株抽出液に予め添加したペ
プチドあるいは蛋白質は、低い等電点を示すペプシンを
除きほとんど上清液中に残存していた。
プチドあるいは蛋白質は、低い等電点を示すペプシンを
除きほとんど上清液中に残存していた。
（Ｘ）低分子キトサン(C-9)処理沈殿から核酸の回収： 前記(B)で調製したヒトＴＮＦポリペプチド含有大腸菌
(E.coli HB101/pHTR-91)培養抽出液、前記(IV)で調製し
た大腸菌(E.coli K-12)培養抽出液、シュードモナス菌
(Pseudomonas fluorescens ATCC 13430)培養抽出液各２
mlに、５w/v%低分子キトサン(C-9)溶液(pH6)120μｌを
添加攪拌し、氷冷下に約10分間放置後、冷却遠心機を用
いて４℃、3000回転／分で10分間遠心分離し、低分子キ
トサン処理上清液と沈殿に分けた。沈殿を２mlの20mMト
リス−塩酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、４℃、3000回転／
分で10分間遠心分離することによって洗浄したのち、0.
01N水酸化ナトリウムまたは1M塩化ナトリウムを含む0.0
1N水酸化ナトリウムの２mlに懸濁させて抽出した。遠心
分離により不溶物を除去し、抽出液中の核酸含量を測定
した。
(E.coli HB101/pHTR-91)培養抽出液、前記(IV)で調製し
た大腸菌(E.coli K-12)培養抽出液、シュードモナス菌
(Pseudomonas fluorescens ATCC 13430)培養抽出液各２
mlに、５w/v%低分子キトサン(C-9)溶液(pH6)120μｌを
添加攪拌し、氷冷下に約10分間放置後、冷却遠心機を用
いて４℃、3000回転／分で10分間遠心分離し、低分子キ
トサン処理上清液と沈殿に分けた。沈殿を２mlの20mMト
リス−塩酸緩衝液(pH7.5)に懸濁し、４℃、3000回転／
分で10分間遠心分離することによって洗浄したのち、0.
01N水酸化ナトリウムまたは1M塩化ナトリウムを含む0.0
1N水酸化ナトリウムの２mlに懸濁させて抽出した。遠心
分離により不溶物を除去し、抽出液中の核酸含量を測定
した。
上記各菌体培養抽出液および各低分子キトサン処理上清
液中の核酸量も併せて測定した。結果を表−12に示す。
液中の核酸量も併せて測定した。結果を表−12に示す。
低分子キトサン処理することにより、菌体培養液中の核
酸成分を分離、これを効率よく回収できた。
酸成分を分離、これを効率よく回収できた。
以上の各実施例から明らかなように、低分子キトサンで
処理することによって、菌体抽出液、細胞抽出液などの
生物材料中に含まれる核酸またはエンドトキシンを効率
よく除去することが可能であり、特に目的とする蛋白
質、ペプチド等の蛋白質類が等電点３以上の場合には有
用な精製手段となることがわかる。また核酸またはエン
ドトキシンを有価物として回収することが可能である。
処理することによって、菌体抽出液、細胞抽出液などの
生物材料中に含まれる核酸またはエンドトキシンを効率
よく除去することが可能であり、特に目的とする蛋白
質、ペプチド等の蛋白質類が等電点３以上の場合には有
用な精製手段となることがわかる。また核酸またはエン
ドトキシンを有価物として回収することが可能である。
なお、以上の各例において、実験に用いた分析方法は以
下の方法により行った。
下の方法により行った。
(1)蛋白質の定量法はＵＶ法〔Methods in Enzymology v
ol 3,p451,(1957)Academic Press〕またはクマシー・ブ
リリアント・ブルーG250を用いる比色法（バイオラッド
社製、バイオラッド プロテイン アッセイ キット，
標準物質ウシ血清アルブミン）を用いた。
ol 3,p451,(1957)Academic Press〕またはクマシー・ブ
リリアント・ブルーG250を用いる比色法（バイオラッド
社製、バイオラッド プロテイン アッセイ キット，
標準物質ウシ血清アルブミン）を用いた。
(2)ＤＮＡの定量法は、ジアミノ安息香酸を用いる蛍光
法〔日本生化学会編：生化学実験講座２核酸の化学Ｉ
分離精製P5(1975)東京化学同人〕を用いた。
法〔日本生化学会編：生化学実験講座２核酸の化学Ｉ
分離精製P5(1975)東京化学同人〕を用いた。
(3)ＲＮＡの定量法はオルシノール−鉄−塩酸によるペ
ントース定量法〔山川民夫編：医化学実験法講座第１巻
Ａ p.55,(1971)中山書店〕を用いた。
ントース定量法〔山川民夫編：医化学実験法講座第１巻
Ａ p.55,(1971)中山書店〕を用いた。
(4)エンドトキシンの定量法はパイロディックキット
（生化学工業製品）を用いた。
（生化学工業製品）を用いた。
(5)ＴＮＦの力価測定法は、in vitroでガン細胞を殺す
効果を測定する方法または酵素免疫測定法を用いた。前
者はヨーロッパ特許公開第155549号28〜29頁に記載され
た方法に準じて行った。後者はβ−ガラクトシダーゼ標
識ＴＮＦと検体ＴＮＦを抗ＴＮＦウサギ血清に対して競
合反応させ、第２抗体を用いてＢ（結合）／Ｆ（遊離）
分離を行い、Ｂ区分のβ−ガラクトシダーゼを発色基質
に作用させて発色させ、比色により検体中のＴＮＦ力価
を測定する方法である。力価表示はIRU(Immuno reactiv
e unit)/mlで行った。
効果を測定する方法または酵素免疫測定法を用いた。前
者はヨーロッパ特許公開第155549号28〜29頁に記載され
た方法に準じて行った。後者はβ−ガラクトシダーゼ標
識ＴＮＦと検体ＴＮＦを抗ＴＮＦウサギ血清に対して競
合反応させ、第２抗体を用いてＢ（結合）／Ｆ（遊離）
分離を行い、Ｂ区分のβ−ガラクトシダーゼを発色基質
に作用させて発色させ、比色により検体中のＴＮＦ力価
を測定する方法である。力価表示はIRU(Immuno reactiv
e unit)/mlで行った。
(6)IL-1の定量法は、サンドイッチ方式による酵素免疫
測定法に従って行った。すなわち、プレートに固定した
抗体と抗原(IL-1)とを特異的に結合させ、次に酵素標識
抗体を固相化抗体結合抗原と反応させて固相化抗体−抗
原−酵素標識抗体からなるサンドイッチ結合物をつくら
せる。この結合物に基質液を加えて酵素反応させると発
色する。発色の強さは結合抗原量と比例するので、吸光
度を測定することにより抗原量を測定することができ
る。力価表示は、標準物質との比較によりμg/mlで行っ
た。
測定法に従って行った。すなわち、プレートに固定した
抗体と抗原(IL-1)とを特異的に結合させ、次に酵素標識
抗体を固相化抗体結合抗原と反応させて固相化抗体−抗
原−酵素標識抗体からなるサンドイッチ結合物をつくら
せる。この結合物に基質液を加えて酵素反応させると発
色する。発色の強さは結合抗原量と比例するので、吸光
度を測定することにより抗原量を測定することができ
る。力価表示は、標準物質との比較によりμg/mlで行っ
た。
(7)インスリン力価の測定はインスリンRIAキット（ダイ
ナボット社製品）を用いて行った。
ナボット社製品）を用いて行った。
(8)成長ホルモンの力価測定はヒト成長ホルモンRIAキッ
ト（ダイナボット社製品）を用いて行った。
ト（ダイナボット社製品）を用いて行った。
(9)ペプシンの力価測定はW.リック(W.Rick)の方法〔Met
hods of Enzymatic Analysis 2nd ed.by Bergmeyer,Aca
demic Press,N.Y.(1965)820〜823〕に従いウシ・ヘモグ
ロビンを基質に用いて行った。
hods of Enzymatic Analysis 2nd ed.by Bergmeyer,Aca
demic Press,N.Y.(1965)820〜823〕に従いウシ・ヘモグ
ロビンを基質に用いて行った。
(10)トリプシンの力価測定はW.リック(W.Rick)の方法
〔Methods of Enzymatic Analysis 2nd ed.by Bergmeye
r,Academic Press,N.Y.(1965)808〜811〕に従いウシ・
ヘモグロビンを基質に用いて行った。
〔Methods of Enzymatic Analysis 2nd ed.by Bergmeye
r,Academic Press,N.Y.(1965)808〜811〕に従いウシ・
ヘモグロビンを基質に用いて行った。
(11)ヒト血清アルブミンの定量はF.L.ロッドケイ(F.L.R
odkey)の方法〔Clin.Chem.,11,478〜487(1965)〕で行っ
た。
odkey)の方法〔Clin.Chem.,11,478〜487(1965)〕で行っ
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/00 (72)発明者 桑島 淳二 大阪府豊中市東泉ケ丘３丁目36番地の８ (72)発明者 北岡 洋一 大阪府大阪市東区北浜２丁目15番地の１ 栗田工業株式会社大阪支社内
Claims (18)
- 【請求項１】低分子キトサンを有効成分として含有する
ことを特徴とする核酸またはエンドトキシンの除去剤。 - 【請求項２】低分子キトサンが固有粘度0.01〜５(dl/g)
である特許請求の範囲第１項記載の除去剤。 - 【請求項３】低分子キトサンがpH４におけるコロイド当
量２meq/g-蒸発残分以上である特許請求の範囲第１項ま
たは第２項記載の除去剤。 - 【請求項４】低分子キトサンが固有粘度0.2〜１(dl/
g)、pH４におけるコロイド当量４meq/g-蒸発残分以上で
ある特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記
載の除去剤。 - 【請求項５】除去剤が核酸またはエンドトキシンを含む
被処理液から核酸またはエンドトキシンを分離するもの
である特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに
記載の除去剤。 - 【請求項６】被処理液が等電点３以上の蛋白質類を含む
ものである特許請求の範囲第５項記載の除去剤。 - 【請求項７】蛋白質類がヒト癌壊死因子である特許請求
の範囲第６項記載の除去剤。 - 【請求項８】蛋白質類がヒトインターロイキン１である
特許請求の範囲第６項記載の除去剤。 - 【請求項９】被処理液が無細胞抽出液である特許請求の
範囲第５項ないし第８項のいずれかに記載の除去剤。 - 【請求項１０】低分子キトサンを用いて核酸またはエン
ドトキシンを分離することを特徴とする核酸またはエン
ドトキシンの除去方法。 - 【請求項１１】低分子キトサンが固有粘度0.01〜５(dl/
g)である特許請求の範囲第10項記載の除去方法。 - 【請求項１２】低分子キトサンがpH４におけるコロイド
当量２meq/g-蒸発残分以上である特許請求の範囲第10項
または第11項記載の除去方法。 - 【請求項１３】低分子キトサンが固有粘度0.2〜１(dl/
g)、pH４におけるコロイド当量４meq/g-蒸発残分以上で
ある特許請求の範囲第10項ないし第12項のいずれかに記
載の除去方法。 - 【請求項１４】分離が核酸またはエンドトキシンを含む
被処理液から核酸またはエンドトキシンを分離するもの
である特許請求の範囲第10項ないし第13項のいずれかに
記載の除去方法。 - 【請求項１５】被処理液が等電点３以上の蛋白質類を含
むものである特許請求の範囲第14項記載の除去方法。 - 【請求項１６】蛋白質類がヒト癌壊死因子である特許請
求の範囲第15項記載の除去方法。 - 【請求項１７】蛋白質類がヒトインターロイキン１であ
る特許請求の範囲第15項記載の除去方法。 - 【請求項１８】被処理液が無細胞抽出液である特許請求
の範囲第14項ないし第17項のいずれかに記載の除去方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61-75779 | 1986-04-02 | ||
| JP7577986 | 1986-04-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6356300A JPS6356300A (ja) | 1988-03-10 |
| JPH0641479B2 true JPH0641479B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62077064A Expired - Lifetime JPH0641479B2 (ja) | 1986-04-02 | 1987-03-30 | 核酸またはエンドトキシンの除去剤および除去方法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0240348B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0641479B2 (ja) |
| KR (1) | KR940005589B1 (ja) |
| AT (1) | ATE96448T1 (ja) |
| AU (1) | AU596160B2 (ja) |
| CA (1) | CA1291594C (ja) |
| DE (1) | DE3787913T2 (ja) |
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| JPH0687974B2 (ja) * | 1990-03-27 | 1994-11-09 | 忠一 平山 | 発熱物質の吸着材料 |
| JP2690415B2 (ja) * | 1991-01-26 | 1997-12-10 | 政志 船山 | 発熱性物質吸着体とそれを用いた発熱性物質の定量方法 |
| JPH06192296A (ja) * | 1992-10-28 | 1994-07-12 | Chiba Pref Gov | 治療用医薬品としての結晶ａ型ボツリヌス毒素の製造法。 |
| US5972225A (en) * | 1996-05-07 | 1999-10-26 | Cook Imaging Corporation | Process for remediating endotoxin-contaminated bulk non-ionic contrast media |
| US7078224B1 (en) * | 1999-05-14 | 2006-07-18 | Promega Corporation | Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles |
| US6194562B1 (en) | 1998-04-22 | 2001-02-27 | Promega Corporation | Endotoxin reduction in nucleic acid purification |
| WO2001081429A1 (en) * | 2000-04-21 | 2001-11-01 | Johns Hopkins University | Differential microbial test |
| US6716970B2 (en) * | 2000-04-21 | 2004-04-06 | Adjuvant Pharmaceuticals, Llc | Water soluble, randomly substituted partial N-partial O-acetylated chitosan, preserving compositions containing chitosan, and processes for making thereof |
| SE0003958D0 (sv) | 2000-10-31 | 2000-10-31 | Biogaia Fermentation Ab | Method for growth of microorganisms |
| AU2002349439A1 (en) * | 2001-12-26 | 2003-07-15 | Nihon Medi-Physics Co., Ltd. | Compositions for eliminating endotoxin and elimination method |
| US7125967B2 (en) * | 2003-10-08 | 2006-10-24 | Adjuvant Pharmaceuticals, Llc | Water-soluble chitosan having low endotoxin concentration and methods for making and using the same |
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| US8222397B2 (en) | 2009-08-28 | 2012-07-17 | Promega Corporation | Methods of optimal purification of nucleic acids and kit for use in performing such methods |
| CN102977392A (zh) * | 2012-12-17 | 2013-03-20 | 上海典范医疗科技有限公司 | 去除内毒素的细菌纤维素的制备方法 |
| US9598504B2 (en) | 2014-12-16 | 2017-03-21 | Chitogen Inc. | Process for the removal of endotoxins to produce medical quality chitosan and other polysaccharides |
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| JPS54140710A (en) * | 1978-03-10 | 1979-11-01 | Mitsui Toatsu Chem Inc | Anti-tumor substance and its preparation |
| US4605623A (en) * | 1982-11-08 | 1986-08-12 | Malette William Graham | Method of altering growth and development and suppressing contamination microorganisms in cell or tissue culture |
| US4474769A (en) * | 1983-05-13 | 1984-10-02 | Pfanstiehl Laboratories, Inc. | Chitosan as a contraceptive |
| EP0155549B1 (en) * | 1984-03-06 | 1991-03-20 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Dna encoding human tumor necrosis factor and human tumor necrosis factor polypeptide |
-
1987
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- 1987-04-01 US US07/034,217 patent/US4885168A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-01 CA CA000533540A patent/CA1291594C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-01 AU AU70964/87A patent/AU596160B2/en not_active Ceased
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- 1987-04-02 DE DE87302870T patent/DE3787913T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-02 AT AT87302870T patent/ATE96448T1/de not_active IP Right Cessation
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