JPH0720984B2

JPH0720984B2 - エンドトキシンの除去方法

Info

Publication number: JPH0720984B2
Application number: JP1247014A
Authority: JP
Inventors: 恒康安達; 純一井田; 正憲橋本
Original assignee: Kurita Water Industries Ltd
Current assignee: Kurita Water Industries Ltd
Priority date: 1989-09-22
Filing date: 1989-09-22
Publication date: 1995-03-08
Anticipated expiration: 2010-03-08
Also published as: JPH03109397A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はエンドトキシンの除去方法に係り、特に蛋白質
とエンドトキシンとを含む蛋白質溶液中に含まれるエン
ドトキシンを選択的かつ効率的に分離除去する方法に関
する。

［従来の技術］バイオテクノロジーにより生産された蛋白質等の医薬品
の精製においては、不純物であるエンドトキシンを数pg
/ml〜数10pg/mlにまで除去する必要がある。従来、エン
ドトキシンの除去技術としては、低分子キトサンを用い
る方法が提案されている（特開昭63−56300号）。即
ち、低分子キトサンを担体に吸着させてカラムに充填
し、このカラムに被処理液を通液すると、低分子キトサ
ンとエンドトキシンが特異的に吸着して液中のエンドト
キシンが除去される。また、特開昭63−287503号には、
エンドトキシン水溶液を、キトサンを架橋したポリアミ
ド微多孔膜と接触させてエンドトキシンを吸着分離する
ことが開示されている。更に、エンドトキシンを低濃度
にまで除去する方法として、イオンクロマトグラフィ
ー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグ
ラフィー（特公平１−16389号）なども検討されてい
る。

［発明が解決しようとする課題］特開昭63−56300号に開示される低分子キトサンによる
方法では、エンドトキシンの吸着効率が十分ではなく、
mg/mlオーダーのものを数＋ng/mlオーダーまでに除去す
るには有効であるが、8.5ng/ml以下の極低濃度にまで除
去するのは難しい。即ち、特開昭63−56300号に開示さ
れる低分子キトサン固定化担体に固定化されているキト
サンは低分子であり、エンドトキシン吸着に用いられる
担体中のキトサン含量が少ないため、エンドトキシンの
平衡吸着量が少ない。そのため、蛋白質溶液中のエンド
トキシンをpg/mlオーダーまで除去する目的には実用上
不適当である。因みに、特開昭63−56300号の実施例で
は、エンドトキシンは270〜57ng/mlと、数100ng/ml〜数
10ng/mlまでしか除去されていない。

特開昭63−287503号に開示されるキトサン固定化膜で
は、膜中のキトサン含量が10％以下と非常に低いため、
やはりエンドトキシンの平衡吸着量が少なく、エンドト
キシンを極低濃度に除去することは不可能であると考え
られる。特開昭63−287503号には、水中のエンドトキシ
ン除去について例示されているが、上述の如く、膜のエ
ンドトキシン平衡吸着量が少ないことから、蛋白質溶液
中のエンドトキシンの除去には実用上不適当である。

イオンクロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィーは、pg/mlオーダーま
での除去を目的として検討されているものではあるが、
それぞれ欠点を有し、実用上有利な方法とはいえない。
即ち、ゲルクロマトグラフィーは、エンドトキシンの分
子量分布が非常に広いため、蛋白質などの高分子量物質
との分離は困難であり、また、イオンクロマトグラフィ
ー、アフィニティクロマトグラフィーは、平衡吸着量が
小さい上に、pH、イオン強度、再生条件などの条件設定
が難しい。

従来においては、特に、蛋白質精製を目的として、蛋白
質溶液中のエンドトキシンを除去する技術について、明
確な条件設定がなされていないために、蛋白質溶液中の
エンドトキシンを選択的にかつ効率的に除去することが
できなかった。

本発明は上記従来の問題点を解決し、蛋白質溶液中のエ
ンドトキシンを極低濃度にまで選択的かつ効率的に除去
することが可能なエンドトキシンの除去方法を提供する
ことを目的とする。

［課題を解決するための手段］本発明のエンドトキシンの除去方法は、蛋白質とエンド
トキシンとを含む液からエンドトキシンを除去する方法
において、該液のpHを該蛋白質の等電点以下に調整した
後、架橋キトサン粒状物を充填したカラムにSV0.2〜2BV
・hr^-1の通液速度で通液してエンドトキシン残留濃度が
8.5ng/ml以下の精製蛋白質含有液を得ることを特徴とす
る。

即ち、本発明者らは、蛋白質溶液中のエンドトキシンを
除去する方法について検討を行なったところ、吸着剤と
して架橋キトサン粒状物が、キトサン含量が多く、エン
ドトキシン平衡吸着量が多いことから極めて有効である
ことを知見した。そして、架橋キトサン粒状物を用いる
方法において、エンドトキシンのみを選択的にかつ効率
的に除去するべく更に検討を重ねた結果、液のpHを蛋白
質の等電点以下とすると共に、カラム通液速度を制御す
るという、従来技術では全く示唆されていない処理条件
を採用することにより、エンドトキシンの選択的、効率
的除去が可能とされることを見出し本発明を完成させ
た。

以下に、本発明を詳細に説明する。

まず、本発明においてエンドトキシン吸着材として用い
る架橋キトサン粒状物について説明する。

本発明に係る架橋キトサン粒状物は、通常のキトサン或
いは低分子量キトサンを用いて、公知の方法で架橋処理
することにより容易に製造することができる。例えば、
キトサンを架橋処理する方法としては、キトサン酸性溶
液に乳化剤を含む疎水性溶剤を加えてエマルジョン化
し、次いでアルカリ溶液中で攪拌下粒状物化する方法
（特公昭59−30722号）が挙げられる。また、低分子キ
トサンを架橋処理する方法としては、低分子量キトサン
を酸性溶液に溶解し、次いで塩基性溶液中に落下させて
粒状化し、架橋処理する方法（特公昭63−54285号）が
挙げられる。

以下に本発明に係る架橋キトサン粒状物の製造方法の一
例について説明する。

キトサンは、カニ、エビなどの甲殻類の外殻皮などに含
量されているキチンを濃アルカリと共に加熱することに
より脱アセチル化して得られる。このようにして得られ
るキトサンは、通常、分子量5,000〜1,000,000、固有粘
度（30℃、0.2M酢酸＋0.1M酢酸ソーダ）［η］＝0.25〜
30dl/g−キトサン、コロイド当量1.0〜6.2meq/g−キト
サンのものである。脱アセチル化の程度は特に制限はな
いが、酸を用いて溶解可能な程度にまで脱アセチル化さ
れていればよく、一般には脱アセチル化度50〜100モル
％程度のものが好ましい。また、キトサンの平均粒径は
９〜300メッシュ程度の粒状であることが好ましい。

このようにして得られるキトサンのうち、本製造例にお
いては、低分子量キトサンとして、分子量１万〜50万、
脱アセチル化度50〜100モル％のものを用いる。そして
この低分子量キトサンをまず酸性溶液に溶解してキトサ
ン酸性水溶液とする。この場合、使用される酸は、キト
サンを溶解するものであればいずれも使用できるが、代
表的なものとしては、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、酪
酸、吉草酸、イソプロピオン酸、イソ酪酸、イソ吉草
酸、安息香酸、ケイ皮酸、サリチル酸、フタル酸などの
有機酸類、塩酸、硝酸などの鉱酸類などを挙げることが
できる。

使用する酸の量はできるだけ少ない方が好ましく、キト
サンを溶解する最低限の量で用いる。一般には、キトサ
ンに対し、0.2〜５倍（重量）の酸を添加する。

キトサン酸性水溶液におけるキトサンの濃度は、キトサ
ンの分子量と脱アセチル化度により適切な溶解濃度が決
定されるが、通常２〜20重量％とするのが好ましい。

得られたキトサン酸性水溶液は、塩基性溶液中に攪拌下
落下させて粒状化する。ここで用いる塩基性溶液の塩基
性物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア、エチレン
ジアミン等のアルカリ性物質が挙げられ、溶媒として
は、水又はメタノール、エタノール等の極性を有するア
ルコール、或いはこれらの極性溶媒と水との混合溶媒が
挙げられる。塩基性溶媒の濃度には特に制限はないが、
通常の場合、１〜20重量％濃度のものが使用される。

粒状化して得られた粒状キトサンは、通常の場合、１μ
ｍ〜1mm程度の多孔質キトサン粒状物であるが、これ
は、水洗後水分を除去した後、架橋処理に供される。

架橋処理は、キトサンを必要に応じて適当な溶媒中に
て、エピクロルヒドリン、グルタルアルデヒド、有機ジ
イソシアネート類等の架橋剤を加えて処理することによ
り行なうことができる。

なお、架橋処理に用いる溶媒としては、メタノール、エ
タノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、
アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチル
ホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類やジ
メチルスルホキシドが使用できる。これらの溶媒は１種
のみを使用しても、また、２種以上を混合して使用して
も良い。また、有機ジイソシアネート類としては、例え
ば、4,4′−ジフェニルメタンジイソシアネート、1,4−
ジフェニレンジイソシアネート、2,4−トリレンジイソ
シアネート、ナフタレンジイソシアネート、4,4′−ジ
シクロヘキシルメタンジイソシアネート、キシリレンジ
イソシアネート、イソフォロンジイソシアネート、ヘキ
サメチレンジイソシアネート等が挙げられる。

架橋剤の使用量は特に制限はないが、キトサンのアミノ
基１当量に対して0.2〜0.8当量反応する程度とするのが
好ましい。また、溶媒を使用する場合、その使用量はキ
トサン粒状体の体積に対し１〜５倍量とするが好まし
い。

架橋処理条件は用いる架橋剤、溶媒の種類によって異な
るが、通常の場合、０〜60℃で0.05〜５時間行なわれ
る。

このようにして製造された架橋キトサン粒状物は、その
使用に際しては、まず、塩基性溶液と接触させることに
よりアルカリ洗浄し、吸着しているエンドトキシンを失
活させて除去する。アルカリ洗浄に用いる塩基性溶液と
しては、NaOH、KOH、NH₃などの水溶液或いは、これらと
有機溶媒との混合液で、濃度0.01〜1Nのものを用いるこ
とができる。その後は、エンドトキシンを含まない滅菌
水（エンドトキシンフリー水）を用いて水洗し、余剰の
アルカリを洗浄除去する。水洗後は、これをそのままエ
ンドトキシン除去に用いることができるが、必要に応じ
て、前記キトサンの酸性水溶液の調製に用いた酸の水溶
液或いは、これらと有機溶媒との混合液で、濃度0.01〜
1Nのものと接触させて、キトサンのアミノ基を解離型と
して用いることもできる。酸と接触させた場合は、その
後更にエンドトキシンを含まない滅菌水で水洗して、余
剰の酸を洗浄除去する。

次に、このような架橋キトサン粒状物をエンドトキシン
吸着材として用いる本発明のエンドトキシンの除去方法
について説明する。

本発明の方法においては、上記架橋キトサン粒状物をカ
ラムに充填し、このカラムに被処理液である蛋白質とエ
ンドトキシンとを含む液を当該蛋白質の等電点以下の酸
性側のpHに調整して通液し、カラム出口の液を回収す
る。液のpHが含有された蛋白質の等電点より塩基性側で
あると、蛋白質も架橋キトサン粒状物に吸着され、蛋白
質回収率が低下する。液のpHは、好ましくは、当該蛋白
質の等電点よりも0.5以上低いpHとするのが好ましい。

本発明において、pHの調整は蛋白質を溶解するバッファ
ーの酸と塩基の濃度を変えることにより容易に行なうこ
とができる。なお、必要に応じ食塩等の塩を添加しても
良い。

本発明において、通液速度はSV0.2〜2BV・hr^-1、好まし
くはSV0.5〜1BV・hr^-1とする。この通液速度は、エンド
トキシンの除去効率に大きく影響し、SVが2BV・hr^-1を
超えても0.2V・hr^-1未満でも、エンドトキシン除去率は
著しく低下し、回収液中のエンドトキシン濃度を8.5ng/
ml以下の極低濃度にすることが難しい。

本発明の方法においては、上記エンドトキシン除去に使
用後の架橋キトサン粒状物は、前述と同様の塩基性溶液
でのアルカリ洗浄及び水洗を行なうことにより再生、再
使用が可能である。

なお、本発明において、処理対照とされる蛋白質及びエ
ンドトキシン含有液の蛋白質としては、特に制限はな
く、その等電点以下のpHにおいて安定な蛋白質であれば
いずれも適用可能である。

本発明によれば、エンドトキシン濃度は比較的低濃度の
液からもエンドトキシンを選択的かつ効率的に除去し、
エンドトキシン濃度を8.5ng/ml以下の極低濃度にまで低
減することができる。従って、本発明の方法は、特にエ
ンドトキシン濃度1000ng/ml以下の液に極めて有効であ
る。

［作用］本発明に係る架橋キトサン粒状物は、キトサン含量が80
％以上（残部は架橋剤である。）と著しく高いため、エ
ンドトキシン平衡吸着量が多い。このため、エンドトキ
シンを効率的に吸着分離除去し、エンドトキシン濃度を
極低濃度まで低減することが可能である。因みに、特開
昭63−287503号に開示されるポリアミド微多孔性膜では
キトサン含量が10％以下であり、また、特開昭63−5630
0号に開示される低分子キトサン固定化担体でもキトサ
ン含量は少ないため、本発明の如く、高いエンドトキシ
ン平衡吸着量を得ることができず、従って、エンドトキ
シンを極低濃度にまで低減させることは難しい。

しかも、本発明においては、このような架橋キトサン粒
状物を用いて、蛋白質の等電点以下のpHで、かつ、SV0.
2〜2BV・hr^-1のカラム通液速度で処理するため、蛋白質
が架橋キトサン粒状物に吸着されることが殆どなく、エ
ンドトキシンのみを選択的かつ効率的に除去することが
可能とされる。

［実施例］以下に実施例及び比較例を挙げて本発明により具体的に
説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の
実施例に限定されるものではない。

なお、以下の実施例及び比較例において、エンドトキシ
ンの定量は生化学工業のトキシカラーシステムを用いて
行ない、アルブミンの定量は紫外線（280nm）の吸光度
を測定して行なった。

実施例１〜４、比較例１脱アセチル化度90モル％、平均分子量50000のキトサン7
0gを酢酸70gを含む水930gに溶解した液を、10重量％水
酸化ナトリウム水溶液中に攪拌下落下させ、凝固析出さ
せた。その後、十分洗浄して平均粒径0.1mmの多孔質キ
トサンを得た。次に、水分を除去後アセトンに加え、ヘ
キサメチレンジイソシアネートで架橋した。

こうして得られた架橋キトサン粒状物を用いて次の試験
を行なった。なお、使用に際して、架橋キトサン粒状物
は0.2NのNaOH水溶液でアルカリ洗浄し、その後エンドト
キシンフリー水で十分に洗浄した。

ウシ血清アルブミン（等電点4.8）5mg/mlと第１表に示
す量のエンドトキシンとを含む試料液を、上記で得られ
た架橋キトサン粒状物を内径10mm、長さ100mmのカラム
に充填したものに通液した。通液条件は第１表に示す通
りである。回収液のエンドトキシン濃度を第１表に示
す。なお、各試験において、アルブミン回収率を紫外線
吸収（波長280mm）より求めた結果、いずれも95％以上
であった。

第１表より明らかなように、液のpHを蛋白質の等電点以
下に調整すると共に、カラム通液速度をSV0.2〜2BV・hr
^-1とすることにより、エンドトキシンを8.5ng/ml以下の
極低濃度にまで除去できる。

これに対して、通液速度をSV0.1BV・hr^-1とした比較例
１では、エンドトキシンをある程度除去できるが、8.5n
g/ml以下の極低濃度にまで除去することはできない。な
お、各試験後、カラム中の架橋キトサン粒状物を0.2Nの
NaOHと30間接触させて再生し、水洗後、同様の処理を繰
り返したところ、いずれの場合においても、ほぼ同様の
処理結果が得られた。

比較例２通液条件のうち、pHを5.3としたこと以外は実施例３と
同様に試験を行なった。

その結果、回収液のエンドトキシン濃度は0.9ng/ml、ア
ルブミン回収率は10％以下であり、エンドトキシンの選
択的かつ効率的な除去は達成されなかった。

［発明の効果］以上詳述した通り、本発明のエンドトキシンの除去方法
によれば、蛋白質及びエンドトキシンを含む液中から、
エンドトキシンのみを選択的かつ効率的に、容易に除去
すうことができ、エンドトキシン残留濃度が8.5ng/ml以
下の極低濃度の処理液を得ることができる。しかも、吸
着材として用いる架橋キトサン粒状物は耐アルカリ性に
優れることから、アルカリ洗浄により再生再利用が可能
であり、極めて経済的である。

本発明のエンドトキシンの除去方法は、医薬品用蛋白質
溶液の精製方法として、工業的に極めて有用である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】蛋白質とエンドトキシンとを含む液からエ
ンドトキシンを除去する方法において、該液のpHを該蛋
白質の等電点以下に調整した後、架橋キトサン粒状物を
充填したカラムにSV0.2〜2BV・hr^-1の通液速度で通液し
てエンドトキシン残留濃度が8.5ng/ml以下の精製蛋白質
含有液を得ることを特徴とするエンドトキシンの除去方
法。