JPH0643436B2 - 新規物質トレハロスタチンおよびその製造方法 - Google Patents

新規物質トレハロスタチンおよびその製造方法

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JPH0643436B2
JPH0643436B2 JP2-503981A JP50398190A JPH0643436B2 JP H0643436 B2 JPH0643436 B2 JP H0643436B2 JP 50398190 A JP50398190 A JP 50398190A JP H0643436 B2 JPH0643436 B2 JP H0643436B2
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Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は、新規な物質であるトレハロスタチンに係る。
また、本発明は、該新規物質トレハロスタチンの製造方
法および該新規物質を産生する放線菌にも係る。
［背景技術］ トレハラーゼはα−グルコシダーゼの一種であり、カ
ビ、酵母及び多くの昆虫の血リンパ中に広く分布するト
レハロースのグルコシド結合の加水分解を特異的に触媒
する酵素である。
［発明の開示］ 本発明者らは土壌より分離したアミコラトプシス（Amyc
olatopsis）属に属する放線菌が、その培養液および菌
体内に、昆虫、特にケブカクロバエのトレハラーゼに対
して極めて低濃度で阻害効果を示す新規な物質を産生す
ることを発見し、この物質をトレハロスタチンと命名し
た。
本発明は、上記の知見にもとづいて完成されたものであ
って、Amycolatopsis属に属するトレハロスタチン産生
菌を培養し、その培養物から採取した新規物質トレハロ
スタチンに関する。また、本発明は、そのような新規物
質を産生する放線菌株および該菌株を使用するトレハロ
スタチンの製造方法も提供する。
本発明で使用できる菌としては、アミコラト プシス・
トレハロスタティカ（Amycolatopsis trehalostatica）
を始めとして、Amycolatopsis属に属する菌でトレハロ
スタチンを産生する菌はすべて本発明に使用することが
できる。
特に、本発明者らが土壌より新たに分離した菌株SAM 09
67が好適に使用できる。
Amycolatopsis trehalostatica SAM 0967は次の菌学的
性質を有する。
１．形態的所見 ＳＡＭ 0967株は、直径0.4-0.8μｍの基底菌糸、及び
気中菌糸を形成する。基底菌糸は分岐し、まれに分断が
認められた。気中菌糸は、分岐し、その先端に10個前
後、あるいはそれ以上の胞子連鎖を形成する。胞子の大
きさは幅0.4-0.5μｍ、長さ0.9-1.3μｍで、その表面は
平滑である。胞子嚢、菌糸束、菌核等の構造体は、21日
培養後も認められなかった。
２．培養所見（28℃、21日間培養） ショ糖・硝酸塩寒天培地；気中菌糸：豊富、白；裏面の
色調：橙褐色；可溶性色素：灰紫色。
グルコース・アスパラギン寒天培地；気中菌糸：豊富、
白；裏面の色調：灰橙色；可溶性色素：無し。
グリセリン・アスパラギン寒天培地；気中菌糸：豊富、
白；裏面の色調：灰褐色；可溶性色素：橙灰色。
スターチ・無機塩寒天培地；気中菌糸：豊富、白；裏面
の色調：白黄色；可溶性色素：無し。
チロシン寒天培地；気中菌糸：豊富、裏面の色調：暗褐
色；可溶性色素：灰褐色。
栄養寒天培地；気中菌糸：豊富、白；裏面の色調：白黄
色；可溶性色素：無し。
酵母エキス・麦芽エキス寒天培地；気中菌糸：豊富、
白；裏面の色調：暗褐色；可溶性色素：灰褐色。
オートミール寒天培地；気中菌糸：豊富、白；裏面の色
調：白黄色；可溶性色素：無し。
素寒天培地；気中菌糸：豊富、白；裏面の色調：白色；
可溶性色素：無し。
1/10馬鈴薯・人参寒天培地；気中菌糸：豊富、白；裏面
の色調：白黄色；可溶性色素：無し。
1/10Ｖ-8ジュース寒天培地；気中菌糸：豊富、白；裏面
の色調：白黄色；可溶性色素：無し。
３．生理学的所見 生育温度範囲 酵母エキス・グルコース液体培地を用いて、16℃、19
℃、22℃、25.5℃、28.5℃、31℃、33℃、36.5℃、39.5
℃、42.5℃、45.5℃、及び47℃の各温度で試験の結果、
19℃以上、39.5℃以下で生育が認められた。生育適温
は、28.5℃から36.5℃付近と思われた。
ゼラチンの液化（28℃） グルコース・ペプトン・ゼラチン培地 陽性 単純ゼラチン培地 陽性 肉汁ゼラチン培地 陽性 スターチの加水分解 陰性 脱脂乳の凝固（28℃） 陰性 脱脂乳のペプトン化 陽性 メラニン様色素の生成 ペプトン・酵母エキス・鉄寒天培地 陰性 チロシン寒天培地 陰性 トリプトン・酵母エキス寒天培地 陰性 硝酸塩の還元 陽性 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地、
28℃、14日間培養） Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｌ−ラクトース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−フルクトース ＋ ラティノース ± Ｄ−マンニトール ＋ イノシトール ＋ シュクロース ＋ ラクトース ＋ 但し、＋；利用する、±利用するかどうか疑わしい、
−；利用しない 酸生産能 ラフィノース ＋ イノシトール ＋ Ｄ−マンニトール ＋ ラクトース ＋ ソルビトール − エリスリトール ＋ Ｌ−アラビノース ＋ アドニトール − Ｄ−ガラクトース ＋ ［Gordon,R.E.et al.（International Journal of Syst
ematic Bacteriology,24巻，54ページ，1974年）の方法
による。］ ４．化学的性質 ２，６−ジアミノピメリン酸 全菌体、及び細胞壁の加水分解物を、Staneck,J.L.及び
Roberts,G.D.の方法（Applied Microbiology,28巻、226
ページ、1974年）に準拠して調べた結果、メソ−2,6−
ジアミノピメリン酸の存在が認められた。
糖 全菌体の加水分解物中に、アラビノースの存在が認めら
れた。また、細胞壁の加水分解物中には、ガラクトー
ス、アラビノールの存在が認められた。
キノン系 ＭＫ−９（Ｈ４）を主成分に有する。
リン脂質タイプ フォスファチジルエタノールアミンを含み、フォスファ
チジルコリン、未知グルコサミン含有リン脂質を含まな
い。これは、Lechevalier,M.P.，及びH.A.Lechevalier
(The Chemotaxonomy of Actinomycetes,227-291ペー
ジ、In A.Dietz and D.W.Thayer（編）、Actinomycete
Taxonomy,Special Publication no.6.Society for Indu
strial Microbiology,U.S.A.1980年）によるＰ−IIタイ
プに属する。
ミコール酸 菌体内にミコール酸は含まない。
ＳＡＭ 0967株の細胞壁は、メソ−2,6−ジアミノピメ
リン酸とガラクトース、アラビノースを含む ＩＶ−Ａ
タイプである。ＳＡＭ 0967株は気中菌糸を形成し、そ
の先端に平滑な胞子を連鎖状に着生する。また、キノン
系はＭＫ−９（Ｈ４）を主成分として有し、リン脂質タ
イプはＰ−IIで、ミコール酸を含まない。以上の分類学
的性質よりＳＡＭ 0967株は明らかに、Amycolatopsis
属に属する放線菌である。Amycolatopsis属には現在６
種１亜種の既知種が含まれている。Lechevalier,M.P. e
t al.（International Journal of Systematic Bacteri
logy,36巻、29ページ、1986年）、及びHenssen,A.et a
l.（International Journal of Systematic Bacteriolo
gy,37巻、292ページ、1987年）に従ってＳＡＭ 0967株
の分類学的位置を検索した結果、Amycolatopsis.orient
alisとAmycolatopsis mediterraneiの２種がＳＡＭ 09
67株に近縁であった。そこでこの２種の基準菌株とＳＡ
Ｍ 0967株について、培養性状、生理的性状、及びキノ
ン系の歯比較試験を行なった。その結果を次表に示す。
表に示すように、ＳＡＭ 0967株とAmycolatopsis orie
ntalis JCM-4600は、酵母エキス・麦芽エキス寒天培
地、無機塩・スターチ寒天培地上での気中菌糸の色調、
5% NaCl存在下での生育、シュクロースの利用性、ラフ
ィノース、エリスリトール、アドニトールからの酸生成
能、メナキノンの組成の点で明らかに区別される。
また、ＳＡＭ 0967株とAmycolatopsis mediterranei J
CM-4789は気中菌糸形成能、メナキノンの組成の点で明
らかに区別される。
本発明者らは、これらの違いはＳＡＭ 0967株とこれら
の２種を区別するのに、十分な差であると判断した。そ
こでＳＡＭ 0967株を、Amycolatposis属の新種とし、A
mycolatopsis trehalostaticaと命名した。
Amycolatopsis trehalostatica SAM 0967は、1989年２
月17日付で工業技術院生物工業技術研究所に、受託番号
微工研寄第10544号（FERM P-10544）として国内寄託さ
れ、その後、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に
関するブタペスト条約下の国際寄託に1990年２月28日付
で移行し、受託番号微工研条寄第2784号（FERM BP-278
4）が付されている。
本発明では、上記のような放線菌を培養する。その際に
使用できる培地は、液体状でも固体状でもよいが、通常
は液体培地による振盪培養または通気撹拌培養が便利で
ある。
培地としては、本発明に係る放線菌が生育して本発明の
新規な物質を蓄積できるものであればどのようなもので
もよい。すなわち、炭素源としては、グルコース、ラク
トース、デンプン、シュクロース、デキストリン、糖
蜜、有機酸類などが、また窒素源としては、ペプトン、
カザミノ酸などの蛋白質加水分解物の他、肉エキス、酵
母エキス、ダイズ粕、コーンスティープリカー、アミノ
酸類、アンモニウム塩、硝酸塩、その他の有機あるいは
無機窒素化合物が用いられる。また、無機塩として各種
燐酸塩、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどを添加
してもよく、また菌の生育を促進する目的でビタミン
類、核酸関連化合物などを添加してもよい。なお、シリ
コン、ポリプロピレングリコール誘導体、大豆油などの
消泡材を培地に添加することが本発明の新規物質の蓄積
量を増大させるのに効果的な場合もある。
培養にあたって、いきなり本培養をするよりは、あらか
じめ小規模な前培養を行ない、その培養物を培地に接種
するのが望ましい。本培養、前培養共に、培養温度、培
養期間、培養の液性などの条件は、本発明の新規物質の
蓄積量が最大となるように適当に選択・調節されるが、
多くの場合、好気的条件下、25℃〜30℃にて培養するの
がよく、また培地の液性はpH5.5〜8.0に保つのがよい。
このように培養することにより、培養物中に本発明の新
規物質が生成・蓄積される。液体培地を用いて培養した
場合は、主としてその液体状部分に目的物が蓄積される
ので、培養物をいったん過あるいは遠心分離して菌体
を除去し、得られた液あるいは上漬からこれを分離す
るのが望ましいが、必要に応じて菌体を除去することな
く、培養液から直接目的物を分離することもできる。
以上のようにして本発明の新規物質トレハロスタチンを
採取する際の目的物の検出・定量は、ケブカクロバエあ
るいはブタ腎臓より調製したトレハラーゼの活性を該目
的物が阻害する程度を定量することによって行なうこと
ができる。培養物からの目的物の分離・精製には、本発
明の新規物質の化学的特性に基づく種々の手段を採用で
きる。すなわち、有機溶媒処理、セファデックスやバイ
オゲルなどによるゲル過、各種イオン交換樹脂による
イオン交換クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル
ル、アンバーライト-XAD-1、同-2などの吸着剤を用いる
吸着クロマトグラフィー、YMC-PA43やTSK-Amide 80など
の担体を用いる順相クロマトグラフィーなどが有効であ
り、これらの手段を適当に組合わせて使用することによ
り、本発明の新規物質トレハロスタチンが白色の無定形
結晶状に単離される。ただし、これら以外の方法であっ
ても、本発明の新規物質の特性を有効に利用するもので
あれば適宜使用できる。特に好ましい吸着剤の組合せと
しては、ダウエックス50WX4(H)、YMC-PA43、TSK-Amide
80の組合せが挙げられる。
なお、本発明の新規物質は単離・精製して用いることも
できるが、場合によってはトレハロスタチン産生菌の培
養物をそのままあるいは簡単に精製しただけで用いるこ
ともできる。
図面の簡単な説明 第１図：トレハロスタチンの重水中でのＨ，Ｈ−ＣＯＳ
Ｙスペクトル 第２図：アセチル化トレハロスタチンのCDCl3中でのＨ
ＭＢＣスペクトル 第３図：トラハロスタチンの重水中での位相検知ＮＯＥ
ＳＹスペクトル 第４図：アセチル化トレハロスタチンのCDCl3中でのＮ
ＯＥＳＹスペクトル 第５図：アセチル化トレハロスタチンの２つの位置異性
体の構造と、それらのCDCl3中での１Ｈ−および１３Ｃ
−ＮＭＲスペクトルデータ（非グルコース部分、斜体数
字は、１３Ｃ−ＮＭＲの化学シフトを表わす） ［発明の実施するための最良の形態］ 以下実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は
これらに限定されるものではない。
実施例１：トレハロスタチンの製造 (1)活性測定法 トレハロスタチンの精製の各段階における阻害活性は、
以下のようにして測定した。
インヒビター溶液10μｌとトレハラーゼ溶液（ケブカク
ロバエ）10μｌとを混合し、37℃で５分間インキュベー
トした後、5mMトレハロース、50mMリン酸緩衝液（pH6.
5）80μｌを添加し、37℃で１時間インキュベートし
た。その後、10μｌの50％トリクロロ酢酸溶液を添加し
て反応を停止させた。反応液中に生成したグルコース
を、ベーリンガー・マンハイム・山ノ内社の新ブラッド
・シュガー・テストにより定量した。酵素量は、前記方
法に従ってインヒビターを加えずに測定した場合にグル
コース定量における使用波長（660nm）の吸光度が1.0に
なる量を使用した。上記測定法で酵素（トレハラーゼ）
活性を50％阻害するトレハロスタチンの濃度を１単位／
mlとした。
(2)アミコラトプシス・トレハロスタチカ SAM 0967の
培養によるトレハロスタチンの製造 ジャガイモ熱水抽出物、グルコース、乾燥酵母エキス、
リン酸１カリウム、硫酸マグネシウムからなる培地3.1
Ｌ（pH7.0）に、30mlのSAM 0967株の純粋培養物を接種
し、小型培養機で28℃、通気量３／分、400rpm／分で
120時間通気撹拌培養した。
培養物を遠心分離して得られた上漬3.07Ｌ（101000単位
のトレハロスタチンを含有する）に、蟻酸を終濃度0.02
Ｍとなるように添加し、塩酸で溶液のpHを3.1に調整
後、これをダウエックス50Ｗ×４(H)（室町化学製）の
カラム（６×37cm）に吸着させた。このカラムを3.0Ｌ
の0.2Ｍピリジン−蟻酸バッファー（pH3.2）にて洗浄し
た後、ケブカクロバエのトレハラーゼを阻害する活性
を、3.5Ｌの0.4Ｍピリジン−酢酸バッファー（pH4.2）
にて溶出させた。
活性画分（120000単位のトレハロスタチンを含有する）
を減圧下で濃縮乾固し、残渣を少量の水に溶解して、溶
液のpHを塩酸で3.1にした。溶液中の不溶物を遠心分離
にて除去し、得られた上漬をダウエックス50Ｗ×４(H)
カラム（３×12cm）に負荷した。このカラムを、0.5Ｌ
の脱イオン水で洗浄し、次いで30％（v/v）メタノール
を含む３Ｌの0.2Ｍピリジン−蟻酸バッファー（pH3.2）
にて洗浄しながら目的物を溶出した。
目的物の画分（120000単位のトレハロスタチンを含有す
る）を減圧下で濃縮後、残渣を50％（v/v）アセトニト
リルに均一に懸濁してこれを高速液体クロマトグラフ用
充填カラム（ＹＭＣ−ＰＡ４３、2.5×27cm）に負荷し
た。このカラムを65％（v/v）の定組成のアセトニトリ
ルで洗浄（流速５ml／分）し、示差屈折計にて溶出物を
検出しながら、溶離液を5.0mlずつ分画した。その結
果、トレハラーゼ阻害活性画分（119000単位のトレハロ
スタチンを含有する）は負荷後200ml付近に溶出させ
た。
目的物の画分を濃縮し、40％（v/v）アセトニトリルに
溶解してこれを高速液体クロマトグラフ用充填カラム
（TSK-Amide 80、0.7×27cm）に負荷した。このカラム
を同組成の溶媒で洗浄（流速１ml／分）し、示差屈折計
にて溶出物を検出しながら、溶離液を0.5mlずつ分画し
た。トレハラーゼ阻害活性画分は負荷後25〜30ml付近に
溶出された。目的物の画分（118000単位のトレハロスタ
チンを含有する）を濃縮乾固し、水を加えて凍結乾燥す
ることにより、純粋な目的物１mgを得た。
実施例２：トラハロスタチンの物理化学的性質 アミコラトプシス・トレハロスタティカ（SAM 0967）の
培養物から、実施例１に従って分離・精製された物質を
トレハロスタチンと命名した。
このトレハロスタチンの物理的・化学的性質を以下に示
す。
性状：白色粉末。
溶解性：水に可溶、ヘキサン、ベンゼン、エーテル、石
油エーテルに難溶。
紫外可視吸収スペクトル：220nm以上に吸収極大をもた
ない。
呈色反応：Rydon-Smith反応に陽性。
ニンヒドリン反応、3,6−ジニトロフタル酸反応、Elson
-Morgan反応に陰性。
薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ＝0.37 Merck Kieselgel 60 F254、展開溶媒（ｎ−ブタノー
ル：酢酸：水＝３：１：２）。
高速液体クロマトグラフィー：Ｒｔ＝11.0分 ＹＭＣ ＰＡ０３（0.7×27cm） 溶媒；65％v/vアセトニトリル（in Ｈ２Ｏ） 流速；1.0ml／分 検出；示差屈折計。
分子量：366（m/z 367、Ｍ＋Ｈ、SIMSによる） ［α］Ｄ；＋115°１ Ｈ−ＮＭＲ／Ｄ２Ｏ：3.3（ppm），dd，1H 3.5（ppm），m，1H 3.5（ppm），t，1H 3.6（ppm），d，1H 3.6（ppm），dd，1H 3.7（ppm），d，1H 3.7（ppm），dd，1H 3.8（ppm），ddd，1H 4.1（ppm），dd，1H 4.2（ppm），d，1H 4.8（ppm），ddd，1H 5.2（ppm），d，1H１３ Ｃ−ＮＭＲ／Ｄ２Ｏ：63.5（ppm） 64.8（ppm） 72.4（ppm） 72.8（ppm） 74.8（ppm） 75.8（ppm） 76.2（ppm） 83.0（ppm） 83.2（ppm） 83.4（ppm） 85.6（ppm） 89.9（ppm） 163.8（ppm） 以下の結果より推定される構造式は以下の式１、式２の
とおりである。
さらにトレハロスタチンの構造を以下のように決定し
た。なお、化学シフトは、トレハロスタチンの場合は25
℃の重水中での測定値であり、アセチル化トレハロスタ
チンの場合は25℃のCDCl3中での測定値である。またと
くにことわらないかぎり、本文中の化学シフトは前者を
あらわすものとする。また、文中のＤＩＳとはDeuteriu
m induced Differential isotope shiftの略称であり、 ＤＩＳ＝δ１３ＣＨ２Ｏ−δ１３ＣＤ２Ｏ（ppm） で定義される。もしある炭素原子に−ＯＨ基や−ＮＨ基
のような重水素交換可能な官能基が結合していると、そ
の炭素原子のＤＩＳは0.02−0.1ppm程度の正の値をあた
える。
まず、トレハロスタチンがα−Ｄ−グルコピラノシル基
を含有することを、以下のようなＭＳ，ＮＭＲ，および
化学的解析により明らかにした。すなわち液体ＳＩＭＳ
（Liquid Secondary lon Mass Spectrometry）法で生成
するm/z367［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンピークが、B/E-li
nked Scan（Ｂ／Ｅ一定リンク走査）にてm/z205［Ｍ＋
Ｈ−Ｃ６Ｈ１０Ｏ５］＋のフラグメントを生成したこと
から、ヘキソース残基の存在を推定した。１Ｈ−ＮＭＲ
（表Ｂ），およびＨ，Ｈ−ＣＯＳＹスペクトル（Ｈ／Ｈ
同種核シフト相関ＮＭＲ分光法（第１図）においてグル
コピラノシル基のスピン系を見いだし、さらにアノメリ
ック水素（5.2ppm）のカップリング定数（Ｊ＝5.0Hz）
に基づいて、これをα−グルコピラノシル基と同定し
た。また、トレハロスタチンを塩酸−メタノール処理す
ると、シリカゲル薄層クロマトグラフィーでメチルグル
コシドと同一の移動度をもつ単糖類を生成した。この単
糖類をアセチル後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ーにて単離し、その１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを標準標品
と比較することにより、メチルグルコピラノシド（アセ
チル化物）と同定し、グルコプラノシル基の存在をさら
に確認した（表Ａ）。このアセチル化メチルグルコピラ
ノシドをｐ−ブロモ安息香酸のテトラエステルに変換し
て円二色性スペクトル測定を行なったことろ、244nmにp
ositive split CDシグナルを与えたので、このグルコピ
ラノシル基の絶対配置をＤ型と決定した。さらα−Ｄ−
グルコピラノシル基のアノメリック炭素（83.4ppm）
が、Ｏ−グルコシドにみられるより高磁場シフトしてい
ることから、このα−Ｄ−グルコピラノシル基がＮ−グ
ルコシドであることが示唆された。
次にトレハロスタチンの非グルコース部分の構造を以下
のように決定した。
分子量（366）から計算されるトレハロスタチンの不飽
和度は４であり、本物質はα−Ｄ−グルコピラノシル基
（不飽和度１）を含有するから、非グルコース部分の不
飽和度は３である。さらにＩＲ（1616cm-1），ＵＶ（末
端吸収），１３Ｃ−ＮＭＲ（163.8ppm）によりウレイド
基（不飽和度１）の存在が示唆されるから、非グルコー
ス部分は２環式であると考えた。１Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ
−ＮＭＲ，ＤＥＰＴ（Distortionless Enhancement by
polarization Transfer）により得られた、トレハロス
タチンの各水素と炭素のスペクトルデータを、Ｈ，Ｃ−
ＣＯＳＹスペクトル（Ｈ／Ｃ異種核シフト相関ＮＭＲ分
光法）により相関させた（表Ｂ）。またアセチル化トリ
ハロスタチンの２つの異性体の非グルコース部分の各水
素と炭素を、ＨＭＱＣ（1H-Detected Multiple Quantum
Coherence Spectrum）により相関させた（第５図）。
Ｈ，Ｈ−ＣＯＳＹスペクトルから、この非グルコース部
分には、4.2、4.8、4.1、3.8ppmの４つの水素（それぞ
れＨ３′，Ｈ４′，Ｈ５′，Ｈ６′）をもつスピン系が
存在することがわかった（第１図）。それらの水素が結
合する炭素（それぞれＣ３′，Ｃ４′，Ｃ５′，Ｃ
６′）の化学シフトの大きさ（表Ｂ）は、これらの水素
が５員環の骨格に含まれることを示唆している。そして
アセチル化トレハロスタチンのＨＭＢＣ（１Ｈ−Detect
ed Multiple-bond Heternuclear Multiple Quantum Coh
erence Spectrum）において、上述のスピン系の両末端
の水素（Ｈ３′，アセチル化物では例えば5.92ppm；お
よびＨ６′，アセチル化物では例えば6.35ppm）が、ｓ
ｐ３−４級炭素（Ｃ２′，アセチル化物では例えば86.5
ppm）に対してクロスピークを与えること（第２図）か
ら、上述のスピン系は、このｓｐ３−４級炭素とともに
５員環炭素骨格を構成することが明らかとなった。ま
た、独立したメチレン水素（Ｈ１′ａ，アセチル化物で
例えば3.94ppm；及びＨ１′ｂ，アセチル化物で例えが
4.21ppm）もｓｐ３−４級炭素（Ｃ２′，アセチル化物
では例えば86.5ppm）に対してクロスピークを与えた
（第２図）。以上の結果から、次のような部分構造が考
えられた。
上述のスピン系を構成する炭素のうち末端の炭素の一つ
（Ｃ３′，76.2ppm）は、アセチル化によって、より高
磁場で共鳴する（アセチル化で例えば58.3ppmになる、
第５図）ことから、この炭素には窒素原子が結合してい
ることが示唆され、さらにこの炭素にＤＩＳ（＞＋0.0
7）が観察されることから、この炭素にはＮＨ基が結合
することが示された。またアセチル化により、3.6，3.7
ppmのメチレン水素（Ｈ１′ａ，Ｈ１′ｂ）および4.1、
3.8ppmの各水素（Ｈ５′，Ｈ６′）が大きく低磁場シフ
トすること（アセチル化で、例えばそれぞれ3.9、4.2、
5.4、6.4ppmになる（第５図））から、これらの水素が
結合する炭素（Ｃ１′，63.5；Ｃ５′，83.2；Ｃ６′，
83.0ppm）には水酸基が結合していることがわかり、そ
れはＤＩＳの結果（それぞれ＋0.06，＋0.04，＋0.07pp
m）からも支持された。一方、89.9ppmの炭素（Ｃ４′）
にはＤＩＳが認められず（ＣＩＳ＜０）、アセチル化に
よってもＨ４′が低磁場シフトしないこと（表Ｂおよび
第５図）から、このＣ４′に結合する酸素は水酸基以外
のものであることがわかった。以上の結果から、非グル
コース部分は、ウレイド（イソウレイド）基を含有する
疑似環状糖アルコールであると考えた（式３参照）。
非グルコース部分の相対的な立体配置を、ＮＯＥＳＹ実
験により以下のように決定した。4.2ppm（Ｈ３′）と4.
8ppm（Ｈ４′）の水素間（Ｊ＝8.6Hz）、および4.1ppm
（Ｈ５′）と3.8ppm（Ｈ６′）の水素間（Ｊ＝4.8Hz）
にそれぞれＮＯＥが観察されたことから、それらは互い
にsynの関係にあることがわかった。4.8ppmの水素（Ｈ
４′）と4.1ppmの水素（Ｈ５′）の間（Ｊ＝2.7Hz）に
はＮＯＥが無いことから、それらはantiの関係にあるこ
とがわかった（第３図）。また、アセチル化トエハロス
タチンの非グルコース部分について、Ｃ２′（アセチル
化物で86.5ppm）に結合する水酸基と、Ｈ３′（アセチ
ル化物で5.92ppm）の間にＮＯＥが観測されたことは、
それらがsynの関係にあることをあらわしている（第４
図，第５図）。またアセチル化トレハロスタチンのふた
つの異性体のうち、一方のＮ−アセチル基のメチル水素
（2.66ppm）が、グルコース残基の３位の水素（アセチ
ル化物で5.39ppm）との間にＮＯＥをもつことから、こ
のものは、グルコースに結合する窒素原子にアセチル基
をもち、もう一方は、Ｎ３′−位にアセチル基をもつ位
置異性体であることがわかった（第４図，第５図）。
以上の結果から、トレハロスタチンについて得られたス
ペクトルデータを満足する構造を以下のように決定した
（式３）。なお、非グルコース部分の構造は、その鏡像
体も可能である。
なお、トレハラーゼを阻害するためには、ウレイド基、
イソウレイド基、もしくはアミジン基の窒素原子の一つ
が結合するＮ−α−グルコピラノシドが有効であると考
えられる。
実施例３．トレハロスタチンの酵素阻害スペクトル ［産業上の利用可能性］ 本発明のトレハロスタチンは、昆虫、特にケブカクロバ
エのトレハラーゼに対して極めて低濃度でも有効な阻害
効果を示すものであり、これら昆虫に対する殺虫剤とし
て有用なものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 19/28 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】水に可溶であり、ヘキサン、ベンゼン、エ
    ーテルおよび石油エーテルに難溶である白色粉末であっ
    て、紫外可視吸収スペクトルが220nm以上に吸収極大を
    もたず、Rydon-Smith反応に陽性であり、ニンヒドリン
    反応、３，６−ジニトロフタル酸反応およびElson-Morg
    an反応に陰性であり、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝３：
    １：２の展開溶媒を用いたMerck kieselgel 60 F254薄
    層クロマトグラフィーにおいてＲｆ＝0.37であり、流速
    1.0ml／分の65％v/vアセトニトリル（Ｈ２Ｏ中）を溶媒
    とするYMC PAO3（0.7×27cm）高速液体クロマトグラフ
    ィーにおいてＲｔ＝11.0分であり、分子量366、［α］
    Ｄ；＋115°、及び以下に示すＮＭＲスペクトル：１ Ｈ−ＮＭＲ／Ｄ２Ｏ：3.3（ppm），dd，1H 3.5（ppm），m，1H 3.5（ppm），t，1H 3.6（ppm），d，1H 3.6（ppm），dd，1H 3.7（ppm），d，1H 3.7（ppm），dd，1H 3.8（ppm），ddd，1H 4.1（ppm），dd，1H 4.2（ppm），d，1H 4.8（ppm），ddd，1H 5.2（ppm），d，1H１３ Ｃ−ＮＭＲ／Ｄ２Ｏ：63.5（ppm） 64.8（ppm） 72.4（ppm） 72.8（ppm） 74.8（ppm） 75.8（ppm） 76.2（ppm） 83.0（ppm） 83.2（ppm） 83.4（ppm） 85.6（ppm） 89.9（ppm） 163.8（ppm） を有する新規物質トレハロスタチン。
  2. 【請求項２】アミコラトプシス（Amycolatopsis）属に
    属する放線菌を培養して得られることを特徴とする請求
    の範囲１に記載のトレハロスタチン。
  3. 【請求項３】放線菌がAmycolatopsis trehalostatica S
    AM 0967(FERMP-10544；BP-2784)であることを特徴とす
    る請求の範囲２に記載のトレハロスタチン。
  4. 【請求項４】請求の範囲１に記載のトレハロスタチンを
    産生するアミコラトプシス（Amycolatopsis）属に属す
    る放線菌を培養することからなるトレハロスタチンの製
    造方法。
  5. 【請求項５】放線菌がAmycolatopsis trehalostatica S
    AM 0967(FERMP-10544；BP-2784)であることを特徴とす
    る請求の範囲４に記載の方法。
  6. 【請求項６】アミコラトプシス・トレハロスタティカAm
    ycolatopsis trehalostatica SAM 0967(FERM P-10544；
    BP-2784)。
  7. 【請求項７】昆虫、特にケブカクロバエのトレハラーゼ
    に対して阻害効果を示す、請求の範囲１に記載のトレハ
    ロスタチンを含有するAmycolatopsis trehalostatica S
    AM 0967(FERM P-10544；BP-2784)の培養物。
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