JPH0643997B2 - 被検体の検知法 - Google Patents

被検体の検知法

Info

Publication number
JPH0643997B2
JPH0643997B2 JP59046614A JP4661484A JPH0643997B2 JP H0643997 B2 JPH0643997 B2 JP H0643997B2 JP 59046614 A JP59046614 A JP 59046614A JP 4661484 A JP4661484 A JP 4661484A JP H0643997 B2 JPH0643997 B2 JP H0643997B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
enzyme
sbm
conjugate
signal
analyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP59046614A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS59178362A (ja
Inventor
ロバ−ト・デイネロ
イアン・ギボンズ
エドウイン・フイツシヤ−・ウルマン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Syva Co
Original Assignee
Syva Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Syva Co filed Critical Syva Co
Publication of JPS59178362A publication Critical patent/JPS59178362A/ja
Publication of JPH0643997B2 publication Critical patent/JPH0643997B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/966—Chemistry: molecular biology and microbiology involving an enzyme system with high turnover rate or complement magnified assay, e.g. multi-enzyme systems

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、被検体（analyte）を含有する疑いのある試
料中の該被検体の存在を検知する方法に関する。
病気の診断及び処置における重要な要素は、病原菌の性
質、病原菌の種類、影響を受けた細胞、異常蛋白質など
を決定する能力、並びに病気の処置中の生理学的分泌液
（fluid）において結合した又は結合してない薬剤の
量、を決定する能力である。薬剤の誤用、毒素の摂取な
どの場合には、薬剤の決定も興味あるものである。また
多くの場合に、病気の診断或いは個体の健康の決定と関
連して、特異的受体（receptor）、特に抗体の存在に関
心がもたれる。更に血液型、HLA型及び他の表現型の生
成物の決定の分析も行なわれている。
多くの状況において、類似の又は異なる構造のものであ
つてもよい種々の物質を含んでいる複雑な組成物中にお
ける非常に少量のある物質を検知することに関心がもた
れてきた。実際には特異的物質の存在を検知するため
に、決定要素（determinant）の位置に特異的に結合す
る抗体又は他の受体が用いられている。この、配位体
（ligand）と受体との間での複合体（complex）の生成
は、ある試料中における限られた決定要素の位置の存在
を定性的或いは定量的に決定するために広く使用されて
いる。
更に最近では、病原菌、突然変異体及びポリヌクレオチ
ドの交雑による遺伝に関連した病気を検知する能力に関
しても興味が増している。これはしばしば全ＤＮＡ及び
／又はＲＮＡの微小な部分だけである独特なシーケンス
を検出することと関係があるから、結果の精度を確かな
ものとするための敏感な方法が必要である。
今なお種類の増大する被検体を検知する必要性が増して
いるので、感度の増大、操作の簡易、自動化の可能性、
再現性及び低い誤差率を含む新しい技術の開発に努力が
向けられている。
米国特許第4,233,402号は均一系チヤンネリング（chann
eling）分析を記述し、米国特許第4,299,916号は不均一
系チャンネリング分析を記述している。またStuart及び
Porter，Exp.Cell.Pes.,113,219〜222（１９７８）は、
DNA-RNA交雑複合体に対するモノクローナル抗体につい
て記述している。
今や信号発生系の第２成分と相互作用する生成物の酵素
による生産を含む新規な分析法が提供される。この酵素
は、特異的結合対の１員に結合する。第２の成分は、酵
素が相互の結合員に結合した結合体（conjugate）とし
てだけ重合体中に包含される条件下に重合せしめられ
る。重合体中の第２成分と酵素の高モル比は結合事象に
対して増大した信号を与える。観察される信号は、標準
との比較により試料中の被検体の量と関連する。
本発明によれば、チヤンネリングを用いる新規な高感度
分析法を、特に低被検体濃度の被検体を決定するために
提供する。この方法は、少くとも１つの酵素、普通には
１つの酵素の生成物が他のものの基質であるということ
で関係づけられた２つの酵素を含む。
本発明は、少くとも３つの員を含む信号発生系を用いる
ものと言える。この３つの員は、酵素、その基質、及び
酵素の生成物と相互作用する物質を含む。酵素の生成物
と相互作用する信号発生系の成分は、測定しうる信号の
変化を与える具合に第１の酵素の生成物と相互作用する
異なつた酵素であつてよく、或いは第１の酵素の生成物
と反応して測定しうる信号の変化をもたらす反応物であ
つてよい。
本発明は、信号発生系に含まれる分子が、多くの部分に
対して、殆んどの粒子と比較して比較的小さい分子であ
るという点で多くの利点を提供する。即ちこの分子は分
析媒体中を迅速な速度で拡散する。酵素の使用は、本発
明の場合結合事象と関連して大きい感度の増巾を提供す
る。信号発生系の１員を重合させることにより、多量の
そのような員が極く近傍にもたらされる。即ち１の酵素
を特異的結合員間の結合事象によつて重合体中に合体す
るという本発明の提案により、第１の酵素はこの第１の
酵素の生成物と相互作用する或いは酵素であるならばこ
の第１の酵素が作用する生成物を生成してよい信号発生
系の他の成分が局在化したその高濃度部分の極く近傍に
存在するようになる。実際には、粒子を用いるが、この
粒子の遅い拡散という問題を回避しつつ標識（label）
又は反応物の高濃度が達成される。このようにして、分
析の感度が非常に高められ、また単一の結合事象から大
きい信号を得ることができる。
信号発生系は、２つの主な範ちゆう、即ち酵素チヤンネ
リング及び酵素生成物反応に分類できる。好適な方法は
酵素チヤンネリング系である。
結合事象は、配位体及び受体である特異的結合対の員を
含む。これらは、それを示すことなしに意図する員を、
第１の結合員（“FBM”）及び第２の結合員（“SBM”）
として任意に言及されるであろう。第１の酵素はＳＢＭ
に結合して酵素−ＳＢＭ結合体を与える。この酵素−Ｓ
ＢＭ結合体の酵素は、ＦＢＭに存在する結合位置の限ら
れた数に基づいて限られた量で存在しよう。
他の酵素は、用いる他の酵素の重合を含む、即ち酵素−
ＳＢＭ結合体及びＦＢＭ間の複合体作用の程度と関連し
た程度まで酵素−ＳＢＭ結合体を重合体中に含有する系
の一部分である。事実分析媒体中におけるすべてのこの
他の酵素の実質的な部分がコロイド状の共重合体凝集体
中に含まれるようになる。
酵素を適当に選択すれば、触媒的連続で第２の酵素の基
質を局在化した高濃度にすることができ、或いは触媒的
連続で第１の酵素によつて生産される生成物の実質的な
部分を凝集体中の第２の酵素によつて消費せしめること
もできる。この方法では、分析媒体中に存在する被検体
の量に関連して観察される信号が、媒体中の被検体の量
に無関係に、生成物の生産に由来するバツクグランドの
信号と比較して非常に高められ、結果として高感度が得
られる。バツクグランドの信号を更に減ずるためには、
随時バルク溶液中に補捉剤を用いてもよい。更にＳＢＭ
のＦＢＭへの結合が粒子の生成に先立つて均一な溶液中
で起こるから、この結合は結合が表面例えば壁又は粒子
への拡散によつて制限されている時よりも迅速に起こ
る。
分析では第１及び第２の結合員の両方を測定することが
できる。ＳＢＭが被検体である場合、予じめ決められた
量のＦＢＭを、用いる試薬中に含有させることができ
る。この時ＳＢＭの量は共重合体凝集体中の酵素−ＳＢ
Ｍの量を減少させる。普通にはＦＢＭが被検体であり、
共重合体凝集体中の酵素−ＳＢＭの量は分析媒体中の被
検体の量と直接関係する。即ちＦＢＭが被検体の場合、
観察される信号の変化は、普通ＦＢＭの量の増加と共に
増大するであろう。
酵素の性質及びその基質を変えることによつて広い種類
の相互作用を与えることができる。即ち共因子（cofact
or）の生産による活性化、禁止剤の生産による不活性
化、或いは２つの酵素が同一の基質に対して競合する
が、酵素−ＳＢＭ結合体の酵素だけが検知しうる信号を
与える生成物を生産することでの不活性化、を付与する
ことができる。
酵素のチヤンネリング反応は、第１酵素の生成物が第２
酵素の基質であるように２つの酵素が関連するというこ
とで記述される。第２の酵素は標準と対比して検知しう
る信号の変化をもたらす生成物を生産する。チャンネリ
ング系の２つの酵素が極く近傍に存在するために、観察
される信号の変化をもたらす生成物の生成に関して速度
の増大が観察される。更に、酵素の１つを他の酵素の近
傍において高濃度にすることにより、凝集における信号
発生生成物の生産がバルク溶液中でのそのような生成物
の生産よりも非常に大きくなる。
多くの場合、酵素は実質的に異なつたターンオーバ速度
（turnover rate）を有するから、複数の１つの酵素を
他の酵素と関係づけることが望ましい。他の場合には、
基質を高い局在化濃度にすることによつて、酵素のター
ンオーバ速度を最高にすることが望ましい。他の考え
は、１つの酵素を他の酵素で実質的に取り囲んで、溶液
中に拡散する中間体の基質の量を最小にすることであ
る。更に分析媒体を一掃して、酵素の１つの実質的な部
分、好ましくは主部分を凝集体中に含ませることによ
り、バツクグランドを実質的に減ずることができる。ま
たバルク媒体中に捕捉剤を用いることによつてバツクグ
ランドを更に減じてもよい。
酵素の１つは通常共有結合でＳＢＭに結合し、そしてＳ
ＢＭの結合する各の結合位置に対して１つ又はいくつか
の酵素が非共有的にＦＢＭに結合するようになる。他の
酵素は、他の酵素の、ＦＢＭ及び酵素−ＳＢＭ共役体の
複合体との共重合を与える系の一部分である。実際に
は、酵素の１つのブロツク重合又は共重合を与える連結
系を用いることにより、複合体が重合体凝集中に断続的
に合体される。ＦＢＭは多価であり、即ち複数の結合位
置を有し、或いは多価形で、即ち複数のＦＢＭが一緒に
結合して与えられる。
所望の重合体凝集を付与するために、種々の形体及び試
薬が使用できる。一度適当な基質及び他の試剤を添加す
ることによつて凝集体が生成しはじめる或いは生成する
と、検知しうる信号を与える生成物の生成又は破壊が達
成できる。次いでその信号を標準に照らして測定し、あ
る被検体の存在又は量を決定することができる。
定義 被検体−第１及び第２結合員が特異的結合対である場合
の、第１の結合員又は第２の結合員であつてよい測定す
べき化合物又は組成物。結合員の１つは配位体又はポリ
ヌクレオチドであり、他の結合員は第１の結合員に対す
る同族体又は相補体である受体又はポリヌクレオチドで
あろう。
第１結合員及び第２結合員（それぞれ“FBM”及び“SB
M”）−第１及び第２結合員は特異的結合対員であり且
つ互いに相互作用の関係にある有機化合物である。この
化合物は配位体及び受体である。配位体は、その受体が
存在する又はそれを作ることのできる有機化合物であ
り、受体と結合する１つの又は複数の位置を有していて
よい。この位置は相互作用的又は同族の受体が結合する
特別な空間的及び極性的構成（organization）を限定す
る決定要素位置又はエピトープ（epitope）として言及
しうる。受体は、受体の性質に依存して高分子ポリペプ
チド又はポリヌクレオチド、ＤＮＡ又はＲＮＡであつて
よく、普通少くとも約１０の塩基を有する。受体は配位
体の特異的な極性的及び空間的構成に結合し、従つて配
位体の表面の多くの特徴と補なう表面を有している。
本発明の目的に対して、ＦＢＭ及びＳＢＭの焦点は、そ
の互いに特異的に結合するという能力である。それ故
に、種々の受体が同一の結合特異性を有する同等物とし
て取り扱われる。例えば抗体、酵素、天然の受体などは
同一の配位体に結合させるために有用である。更に受体
のフラグメント、例えばFab，F(AB′)2又はFvは本発明
の目的に対して完全な抗体に同等であろう。更に種々の
種類の免疫グロブリンはいろいろな状態において相互に
変換しうる。
同様に、大きい配位体を用いる場合、いくつかの例では
全体の配位体よりもむしろ決定要素位置又はエピトープ
と関連した配位体の一部分だけを用いることも可能であ
る。
改変された第２結合員（“改変ＳＢＭ”）−改変ＳＢＭ
は改変ＳＢＭを重合体凝集体に含んで有する連結系の一
部である標識をＳＢＭに共有結合して有するであろう。
この改変はＳＢＭへの共有又は非共有結合の結果として
であつてよく、共重合体凝集体における信号発生系の員
を多数与える。
信号発生系−信号発生系は少くとも３つの員を含む。必
須の員は酵素、生成物を生産する酵素のための基質、及
び酵素生成物と相互作用し、分析媒体中において測定し
うる信号の変化を与える相互作用員である。この相互作
用員は、第１の酵素の生成物を基質として用いる第２酵
素であつてよく、或いは酵素の生成物と反応して検知し
うる信号の変化を与える化学化合物であつてよい。信号
発生系の３つの必須員のうち２つは重合体凝集体中に含
まれ、この２つのうち１つは他のものに対して高モル倍
率で含有されよう。多くの場合、重合体凝集体中の２つ
の員は酵素のチヤンネリング反応に含まれる酵素であ
る。しかし酵素の１つは他の酵素の生成物と反応するこ
とのできる化合物で代替することができる。
連結系−連結系は、酵素或いは酵素の生成物と反応して
検知しうる信号の変化を発生する化合物のいずれかであ
る信号発生系の一員を重合させるための方法を提供す
る。重合体凝集体は、信号発生系の重合した員及びＦＢ
Ｍを介してＳＢＭに結合した酵素を含有するであろう。
この場合、重合した信号発生系員はＳＢＭに結合した酵
素に対して高倍率で与えられる。重合体凝集体中に酵素
−ＳＢＭを含有させるためには、ＦＢＭが多価であるか
又は多価形で与えられるかが必要である。ハプテン（ha
pten）がＦＢＭとして働く場合には、複数のハプテンを
一緒に結合し、或いはハプテンを共重合体凝集体に対す
る連結員として役立つ共役体としての他の分子に結合し
てすることにより、ハプテンを供してよい。
配位体同族体−受体に対して同族配位体と競合する改変
された配位体。この改変は複数の配位体同族体を単一体
に結合する手段或いは標識へ結合させるための手段を提
供する。配位体同族体は、配位体同族体を中心（hub）
核又は標識に連結する結合で水素を置換したもの以上
で、配位体と異なるであろう。
ポリ（配位体同族体）−通常中心核に共有結合で一緒に
結合した複数の配位体同族体。この中心核は多官能性物
質であり、通常は連続点として複数の官能基例えばヒド
ロキシル、アミノ、メルカプト、エチレン性結合などを
有する重合体である。ポリ配位体重合体は、水溶性であ
つてよく、普通少くとも約30,000の分子量を有し、１０
００万又はそれ以上の分子量であつてもよい。中心核の
例は多糖類、ポリペプチド（蛋白質を含む）、核酸など
を含む。
受体−分子のある空間的及び極性的構成、例えばエピト
ープ又は決定要素位置を認識することのできるいずれか
の大分子有機化合物又は組成物。受体は通常受体が結合
する特異的構成、例えば大分子と少くとも同程度に大き
い。或いは普通にはそれよりも非常に大きいであろう。
受体の例は、天然に産する受体、抗体、酵素、Fabフラ
グメント、レクチンなどを含む。いずれかの特異的な配
位体に対して、受体は抗配位体として言及されるであろ
う。受体−抗配位体及びその相互作用する配位体は特異
的結合対を形成する。
凝集体−信号発生系の１員の重合体からなるコロイド状
粒子。なおそのような員はＦＢＭ−ＳＢＭ結合の生成と
は無関係に混入され、酵素はそのような結合に依存して
合体され、結果として重合体の信号発生系員は酵素に対
して高倍率となる。
標識−検知しうる信号の発生を伴つて直接的又は間接的
に含まれる及び配位体、配位体同族体又は受体に直接的
又は間接的に結合する化合物。本発明において、標識は
信号発生系に含まれる成分、例えば酵素及び反応物、そ
して重合体凝集体を生成するための連結系に使用される
化合物であろう。それ故に標識は信号発生員の標識と連
結の標識との間で区別される。
中間体基質−中間体基質は他の酵素の基質として作用す
る１つの酵素の生成物である。
最終生成物−第１酵素の基質とは区別しうる信号発生系
の最終反応の生成物。この最終生成物の生成は分析にお
いて検知しうる信号の変化をもたらす。普通、最終生成
物は電磁照射、特に紫外線又は可視光を、吸光又は放射
の結果として、螢光、化学発光又は燐光を含む信号を与
えよう。
最終反応物−重合し、酵素生成物と反応して検知しうる
信号の変化を与える生成物を生成する化合物。
分析 本分析は、少くとも部分的には水性域中において、一般
に最適分析感度に近い適度なpHで行なわれる。被検体の
決定のために複合体が生成する水性分析域は、通常緩衝
された適当な水溶液、予備処理してあつてもよい未知の
試料、酵素−ＳＢＭ共役体、他の酵素に対する連結系の
成分及び分析媒体中で検知しうる信号の変化のために必
要な残りの員を用いることによつて調製される。
（以下において、チャンネリング系の２つの酵素を一緒
に言及する場合には、一連の酵素反応において、第１酵
素である酵素がいずれかを指示するのを避けるために、
２つの酵素を「酵素＋」及び「酵素＊」として言及す
る）。
多くの場合、問題の被検体はポリエピトープ（polyepit
ope）であろう。しかしながら、本系をモノエピトープ
配位体、即ちハプテンに対して使用することも可能であ
る。これはポリ（配位体同族体）を製造することによつ
て達成することができる。この場合、ハプテン配位体と
ポリ（配位体同族体）は存在する受体に対して競合し、
結果として起こるチャンネリングの程度が媒体中に存在
するハプテンの量に依存しよう。或いは標識が多価を与
える標識したハプテンを用いることもできる。
分析を行う場合、通常は水性媒体が使用される。他の極
性溶媒、普通にはアルコール、エーテル、アミドなどを
含む炭素数１〜６、更に普通には１〜４の酸素化有機溶
媒も使用することができる。普通これらの共溶媒は約４
０重量％以下、更に普通には約２０重量％以下で存在し
よう。ポリヌクレオチドを用いる場合には、塩例えばNa
Clを一般に0.1〜1.5Ｍの範囲の濃度で添加してよい。
媒体に対するpHは普通約４〜１１、更に普通約５〜１
０、好ましくは約6.5〜9.5の範囲である。このpHは、信
号発生感度を最適化しつつ、受体による特異的結合をか
なりの程度に維持するために選択される。いくつかの場
合、これらの双方を考慮して妥協が計られる。所望のpH
を達成し且つそのpHを測定中維持するために種々の緩衝
剤が使用できる。緩衝剤の例は、ホウ酸塩、燐酸塩、炭
酸塩、トリス、バルビタールなどを含む。用いる特別な
緩衝剤は本発明にとつて厳密でないが、個々の分析にお
いてはある緩衝剤が他の緩衝剤より好適である。
分析を行なうために、普通適度な温度が使用され、分析
の期間中一定の温度が使用される。測定のための温度は
一般に約１０〜６０℃、更に普通には約１５〜４５℃の
範囲にあるであろう。
分析しうる被検体の濃度は一般に約１０−４〜１０
−１５Ｍ、更に普通には約１０−６〜１０−１４Ｍで変
化しうる。分析が定性的、半定量的又は定量的であるか
どうか考慮する場合、用いる検知技術及び問題の被検体
の濃度によつて他の試剤の濃度が普通決定されよう。
種々の試剤の濃度は一般に問題とする被検体の濃度範囲
によつて決定されるが、各試剤の最終濃度は普通には分
析の感度を問題の範囲に亘つて最適化するように実験的
に決定されるであろう。配位体及び受体の結合位置に基
づいて、この比は普通約１０４以上でない、更に普通に
は約１０２以上でない。（ポリヌクレオチドの相補的シ
ーケンスは１つの結合位置になる）。結合位置を考えれ
ば、これは、必ずしもではないが普通には、配位体がポ
リエピトープの場合、その配位体に結合する受体のすべ
てを考慮するということを意味しよう。しかしながら、
同一のエピトープ位置に対して競合しない受体が２群存
在するならば、比は独立に考慮すればよい。連結系の員
の濃度は広く変化させうるが、信号発生系員を重合させ
るために実験的に決定される。それ故に重合体が共重合
体である場合、普通コモノマーの比は比較的１に近くな
る。
上述のように、試剤の各の濃度は多くの場合実験的に決
定される。分析の信号変化に含まれる成分；即ち基質及
び酵素に対する共因子、及び最終反応物の各の量は、律
速とならないような十分な量である。即ち分析中のその
ような成分の濃度変化は見かけ上最終生成物の生成速度
に影響しない。
試剤の添加順序は酵素−ＳＢＭ共役体及びＦＢＭ被検体
に対して特異的ないずれか他のＳＢＭ（又はＳＢＭ被検
体に対する相補的ＦＢＭ）を添加し、次いで連結系の残
りの員及び最終生成物を生成するのに必要な成分を添加
することを含む。受体被検体の場合には、最初に標識さ
れた配位体を試料に添加し、次いで残りの結合員及び信
号発生系員、連結系員を添加することができる。
凝集体が生成するのに十分な時間の後、随時分析混合物
の一部分を固体担体、望ましくは吸湿性担体又は繊維質
担体に移すとができる。凝集体には、溶液中又は担体上
のいずれであれ、観察される信号の変化を与えるのに必
要な試剤例えば基質及び共因子を含んでなる現像剤（de
veloper）を添加する。
分析を行う場合、被検体を含む試料が入手する。この試
料は広い種類の起源に由来してよく、予じめ処理されて
いてもよい。その起源の例は、生理学的分泌液例えば血
液、血清、尿、リンパ、背髄液、膿、粘液などを含む。
他の細胞物質の試料は、組織培養、溶解物（lysate）、
ＤＮＡ，ＲＮＡ，膜などであつてよい。試料は生理学的
分泌液又は細胞である必要はなく、水、化学工程などの
汚染物を監視するためのものであつてもよい。試料の性
質並びに被検体の性質に依存して、試料は問題の被検体
に関して通常の種々の予備処理に供してあつてもよい。
競争的蛋白質結合分析又は免疫分析における種々の通常
の被検体以外に、例えば低分子量の有機化合物例えば薬
剤及び合成化学品、及び大分子例えば多糖類、ポリペプ
チド及び蛋白質、オリゴ及びポリヌクレオチドも結合員
として役立ちうる。ポリヌクレオチドは、ゲノム、エピ
ゾーム、プラスミド、ミトコンドリア、合成物などを含
めて多種類の起源に由来していてよい。ポリヌクレオチ
ドを含んでいる場合には、細胞の溶解、グラジエント遠
心分離、電気泳動などを含む種々の予備処理を行うこと
ができる。
配位体の例示には、米国特許第4,233,402号の第９欄６
５行から始まつて第１７欄２０行に終る記述が参考文献
として本明細書に引用される。
同様に、配位体同族体は米国特許第4,233,402号の第１
７欄２１行から第１８欄１２行までに記述されており、
これも参考文献として本明細書に引用される。
キツトに使用され且つ付与できる試剤は、酵素＋−ＳＢ
Ｍ結合体、酵素対の酵素＊を重合体凝集体に連結するた
めの或いは最終反応物を連結するための連結系、及び検
知しうる信号の生成に含まれる種々の成分を含んでなろ
う。
議論すべき第１の試剤は酵素−ＳＢＭ結合体である。酵
素は普通ＳＢＭに共有結合されているであろう。すでに
示したように、このＳＢＭは配位体、受体、普通には蛋
白質、例えば抗体、或いはポリヌクレオチド、即ちポリ
リボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドで
あり、被検体と同一の又は異なる糖であるであろう。ポ
リヌクレオチドＳＢＭは、被検体のシーケンス及び連結
鎖、望ましくは酵素のＳＢＭへの結合を可能にするその
ようなシーケンスに共有結合した延長鎖に対して相補的
なシーケンスを有しよう。結合は酵素及びＳＢＭ連結鎖
間で共有的であつてよく、或いは例えば抗体或いは酵素
に共有結合したポリヌクレオチドの延長シーケンスに相
補的な１つ又はいくつかのシーケンス或いは延長鎖に結
合した配位体に相補的な他の受体を用いることによつて
非共有的であつてよい。
この方法では、１つ又は複数の酵素が連結鎖に結合しう
る。いずれかの相補的シーケンスは普通少くとも約６、
しばしば１０又はそれ以上の塩基であるであろう。延長
シーケンスは少くとも１５、普通２０又はそれ以上の塩
基であり、便宜上単独重合体、簡便にはポリＧ及びポリ
Ｃである。
ＳＢＭ及び酵素の性質に依存して、ＳＢＭ当り１つより
も多い酵素が或いは酵素当り１つよりも多いＳＢＭが存
在していてよい。考慮すべき因子は、相対的な分子量、
酵素の性質、一方の又は他方の成分を成分のいずれかの
官能基上に複数で有していることの影響、などである。
普通酵素とＳＢＭの比は約0.1〜１０００：１又はそれ
以上で変化しうる。種々の連結法が技術的に良く知られ
ている。所望の比を与え且つＳＢＭ及び酵素の所望の活
性を保持させるために満足ないずれかの方法が使用しう
る。
２つの酵素を使用するときに酵素を選択する場合には、
酵素が対の１員である、即ち一方の酵素の基質が他方の
酵素の生成物であるという事実、そして最終的結果が分
析媒体中において示差的信号を与える生成物を分解又は
生成することであるという事実を考慮しなければならな
い。この結果を与える酵素系は多くが公知であり、米国
特許第4,233,402号に記述されている。
考慮しうる酵素の第１の種類は酸化還元酵素である。こ
れらの酵素はI.U.E.分類によるとクラス１である。この
種類で特に興味あるものは、1.1.1及び1.6の酵素群であ
り、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又はそのホ
スフエート（NAD及びNADP）が含まれる。これらの酵素
は補酵素NADH及びNADPHの還元形を生成するために使用
でき、またその逆も可能である。特異的な酵素は、デヒ
ドロゲナーゼ例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、グリ
セロールデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナー
ゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホス
フエートデヒドロゲナーゼ、マンニトール−１−ホスフ
エートデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホ
スフエート及びイソシトレートデヒドロゲナーゼを含
む。
酸化還元酵素種の他の酵素群は、過酸化水素を生成する
又は分解するものである。これらの酵素には、群1.11.1
のもの、例えばカタラーゼ及びペルオキシダーゼ、アミ
ノ酸オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクト
ースオキシダーゼ、ウリカーゼ、ポリフエノールオキシ
ダーゼ及びアスコルベートオキシダーゼがある。興味あ
る他の酸化還元酵素はジアホラーゼである。
他の問題の酵素群は、I.U.B.分類のクラス２の転化酵
素、特に準クラス2.7のホスフエートをアルコールに転
位する酵素、クラス2.7.1の例えばヘキソキナーゼであ
る。
他の問題の酵素はI.U.B分類のクラス３の加水分解酵素
である。特に興味あるものは、クラス3.2.1のグリコシ
ドヒドロラーゼ（グリコシダーゼ）及びクラス3.1.3の
ホスフアターゼである。特に興味あるものは、α−アミ
ラーゼ、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、アミログル
コシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アミログルコシダ
ーゼ、β−グルクロニダーゼ、酸ホスフアターゼ及びア
ルカリホスフアターゼである。
問題の酵素の２つの更なる群は、クラス４のリアーゼ及
びクラス５、特に準クラス5.3及び5.4の異性化酵素であ
り、後者はホスホグルコースイソメラーゼ、トリオース
ホスフエートイソメラーゼ及びホスホグルコースムター
ゼのような酵素を含む。
種々の酵素の作用様式の例示として、次に例を示す。第
１の例は酵化還元酵素特にＮＡＤをＮＡＤＨへ還元する
ものと関連する。これらの酵素は多くの場合デヒドロゲ
ナーゼであり、ヒドロキシル基がオキソ基に変わる。こ
の時ＮＡＤＨは多くの異なる酵素と組合わさつて検知し
うる生成物を生成することのできる中間体基質になる。
例えば第２の酵素はジホラーゼであつてよく、これは合
成基質例えば２，６−ジクロルフエノールインドフエノ
ール、メチレンブルー又はフエリシアン化カリウムと反
応しうる。ＮＡＤＨはグルコオキシダーゼ、アミノ酸オ
キシダーゼ及びジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼの
ような酵素を含むフラボ蛋白と一緒に使用することがで
きる。この時にはフラボ蛋白及びＮＡＤＨ及び酵素の生
成物、即ち過酸化水素を検出できる。
他に過酸化水素を生成する酸化還元酵素を使用すること
ができる。そのような酵素はグルコースオキシダーゼ、
チトクロームリダクターゼ、ウリカーゼなどを含む。こ
れらの酵素は過酸化水素と反応する酵素例えばペルオキ
シダーゼと組合せることができる。この場合には、過酸
化水素が中間体基質として反応する。過酸化水素＋ペル
オキシダーゼ＋ルミネツセンス材料、例えばルミノール
が化学発光反応を起こすために使用される。
加水分解酵素は、２つの別々の段階において２つの置換
基を加水分解的に除去することを必要とする化合物を用
いて有効に使用することができる。
例えば、螢光の信号を得るためには、１−ウンベリフエ
リル−β−ガラクトシド−ｂ−ホスフエートをウンベリ
フエロン（umbelliferone）に転化しなければならな
い。アルカリホスフアターゼを第１酵素として、１−ウ
ンベリフエリル−β−ガラクトシドを中間体基質とし
て、及びβ−ガラストシダーゼを第２酵素として用いる
ことにより、２つの標識の複合体における近さに依存し
て検知しうる螢光信号を得ることができる。検知しうる
信号を与えるウンベリフエロンの生成には両酵素が必須
である。
他に、加水分解酵素は続く酵素反応で使用しうる生成物
を生成する。例えば補酵素を官能基処理してその活性を
禁止し、加水分解酵素によつてその官能基を除去し、次
いで遊離の補酵素を第２の酵素と相互作用させて検知し
うる信号を得てもよい。
更に異性化酵素を用いて続く酵素反応に対する基質を生
成せしめてもよい。特に糖類の場合には、ホスフエート
をある位置から他の位置へ移すことによつてアルドース
及びケトースを異性化する。
酵素チヤンネリング系は断然好適であるけれど、第１の
酵素の生成物と反応することのできる反応物を用いて、
検知しうる信号の変化を得ることも可能である。例えば
ジスルフイドが重合しうる化合物、例えばコリネステラ
ーゼのような酵素を用いることによつて重合しうるビオ
チンに結合されているエルマン（Ellman）試薬の誘導体
を用いることができ、エルマン試剤と反応するチオ酢酸
を遊離してカルボキシニトロフエニルチオフエノキシド
を生成させるとよい。この後者は観察しうる信号を与え
る。他に過酸化水素を生成する酵素及び最終反応物とし
てこの過酸化水素を分解するキレート金属触媒を使用し
てもよい。この場合には、分析媒体中に存在する過酸化
水素を測定することになる。他の組合せは、ＮＡＤとデ
ヒドロゲナーゼを用いることを含む。この時に得られる
ＮＡＤＨは色を生成する又は分解する化合物、例えばメ
ルドラ・ブルー（Meldola blue）と反応しよう。他の組
合せも可能である。
次の試剤群は連結系である。連結系は互いに特異性を有
する、即ち特異的反応性を有する或いは同族体又は同類
体の配位体及び受体である共有的又は非共有的連結員の
組合せを含む。連結系は、酵素を重合させ且つＦＢＭと
酵素−ＳＢＭ結合体との間の複合体を酵素重合体と合体
させることにより、大複数の酵素を該複合体に結合せし
める。種々の連結技術、共有的及び非共有的、好ましく
は非共有的連結技術が使用できる。
この概念は、酵素の１つの殆んどを大きい凝集体に重合
させること及び他の酵素を、ＦＢＭ及び酵素−ＳＢＭ結
合体の複合体により、特にＦＢＭに結合させてそのよう
な凝集体と合体させることである。
連結系の員は多価であり、少なくとも２価である。この
多価は複数の反応性官能基の結果としてであつてよく、
これは分析の条件下に酵素−ＳＢＭ結合体の、ＦＢＭへ
の結合以外による重合体酵素凝集体への結合を実質的に
妨害する結合を生成するであろう。
他に非共有結合が使用できる。この時、同族体配位体及
び受体は、天然に存在する又は合成的に導入された酵素
上の複数のエピトープ又は決定要素位置及びこの酵素上
に存在する位置に対して特異的な複数の結合位置をもつ
多価の受体を有しせしめることによつて共重合体を生成
する。
重合の過程では、酵素が生長している重合体へ迅速に拡
散するために大きい酵素の凝集体が生成し、この間に酵
素のバルク溶液が実質的に消費される。更に、酵素の凝
集体が生成するにつれて、ＦＢＭに結合して酵素−ＳＢ
Ｍは凝集体に結合し、チヤンネリングに含まれる２つの
酵素を相互に極く近傍へもつていく。酵素の一方は好ま
しくは酵素−ＳＢＭ結合体の酵素に対して実質的にモル
過剰量である。
非共有的連結技術には、種々の受体を用いることができ
る。１つの系は標識の共通の決定要素位置を配位体
（「抗配位体」）に対する受体及びこれらの共通の決定
要素位置を認識する多価受体上に含んでいてよい。この
共通の決定要素位置は酵素標識の決定要素位置であるこ
とができ、酵素は受体に結合し且つ随時受体に共有結合
しない更なる酵素が添加される。或いは決定要素位置は
種々の化合物、特に低分子量の有機化合物を抗配位体に
及び酵素に共有結合させることによつて導入しうる。そ
のような化合物の例は、天然に産する受体アビジン（av
idin）と共に使用できるビオチン、チロキシンを結合す
るグロブリンと共に使用できるチロキシン、ジヒドロホ
レートリダクターゼと共に使用できるメゾトレキセート
（methotrexate）である。
他に、種々の宿主起原、例えばウサギ、ヒツジなどから
の抗体が使用でき、この時にはそのような宿主の免疫グ
ロブリンに対する抗体を用い、重合系として働かさせ
る。例えば酵素−ヒツジの抗配位体の結合体を用い、こ
れにウサギの抗（ヒツジの免疫グロブリン）を添加す
る。酵素−ＳＢＭ結合体がＳＢＭに対するヒツジの免疫
グロブリン以外の受体を合体する。
ポリヌクレオチドを含む場合、酵素−抗体結合体が使用
できる。この場合、抗体はＳＢＭ中に存在しない被検体
のエピトープに向き、例えば抗体は被検体の糖を有する
単一繊維ポリヌクレオチド、即ちＤＮＡ又はＲＮＡに向
く。この方法では、問題のシーケンス以外のシーケンス
は、問題のシーケンスと共に、被検体のヌクレオチドシ
ーケンス及び酵素−ＳＢＭ結合体間の複合体の周りに、
酵素の１つの大きい３次元凝集体を形成するであろう。
例えば興味あるＤＮＡシーケンスの場合、ＳＢＭはＤＮ
Ａ被検体に対して相補的なＲＮＡであり、また共有的に
或いはＲＮＡ−ＲＮＡ結合を通して或いはＲＮＡへの抗
ＲＮＡ結合により、同一の酵素の１つ又はそれ以上が結
合した延長されたポリリボヌクレオチドに連結するであ
ろう。酵素＊−抗ＤＮＡ結合体を添加することにより、
分析媒体中に存在するＤＮＡは酵素＊−抗ＤＮＡと共重
合してＤＮＡ被検体−（ＲＮＡ−酵素＋）交雑生成物を
含む大きい凝集体を形成することができ、酵素＊の多量
が酵素＋の極く近傍に位置するようになる。
共有結合に対しては、種々の反応性の組合せが使用でき
る。この組合せ物は、分析媒体中においてそれぞれ安定
である一方、予じめ決められた条件下に特異的及び優先
的に共有結合を形成するであろう。１つの反応物は１つ
の員上にあり、他の反応物は他の員上にあろう。組合せ
の例は活性ハロゲン例えばブロムアセチル、及びチオー
ル基、活性エチレン例えばマレイミジル及びチオール
基、チオール及びエルマン試剤誘導体、チオール及びビ
ス−アリール水銀ハライドなどを含む。１つ又は複数の
基が、ＦＢＭに対する相互補足的結合員に共有的に結合
していてよい。例えば、酵素をマレイミド基で官能基処
理し、抗体をメルカプタンで官能基処理することができ
る。酵素−ＳＢＭ共役体が相互作用しうる基、例えばチ
オール基を有する場合、これらは分析中のいずれかの反
応を防止するために保護することができる。ジスルフイ
ドの生成には、メルカプタンが使用でき、穏やかな酸化
剤例えば過酸化水素を添加すると良く或いは酵素反応の
生成物として存在してよい。
連結系を用いることにより、多量の酵素又は最終反応物
を分析媒体から除去でき、これらの信号発生系員を酵素
−ＳＢＭ結合体及び配位体の複合体の極く近傍に持つて
行くことができる。従つて水性媒体における拡散速度の
利点と共に、信号の高増巾を得ることができる。この方
法では、ＦＢＭに結合した酵素−ＳＢＭ結合体と結合し
てない酵素−ＳＢＭ結合体が分離せずに、水性媒体中に
おける信号の測定を可能にする安定な分散液を維持しな
がら、均一な分散凝集体が得られる。他に、信号発生に
必要な試剤を添加する前に、凝集体を孔性パツド又は
紙上で分離してもよい。
分析に使用される基質の残りの第３群は、信号発生系の
員、即ち分析媒体中で信号の変化を示す基質及び共因子
である。信号の変化は、吸光度の変化、螢光の変化、化
学発光又は電磁照射に及ぼす系の影響における他の変化
或いは他の性質、例えば電気化学的性質の変化の結果と
してであつてよい。多くの場合検知しうる信号は、紫外
又は可視光のいずれかの光の信号であるであろう。基質
は用いる特別な酵素と共に変化し、またすべてではない
が殆んどの酵素に対して基質は分光学的に又は螢光学的
に検知できる生成物を生成するものと記述され或いは一
般にそのために存在するから、これらの物質又はその誘
導体の多くは酵素の適当な組合せを与えることによつて
使用しうる。
いくつかの状態において、第１の酵素の生成物の補足剤
を付与することが望ましい。例えば過酸化水素が生成物
である場合、バルク媒体中における過酸化水素の濃度を
非常に低く又は無視できるようにするために、カタラー
ゼを媒体中に導入してもよい。
種々の補助的な物質、特に緩衝剤、安定剤、蛋白質、表
面活性剤、更に特に非イオン性表面活性剤などが使用さ
れよう。これらは分析媒体に特別な性質を与える、例え
ば所望のpHを維持する、非特異的結合を禁止する、凍結
乾燥した生成物としての又は水性媒体中での貯蔵中の試
剤に対して安定性を付与する、などの機能をすることが
できる。
望ましくは、試剤は、被検体の問題とする濃度範囲に亘
つて最適感度を付与するために特別な比を最適化したキ
ツトとして提供できる。キツトは、同一の容器に組合せ
て或いは異なる容器に別々に、酵素−ＳＢＭ結合体、連
結系の員、酵素基質及び共因子、最終反応物、適当なも
のとして上述の補助員、バルク因子（bulking factor）
などを含有するであろう。
次の実施例を、限定ではなくて例示の目的で提示する。
実施例１ ＨＲＰの抗体への結合 pH5.3の蒸留水２０ml中ＨＲＰ、（Sigmaロツト番号３１
Ｆ９６０５）１５０mgに、蒸留水中0.1Ｍ過ヨウ素酸ナ
トリウム４mlを添加し、混合物を室温で２０分間撹拌し
た。１Ｍグリセロール2.4mlを添加した後、溶液を室温
で３０分間撹拌し、次いでpH4.5の２ｍＭ酢酸ナトリウ
ム500mlずつに対してそれぞれ２時間、夜通し、そして
２時間透析した。
ポリリボースホスフエートに対する抗体の試料（３ml、
試料Ｎ−２、ロツト２８Ａ）を９mlまで希釈し、pH9.5
の３×１０ｍＭ炭酸ナトリウムに対して２時間、夜通
し、そして２時間透析した。
酸化されたＨＲＰ試料をpH6.0の0.1Ｍ燐酸ナトリウム中
に１：２０で希釈し（ＨＲＰ−403nmでの吸収に基づい
て1.072×１０−４Ｍ＝4.3mg／ml）、濃度３．１３mg／
mlの最終溶液にした。酸化されたＨＲＰ21.64ml及び上
述の抗体4.67mlから反応混合物を調製し、溶液を１０ｍ
Ｍ炭酸ナトウムで29.7mlに希釈し、次いでpHを0.1Ｎ水
酸化ナトリウムで9.6に調節した。次いで反応混合物を
室温で２時間撹拌し、続いて氷上で０℃まで冷却し、水
素化ホウ素ナトリウム1.5mlを添加した。反応はアルミ
ニウムホイルで光を遮断して行なつた。０℃で２時間撹
拌した後、反応混合物を１のＰＢＳ（１０mlＭ燐酸ナ
トリウム、pH7.2、0.15Ｍ ＮａＣｌ）に対して夜通し
透析した。
コロジオン装置を用いて共役体を3.5〜4.5mlまで濃縮し
た。次いでこの濃縮物を、2.5×９０cmのBiogel Ａ５
Ｍ、カラムのクロマトグラフイーに供し、画分を５mlず
つ集めた。流出液を280nmの透過光に対して監視し、蛋
白質を0.01％のナトリウムアジドを含むＰＢＳで流出さ
せた。カラムを20ml／時で操作し、画分３９〜４８、４
９〜５７、５８〜６１及び６２〜６６を集め、それぞれ
プール（pool）１〜４を得た。
実施例２ グルコースオキシダーゼの抗ＰＲＰへの共役 グルコースオキシダーゼ（４０ml、ロツト番号６１Ｆ９
００７）を、0.3Ｍ炭酸水素ナトリウムそれぞれ１に
対して透析した（３時間、夜通し、３時間）。（グルコ
ースオキシダーゼの初期濃度は5.3mg／ml）であつた。
透析の完了後、0.2ml部分を除去し、残りを１−フルオ
ル−２，４−ジニトロベンゼンで処理した。pH8.23の残
りの容量３５mlを無水エタノール中１−フルオル−２，
４−ジニトロベンゼンの１％（Ｗ／Ｖ）溶液3.5mlと一
緒にした。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を0.3
Ｍ炭酸水素ナトリウム１に対して夜通し透析し、翌日
新しい炭酸水素ナトリウム１で透析を３時間繰返し
た。次いでコロジオン装置を用いて試料を約２０mlまで
濃縮した。
この濃縮した、官能基の保護されたグルコースオキシダ
ーゼに、蒸留水中0.4Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムを添加
し、この溶液を室温で２０分間撹拌した。次いでこの反
応混合物に水中１Ｍグリセロール1.1mlを添加し、溶液
を更に１時間室温で撹拌した。この溶液をpH9.6の３×
１０ｍＭ炭酸ナトリウムに対して透析し（３時間、夜通
し、３時間、それぞれ仕込み量６００ml）、容量27.5ml
の残留物を得た。
抗ＰＲＰ（ニユーヨーク州保健局ロツト番号２８Ａ、1.
2ml）をpH9.6の１０ｍＭ炭酸ナトリウムで3.6mlまで希
釈し、この希釈した試料をpH9.6の３×１０ｍＭ炭酸ナ
トリウムに対して透析し（３時間、夜通し、３時間、そ
れぞれ仕込み量３００ml）、3.2mlの最終容量を残し
た。
２８０ｎｍの紫外線吸収によつて測定した濃度は28.7mg
／mlであつた。
官能基を保護したグルコースオキシダーゼ27.5mlに、上
に調製した抗体試料を添加し、この溶液を室温で１４時
間撹拌し、次いで氷で０℃まで冷却した。次いでこの反
応混合物に、溶液を光から遮断しながら蒸留水中４mg／
ml水素化ホウ素ナトリウムを1.55ml添加し、室温で２時
間撹拌した。この時期の終りに反応混合物をＰＢＳ１
に対し、室温で３時間透析した。
ＰＢＳ溶液を、コロジオン装置を用いて５mlまで濃縮
し、次いで前述の如く2.5×９０cmのBiogel Ａ５Ｍカ
ラムクロマトグラフイーにかけ、２８０nm及び４５０nm
で画分を監視しながら４５〜４５、４６〜５０、５１〜
５６、５７〜６０及び６１〜６３の画分を集め、それぞ
れプール１〜５とした。
本発明の技術の感度及び効果を示すために、次の研究を
行なつた。グルコースオキシダーゼ共役体（実施例２）
のプールを１：４０で及びＨＲＰ共役体（実施例１）の
プール１を１：３２で希釈することによつて酵素試剤を
準備した。用いた緩衝剤はＰＢＳ−Tween（１０ｍＭ燐
酸ナトリウム、pH7.2、１５０ｍＭNaCl、0.05％w/vTwee
n２０）であつた。１１ミクロ力価（microtiter）の井
戸に、酵素結合体それぞれ２μ及び２倍の希釈で連続
的に希釈した、５００〜0.5ng／mlの範囲のＰＲＰ １
０μを添加し、１１番目の井戸を空試験に使用した。
次いでプレートで覆い、３７℃に１０分間保温した。こ
の混合物にＰＢＳ−Tween緩衝剤中においてアミノ改変
グルコースオキシダーゼに対し１：５０で希釈されたヒ
ツジの抗体１０μを添加した。次いで混合物を振とう
しながら３７℃に６０分間保温し、次いで現像剤溶液
（グルコース２５０ｍＭ、ABTS（2,2′−アジノ−ジ−
３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）１０ｍＭ、オ
バルブミン0.8mg／ml及びカタラーゼ１８５μｇ／ml）
２２０μを添加した。この混合物を３７℃で１１分間
振とうし、アーテク（Artek）垂直ビーム・ミクロ力価
板読取機により４１５nmで読んだ。読みの結果を次の表
に示す。
第２の分析においては上述の方法を改良した。前述と同
一の試剤及び材料を用いることにより、２つの共役体及
びＰＲＰの分析物を１０×７５mmのガラス管中に置き、
次いでヒツジの抗（アミン改変のグルコースオキシダー
ゼ）を添加し、この管を振とうしながら更に３０分間３
７℃に保温した。
この時間の終りに、各の管にＰＢＳ−Tween緩衝剤２７
０μを添加し、管をかき混ぜ、管の内容物１００μ
を取り出して、第２の大きなガラスフイルターパツド上
に置かられたガラス紙（glass filter paper）の８×
８mmパツドに滴下した。次いでこのスポツト上に、前述
の現像剤溶液３mlを添加し、結合してない結合体を洗い
出し、そして有色生成物の現像を開始させた。各パツド
を2.5分間現像し、次いでＰＢＳ−Tween緩衝剤２７０μ
で洗浄し、圧刀をかけて乾燥した。この結果0.5ng／m
lの濃度、即ち用いた最小濃度が検知できた。しかしな
がら、パツドの洗浄及び圧縮乾燥後、しばらくの間現像
を続けると、空試験においても均一な色が現われた。長
期間放置した後でさえ、２５ng／mlのＰＲＰとそれのな
いものとは容易に区別することができた。
抗（アミノ改変グルコースオキシダーゼ）との保温が６
０分間であり、現像が４４０秒であるという以外上述の
実験を繰返した。同様の結果を得た。
上述の結果から、本方法はいろいろな具合に行なうこと
のできる迅速且つ敏感な分析法を提供する、ということ
が明白である。かなり簡単な手順により、非常に低濃度
の被検体が検知できる。特に高濃度の酵素が第２の酵素
に対する基質を与える場合、一方の酵素を、他の酵素に
比べて高局在化濃度で提供する連結手段を用いることに
よつて検知しうる生成物の生成速度を非常に高めること
ができる。従つてバツクグランドの信号と比べて強い信
号を発生するために非常に低濃度の被検体も検出でき
る。分光計又は反射計のような装置を用いれば定量的結
果が得られ、一方特に、比較するための対照を用いれば
肉眼で半定量的又は定性的結果を得ることもできる。
以上明瞭に理解する目的で、本発明を例示及び実施例に
よつていくらか詳細に記述してきたけれど、ある種の変
化及び改変が特許請求の範囲内で行いうることは明白で
あろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エドウイン・フイツシヤ−・ウルマン アメリカ合衆国カリフオルニア州94025ア サ−トン・セルビ−レイン135 (56)参考文献 特開 昭54−136896（ＪＰ，Ａ)

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】被検体を含む疑いのある試料中における該
    被検体の存在を検知する方法であって、該被検体が第１
    及び第２の結合員（それぞれ“ＦＢＭ”および“ＳＢ
    Ｍ”）からなる特異的結合対の１員であるとき、 その検知法がＳＢＭに結合して酵素＋−ＳＢＭ結合体を
    与える酵素、すなわち酵素＋、酵素基質及び最終反応物
    を含んでなるチャンネリング信号発生系を使用し、但し
    該最終反応物が（１）１つの酵素の基質が他の酵素の生
    成物であるということによって２つの酵素が関係づけら
    れている場合の他の酵素、即ち酵素＊であるか或いは
    （２）該酵素＋の生成物と反応する化合物であり、ここ
    で該酵素＋の酵素＊又は該化合物との反応が該試料中の
    被検体の量に関連した観察し得る信号の変化をもたら
    し、そして 連結系が、酵素＋−ＳＢＭ結合体のＦＢＭへの結合の機
    能としてのみ酵素＋を重合体内に合体させる最終反応物
    の重合を行なうことによって、重合体チャンネリング凝
    集体を生成させ、そして上記方法は、水性分析媒体中に
    おいて、 （ａ）該試料、及び （ｂ）該ＦＢＭ及び酵素＋−ＳＢＭ結合体間に、存在す
    る被検体の量に関連して複合体を生成させるための該酵
    素＋−ＳＢＭ結合体、及び該被検体がＳＢＭのときには
    ＦＢＭ、次いで、 （ｃ）該最終反応物及び酵素＋−ＳＢＭ結合体のＦＢＭ
    との複合体の重合体チャンネリング凝集体を生成する該
    連結系のいずれかの員、および （ｄ）該重合体チャンネリング凝集体中の該信号発生系
    の該員のチャンネリングの結果として、検知しうる信号
    の変化をもたらす最終生成物を生成する信号発生系の残
    りの員、 を組合せ、そして 該検知しうる信号を、被検体を公知の量で有する分析媒
    体中で観察される検知しうる信号と比較する、 ことを含んでなる、 被検体を含む疑いのある試料中における該被検体の存在
    を検知する方法。
  2. 【請求項２】（１）信号発生系の員である２つの酵素、
    酵素＋及び酵素＊を用い、１つの酵素の生成物が他の酵
    素の基質であり、そして酵素＋がＳＢＭに結合して酵素
    ＋−ＳＢＭ結合体を与えるという酵素チャンネリング、
    （２）該酵素＊の重合及び酵素＋−ＳＢＭ結合体の複合
    体のＦＢＭへの結合によって酵素＋を合体させることに
    より重合体チャンネリング凝集体を生成させる連結系、
    そして（３）該重合体チャンネリング凝集体の生成の結
    果として、存在する被検体の量に関連して検知しうる信
    号の変化をもたらす、共因子を含む該酵素の基質を含ん
    でなる信号発生系の残りの員、を使用し、なお （ａ）試料、及び （ｂ）該ＦＢＭ及び該酵素＋−ＳＢＭ結合体間に、存在
    する被検体の量に関連して複合体を生成させるための該
    酵素＋−ＳＢＭ結合体、及び該被検体がＳＢＭのときに
    はＦＢＭ、次いで、 （ｃ）酵素＊及び酵素＋−ＳＢＭ結合体のＦＢＭとの複
    合体の重合体チャンネリング凝集体を生成する該連結系
    の員、そして （ｄ）該重合体チャンネリング凝集体中の該信号発生系
    の該員のチャンネリングの結果として、検知しうる信号
    の変化をもたらす最終生成物を生成する信号発生系の残
    りの員、 を水性分析媒体中で組合せ、そして 該検知しうる信号を、被検体を公知の量で有する分析媒
    体中で観察される検知しうる信号と比較する、 ことを含んでなる特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】該ＦＢＭが配位体であり、該ＳＢＭが受体
    である特許請求の範囲第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】該ＳＢＭが抗体である特許請求の範囲第３
    項記載の方法。
  5. 【請求項５】該連結系が酵素＊−ＳＢＭ結合体及び抗酵
    素＊を含んでなる特許請求の範囲第１、２、３又は４項
    記載のいずれかの方法。
  6. 【請求項６】該連結系が改変された酵素＊−ＳＢＭ結合
    体を含んでなり、但し該改変が配立体の、該配位体に対
    する該結合体及び多価受体への結合である特許請求の範
    囲第２、３又は４項記載のいずれかの方法。
  7. 【請求項７】該酵素が酸化還元酵素である特許請求の範
    囲第２項記載の方法。
  8. 【請求項８】該信号発生系を該重合体チャンネリング凝
    集体に添加する前に、該分析媒体を多孔質坦体に移す特
    許請求の範囲第２項記載の方法。
  9. 【請求項９】該連結系の非酵素的員の添加前に、該試料
    及び該酵素＋−ＳＢＭ結合体を該分析媒体中において一
    緒に保温する特許請求の範囲第２項記載の方法。
  10. 【請求項１０】該被検体が配位体及び受体からなる特異
    的結合対の１員である時、 （１）信号発生系の員である２つの酸化還元酵素、酵素
    ＋及び酵素＊を用い、１つの酵素の生成物が他の酵素の
    基質であり、そして酵素＋が第１の受体の配位体に結合
    して第１の受体に結合した酵素＋−第１の受体の結合体
    で存在するという酵素チャンネリング、（２）天然に産
    する決定要素位置を有し又はそのような位置が合成的に
    導入されている第１の受体に結合した酵素＊、酵素＊−
    第１の受体の結合体、及び酵素＊の重合及び酵素＋−第
    １の受体の結合体の複合体の配位体への結合による酵素
    ＋の合体を起こさせて重合体チャンネリング凝集体を生
    成する該決定要素位置に対する多価の第２の受体、を含
    んでなる酵素＊の重合を与える連結系、そして（３）該
    重合体チャンネリング凝集体の生成の結果として存在す
    る被検体の量に関連して検知しうる信号の変化を与える
    最終生成物の生成をもたらす共因子を含む該酵素の基質
    を含んでなる信号発生系、を使用し、なお （ａ）該試料、及び （ｂ）酵素＋−第１の受体及び配位体の複合体を生成さ
    せるための該酵素＋−１の受体の結合体、及び該被検体
    が受体であるときには配位体、次いで、 （ｃ）酵素＊を重合させ且つ酵素＋を該複合体の一部と
    して合体させるという酵素＊を重合させるための酵素＊
    −第１の受体及び第２の受体、 （ｄ）該酵素のチャンネリングと組合さって、存在する
    被検体の量に関連した量を検知しうる信号を与える最終
    生成物を生成する信号発生系の員、を水性媒体中で組合
    せ、そして 該検知しうる信号を、被検体を公知の量で有する分析媒
    体中で観察される検知しうる信号と比較する、 ことを含んでなる特許請求の範囲第１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】更なる酵素＊を該連結系の一員として添
    加する特許請求の範囲第１０項記載の方法。
  12. 【請求項１２】該酵素の１つがグルコースオキシダーゼ
    であり、該酵素の他が西洋ワサビのペルオキシダーゼで
    ある特許請求の範囲第１０又は１１項記載のいずれかの
    方法
  13. 【請求項１３】酵素＋及び酵素＊が、一方の基質が他方
    の生成物であることによって関連づけられている場合
    に、酵素＋−ＳＢＭ結合体、及び１つの成分としての酵
    素＊、及び酵素＊を重合させるための手段を含む連結系
    を含んでなる試料中における被検体の存在を検知するた
    めのキット。
  14. 【請求項１４】該連結系が酵素＊−受体の結合体及び酵
    素＊のための受体又は酵素＊に結合した配位体を含んで
    なる特許請求の範囲第１３項記載のキット。
JP59046614A 1983-03-14 1984-03-13 被検体の検知法 Expired - Lifetime JPH0643997B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US474906 1983-03-14
US06/474,906 US4687735A (en) 1983-03-14 1983-03-14 Enzymatic poly-reactant channeling binding assay

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS59178362A JPS59178362A (ja) 1984-10-09
JPH0643997B2 true JPH0643997B2 (ja) 1994-06-08

Family

ID=23885435

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP59046614A Expired - Lifetime JPH0643997B2 (ja) 1983-03-14 1984-03-13 被検体の検知法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US4687735A (ja)
EP (1) EP0122059B1 (ja)
JP (1) JPH0643997B2 (ja)
AT (1) ATE40926T1 (ja)
AU (1) AU575315B2 (ja)
CA (1) CA1230289A (ja)
DE (1) DE3476834D1 (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4772550A (en) * 1986-02-10 1988-09-20 Miles Inc. Heterogeneous specific binding assay employing an aggregatable binding reagent
AU7399487A (en) * 1986-05-22 1987-12-22 Unilever Plc Solid phase immunoassay method
EP0310361A3 (en) * 1987-09-30 1989-05-24 Beckman Instruments, Inc. Tridentate conjugate and method of use thereof
US4943525A (en) * 1987-11-02 1990-07-24 Bioventures, Inc. Simultaneous immunoassay for the determination of antigens and antibodies
IT1235349B (it) * 1988-12-23 1992-06-30 Biodata Spa Saggio immunologico per determinazioni in fase omogenea
US5196306A (en) * 1989-03-29 1993-03-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection or quantitation of an analyte using an analyte dependent enzyme activation system
WO1991015767A1 (en) * 1990-04-06 1991-10-17 University Of Florida Liquid-phase immunodiagnostic assay
US5998220A (en) 1991-05-29 1999-12-07 Beckman Coulter, Inc. Opposable-element assay devices, kits, and methods employing them
US5877028A (en) 1991-05-29 1999-03-02 Smithkline Diagnostics, Inc. Immunochromatographic assay device
US6168956B1 (en) 1991-05-29 2001-01-02 Beckman Coulter, Inc. Multiple component chromatographic assay device
US5391272A (en) * 1992-03-06 1995-02-21 Andcare, Inc. Electrochemical immunoassay methods
AU2001296830A1 (en) * 2000-10-14 2002-04-29 Alex M. Saunders Ligand based solution assay for low concentration analytes
US8956859B1 (en) 2010-08-13 2015-02-17 Aviex Technologies Llc Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
AU531777B2 (en) * 1978-04-05 1983-09-08 Syva Co. Label/solid conjugate immunoassay system
US4281061A (en) * 1979-07-27 1981-07-28 Syva Company Double antibody for enhanced sensitivity in immunoassay
US4299916A (en) * 1979-12-26 1981-11-10 Syva Company Preferential signal production on a surface in immunoassays
US4391904A (en) * 1979-12-26 1983-07-05 Syva Company Test strip kits in immunoassays and compositions therein
DE3006709A1 (de) * 1980-02-22 1981-08-27 Hans A. Dipl.-Chem. Dr. 8000 München Thoma Homogenes verfahren zur kompetitiven bestimmung von liganden
DE3362399D1 (en) * 1982-05-24 1986-04-10 Miles Lab Improved homogeneous binding assay method and reagent system, test kit and test device therefor
JPH07108168B2 (ja) * 1992-10-21 1995-11-22 オリオン機械株式会社 ストールにおける出口ゲートの開閉機構

Also Published As

Publication number Publication date
AU2556184A (en) 1984-09-20
US4687735A (en) 1987-08-18
EP0122059A3 (en) 1985-07-03
DE3476834D1 (en) 1989-03-30
JPS59178362A (ja) 1984-10-09
AU575315B2 (en) 1988-07-28
ATE40926T1 (de) 1989-03-15
EP0122059A2 (en) 1984-10-17
EP0122059B1 (en) 1989-02-22
CA1230289A (en) 1987-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
USRE49466E1 (en) Solution phase homogeneous assays
US4780421A (en) Cleavable labels for use in binding assays
KR100225682B1 (ko) 올리고머화된 수용체를 사용한 결정 방법
US4663278A (en) Agglutination dependent enzyme channeling immunoassay
EP0154884A2 (en) Nucleic acid-protein conjugate
WO1981001057A1 (en) Assay method using enzymes as labelling substances
JPS6337348B2 (ja)
JPH0145027B2 (ja)
JPH0643997B2 (ja) 被検体の検知法
JPH0716438B2 (ja) 化学ルミネッセンス分析でのオキシダ−ゼ酵素系の使用
JPS6175260A (ja) 増幅された続取りおよび気相検出を伴う結合アツセイ
EP0075379B1 (en) Competitive protein binding assay on a surface
US5035997A (en) Redox polymerization diagnostic test composition and method for immunoassay and nuclei acid assay
Lv et al. Glycan-matchmade multivalent decoration of enzyme labels for amplified electrochemical detection of glycoproteins
RU2102759C1 (ru) Способ обнаружения или количественного определения аналита в образце
Zeng et al. Nonlinear hybridization chain reaction-based flow cytometric immunoassay for the detection of prostate specific antigen
JP3847983B2 (ja) 免疫学的分析用試薬、免疫学的分析方法及び免疫学的分析用キット
EP0313274A1 (en) Enzyme assay method
EP1634074B1 (en) Hydrolytic substrates for an analyte-dependent enzyme activation system
JP4004230B2 (ja) 架橋アビジン含有新規複合体、架橋アビジンを用いる分析方法、並びに分析用試薬及びキット
JPS6017360A (ja) 特異結合剤を使用する検定方法
JP2007512543A (ja) ホモジニアスな検出方法
JPWO2000028326A1 (ja) 架橋アビジン含有新規複合体、架橋アビジンを用いる分析方法、並びに分析用試薬及びキット
JP2003028874A (ja) ２段階酵素反応を用いた測定対象物質の測定法
JPH07118291A (ja) 核酸と免疫化学的活性物質との複合体、その製法およびその複合体を使用する免疫化学的測定試薬