JPH0646887A - バイオセンサー - Google Patents
バイオセンサーInfo
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- JPH0646887A JPH0646887A JP5087967A JP8796793A JPH0646887A JP H0646887 A JPH0646887 A JP H0646887A JP 5087967 A JP5087967 A JP 5087967A JP 8796793 A JP8796793 A JP 8796793A JP H0646887 A JPH0646887 A JP H0646887A
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- enzyme
- polyether
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/002—Electrode membranes
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- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
- Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
-
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 技術的に簡単で機能安定性がよく適正価格で
製造できる高分子と生化学物質からなる選択的識別組織
をもったバイオセンサーを提供する。 【構成】 光硬化性のエポキシ官能基を有するポリエー
テルを担体物上に塗布し、高エネルギーの光照射によっ
て高分子マトリックスに網状化した後、被膜を生化学物
質の水溶液で処理する。生化学物質はエポキシ基と反応
して高分子マトリックス中に固定化され安定化される。
製造できる高分子と生化学物質からなる選択的識別組織
をもったバイオセンサーを提供する。 【構成】 光硬化性のエポキシ官能基を有するポリエー
テルを担体物上に塗布し、高エネルギーの光照射によっ
て高分子マトリックスに網状化した後、被膜を生化学物
質の水溶液で処理する。生化学物質はエポキシ基と反応
して高分子マトリックス中に固定化され安定化される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は高分子と生化学物質特に
酵素とからなる選択的識別組織を有するバイオセンサー
に関する。
酵素とからなる選択的識別組織を有するバイオセンサー
に関する。
【０００２】
【従来の技術】バイオセンサーは生体識別組織をもった
化学センサーである。これらの識別組織はセンサーの表
面またはその上部にある薄層中に固定化された酵素、抗
体、レクチネン、ホルモン受容体のような生物活性物質
から作られている。識別過程でセンサーの表面ないし被
膜中で、特徴化すべきガス状または液状の媒体との相互
作用によって変化が起こるが、その変化は電気的、光学
的、機械的、音響ないし熱量等の測定方法で評価するこ
とができる。電子データ検出装置並びに評価装置ではこ
のため活性表面ないし被膜は、信号変換器即ち電子評価
装置に接続されたトランスデューサーと直接空間的に連
結されて、信号発生器となっている。
化学センサーである。これらの識別組織はセンサーの表
面またはその上部にある薄層中に固定化された酵素、抗
体、レクチネン、ホルモン受容体のような生物活性物質
から作られている。識別過程でセンサーの表面ないし被
膜中で、特徴化すべきガス状または液状の媒体との相互
作用によって変化が起こるが、その変化は電気的、光学
的、機械的、音響ないし熱量等の測定方法で評価するこ
とができる。電子データ検出装置並びに評価装置ではこ
のため活性表面ないし被膜は、信号変換器即ち電子評価
装置に接続されたトランスデューサーと直接空間的に連
結されて、信号発生器となっている。
【０００３】センサー全体の信頼性は、バイオセンサー
の敏感な被膜中で発信される信号の分類能力と再現性に
かかっている。それは被膜が高い選択性と鋭敏性と並ん
で特にヒステレシスやドリフトの無い機能、化学的、生
物的安定性並びに耐汚染性を示さなければならないこと
を意味する。特に工業的に使用するには更に操作の容易
さ、集積能力および長時間安定性の優れたできるだけ測
定／再生所要時間の短いことが要求される。その際被膜
の形成は製造技術上能率が良く自動化できる方法によっ
て、できるだけ簡単で再現性がよく、適正な経費でかつ
センサーを作る製造過程に組み込めるものでなければな
らない。
の敏感な被膜中で発信される信号の分類能力と再現性に
かかっている。それは被膜が高い選択性と鋭敏性と並ん
で特にヒステレシスやドリフトの無い機能、化学的、生
物的安定性並びに耐汚染性を示さなければならないこと
を意味する。特に工業的に使用するには更に操作の容易
さ、集積能力および長時間安定性の優れたできるだけ測
定／再生所要時間の短いことが要求される。その際被膜
の形成は製造技術上能率が良く自動化できる方法によっ
て、できるだけ簡単で再現性がよく、適正な経費でかつ
センサーを作る製造過程に組み込めるものでなければな
らない。
【０００４】今日まで酵素反応が基本となるセンサーだ
けが実用上の価値をもっていた。このような反応におい
てはＨ+ 、Ｏ2 、Ｈ2 Ｏ2 、ＣＯ2 およびＮＨ3 のよう
な簡単に検知できる生成物が発生ないし消滅する状態が
利用される。選択性と鋭敏性に関しては、酵素反応が十
分にその要求を満たしてくれる。しかしながら酵素がそ
の活性を消失することなく、できるだけ薄い識別被膜の
中で、検知すべき物質に速やかに近ずき易く、毒物並び
に生化学的有害物質に耐え、できるだけ長時間機能が維
持されるように固定化することには困難がある。
けが実用上の価値をもっていた。このような反応におい
てはＨ+ 、Ｏ2 、Ｈ2 Ｏ2 、ＣＯ2 およびＮＨ3 のよう
な簡単に検知できる生成物が発生ないし消滅する状態が
利用される。選択性と鋭敏性に関しては、酵素反応が十
分にその要求を満たしてくれる。しかしながら酵素がそ
の活性を消失することなく、できるだけ薄い識別被膜の
中で、検知すべき物質に速やかに近ずき易く、毒物並び
に生化学的有害物質に耐え、できるだけ長時間機能が維
持されるように固定化することには困難がある。
【０００５】酵素を固定化するには今まで次の方法が利
用されている。 −担体表面で及着させる。 −担体表面でイオン結合させる。 −担体表面で共有結合させる。 −高分子被膜に吸収させる。 −高分子網状構造中に封じ込める（マトリックス封入、
マイクロカプセル化）。 −薄膜で被覆して封じ込める（マイクロカプセル化）。 −２または多官能性モノマーと交互結合ないし共重合さ
せる。
用されている。 −担体表面で及着させる。 −担体表面でイオン結合させる。 −担体表面で共有結合させる。 −高分子被膜に吸収させる。 −高分子網状構造中に封じ込める（マトリックス封入、
マイクロカプセル化）。 −薄膜で被覆して封じ込める（マイクロカプセル化）。 −２または多官能性モノマーと交互結合ないし共重合さ
せる。
【０００６】しかし酵素の固定化に関する広範囲の文献
から読み取れるようにこれらの方法はすべて、工業的セ
ンサーの製作にあまり魅力的に見えない欠点をもってい
る（例えばＷ．Ｈａｒｔｍｅｉｅｒ“Ｉｍｍｏｂｉｌｉ
ｓｉｅｒｔｅ Ｂｉｏｋａｔａｌｙｓａｔｏｒｅｎ”Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄ
ｅｌｂｅｒｇ、１９８６、２３〜５１頁並びにＪ．Ｗｏ
ｏｄｗａｒｄ“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ ｃｅｌｌｓ
ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆ
ｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、１９８５、３〜
５４頁参照）。
から読み取れるようにこれらの方法はすべて、工業的セ
ンサーの製作にあまり魅力的に見えない欠点をもってい
る（例えばＷ．Ｈａｒｔｍｅｉｅｒ“Ｉｍｍｏｂｉｌｉ
ｓｉｅｒｔｅ Ｂｉｏｋａｔａｌｙｓａｔｏｒｅｎ”Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄ
ｅｌｂｅｒｇ、１９８６、２３〜５１頁並びにＪ．Ｗｏ
ｏｄｗａｒｄ“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ ｃｅｌｌｓ
ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆ
ｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、１９８５、３〜
５４頁参照）。
【０００７】例えば表面に酵素を吸着させたりイオン結
合させたりすると限られた使用幅に比較的不安定な組織
をつくりだす。酵素に接触している溶液のｐＨ値の変化
とイオン強度の変化または他の物質の存在は既に表面に
結合している酵素を駆逐し、同時に識別組織の活性損失
につながる。また高分子被膜に吸収させるには、多くの
場合軟質のポリ塩化ビニルが使用され（例えば“Ｓｅｎ
ｓｏｒｓ ａｎｄＡｃｔｕａｔｏｒｓ”１８巻（１９８
９）３２９〜３３６頁および“Ｂｅｒ． Ｂｕｎｓｅｎ
ｇｅｓ Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．”９２巻（１９８８）１
４２３〜１４２６頁参照）、比較的不安定な組織ができ
あがる。酵素の移動と抽出は恒常的な活性の減少（ドリ
フト）を起こし、センサーの寿命を制限する。
合させたりすると限られた使用幅に比較的不安定な組織
をつくりだす。酵素に接触している溶液のｐＨ値の変化
とイオン強度の変化または他の物質の存在は既に表面に
結合している酵素を駆逐し、同時に識別組織の活性損失
につながる。また高分子被膜に吸収させるには、多くの
場合軟質のポリ塩化ビニルが使用され（例えば“Ｓｅｎ
ｓｏｒｓ ａｎｄＡｃｔｕａｔｏｒｓ”１８巻（１９８
９）３２９〜３３６頁および“Ｂｅｒ． Ｂｕｎｓｅｎ
ｇｅｓ Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．”９２巻（１９８８）１
４２３〜１４２６頁参照）、比較的不安定な組織ができ
あがる。酵素の移動と抽出は恒常的な活性の減少（ドリ
フト）を起こし、センサーの寿命を制限する。
【０００８】著しく安定な組織は、酵素を担体表面に共
有結合で結合させ、交互網状化ないし共重合により不溶
性にするかまたはマイクロカプセル化かマクロカプセル
化することによって固定化するときに作られる。共有結
合を作り、交互網状化させるために、酵素の側からは、
アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、およびメ
ルカプト基が供され。担体物質にはガラスのような無機
質材料も、天然または合成の有機高分子も使用できる。
その際担体物質はイソシアネート、イソチオシアネー
ト、酸クロライドおよびエポキシド基のような活性基を
含有することが前提条件である。少量の活性基例えばカ
ルボキシル基はカルボジイミドまたはアジド法によっ
て、ヒドロキシル基はブロムシアン法によって、アミノ
基はイソチオシアネートまたはアゾ法によって、それぞ
れ活性化される。なかでもアクリルおよびメタアクリル
酸誘導体を基にして、ジニトロフルオロフェニル、イソ
チオシアネート、オキシランまたは酸無水物基との数多
くの活性共重合物を製造することができる。例えばオキ
シラン基を有するポリアクリルアミド並びに酢酸ビニル
およびジビニルエチレン尿素を基にしたオキシラン基と
の変性共重合物は市販されている。
有結合で結合させ、交互網状化ないし共重合により不溶
性にするかまたはマイクロカプセル化かマクロカプセル
化することによって固定化するときに作られる。共有結
合を作り、交互網状化させるために、酵素の側からは、
アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、およびメ
ルカプト基が供され。担体物質にはガラスのような無機
質材料も、天然または合成の有機高分子も使用できる。
その際担体物質はイソシアネート、イソチオシアネー
ト、酸クロライドおよびエポキシド基のような活性基を
含有することが前提条件である。少量の活性基例えばカ
ルボキシル基はカルボジイミドまたはアジド法によっ
て、ヒドロキシル基はブロムシアン法によって、アミノ
基はイソチオシアネートまたはアゾ法によって、それぞ
れ活性化される。なかでもアクリルおよびメタアクリル
酸誘導体を基にして、ジニトロフルオロフェニル、イソ
チオシアネート、オキシランまたは酸無水物基との数多
くの活性共重合物を製造することができる。例えばオキ
シラン基を有するポリアクリルアミド並びに酢酸ビニル
およびジビニルエチレン尿素を基にしたオキシラン基と
の変性共重合物は市販されている。
【０００９】交互網状化ないし共重合による固定化は共
有結合の特別の形である。この方法で酵素分子と重合物
との間に付加的に共重合が起こる場合には、酵素分子と
グルタールジアルデヒドのような２または多官能基を有
するモノマーとの間に共有結合が形成される。このよう
にして高分子の不溶解凝集体ができる。交互網状化は固
定化方法として一般に他の方法と組み合わせて例えば吸
着と吸収とを組み合せて遂行される。この際酵素分子は
先ず担体の表面に吸着されるかその上層被膜に中に吸収
され、続いて相互に網状化される。
有結合の特別の形である。この方法で酵素分子と重合物
との間に付加的に共重合が起こる場合には、酵素分子と
グルタールジアルデヒドのような２または多官能基を有
するモノマーとの間に共有結合が形成される。このよう
にして高分子の不溶解凝集体ができる。交互網状化は固
定化方法として一般に他の方法と組み合わせて例えば吸
着と吸収とを組み合せて遂行される。この際酵素分子は
先ず担体の表面に吸着されるかその上層被膜に中に吸収
され、続いて相互に網状化される。
【００１０】共有結合による固定化の基本的な欠点は、
生体触媒に強力な負担がかかることである。ｐＨ値の強
力な変動を伴い、有機溶剤を使用しなければならず、ま
た低分子の活性物質との反応が生じる部分的に粗い固定
化処理は、常に強力な構造変化を起こし、同時にこの種
の束縛酵素の活性化喪失をもたらす。
生体触媒に強力な負担がかかることである。ｐＨ値の強
力な変動を伴い、有機溶剤を使用しなければならず、ま
た低分子の活性物質との反応が生じる部分的に粗い固定
化処理は、常に強力な構造変化を起こし、同時にこの種
の束縛酵素の活性化喪失をもたらす。
【００１１】封じ込みによって固定化する場合即ちマイ
クロまたはマクロカプセルの場合には、酵素自体は溶解
しなくなることはないが、その反応範囲が半透過性の高
分子ないし高分子被膜によって制約される。この様にし
て封じ込まれた酵素の機能性を現す前提条件は、酵素自
体が抑留されている間、基質および生成物が被覆物を透
過できることである。マトリックスの封じ込みには、酵
素の耐久性のある固定化には確かに目の粗すぎるアルギ
ン酸塩、カラゲナン、ペクチン、寒天およびゼラチンの
ような天然高分子と並んで、特にポリアクリルアミドの
ような合成高分子が使用される。カプセル化には例えば
ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステルおよびポリ尿
素が使われる。この封入方法はセンサー反応の所要時間
を長くする比較的厚い膜ができるという欠点をもってい
る。
クロまたはマクロカプセルの場合には、酵素自体は溶解
しなくなることはないが、その反応範囲が半透過性の高
分子ないし高分子被膜によって制約される。この様にし
て封じ込まれた酵素の機能性を現す前提条件は、酵素自
体が抑留されている間、基質および生成物が被覆物を透
過できることである。マトリックスの封じ込みには、酵
素の耐久性のある固定化には確かに目の粗すぎるアルギ
ン酸塩、カラゲナン、ペクチン、寒天およびゼラチンの
ような天然高分子と並んで、特にポリアクリルアミドの
ような合成高分子が使用される。カプセル化には例えば
ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステルおよびポリ尿
素が使われる。この封入方法はセンサー反応の所要時間
を長くする比較的厚い膜ができるという欠点をもってい
る。
【００１２】前述の方法においては、酵素の固定化は大
抵の場合手作業で実施され、比較的遅く高価で再現性が
悪く最近の製造工程に組み込むことを阻害している。Ｆ
ＥＴ基準（ＥＮＦＥＴ）の酵素センサーを提供できると
いう有利性があるため、近年集積回路の製造の平面技術
で酵素を固定化する試みが行われている。例えばポリビ
ニルアルコールを主体にした酵素を含有する光硬化性被
膜の製造と直接的光構造化が既に知られている（“Ｐｒ
ｏｃ．３ｒｄ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．ＳｏｌｉｄＳｔａｔ
ｅ Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ（Ｔ
ｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ´８５）”１９８５年６月１１〜
１４日、１４８〜１５１頁参照）。また前述の目的のた
め光感応性のポリビニルピロリドンを使用することも知
られている（“ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．Ｅｒｅｃｔｒｏ
ｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ”ＥＤ−３６巻（１９８９）１３０
３〜１３１０頁）。この方法にしたがってウエハ上にＦ
ＥＴのゲートを正確にカバーするパターンを作ることが
できる。この方法にはむろん紫外線照射の際少なくとも
酸素の一部分が不活性化されるという大きな欠点があ
る。
抵の場合手作業で実施され、比較的遅く高価で再現性が
悪く最近の製造工程に組み込むことを阻害している。Ｆ
ＥＴ基準（ＥＮＦＥＴ）の酵素センサーを提供できると
いう有利性があるため、近年集積回路の製造の平面技術
で酵素を固定化する試みが行われている。例えばポリビ
ニルアルコールを主体にした酵素を含有する光硬化性被
膜の製造と直接的光構造化が既に知られている（“Ｐｒ
ｏｃ．３ｒｄ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．ＳｏｌｉｄＳｔａｔ
ｅ Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ（Ｔ
ｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ´８５）”１９８５年６月１１〜
１４日、１４８〜１５１頁参照）。また前述の目的のた
め光感応性のポリビニルピロリドンを使用することも知
られている（“ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．Ｅｒｅｃｔｒｏ
ｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ”ＥＤ−３６巻（１９８９）１３０
３〜１３１０頁）。この方法にしたがってウエハ上にＦ
ＥＴのゲートを正確にカバーするパターンを作ることが
できる。この方法にはむろん紫外線照射の際少なくとも
酸素の一部分が不活性化されるという大きな欠点があ
る。
【００１３】更に紫外線照射によって酵素が不活性にな
ることを利用することが知られている。即ち先ず酵素を
含んだアセチルセルローズの被膜を作り、その被膜中で
酵素をグルタールジアルデヒドと交互結合させた後マス
クを通して照射し、ゲート被膜に輪郭をつけて活性を維
持し、他の表面は不活性にする（“ＣｈｅｍｉｃａｌＥ
ｃｏｎｏｍｙ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉ
ｅｗ”１７巻（１９８５）７〜８号、２２〜２７頁）。
不活性になった被膜はセンサー上に止まるが、これは更
に使用するのに必要なセンサーの絶縁や封じ込みに不利
になることが明らかにされている。
ることを利用することが知られている。即ち先ず酵素を
含んだアセチルセルローズの被膜を作り、その被膜中で
酵素をグルタールジアルデヒドと交互結合させた後マス
クを通して照射し、ゲート被膜に輪郭をつけて活性を維
持し、他の表面は不活性にする（“ＣｈｅｍｉｃａｌＥ
ｃｏｎｏｍｙ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉ
ｅｗ”１７巻（１９８５）７〜８号、２２〜２７頁）。
不活性になった被膜はセンサー上に止まるが、これは更
に使用するのに必要なセンサーの絶縁や封じ込みに不利
になることが明らかにされている。
【００１４】またリフトオフ技術も知られている（“Ｓ
ｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ”１３巻
（１９８８）１６５〜１７２頁参照）。この方法ではゲ
ート表面のみが自由に残るようにホトレジストがパター
ン化形成される。ついでその上に酵素がグルタールジア
ルデヒドと一緒に塗布され交互結合される。ホトレジス
トはリフトオフ技術により、アセトンと超音波によって
除去される。この場合には同様に少なくとも部分的に酵
素の変性が避けられない。
ｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ”１３巻
（１９８８）１６５〜１７２頁参照）。この方法ではゲ
ート表面のみが自由に残るようにホトレジストがパター
ン化形成される。ついでその上に酵素がグルタールジア
ルデヒドと一緒に塗布され交互結合される。ホトレジス
トはリフトオフ技術により、アセトンと超音波によって
除去される。この場合には同様に少なくとも部分的に酵
素の変性が避けられない。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は技術的
に簡単で、効率的且つ適正価格で製造できる選択的識別
組織（高分子と生化学物質からなる）をもったバイオセ
ンサーを提供することにある。その際製造方法は最近の
製造方法に組み込むことができて、再現性のあるように
機能が安定していて場合によっては小形化され集積され
た識別組織に、不変の品質と長い寿命を付与しなければ
ならない。
に簡単で、効率的且つ適正価格で製造できる選択的識別
組織（高分子と生化学物質からなる）をもったバイオセ
ンサーを提供することにある。その際製造方法は最近の
製造方法に組み込むことができて、再現性のあるように
機能が安定していて場合によっては小形化され集積され
た識別組織に、不変の品質と長い寿命を付与しなければ
ならない。
【００１６】
【課題を解決するための手段】この課題は本発明によれ
ば、次の方法即ち −オレフィン系不飽和のエポキシ官能基を有するポリエ
ーテルが担体物質に被膜状に塗布され、 −ポリエーテルが高エネルギーの光照射によって目の粗
いエポキシ官能基を有する高分子マトリックスに網状化
され、 −被膜が生化学物質の水溶液で処理され、その際生化学
物質は高分子マトリックス中でエポキシ基と反応して固
定化され、 −被膜が、未反応のエポキシ基とアミノ基および／また
はカルボキシル基含有化合物との反応によって安定化さ
れる、 という過程で製造された識別組織であることを特徴とす
る高分子と生化学物質特に酵素とからなる選択的識別組
織を有するバイオセンサーにより解決される。
ば、次の方法即ち −オレフィン系不飽和のエポキシ官能基を有するポリエ
ーテルが担体物質に被膜状に塗布され、 −ポリエーテルが高エネルギーの光照射によって目の粗
いエポキシ官能基を有する高分子マトリックスに網状化
され、 −被膜が生化学物質の水溶液で処理され、その際生化学
物質は高分子マトリックス中でエポキシ基と反応して固
定化され、 −被膜が、未反応のエポキシ基とアミノ基および／また
はカルボキシル基含有化合物との反応によって安定化さ
れる、 という過程で製造された識別組織であることを特徴とす
る高分子と生化学物質特に酵素とからなる選択的識別組
織を有するバイオセンサーにより解決される。
【００１７】本発明によれば、一方で酵素を固定化する
新しい技術と、他方で選択的識別組織をもった生化学物
質と光硬化性のエポキシ官能基を有するポリエーテルか
ら生成される被膜とから成り立っている。驚くべきこと
に水溶液からこれら物質は粗目に網状化したエポキシ官
能基を有するポリエーテル中に浸透することができて、
鎖状結合のエポキシ基と非常に温和な条件で反応して高
分子マトリックス即ち高分子網目中に定着させることが
できる。この事実はまったく新規なことで、生化学物質
を固定化する前に被膜の製造、パターン化および網状化
を行い、一般に非常に敏感な物質の損傷を前述の過程に
よって避ける可能性を与えるものである。
新しい技術と、他方で選択的識別組織をもった生化学物
質と光硬化性のエポキシ官能基を有するポリエーテルか
ら生成される被膜とから成り立っている。驚くべきこと
に水溶液からこれら物質は粗目に網状化したエポキシ官
能基を有するポリエーテル中に浸透することができて、
鎖状結合のエポキシ基と非常に温和な条件で反応して高
分子マトリックス即ち高分子網目中に定着させることが
できる。この事実はまったく新規なことで、生化学物質
を固定化する前に被膜の製造、パターン化および網状化
を行い、一般に非常に敏感な物質の損傷を前述の過程に
よって避ける可能性を与えるものである。
【００１８】本発明によるバイオセンサーの好ましい実
施形態は従属請求項に記載されている。
施形態は従属請求項に記載されている。
【００１９】本発明によるバイオセンサーの識別組織の
製造は一般に次の工程に従って行われる。
製造は一般に次の工程に従って行われる。
【００２０】１．被膜の調整 放射性網状化性のエポキシ官能基を有するポリエーテル
またはこの種のポリエーテル混合物は、場合によっては
網状化開始剤、網状化促進剤および／またはその他の添
加剤と組み合わせて、担体物質上に所望の膜厚に塗布さ
れる。用途と担体物質の種類に応じて、ポリエーテルは
溶液からまたは溶剤を含まないで浸漬、スピン塗布、ロ
ーラ塗布、カーテン塗布またはその他技術的に通常の工
程で進められ、その際接着助剤による担体表面の前処理
が必要となる。膜厚は粘度の調整と溶剤または活性希釈
剤の添加によって制御される。この様にして作られた被
膜は如何なる場合でも揮発性成分を除去しなければなら
ないが、これは例えば乾燥またはガス抜きによって行う
ことができる。
またはこの種のポリエーテル混合物は、場合によっては
網状化開始剤、網状化促進剤および／またはその他の添
加剤と組み合わせて、担体物質上に所望の膜厚に塗布さ
れる。用途と担体物質の種類に応じて、ポリエーテルは
溶液からまたは溶剤を含まないで浸漬、スピン塗布、ロ
ーラ塗布、カーテン塗布またはその他技術的に通常の工
程で進められ、その際接着助剤による担体表面の前処理
が必要となる。膜厚は粘度の調整と溶剤または活性希釈
剤の添加によって制御される。この様にして作られた被
膜は如何なる場合でも揮発性成分を除去しなければなら
ないが、これは例えば乾燥またはガス抜きによって行う
ことができる。
【００２１】２．被膜の網状化 被膜即ちポリエーテルの網状化は高エネルギーの光照射
によって特に紫外線、電子線およびγ線によって行われ
る。その際オレフィン系不飽和のラジカル重合性基が専
ら反応するが、他方エポキシ基は定量的に含有されたま
まである。網状化によって粗い高分子網目ができる。投
射露光またはマスクを通しての照射およびこれに続く網
状化されない範囲の溶出により被膜はパターン化され
る。
によって特に紫外線、電子線およびγ線によって行われ
る。その際オレフィン系不飽和のラジカル重合性基が専
ら反応するが、他方エポキシ基は定量的に含有されたま
まである。網状化によって粗い高分子網目ができる。投
射露光またはマスクを通しての照射およびこれに続く網
状化されない範囲の溶出により被膜はパターン化され
る。
【００２２】３．生化学物質の固定化 網状化された被膜が生物活性物質の水溶液に接触する
と、この物質は高分子マトリックス中に移行し、そこで
エポキシ基と反応して共有結合される。この過程の前提
条件は必要な網目の幅の他に網状化の際形成された高分
子網目の十分な親水性である。それ故先行するポリエー
テルの親水性化によって固定化が促進される。このこと
はエポキシ基の一部分をＮＨ−、ＯＨ−、ＳＨ−または
ＣＯＯＨ基のような活性基をもった親水性の化合物と反
応することで達成され、それによって高分子被膜の親水
性が高められる。固定化過程はまたポリエーテルに高い
吸湿性を付与するポリビニルピロリドンのよううな添加
剤によっても、またジオキサン、テトラヒドロフラン、
アルコールまたはポリエーテルのような水に混合可能な
溶剤によっても著しく促進される。通常一つの被膜中に
数種の異なった生化学物質が同時にまたは相前後して固
定化される。
と、この物質は高分子マトリックス中に移行し、そこで
エポキシ基と反応して共有結合される。この過程の前提
条件は必要な網目の幅の他に網状化の際形成された高分
子網目の十分な親水性である。それ故先行するポリエー
テルの親水性化によって固定化が促進される。このこと
はエポキシ基の一部分をＮＨ−、ＯＨ−、ＳＨ−または
ＣＯＯＨ基のような活性基をもった親水性の化合物と反
応することで達成され、それによって高分子被膜の親水
性が高められる。固定化過程はまたポリエーテルに高い
吸湿性を付与するポリビニルピロリドンのよううな添加
剤によっても、またジオキサン、テトラヒドロフラン、
アルコールまたはポリエーテルのような水に混合可能な
溶剤によっても著しく促進される。通常一つの被膜中に
数種の異なった生化学物質が同時にまたは相前後して固
定化される。
【００２３】４．被膜の安定化 この処置は固定化の後でも残留するエポキシ基とアミノ
基および／またはカルボキシル基含有化合物、特にアミ
ノ酸とを反応させることである。安定化は、使用された
化合物に応じて、被膜を緻密に網状化し同時に機械的強
度を改良したりまたは材料特性と物質移動とを適応させ
ることに利用される。ちなみにセンサー被膜の表面を被
覆することは一層ないし数層を付加することにより可能
であり、規定の拡散条件を調整するため有意義である。
基および／またはカルボキシル基含有化合物、特にアミ
ノ酸とを反応させることである。安定化は、使用された
化合物に応じて、被膜を緻密に網状化し同時に機械的強
度を改良したりまたは材料特性と物質移動とを適応させ
ることに利用される。ちなみにセンサー被膜の表面を被
覆することは一層ないし数層を付加することにより可能
であり、規定の拡散条件を調整するため有意義である。
【００２４】本発明によるバイオセンサーには、特に次
の構造：
の構造：
【化５】 この場合
【化６】
【化７】
【化８】 のエポキシ官能基を有するポリエーテルが適している。
【００２５】
【発明の効果】本発明は次の利点を有する。 −周辺で活性のＮＨ−、ＯＨ−、ＳＨ−またはＣＯＯＨ
基を支配できる生化学物質はすべて固定化できる。 −固定化された生化学物質を有する被膜の乾燥ができ
て、滅菌してない条件下でも、この物質は障害を受ける
こと無く保存される。 −生化学物質の固定化が非常に温和な条件下に水溶液の
中で、低分子量の活性成分が無くてもできる。このこと
によって損失例えば酵素の変質が避けられる。 −多数の種類の異なる生化学物質の固定化のため、種類
の違ったセンサーのため、大規模に製造可能で同時に適
性価格に近い高い耐熱性と熱安定性のある比較的少数の
高分子材料が使われる。 −被膜の形成および網状化また場合によっては構造化が
平面技術にしたがって即ち技術的に簡単で再現可能で適
性価格でかつまたセンサー製造工程に組み込むことがで
きるよう遂行できる。 −必要と使用目的に応じて、生化学物質の固定化は被膜
の形成とは無関係に、場合によってユーザーが使用する
に当たってその直前にできる。 −高分子マトリックス中に生化学物質を化学的に定着さ
せることによって、脱離、移動および抽出による損失が
避けられる。 −生化学物質の周辺のＮＨ−、ＯＨ−、ＳＨ−およびＣ
ＯＯＨ基と非常に軟らかくて可撓性の被覆をした高分子
物質との間に共有結合が形成されることによって、部分
的に非常に敏感な物質例えば酵素に高度の機械安定性と
長時間安定性が与えられる。 −非常に薄い被膜（＜＜１μｍ）を形成できることによ
って、非常に短縮したセンサーの反応時間が達成でき
る。 −微小電子回路の識別組織を例えばＩＳＦＥＴおよびＥ
ＮＦＥＴの製造のため小形化や集積化することに問題は
ない。 −選択的識別組織はすべてのセンサー測定装置に対し基
本的に適している。
基を支配できる生化学物質はすべて固定化できる。 −固定化された生化学物質を有する被膜の乾燥ができ
て、滅菌してない条件下でも、この物質は障害を受ける
こと無く保存される。 −生化学物質の固定化が非常に温和な条件下に水溶液の
中で、低分子量の活性成分が無くてもできる。このこと
によって損失例えば酵素の変質が避けられる。 −多数の種類の異なる生化学物質の固定化のため、種類
の違ったセンサーのため、大規模に製造可能で同時に適
性価格に近い高い耐熱性と熱安定性のある比較的少数の
高分子材料が使われる。 −被膜の形成および網状化また場合によっては構造化が
平面技術にしたがって即ち技術的に簡単で再現可能で適
性価格でかつまたセンサー製造工程に組み込むことがで
きるよう遂行できる。 −必要と使用目的に応じて、生化学物質の固定化は被膜
の形成とは無関係に、場合によってユーザーが使用する
に当たってその直前にできる。 −高分子マトリックス中に生化学物質を化学的に定着さ
せることによって、脱離、移動および抽出による損失が
避けられる。 −生化学物質の周辺のＮＨ−、ＯＨ−、ＳＨ−およびＣ
ＯＯＨ基と非常に軟らかくて可撓性の被覆をした高分子
物質との間に共有結合が形成されることによって、部分
的に非常に敏感な物質例えば酵素に高度の機械安定性と
長時間安定性が与えられる。 −非常に薄い被膜（＜＜１μｍ）を形成できることによ
って、非常に短縮したセンサーの反応時間が達成でき
る。 −微小電子回路の識別組織を例えばＩＳＦＥＴおよびＥ
ＮＦＥＴの製造のため小形化や集積化することに問題は
ない。 −選択的識別組織はすべてのセンサー測定装置に対し基
本的に適している。
【００２６】
【実施例】本発明を実施例に基づき以下に詳述する。例 １ ポリエーテル／酵素被膜の製造 次の構造：
【化９】 の１００重量部のエポキシ官能基を有するポリエーテル
を７重量部のプロポキシ化グリセリントリアクリレート
活性希釈剤および２重量部の２‐ヒドロキシ‐２‐メチ
ル‐１‐フェニルプロパン‐１‐オン光反応開始剤と混
合し、必要な加工特性に調整するため適当量のトルオー
ルを添加した。この溶液は次に浸漬、滴下またはドクタ
ー塗布により、場合によっては接着助剤で前処理された
敏感なセンサー表面上に塗布された。これと平行して同
じ溶液をシリコーンウェハにワニス平面塗布装置で塗布
した。塗布時間は約１０秒であった。
を７重量部のプロポキシ化グリセリントリアクリレート
活性希釈剤および２重量部の２‐ヒドロキシ‐２‐メチ
ル‐１‐フェニルプロパン‐１‐オン光反応開始剤と混
合し、必要な加工特性に調整するため適当量のトルオー
ルを添加した。この溶液は次に浸漬、滴下またはドクタ
ー塗布により、場合によっては接着助剤で前処理された
敏感なセンサー表面上に塗布された。これと平行して同
じ溶液をシリコーンウェハにワニス平面塗布装置で塗布
した。塗布時間は約１０秒であった。
【００２７】被膜はラミナーボックス中で乾燥されつい
で窒素気中で２００〜４５０ｎｍ波長の紫外線照射によ
り硬化された。照射時間は４．６秒であった。溶解成分
を除去するために硬化被膜は室温で２４時間ジオキサン
で抽出された。被膜の親水性を増大させるため、エポキ
シ基の一部はアミノ酸の形でＮＨ基を含む化合物と反応
させた。その際特に被膜層はジオキサンと水を２：１に
混合したプロリンまたはグルタミン酸の２％水溶液中で
４０〜６０℃で加温された。平行して前処理されたシリ
コンウェハを基にして赤外線吸収スペクトルによって転
化反応が追跡された。大抵の場合５０％の転化で十分で
あったが、必要によってはより高い値に調整することも
できる。
で窒素気中で２００〜４５０ｎｍ波長の紫外線照射によ
り硬化された。照射時間は４．６秒であった。溶解成分
を除去するために硬化被膜は室温で２４時間ジオキサン
で抽出された。被膜の親水性を増大させるため、エポキ
シ基の一部はアミノ酸の形でＮＨ基を含む化合物と反応
させた。その際特に被膜層はジオキサンと水を２：１に
混合したプロリンまたはグルタミン酸の２％水溶液中で
４０〜６０℃で加温された。平行して前処理されたシリ
コンウェハを基にして赤外線吸収スペクトルによって転
化反応が追跡された。大抵の場合５０％の転化で十分で
あったが、必要によってはより高い値に調整することも
できる。
【００２８】酵素の固定化は被膜を約１〜２％の酵素の
水溶液中に、２０〜３０℃で保持することによってもで
きる。この経過を促進するために酵素の敏感度に応じ
て、溶液を１０〜５０％ジオキサンと混合することもで
きる。固定化は１〜８時間後に終了した。残留エポキシ
基はアミノ酸と緩慢に反応して除去された。最後に被膜
を水で徹底的に洗浄して抽出可能の成分が除去された。
水溶液中に、２０〜３０℃で保持することによってもで
きる。この経過を促進するために酵素の敏感度に応じ
て、溶液を１０〜５０％ジオキサンと混合することもで
きる。固定化は１〜８時間後に終了した。残留エポキシ
基はアミノ酸と緩慢に反応して除去された。最後に被膜
を水で徹底的に洗浄して抽出可能の成分が除去された。
【００２９】表１はシリコンウェハ上に１０μｍの厚さ
の同じ前処理した被膜に、８時間以内に３０℃で固定化
した本発明による酵素並びに２５℃における酵素活性を
まとめて示したものである。
の同じ前処理した被膜に、８時間以内に３０℃で固定化
した本発明による酵素並びに２５℃における酵素活性を
まとめて示したものである。
【００３０】
【表１】 酵 素 活 性 度 測 定 方 法 ─────────────────────────────────── アスペルギルスニゲル 0.8 Ｕ／ｃｍ2 Ｍｅｒｃｋ社のＧｌｕｃ− のグルコースオキシタ ＤＨ法 ーゼ 親液性 ２４０ Ｕ／ｍｇ 牛レバーのカタラーゼ 350 Ｕ／ｃｍ2 B.Stellmach 著「 Bestimmungs 濁懸液 Methoden Enzyme 」Steinkopff ６５０００Ｕ／ｍｇ Verlag,Darmstadt (1988) １５２〜２７１頁参照 ナタマメのウレアーゼ 0.7 Ｕ／ｃｍ2 上掲刊行物 親液性 ２６９〜２７１頁参照 １００ Ｕ／ｍｇ 酵母のアルコール 2.0 Ｕ／ｃｍ2 上掲刊行物 脱水素酵素 １１〜１２頁参照 親液性 ４００ Ｕ／ｍｇ Ｌ‐アスパラギナーゼ 0.7 Ｕ／ｃｍ2 上掲刊行物 の５０％グリセリン ６３〜６８頁参照 溶液 ８０Ｕ／ｍｇ溶液
【００３１】例 ２ 固定化酵素の機能安定性評価 本発明による固定化酵素（８時間経過）の機能安定性を
評価するためシリコンウェハ上に作られた１０μｍ厚さ
の被膜で例１による活性度が数週間を経て２５℃で測定
された（表１参照）。グルコースオキシダーゼの活性度
が７０日に亘って追跡され、最初の値が減少しないこと
を確認することができた。これと平行して表１に記載し
た測定方法に従ってグリコースオキシターゼ水溶液の活
性度減少が２０℃で測定された。その際１０日以内に活
性度が約５０％損失したのに、本発明に従って固定化さ
れたグルコースオキシタゼの増強された安定性は確保さ
れていた。表１に挙げた他の固定化された酵素の評価に
よれば、最初に測定された活性度が少なくとも８週間に
亘って保持されていた。
評価するためシリコンウェハ上に作られた１０μｍ厚さ
の被膜で例１による活性度が数週間を経て２５℃で測定
された（表１参照）。グルコースオキシダーゼの活性度
が７０日に亘って追跡され、最初の値が減少しないこと
を確認することができた。これと平行して表１に記載し
た測定方法に従ってグリコースオキシターゼ水溶液の活
性度減少が２０℃で測定された。その際１０日以内に活
性度が約５０％損失したのに、本発明に従って固定化さ
れたグルコースオキシタゼの増強された安定性は確保さ
れていた。表１に挙げた他の固定化された酵素の評価に
よれば、最初に測定された活性度が少なくとも８週間に
亘って保持されていた。
【００３２】例 ３ 本発明によって固定化された酵素
を有するバイオセンサーの機能安定性評価 例１に記載した方法によりポリエーテル／酵素被膜がセ
ンサー測定装置上に形成され、その機能と機能安定性
を、発生するセンサー信号を測定する方法で追跡され
た。表２は評価された酵素並びに評価のために選定され
た測定装置および作用期間を示している。
を有するバイオセンサーの機能安定性評価 例１に記載した方法によりポリエーテル／酵素被膜がセ
ンサー測定装置上に形成され、その機能と機能安定性
を、発生するセンサー信号を測定する方法で追跡され
た。表２は評価された酵素並びに評価のために選定され
た測定装置および作用期間を示している。
【００３３】
【表２】 酵 素 セ ン サ ー 測 定 装 置 作用期間 ────────────────────────────────── グルコースオキ 欧州特許公開第０４７０４７３号 ８週間以上 シダーゼ による酸素センサー （ＧＯＤ） ＧＯＤ＋カタラーゼ 欧州特許公開第０４７０４７３号 ８週間以上 （１：１） による酸素センサー ウレアーゼ ＮＨ4 + 感応ガラス電極 ８週間以上 （Ｆａ．Ｔｅｃａｎ Ａ．Ｇ．） Ｌ- アスパラギ ＮＨ4 + 感応ガラス電極 ８週間以上 ナーゼ （Ｆａ．Ｔｅｃａｎ Ａ．Ｇ．）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 27/327 // Ｃ１２Ｎ 11/08 Ａ
Claims (4)
- 【請求項１】 次の方法即ち −オレフィン系不飽和のエポキシ官能基を有するポリエ
ーテルが担体物質に被膜状に塗布され、 −ポリエーテルが高エネルギーの光照射によって目の粗
いエポキシ官能基を有する高分子マトリックスに網状化
され、 −被膜が生化学物質の水溶液で処理され、その際生化学
物質は高分子マトリックス中でエポキシ基と反応して固
定化され、 −被膜が、未反応のエポキシ基とアミノ基および／また
はカルボキシル基含有化合物との反応によって安定化さ
れる、 という過程で製造された識別組織であることを特徴とす
る高分子と生化学物質特に酵素とからなる選択的識別組
織を有するバイオセンサー。 - 【請求項２】 被膜がパターン化されることを特徴とす
る請求項１記載のバイオセンサー。 - 【請求項３】 網状化されたポリエーテルに親水性を与
えることを特徴とする請求項１または２記載のバイオセ
ンサー。 - 【請求項４】 ポリエーテルが一般式： 【化１】 この場合 【化２】 【化３】 【化４】 を有することを特徴とする請求項１ないし３の１つに記
載のバイオセンサー。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4209370 | 1992-03-23 | ||
| DE4209370.8 | 1992-03-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646887A true JPH0646887A (ja) | 1994-02-22 |
| JP3151330B2 JP3151330B2 (ja) | 2001-04-03 |
Family
ID=6454783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08796793A Expired - Fee Related JP3151330B2 (ja) | 1992-03-23 | 1993-03-22 | バイオセンサー |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5389534A (ja) |
| EP (1) | EP0562370B1 (ja) |
| JP (1) | JP3151330B2 (ja) |
| AT (1) | ATE160633T1 (ja) |
| CA (1) | CA2092042A1 (ja) |
| DE (1) | DE59307719D1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7901170B2 (en) | 2006-09-26 | 2011-03-08 | Denso Corporation | Holding device for holding object |
| JP2013518255A (ja) * | 2010-01-22 | 2013-05-20 | バイエル・ヘルスケア・エルエルシー | 確度改善性乾燥剤 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US6329139B1 (en) | 1995-04-25 | 2001-12-11 | Discovery Partners International | Automated sorting system for matrices with memory |
| US6331273B1 (en) | 1995-04-25 | 2001-12-18 | Discovery Partners International | Remotely programmable matrices with memories |
| US5741462A (en) | 1995-04-25 | 1998-04-21 | Irori | Remotely programmable matrices with memories |
| US5751629A (en) | 1995-04-25 | 1998-05-12 | Irori | Remotely programmable matrices with memories |
| US5874214A (en) | 1995-04-25 | 1999-02-23 | Irori | Remotely programmable matrices with memories |
| US6416714B1 (en) | 1995-04-25 | 2002-07-09 | Discovery Partners International, Inc. | Remotely programmable matrices with memories |
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