JPH0646899A - 核酸結合因子の検出のための迅速な検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 複雑な流体混合物中のヌクレオチド結合化合
物の検出のための方法を提供する。 【構成】 この方法は、既知の配列の標的ポリヌクレオ
チドを、容器を含むまたは容器内に含まれる非多孔性支
持体に固定し、次いで被験試料の流体を流体中に存在す
る化合物が標的ポリヌクレオチドに結合するように導入
することにより、検出可能な信号を生成することのでき
る部分を含む標識が結合した第二の相補的ポリヌクレオ
チドがハイブリダイゼーションすることをブロックする
ことを原理とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】核酸に結合する基質を同定および検出する
方法は、しばしば明瞭であると考えられる科学分野の境
界にまたがる、急速に成長しつつある生物学の分野の一
つを含んでいる。例えば、臨床微生物学者は係る技術を
病原菌、寄生虫、真菌およびウイルスの迅速な同定に使
用することができる。環境科学者はこれらの技術を、下
水または化学的流去水による地下水または飲料水の汚染
の迅速な同定に使用することができる。分子生物学者ま
たは生化学者は、部位特異的手法で、または一般的な核
酸結合化合物として、核酸に結合する蛋白を精製しなが
ら、伝統的にこれらの技術を検定法として使用する。

【０００２】複雑な流体中の細菌を検出及び同定するた
めの伝統的な方法は、試料の型および問題となる病原体
によって異なる。現在可能な方法で全ての病原体の検出
に最適なものはない。可能性を選別するために、退屈で
冗長な工程である、方法の組合せを使用しなければなら
ない。多くの病原体は非常に培養条件が難しく、且つ増
殖速度が極めて遅い。例えば、臨床微生物学者が、結核
の同定及び処置に要する多くの試験を実施するに充分
な、結核の原因生物マイコバクテリウム・トゥバキュロ
ーシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）の増殖をさせるためには通常３ないし４週
間が必要である。Ｒ．ワイス、サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）２５５巻１４８−１５０頁（１９９２）。この生
物の迅速な同定のための現在利用可能な技術はない。

【０００３】現行の培養方法には、高価な材料；労働集
約的；危険であるかも知れない体液を長期に扱うこと；
この長期的取扱いに起因する偽陽性；難しい培養条件ま
たは試料の生存性が低いことに起因する偽陰性；陽性の
診断及び同定には相対的に長時間かかること；そして試
験方法の融通性の欠如、を含む幾つかの非常に重大な欠
点がある。本発明中に記載される技術は、微生物の同定
のための迅速で再現性のある方法を提供するものであ
る。さらにこれらの方法は、販売者ではなく実施者が適
当と考える試験方法を設計できる融通性を、熟練した実
施者に提供するものである。

【０００４】特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に結合する
蛋白の精製を試みる生化学者はしばしば難しい検定に直
面し、その結果偽陽性または陰性が導かれ、一般に膨大
な時間が費やされる。これらの検定は実施者が全試料を
保存することを余儀なくさせ、次の精製工程を設計しこ
れを開始することを躊躇させる。ニトロセルロースフィ
ルター結合、ＤＮアーゼＩフットプリント、メチル化阻
害、およびゲル移動性変化は、極めて高い比活性で放射
標識されたＤＮＡプローブを必要とし、初心者にとって
は非常に困難であり得る。

【０００５】本発明は、実施者の必要性及び設計に応じ
て配列特異的手法または一般的方法のいずれかで核酸に
結合する因子を含有する流体を迅速に同定するための技
術を記載するものである。これらの技術は、取扱いが危
険で、プローブの自己減成をもたらし、そして相対的に
短い半減期を有する放射性同位体を使用することなく実
施できる。

【０００６】この発明は、複雑な流体混合物中のヌクレ
オチド結合化合物を検出するための方法を記載するもの
である。本発明の一つの態様は、第一に、既知の配列の
標的ポリヌクレオチドを、容器系の中に含まれるまたは
容器系を含む非多孔性支持体に固定することを必要とす
る。次に、流体中に存在する化合物が標的ポリヌクレオ
チドに結合するようなやり方で、被験試料の流体を導入
する。この結合は、検出可能な信号を生成することので
きる部分を含む標識の結合した第二の相補的ポリヌクレ
オチドが引き続いてハイブリダイゼーションすることを
妨げる。次いで信号を生成させ、対照区に比較した実験
区に由来する信号の低下を検出する。

【０００７】本発明のさらなる態様は、標的ポリヌクレ
オチドの支持体への結合を仲介するリガンド／レセプタ
ー対を使用する。本発明のさらなる態様は、信号生成部
分および相補的ポリヌクレオチドの結合を仲介する第二
のリガンド／レセプター対を使用する。

【０００８】本発明は、配列特異的手法でまたは一般的
ヌクレオチド結合因子としてのポリヌクレオチド配列に
結合する化合物を複雑な流体から同定する方法を記載す
るものである。これらの複雑な流体の例は、血液または
血清；髄液；リンパ液；尿；細胞抽出液；発酵ブロス；
飲料水；下水；滑液；薬物；ならびに食物および飲物を
包含する。

【０００９】本発明に係る方法は、流体中の、一般的な
ヌクレオチド結合蛋白、配列特異的ヌクレオチド結合蛋
白、挿入物質、リボ核酸、またはオリゴヌクレオチドの
存在を決定するために使用することができる。本発明方
法は多くの広い実施領域の実施者が使用することができ
る。この技術は分野に拘らず似かよっており、唯一の主
たる相違は、使用される複雑な流体の型である。

【００１０】本発明が使用できる一つの広い領域は、流
体中の生きている生物の同定またはこれらの生物に由来
する残留物の同定である。例えば、流体中の望ましくな
い細菌の存在が容易に決定できる。

【００１１】これらの技術は、細菌中に見いだされるリ
ボゾームリボ核酸（ｒＲＮＡ）配列に通常基づくプロー
ブを使用する。一般にリボゾームは細胞当り約２０００
０コピーが存在し、細胞の体積の約四分の一を構成して
いる。Ｌ．ストライヤー、バイオケミストリー（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（３版、１９８８）。三つのリボ
ゾーム性ＲＮＡの各々がリボゾームにつき１コピー存在
する。同上。

【００１２】ｒＲＮＡの幾つかのセグメント、とりわけ
１６Ｓとして知られるｒＲＮＡのセグメントは全ての生
物に普遍的であり、それ故普遍プローブとして、即ち流
体中の任意の有機的物質の存在の決定に使用することが
できる。Ｄ．Ｊ．レイン等、プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ、
Ｕ．Ｓ．Ａ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）８２巻６９５５頁（１９８
５）。相異なる系統発生群の細菌間の識別に直ちに使用
することのできる、系統発生群に特異的なプローブが記
載されている。Ｓ．Ｊ．ジョバノーニ等、ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１７０巻７２０−７２６頁（１
９８８）；Ｄ．Ｊ．レイン等、欧州特許公開ＷＯ９０／
１５１５７号（１９９０年１２月１３日公開）。例え
ば、飲料水中のコリシンまたは病原菌の存在を、コリシ
ンまたは病原体に特異的なプローブを用いて迅速に決定
することができる。

【００１３】本発明に記載される方法は用途が広いた
め、緊縮性のレベルは本発明の実施者によって殆ど無制
限に操作することができる。実施者の希望に応じて、異
なった型のプローブを使用し、分類学上最も広い［例え
ばＣ．ウース、マイクロバイオロジカル・レビューズ
（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）
５１巻２２１−２７１頁（１９８７）により記載されて
いるＵｒｋｉｎｇｄｏｍｓ］相違から最も個別的な（特
定の亜種の突然変異体）相違に至る任意のレベルの分類
学的相違に基づいた生物の分類を行なうことができる。

【００１４】本発明が利用できるもう一つの広い分野
は、蛋白精製の分野、とりわけ核酸に結合する蛋白の精
製の分野である。本発明において開示される技術は、例
えばカラムクロマトグラフィーからの画分の研究に使用
される迅速な感受性の高い検定を提供する。これらの技
術は、ＤＮアーゼＩフットプリント、ゲル移動度変化、
およびニトロセルロースフィルター結合のような伝統的
な検定よりはるかに迅速な結果を提供する。さらに、こ
れらの技術は放射性同位体を使用せずに実施することが
できる。

【００１５】さらに本発明方法は、新生物の存在の指標
として働き得る体液中の特定の蛋白（例えばｃ−ｍｙ
ｃ）の同定に使用することができる。さらにこれらの方
法は、特定の因子の存在または不在について生物学的培
養を迅速にスクリーニングするために使用することがで
きる。熟練した実施者は、その実験の目的を知って、殆
ど無制限の融通性をもたらすよう、実験区および対照区
を作り上げることができる。

【００１６】本発明の一般的方法は、まず、容器系を含
むまたはこれに含まれる固体支持体に標的ポリヌクレオ
チドを固定することを必要とする。係る支持体は、容器
内の粒子または容器自身の表面であることができる。使
用される容器系の性格は、使用される信号生成部分の型
に依存する。例えば、放射性信号の使用は、放射される
粒子に対して容器が透過性であることを必要とする。発
色性または蛍光生成性信号を使用する際は、容器系は、
当該信号を検出するために、使用波長において透明であ
るか、または、反応流体が直接見えるように組み立てら
れなければならない。

【００１７】好ましい系は、微量定量検定または組織培
養に通常使用されるようなウェルプレートを使用する。
発色性または蛍光生成性信号に最も好ましい系は、９６
個のウェルを有し、ウェルに対して平らな底があり、ウ
ェル表面への容易な結合を受け入れるよう前処理をして
あるプレートを使用する。

【００１８】支持体に対する標的ポリヌクレオチドの固
定は、支持体表面へのポリヌクレオチドの直接結合であ
るか、または、リガンド／レセプター相互作用により仲
介されるものであるかのいずれかとすることができる。
次いで被験流体を、結合した標的を含む容器系の実験区
に導入する。負の対照区は、被験流体を添加しなかった
区である。

【００１９】標的ポリヌクレオチド配列に結合すること
のできる、流体中のいかなる化合物の存在も、該標的に
対する化合物の複合体形成をもたらすであろう。

【００２０】被験流体中の係る化合物の存在を、標的ポ
リヌクレオチドに対する第二の相補的ポリヌクレオチド
のハイブリダイズを試みることによって決定する。標的
ポリヌクレオチドに結合した化合物の複合体は、被験流
体が添加されない対照に比較して、標的ポリヌクレオチ
ド及びその相補体のハイブリダイゼーションの低下をも
たらす。

【００２１】標的ポリヌクレオチドおよびその相補体の
ハイブリダイゼーションの量は、直接または間接的に相
補的ポリヌクレオチドに結合している信号部分によって
決定される。信号が生成する際にハイブリダイゼーショ
ンの効率が直ちに決定される。その効率の低下は、被験
流体中の、ハイブリダイゼーションをブロックする化合
物の存在を示す。

【００２２】これらの検定のために選択される標的ポリ
ヌクレオチドは、任意の長さのデオキシリボ核酸または
リボ核酸とすることができる。この検定に使用されるポ
リヌクレオチドの正確な配列及び長さは、検定の望まし
い目的に応じて技術者の裁量に委ねられる。この柔軟性
によって、熟練した実施者は多数の検定を同時に行なう
ことができ、その結果、より高い効率がもたらされる。

【００２３】望ましい配列のポリヌクレオチドを合成す
る技術は当分野で良く知られている。例えば、既知の鋳
型核酸は、当業者に良く知られた多数の技術によって容
易に酵素的に再生産することができる［例えばＪ．サム
ブルック等、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラ
トリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第
２版、１９８９）；Ｆ．Ｍ．アウスベル等、カレント・
プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９８７およびその追
補）を参照されたい］。

【００２４】本発明の好ましい態様は、当業者に良く知
られる技術によって製造される化学合成されたオリゴヌ
クレオチドを使用する［例えば、Ｍ．Ｊ．ゲイト編、オ
リゴヌクレオタイド・シンセシス、ア・プラクティカル
・アプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒ
ｏａｃｈ）（１９８４）を参照されたい］。化学合成さ
れたオリゴヌクレオチドは市販の供給源からも容易に入
手される。一般に２０残基またはそれ以下のオリゴヌク
レオチドを使用するのが好ましい。

【００２５】本発明の特に好ましい態様は、ヌクレアー
ゼに対し抵抗性のオリゴヌクレオチドを使用する。係る
態様の一つは、生物学的に典型的なホスホジエステル結
合ではなくホスホロチオアート結合によって結合したオ
リゴヌクレオチドを使用する。これらのオリゴヌクレオ
チドは一般式：

【化１】 を有する。ホスホロチオアート結合を有するオリゴヌク
レオチドは、ヌクレアーゼの作用をより受けにくいが、
それでも殆どの化合物と正常に結合する。Ｃ．Ａ．ステ
イン等、ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）１６巻３２０９−
３２２１頁（１９８８）。

【００２６】ホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレ
オチドの合成には、一般に二つの方法が使用される。第
一は、各合成サイクルにおける硫黄元素による亜燐酸ト
リエステル中間体の緩和な酸化を組み合わせた、通常の
β−シアノエチルホスホアミダイト合成法の使用による
ものである。Ｗ．Ｊ．ステック等、ジャーナル・オブ・
ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）１０６巻６０７７−６０７９頁
（１９８４）。第二のプロトコルは、オリゴヌクレオチ
ド合成の完結時における最終的オリゴヌクレオチドの強
力な全体的硫黄酸化を用いるＨ−ホスホナート化学を使
用するものである。Ｐ．Ｊ．ガレッグ等、テトラヘドロ
ン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ）２７巻４０５５−４０５８頁（１９８６）。さら
に、ホスホロチオアート化オリゴリボヌクレオチドがＨ
−ホスホナート化学を用いて容易に合成できる。Ｓ．ア
グローアルおよびＪ．Ｙ．タング、テトラヘドロン・レ
ターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）３
１巻７５４１−７５４４頁（１９９０）。

【００２７】ポリヌクレオチドは、直接的または間接的
に支持体の表面に固定することができる。直接的固定法
においては、標的ポリヌクレオチドを含有する溶液を適
当な活性化支持体に添加する。結合反応を４℃で通常は
一夜インキュベートする。次いで、牛血清アルブミンの
ような相対的に不活性な蛋白を含有する溶液を添加する
ことにより、支持体の過剰の活性化結合部位を飽和す
る。この飽和反応は、後に信号生成部分の非特異結合を
阻害し、それによりバックグラウンドの信号を減少させ
る。この結合反応の結果、支持体表面にしっかりと固定
されている標的ポリヌクレオチドが得られる。

【００２８】ポリヌクレオチドを固定する間接的方法
は、リガンド／レセプター反応を使用する。リガンドを
支持体表面に結合させる。次に、標的ポリヌクレオチド
に共有結合で結合したレセプターを容器中に導入する。
次いで、リガンド／レセプター相互作用が、ポリヌクレ
オチドを支持体表面に固定する働きをする。好ましいリ
ガンド／レセプター対は、ビオチンおよびストレプトア
ビジン、ビオチンおよびアビジン、ならびに糖およびレ
クチンを包含する。

【００２９】糖／レクチンの対の使用は、ポリヌクレオ
チドが宿主生物によって甚だしく修飾されている時には
特に貴重であり得る。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の殆どの菌株中で増殖するバクテ
リオファージＴ４の天然に存在するＤＮＡは甚だしくグ
リコシル化されている。Ｅ．Ａ．バージ、バクテリアル
・アンド・バクテリオファージ・ジェネティクス（Ｂａ
ｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）（１９８１）６９−７２頁。グル
コピラノシル残基に強く結合するレクチン（フィトヘマ
グルチニン）コンカナバリンＡの支持体表面に対する結
合は、修飾されたポリヌクレオチドの効率的な結合を可
能にする。

【００３０】リガンド／レセプター対としてのビオチン
およびアビジンまたはビオチンおよびストレプトアビジ
ンの使用は一般に、これらの極めて高い親和相互作用
（Ｋ_d＝１０^-15）の故に好ましい。アビジンは、各々が
１５０００ダルトンの分子量を有する４個の同一のサブ
ユニットを含む四量体として天然に存在する糖蛋白であ
る。これは卵白から容易に単離することができる。例え
ば、Ｍ．ウィルチェクおよびＥ．Ａ．バイヤー、アナリ
ティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１７１巻１−３２頁（１
９８８）ならびにその参考文献を参照されたい。

【００３１】本発明の特に好ましい態様は、卵白アビジ
ンの代わりにストレプトアビジンを使用する。ストレプ
トアビジンはしばしば幾つかの理由でアビジンより好ま
しい。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ）種の培養濾液から単離されるストレプトアビジン
は、炭水化物部分を持たず、アビジンのｐＩが１０．０
であるのに比べ、ｐＩが５．０であるという点で、アビ
ジンとは異なっている。炭水化物の存在及び高いｐＩ値
は非特異結合を増加させる結果となり得るため、この事
は重要である。卵白アビジンのデグリコシル化型もまた
バックグラウンド結合を減少させるために使用すること
ができる。Ｙ．ヒラー等、バイオケミカル・ジャーナル
（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）２４８巻
１６７−１７１頁（１９８７）。

【００３２】ビオチン化ヌクレオチドの合成はランガー
等によって１９８１年にＰ．Ｒ．ランガー等、プロシー
ディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ、ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）７８巻６６３３−６６３
７頁（１９８１）に初めて記載された。この時以来、酵
素的そして化学的にビオチン化ヌクレオチドをポリヌク
レオチドに取り込ませる数多くの方法が開発されてき
た。ウィルチェクおよびバイヤー、上記、を参照された
い。一般に、ビオチンは、アリルアミンリンカーの腕に
よってピリミジン環のＣ５位に共有結合で結合する。ビ
オチン化オリゴヌクレオチドは幾つかの供給源から市販
品を入手できる。

【００３３】被験流体、試験すべき複雑な流体は、求め
る因子の性格に応じて前処理することができる。例え
ば、その試験が小分子の検出を意図するものであるなら
ば、流体は、特定の分子量以下の分子を保持する小孔を
有する膜で濾過することができる。求められる因子が熱
安定性であるならば、試料の流体を加熱または煮沸して
蛋白を変性させ、バックグラウンドに加わるかも知れな
い熱不安定性化合物を破壊することができる。熟練した
実施者が、求められている因子の化学的特性を知ってい
るならば、その実施者はバックグラウンドを増大させ得
る非特異的相互作用を減少させるように試料を処理する
ことができる。

【００３４】標的ポリヌクレオチドに対する相補的ポリ
ヌクレオチドのハイブリダイゼーションが行なわれる温
度は、部分的には、求められる化合物の特性に依存す
る。このハイブリダイゼーション反応は一般に約４℃な
いし約６０℃の温度で行なわれる。標的ポリヌクレオチ
ド及び相補的ポリヌクレオチドのうち短い方の長さなら
びにその塩基組成が、一般的に最高許容温度を決定す
る。

【００３５】短いオリゴヌクレオチドが標的または相補
的ポリヌクレオチド用に使用される場合、そのオリゴヌ
クレオチドの融解温度は、式： Ｔ_m＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ） ［式中、Ｔｍは摂氏の融解温度を意味し、（Ａ＋Ｔ）は
該オリゴヌクレオチド中のアデニン及びチミン残基の数
に対応し、そして（Ｇ＋Ｃ）はグアニン及びシトシン残
基の数に対応する］によって近似される。この融解温度
は、ハイブリダイゼーションが行なわれ得る最高温度と
して働く。

【００３６】相補的ポリヌクレオチド配列は、信号を生
成することのできる部分をこれに結合させている。信号
生成部分は該相補的ポリヌクレオチド配列に直接的また
は間接的に結合することができる。

【００３７】相補的ポリヌクレオチド配列に対する信号
生成部分の直接的共有結合は、実施者に一つの工程の倹
約を可能にさせ、そして、一つの相補的ポリヌクレオチ
ドおよび一つの好ましい信号で幾つかの試験を実施する
場合に有利である。しかしながら、実施者が多数の相補
的ポリヌクレオチド配列または多数の信号生成部分の使
用を所望する場合は、その技術者は、間接的な信号生成
方法の使用がより有利であることを見いだすかも知れな
い。

【００３８】相補的ポリヌクレオチド配列に信号生成部
分を直接結合させる方法は、所望とされる個々の部分に
依存する。本発明の好ましい態様は相補的ポリヌクレオ
チドに結合させた酵素を使用し、この酵素は適当な基質
が導入されたときに発色性信号を生成することができ
る。

【００３９】一例として、酵素アルカリホスファターゼ
（ＥＣ３．１．３．１）は、反応性チオール基を含む相
補的オリゴヌクレオチドに容易に結合することができ
る。このようなオリゴヌクレオチドは市販の供給源から
容易に入手できる。アルカリホスファターゼは一般に、
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのよ
うなヘテロ二官能性架橋分子を介して該オリゴヌクレオ
チドと複合体形成する。Ｓ．ヨシタケ等、ジャーナル・
オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９２巻１４１３頁（１９８
２）。酵素は、化学合成されたオリゴヌクレオチド以外
のポリヌクレオチドと、確立された方法によって結合す
ることができる。上記。

【００４０】信号はｐ−ニトロフェニルホスファート
（ＰＮＰ）のような発色性基質の添加によって生成す
る。ＰＮＰの加水分解の結果ｐ−ニトロフェノール基が
遊離し、４０５ｎｍにおける吸収（Ａ₄₀₅）の増大及び
黄色の外観がもたらされる。

【００４１】発色性信号を生成することのできる好まし
い酵素のその他の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
β−Ｄ−グルコロニダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、６−ホスホ−β−Ｄ−ガラクトシド ６−ホスホガ
ラクトヒドロラーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−
Ｄ−グルコシダーゼ、α−アミラーゼ、α−グルコシダ
ーゼ、ノイラミナダーゼ、ブチラートエステラーゼ、リ
パーゼ類、酸ホスファターゼ、ピログルタミルアミノペ
プチダーゼ、Ｌ−アラニンアミノペプチダーゼ、アリー
ルアミノペプチダーゼ類、コアギュロース、ウレアー
ゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、および
他のペルオキシダーゼ類である。

【００４２】使用される基質ならびに吸収を読み取る波
長は、信号を生成させるために用いられる個々の酵素に
よって決定される。使用する酵素の型は、部分的には、
求められる因子の型によって決定され得る。例えばホス
ホジエステラーゼ類またはヌクレアーゼ類は、標的及び
相補的ポリヌクレオチドの消化をもたらし得るため、一
般には使用されない。同様に、標的ポリヌクレオチドと
の複合体形成に蛋白が含まれると信ぜられる場合は、ペ
プチダーゼの使用は賢明でないかも知れない。

【００４３】信号を生成させるその他の好ましい手段
は、蛍光生成基質、放射性信号および電気的または磁性
信号の使用を含む。相補的ポリヌクレオチドと複合体生
成した（直接的または間接的に）蛍光生成基質は、ハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドを定量する迅速な手段
を提供する。蛍光生成基質の例は、フルオレセインイソ
チオシアナート、テキサスレッド、ローダミンイソチオ
シアナート、スルホローダミン、ルシフェラーゼ、エオ
シンイソチオシアナート、ダンシルクロリド、トリフル
オロメチルクマリン、フタルジアルデヒド、キノリジノ
−置換フルオレセインイソチオシアナート、およびテト
ラメチルローダミンイソチオシアナートを包含する。蛍
光色素は、しばしばピリミジン環のＣ５位に結合してい
るアリルアミンリンカーの腕を介してポリヌクレオチド
に取り込むことができる。

【００４４】蛍光の迅速な定量は、微量定量プレートの
読み取りが可能な市販の蛍光計（分光蛍光計）を用いて
実施することができる。放射光の波長および受光フィル
ターは、使用される個々の蛍光生成基質に依存する。

【００４５】信号生成部分として使用される放射性同位
体の好ましい例は、燐−３２、ヨウ素−１２５、炭素−
１４、トリチウム、および硫黄−３５である。相補的ポ
リヌクレオチドに放射性信号を結合させる方法は、使用
される放射性同位体、および信号生成部分と相補的ポリ
ヌクレオチドとの直接的または間接的付着があるかどう
かによる。例えば、燐−３２は、燐酸化反応の使用によ
って相補的ポリヌクレオチド中に直接統合され得る。
Ｔ．マニアティス等、モレキュラー・クローニング、ア
・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ）１２３−１２５頁（１９８２）。

【００４６】信号生成部分および相補的ポリヌクレオチ
ドを結合する間接的方法は、リガンド／レセプター相互
作用を使用する。使用されるリガンドおよびレセプター
対の型は、部分的には、リガンド／レセプター対が試験
系の表面への標的ポリヌクレオチドの結合に使用された
か否かによって決定されるであろう。先に使用されたも
のと同じリガンド／レセプター対の使用は、高いレベル
のバックグラウンドをもたらし得る。

【００４７】相補的ポリヌクレオチドへの信号生成部分
の結合のための好ましいリガンドおよびレセプターの対
は、アビジンおよびビオチン、ストレプトアビジンおよ
びビオチン、レクチンおよび糖類、抗原および抗体、な
らびにレセプターおよびホルモンである。相補的ポリヌ
クレオチドおよび信号生成部分の結合のための一つの特
に好ましいリガンドおよびレセプター対は、ジゴキシゲ
ニンおよび抗ジゴキシゲニン抗体である。ビオチンと同
様にジゴキシゲニンはリンカーを介してピリミジン環の
Ｃ５位に結合する。ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ
は、ニック翻訳または無作為プライミング合成によって
ＤＮＡ中に取り込まれ得る。アウスベル等、上記（３．
１８．４において）。

【００４８】次に、信号生成部分と共有結合で複合体形
成した抗ジゴキシゲニン抗体を用いて、ジゴキシゲニン
／抗体複合体によって仲介される、相補的ポリヌクレオ
チドに対する信号生成部分の間接的結合を作り出す。信
号生成部分は、信号生成部分がポリヌクレオチドに結合
するのと殆ど同じように抗体に結合する。例えば、酵素
西洋ワサビペルオキシダーゼはヘテロ二官能性架橋剤に
よって抗体に結合させることができる。信号の生成は、
信号生成部分が相補的ポリヌクレオチドに直接結合する
ときに行なわれる。

【００４９】以下の実施例は本発明に使用される方法を
さらに例示するものである。実施例は例示の目的にのみ
提供されるものであって、いかなる方法によっても本発
明の範囲を限定するものと解してはならない。

【００５０】本実施例に使用される用語および略語は、
別途指定の無い限りそれらの通常の意義を有する。例え
ば「℃」は摂氏を意味し、「ｒＲＮＡ」はリボゾームリ
ボ核酸を意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、
「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「Ｍ」はモルま
たはモル濃度を意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味
し、そして「μｇ」はマイクログラムを意味する。

【００５１】

【実施例】

実施例１ 直接的標的結合／直接的信号生成法を用いた
淡水中のコリシンの検出

【００５２】ハイブリダイゼーション緩衝液［５ｘＳＳ
Ｃ緩衝液（０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．０７５Ｍク
エン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％Ｎ−ラウロ
イルサルコシン、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム］
に入れた、配列： ５'−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧ−３' を有する標的オリゴヌクレオチドの５ｎｇ／ｍｌ溶液２
００μｌを添加することにより、９６ウェルの高結合平
底微量定量プレート（例えばコスター、ノースアンバー
ランド、英国、カタログ番号３５９０）のウェルに標的
オリゴヌクレオチドを結合させる。この配列は、多くの
コリシンにおいて保存されている１６ＳｒＲＮＡの領域
に対応する。Ｄ．レイン等、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１５
１５７（１９９０年１２月１３日公開）。この被覆反応
を４℃で一夜進行させる。

【００５３】結合していないオリゴヌクレオチドを含む
上清を吸引によって除いた後、ウェル表面の非結合活性
化部位を、ハイブリダイゼーション緩衝液中の牛血清ア
ルブミンの５０μｇ／ｍｌ溶液２００μｌを加えること
によって飽和させる。この反応を４℃でさらに４時間イ
ンキュベートする。次いでプレートを滅菌蒸留水で一回
洗浄して非結合ＢＳＡを除去する。

【００５４】次いで各実験ウェルに２００μｌの試験す
べき水を加える。負の対照ウェルの各々には試料の水は
加えない。試料の水は、蛋白および粒子を保持し非結合
核酸を通過させるニトロセルロースフィルターまたはサ
イズ排除膜のいずれかによって最初に濾過することがで
きる。試料の水と標的オリゴヌクレオチドとの反応を室
温で１時間インキュベートする。次いで各ウェルを３ｘ
ＳＳＣ緩衝液（０．４５Ｍ塩化ナトリウム、０．０４５
Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）］で１回洗浄し
て、結合していない物質を除く。

【００５５】フルオレセインイソチオシアナートに共有
結合で結合させた、配列： ５'−ＦＩＴＣ−ＡＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴ−３' を有する相補的オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼ
ーション緩衝液に入れた該複合体の２ｎｇ／ｍｌ溶液２
００μｌを各ウェルに添加することにより、反応へと導
入する。このハイブリダイゼーション反応を室温で少な
くとも１時間進行させる。次いで各ウェルを３ｘＳＳＣ
緩衝液で３回洗浄して、ハイブリダイズしていないオリ
ゴヌクレオチド／フルオレセイン複合体を除去する。

【００５６】蛍光の強度を、青色光の励起光線および４
５０−４９０ｎｍのフィルターを備えた蛍光計を用いて
測定することができる。試料の水を加えなかった負の対
照ウェルに対する実験ウェルの蛍光信号の低下は、陽性
の結果を示している。

【００５７】実施例２ 間接的標的結合／直接的信号生
成法を用いた、薬学的試料中の真核生物または原核生物
の検出

【００５８】９６ウェルの高結合平底微量定量プレート
の各ウェルを、０．０５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ
９．６）中のストレプトアビジンの１５μｇ／ｍｌ溶液
２００μｌの添加によって予備被覆する。この予備被覆
反応を４℃で一夜インキュベートする。次にプレートを
蒸留水で１回洗浄して非結合ストレプトアビジンを除去
する。

【００５９】ビオチン化標的オリゴヌクレオチド（ハイ
ブリダイゼーション緩衝液中２ｎｇ／ｍｌ）２００μｌ
を各ウェルに加えることにより標的オリゴヌクレオチド
を導入する。標的オリゴヌクレオチドの配列は、 ５'−ビオチン−ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＴ−３' である。この配列は、ジョバノーニ等、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１７０巻７２０、７２２頁（１９
８８）に記載の普遍プローブに対応する。この混合物を
室温で１時間インキュベートする。次いで各ウェルを３
ｘＳＳＣ緩衝液で１回洗浄して、捕捉されなかったオリ
ゴヌクレオチドを除去する。

【００６０】次に、各実験ウェルに、複雑な流体、この
例においては血清を２００μｌ添加する。信号の生成を
最適なものとするため、血清の幾つかの希釈液を使用す
る。試料は滅菌ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈す
る。この反応を室温で１時間インキュベートする。各ウ
ェルを３ｘＳＳＣ緩衝液で１回洗浄する。

【００６１】ハイブリダイゼーション緩衝液中の西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合させた相補的オリゴヌクレ
オチドの２ｎｇ／ｍｌ溶液２００μｌを各ウェルに添加
することにより、配列： ５'−ＨＲＰ−Ｓ−ＡＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴ−３' を有する相補的オリゴヌクレオチドを反応中に組み入れ
る。ハイブリダイゼーション反応は室温で少なくとも１
時間進行させる。次いで各ウェルを３ｘＳＳＣで３回洗
浄して、ハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチド
／酵素複合体を除去し、それによりバックグラウンド信
号を減少させる。

【００６２】ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド
基質［４０ｍｇＯＰＤ／１００ｍｌ燐酸−クエン酸緩衝
液（０．２Ｍ二塩基性燐酸ナトリウム２５．７ｍｌ、
０．１Ｍクエン酸２４．３ｍｌ、水５０ｍｌ、ｐＨ５．
０）］２００μｌを各ウェルに加えることにより、信号
を生成させる。対照反応において所望の光学密度に到達
するまで反応を室温で進行させる。対照の光学密度がお
よそ１．０であることが望ましい。

【００６３】５Ｎ硫酸５０μｌの添加によって反応を停
止させる。次いでプレートを、微量定量プレート読み取
り機上で４９２ｎｍにおいて分光光度的に読み取る。負
の対照として働くウェルの信号に比較した発色性基質か
らの信号の低下は、陽性の結果を示す。

【００６４】実施例３ 直接的標的結合／間接的信号生
成法を用いた、培養細胞の上清に存在するＨＩＶ−１
Ｒｅｖ蛋白の検出

【００６５】ハイブリダイゼーション緩衝液中の、配
列： ５'−ＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡ−３' を有する標的ホスホロチオアート化オリゴリボヌクレオ
チドの５ｎｇ／ｍｌ溶液２００μｌを各ウェルに加える
ことにより、標的オリゴリボヌクレオチドをウェルに結
合させる。この配列はＨＩＶ−１ ＲＮＡのＲｅｖ応答
要素に対応する。Ｔ．Ｊ．ダリー等、ネイチャー（ロン
ドン）（Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ））３４２巻８１
６−８１９頁（１９８９）；Ｓ．デフラー等、プロシー
ディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ、ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）８７巻４５７１−４５７
５頁（１９９０）。所望ならば胎盤ＲＮアーゼ阻害剤１
０単位を各ウェルに加えることができる。この結合反応
を４℃で一夜進行させる。非結合オリゴヌクレオチドを
含む上清を除去した後、ウェル表面の非結合活性化部位
を、ハイブリダイゼーション緩衝液中の牛血清アルブミ
ンの５０μｇ／ｍｌ溶液２００μｌの添加によって飽和
し、これを４℃でさらに少なくとも４時間インキュベー
トする。次いでプレートを滅菌蒸留水で１回洗浄して非
結合ＢＳＡを除く。

【００６６】次に、培養細胞からの上清２００μｌを各
ウェルに加える。培養細胞の上清と標的オリゴヌクレオ
チドとの反応を室温で１時間インキュベートする。次い
で各ウェルを３ｘＳＳＣ緩衝液で１回洗浄して非結合物
質を除く。

【００６７】ハイブリダイゼーション緩衝液中のビオチ
ン化オリゴヌクレオチドの２ｎｇ／ｍｌ溶液２００μｌ
を各ウェルに加えることにより、配列： ５'ビオチン−ＴＣＧＧＣＣＣＡＴＡＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴ−３' を有する相補的オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリ
ダイズする。ハイブリダイゼーション反応は室温で少な
くとも１時間インキュベートさせる。次いで各ウェルを
３ｘＳＳＣで３回洗浄して、ハイブリダイズしなかった
オリゴヌクレオチド／リガンド複合体を除去する。

【００６８】蛍光色素テキサスレッドと複合体形成させ
たアビジンの５μｇ／ｍｌ溶液２００μｌを添加するこ
とにより、信号を生成させる。結合したビオチンおよび
アビジン間の反応を室温で１時間インキュベートする。
次いで各ウェルを３ｘＳＳＣ緩衝液で３回洗浄して、非
結合アビジン／テキサスレッド複合体を除去する。対照
試料に比較した蛍光源の減少は、５１０−５６０ｎｍの
フィルターを備えた蛍光計を用いて定量することができ
る。

【００６９】実施例４ 間接的標的結合／間接的信号生
成法を用いた痰試料からのマイコバクテリウム・トゥバ
キュローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｒＲＮＡの検出

【００７０】９６ウェルの高結合平底微量定量プレート
を、各ウェルに０．０５Ｍ炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ
９．６）中のストレプトアビジンの１５μｇ／ｍｌ溶液
２００μｌを添加することによって予備被覆する。この
被覆反応を４℃で一夜進行させる。プレートを滅菌蒸留
水で１回洗浄して非結合ストレプトアビジンを除去す
る。

【００７１】次に、ハイブリダイゼーション緩衝液中に
２ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、配列： ５'−ビオチン−ＧＣＣＣＴＡＣＧＴＡＣＡＧＡＡＣＡ−３' を有するビオチン化オリゴヌクレオチド２００μｌを各
ウェルに加える。このリガンド／レセプター反応を室温
で１時間インキュベートさせる。次いで各ウェルを３ｘ
ＳＳＣ緩衝液で１回洗浄して非結合オリゴヌクレオチド
を除去する。

【００７２】ハイブリダイゼーション緩衝液で連続的に
希釈した痰２００μｌを各ウェルに加える。この反応を
３０℃で１時間インキュベートする。次いでプレートを
３ｘＳＳＣ緩衝液で１回洗浄する。

【００７３】１１原子のスペーサーを介してウリジン三
燐酸に結合させたジゴキシゲニン（ｄｉｇＵ）を幾つか
のチミジン三燐酸に代えて取り込ませた、配列： 5'-TG-digU-TC-digU-G-digU-ACG-digU-AGGGC-3' を有する相補的ポリヌクレオチドを、ハイブリダイゼー
ション緩衝液中の置換ポリヌクレオチドの５ｎｇ／ｍｌ
溶液２００μｌの添加によって、反応中に導入する。こ
のハイブリダイゼーション反応を４５℃で少なくとも１
時間インキュベートする。次いでウェルを３ｘＳＳＣ緩
衝液で３回洗浄する。

【００７４】アルカリホスファターゼに共有結合で結合
させた抗ジゴキシゲニン抗体（Ｆａｂフラグメント）の
添加により、信号生成部分を反応中に入れる。次に、燐
酸緩衝化塩水中の抗ジゴキシゲニン抗体／アルカリホス
ファターゼ複合体２００μｌ（２μｇ）を各ウェルに加
える。抗体／抗原結合反応を室温で１時間インキュベー
トする。次いでウェルを３ｘＳＳＣ緩衝液で１回洗浄し
て非結合抗体／酵素複合体を除去する。

【００７５】アルカリホスファターゼの基質ｐ−ニトロ
フェニルホスファート（０．０５Ｍ炭酸ナトリウムおよ
び０．０５ｍＭ塩化マグネシウム中３ｍＭ ＮＰＰ）２
００μｌの添加により信号を生成させる。この加水分解
反応を室温で少なくとも１時間、または対照が所望の光
学密度（約Ｏ．Ｄ．１．０）に到達するまでインキュベ
ートする。次いで０．５Ｍ水酸化ナトリウム２５μｌの
添加によって反応を停止させる。ウェルを４０５ｎｍに
おいて分光光度的に読み取る。負の対照として働くウェ
ルに比較した発色性基質からの信号の減少は、陽性の結
果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レイモンド・チェ−フォン・ヤオ アメリカ合衆国46032インディアナ州カー メル、ウッドゲイト・ドライブ1189番

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標的ポリヌクレオチドに結合する化合物
   を検出する方法であって、 ａ．該標的ポリヌクレオチドを、容器系を含むまたは容
   器系内に含まれる固体支持体に固定し； ｂ．標的ポリヌクレオチドに対して相補的な第二のポリ
   ヌクレオチドのハイブリダイゼーションをブロックする
   化合物の結合した該標的ポリヌクレオチドからなるもの
   を形成させ［ここで第二のポリヌクレオチドは、検出可
   能な信号を生成することのできる標識部分を結合させて
   ある］； ｃ．該信号を生成させ；そして、 ｄ．対照に比較した該信号の減少を検出する、 ことからなる方法。
2. 【請求項２】 標的ポリヌクレオチドに結合する化合物
   を検出する方法であって、 ａ．レセプターを、容器系を含むまたは容器系内に含ま
   れる固体支持体に固定し； ｂ．該レセプターに、レセプターによって認識されるリ
   ガンドに結合した標的ポリヌクレオチドを複合体形成さ
   せ； ｃ．標的ポリヌクレオチドに対して相補的な第二のポリ
   ヌクレオチドのハイブリダイゼーションをブロックする
   化合物の結合した該標的ポリヌクレオチドからなるもの
   を形成させ［ここで第二のポリヌクレオチドは、検出可
   能な信号を生成することのできる標識部分を結合させて
   ある］； ｄ．該信号を生成させ；そして、 ｅ．対照に比較した該信号の減少を検出する、 ことからなる方法。
3. 【請求項３】 標的ポリヌクレオチドに結合する化合物
   を検出する方法であって、 ａ．レセプターを、容器系を含むまたは容器系内に含ま
   れる固体支持体に固定し； ｂ．該レセプターに、レセプターによって認識されるリ
   ガンドに結合した標的ポリヌクレオチドを複合体形成さ
   せ； ｃ．標的ポリヌクレオチドに対して相補的な第二のポリ
   ヌクレオチドのハイブリダイゼーションをブロックする
   化合物の結合した該標的ポリヌクレオチド配列からなる
   ものを形成させ［ここで第二のポリヌクレオチドは、第
   二のレセプターと結合することのできる第二のリガンド
   を結合させてある］； ｄ．第二のリガンドおよび第二のレセプターの間に複合
   体を形成させ［ここで第二のレセプターは、検出可能な
   信号を生成することのできる標識部分を結合させてあ
   る］； ｅ．該信号を生成させ；そして、 ｆ．対照に比較した該信号の減少を検出する、 ことからなる方法。
4. 【請求項４】 標的ポリヌクレオチドに結合する化合物
   を検出する方法であって、 ａ．該標的ポリヌクレオチドを、容器系を含むまたは容
   器系内に含まれる固体支持体に固定し； ｂ．標的ポリヌクレオチドに対して相補的な第二のポリ
   ヌクレオチドのハイブリダイゼーションをブロックする
   化合物の結合した該標的ポリヌクレオチド配列からなる
   ものを形成させ［ここで第二のポリヌクレオチドは、レ
   セプターに結合することのできるリガンドを結合させて
   ある］； ｃ．リガンドおよびレセプターの間に複合体を形成させ
   ［ここで該レセプターは、検出可能な信号を生成するこ
   とのできる標識部分を結合させてある］； ｄ．該信号を生成させ；そして、 ｅ．対照に比較した該信号の減少を検出する、 ことからなる方法。