JPH07500493A - 突然変異の検出法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 突然変異の検出法 背景の説明 試料中の特定の核酸分子の存在を検出できる検定法は、病気の予想及び診断、法 医学、疫学及び公衆衛生において実質的に重要である。そのような検定法は例え ば患者における突然変異遺伝子の存在の検出に用いることができ、患者が遺伝病 に罹る可能性を決定することができる。細胞の発癌遺伝子における個別の突然変 異がその発癌遺伝子を活性化し、その細胞を癌細胞に変換し得るという発見と共 に、癌の早期発見又は癌に罹り易さの発見における突然変異の検出能力の重要性 が増してきた（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ： 　２４３：３１３−３２７　（１９８７）；Ｂｏｓ、Ｊ、Ｌ、、ＣａｎｃｅｒＫ 且）、」旦：　４６８２−４６８９　（１９８９））。

核酸検出検定法は、核酸分子の多くの特性、例えばその寸法、配列、制限エンド ヌクレアーゼにより消化される傾向などのいずれに基づくこともできる。そのよ うな検定法の感度は、検出が報告されるか又は観察者に信号が送られる方法を変 えることにより向上させることができる。

従って例えば検出可能な標識をした試薬を用いることにより検定感度を向上させ ることができる。酵素標識（Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、。

米国特許第４，５８１．３３３号明細書）、放射性同位体標識（Ｆａｔｋｏｗｅ ±　−ａｌ、、米国特許第４．　３５８．　５３５号明細書；　Ｂ　ｅｒｎｉｎ ｇｅｒ、米国特許第４，４４６．２３６号明細書）、蛍光標識（Ａｌｂａｒｅｌ ｌａ　ｅｔ　ａｌ、、欧州特許第１４４９１４号明細書）、化学標識（Ｓｈｅｌ ｄｏｎ　ＩＩＩ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許第４．５８２，７８９号明細書；Ａｌ ｂａｒｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ１．米国特許第４，５６３，４１７号明細書）、修 飾塩基（Ｍｉｙｏｓｈｉ且工　見±、、欧州特許第１１９４４８号明細書）など の多様な標識がこの目的で用いられてきた。

いくつかの核酸検出系が特定の突然変異の検出のために設計され、それはプロー ブと追加の結合パートナ−の組み合わせを含み、後者はレポーターとして働＜ａ 　Ｐａａｕ　ｅｔ　ａｔ、、米国特許第４．　５５６゜６４３号明細書は、標的 −特異的配列及び蛋白質−結合配列を有するポリヌクレオチドプローブを開示し ている。はとんどの場合そのような蛋白質−結合配列は、標的−特異的セグメン トに連結されたＤＮＡの外部セグメント（ｅｘｔｒａ　ｓｅｇｍｅｎｔ）である 。用いられる結合蛋白質は、蛋白質−酵素複合体などの蛋白質−マーカー複合体 の一部であることができる（ｌｌｌＩ７、行７−１０）。開示されている結合蛋 白質はＤＮＡ−修飾酵素、ポリメラーゼ、ラクトースリプレッサー又は抗原性Ｄ ＮＡ配列である（欄７、行１Ｏ−２９）。この参照文献に記載されていルフロー フノ典型的例（実施例Ｔ、？！１１１２及び１３）は、ｃＤＮＡ分子（標的ＤＮ Ａ配列とハイブリッド形成できる）であり、それにＴ７プロモーター（蛋白質結 合配列）が連結されている。このプローブのハイブリッド形成の後にＥ、コリ（ Ｅ、ｃｏ　Ｉ　１）ＲＮＡポリメラーゼが結合蛋白質として加えられ、Ｔ７プロ モーターに結合する。結合したＲＮＡポリメラーゼの存在は、ポリメラーゼに特 異的なウサギ抗血清、及びその後パーオキシダーゼー複合化ヒツジ−抗つサギ第 ２抗体、ならびにパーオキ、シダーゼー抗−パーオキシダーゼ検出系により検出 される。

Ｍｕｎｄｙ、米国特許第４，６５６，１２７号明細書は、特定のヌクレオチド塩 基の突然変異を検出する方法を開示しており、それは問題の領域の配列がわかっ ていることが必要であり（ｌｌｌｌ１１、行５２−４３）、突然変異が制限部位 にな（でも良いという利点を有する。突然変異の部位から１方向に延びる核酸鎖 の一部に相補的な直鎖状プローブが提示されている。ハイブリッド形成の後に、 特定の塩基配列が存在するが不在かに依存してプローブの末端に結合するヌクレ オチド誘導体が加えられる。１本鎖部分は消化される。その後プローブの存在又 は不在が検出さレル（ｌＩＩＩ２、行３−２２）。参照文献ではヌクレオチド誘 導体としてチオヌクレオチドが考えられており（欄４、行４６−５１）、それは 検出可能な標識をすることにより検出される。

Ｋａｔｏ　ｅ工　見↓　、欧州特許公開第４０７，７８９号明細書は、標識プロ ーブを用いたハイブリッド形成に基づく核酸の検出法を開示している。非放射性 標識の中に、ビオチン−アビジン系を用いた酵素及び蛍光が挙げられている（頁 ２、行３６−３９）。標識の例はビオチン−標識ｄＵＴＰであり、合成によりプ ローブ中に挿入される。

核酸ハイブリッドにおけるミスマツチ塩基対の検出のために設計された多くの方 法が当該技術分野において既知である。初期の方法はミスマツチの酵素切断に基 づいていた（Ｇｉｂｂｓ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３６：３０３ −３０５　（１９８７））、　これらの方法はミスマツチＤＮＡハイブリッドを 酵素により切断する段階を含む。これらの方法の欠点の１つは、すべてのミスマ ツチを確実には検出しないことである。最近記載されたミスマツチＤＮＡの切断 のための化学的方法（Ｃｏｔｔｏｎ、Ｒ，Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ｓｃｉ。

８９））は多（の試薬、特に四酸化オスミウム及びヒドロキシルアミンヲ用イた ＤＮＡ−ＤＮＡへテロ２本鎖におけるミスマツチ部位の化学的切断に基づく。こ の方法の場合、ＤＮＡプローブは問題のＤＮＡの制限酵素切断により調製される 。問題の配列を含むプラスミドＤＮＡを標識プローブＤＮＡ　（”Ｐを用いた末 端−標識又は内部標識）にハイブリッド形成させる。ヒドロキシルアミンはミス マツチしたシトシンを化学的に修飾し、四酸化オスミウムはミスマツチしたチミ ンを修飾する。その後ピペリジンを用いて修飾部位でＤＮＡを切断し、続いてポ リアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びオートラジオグラフィーを行い 、切断生成物を同定する。この方法は、ミスマツチに隣接する正常の塩基対での 切断も生ずるので、すべての可能な１個のミスマツチ塩基誤射を検出するという 利点を有すると言われている。

Ｃａ５ｋｅｙ及び共同研究者等は突然変異の位置決定の方法を開示しており、そ れはミスマツチ切断反応のための鋳型源としてＰＣＲ−増幅ｃＤＮＡを用いる。

この方法はオルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣａｓｅ）欠乏症患者の 研究で突然変異のマツピングに適用された。

Ｋｕｎｇ　ｅｔ　且↓　、米国特許第４．９６３，６５８号明細書は、高親和性 ５ｓＤＮＡ−結合蛋白質、例えばトポイソメラーゼ又はそれ自身が標識に結合で きるＤＮＡ巻戻し蛋白質（欄２、行４４−４７）、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダ ーゼ（ｔ！＄１７、行１）との結合による、１本鎖ＤＮＡ　（ｓｓＤＮＡ）の検 出につき開示している。

現在利用できる検定法の用途及び適用性を増す望みは多くの場合、感度ならびに 複雑性及び経費により失敗してきた。従ってより感度が高く、簡単で、比較的安 価な、ＤＮＡにおける改変の検出のための検定法の開発が非常に望まれている。

発明の概略 本発明は配列中に１塩基の変化のような小さい変化を含む核酸配列の突然変異を 検出する方法に関する。試料中に標的ポリヌクレオチドが存在する程度も決定す ることができる。本方法はＥ、コリ及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の ＭｕｔＳ蛋白質を例とするミス’ｖ−／チー結合蛋白質の利用に基づいている。

本明細書で用いられる標的ポリヌクレオチドという用語は検出されるべき核酸配 列である。突然変異を含まない標的ポリヌクレオチド配列（非改変形態）は、非 突然変異標的ポリヌクレオチド又は非突然変異標的配列と言われる。突然変異又 は改変を含む標的ポリヌクレオチド配列は、突然変異標的ポリヌクレオチドと言 われる。本方法は、例えば突然変異発癌遺伝子の存在を検出することにより、多 様な重要疾患状態又は罹り易さを診断するのにに有用である。方。

法はＰＣＨに基づく方法の効率に関する利点を共有するが、実施することがもっ と簡単で安価である。発明者等は本発明の方法を行うためのキットの考案も行っ た。

分析するＤＮＡは血液細胞、精子又は生物、好ましくはヒトの組織から得たＤＮ Ａなどのいずれの種類であることもできる。本発明の方法はＰＣＲで用いられる ような精巧な、又は高価な装置を必要とせず、洗練率ＤＮＡに同一の処理が行わ れるように内部制御することができる。最後に方法は、例えば膜フィルター上の 着色“プラス”又は“マイナス”の印などの、簡単で解釈の容易な結果を与える ように設計すること力（できる。

本発明は２つの重要要素に基づいている。第１は誤対合又は非対合塩基を含む核 酸へテロ２本鎖に結合する蛋白質の存在である。そのようなミスマツチ−結合蛋 白質の周知の例はバクテリア蛋白質、例えばＤＮＡ修復において機能するＥ　コ リのＭｕｔＳ蛋白質である。第２の要素は特定の遺伝子及びその突然変異対立遺 伝子の単離及び配列決定が比較的容易であることである。

かくして本発明は、試料中の１本鎖ポリヌクレオチド（又は標的ポリヌクレオチ ド）の配列中に突然変異が存在するかどうかを決定する方法を目的とする。すな わちそれは突然変異標的ポリヌクレオチドの検出、あるいはポリヌクレオチド（ ＤＮＡ又はＲＮＡ）中に突然変異が存在（又は不在）するかどうかの決定の方法 である。

方法において、突然変異標的ポリヌクレオチドに関して分析さ第１る試料は、非 突然変異標的ポリヌクレオチドの配列と相補的な少なくとも１個の１末鎖塩基配 列である１本鎖ポリヌクレオチドハイブリツド形成ノ々−トナーと箕にインキュ ベートされる。ハイブリッド形成ノ（−トナー及び、突然変異標的ポリヌクレオ チドに関して評価されるポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ試料）は、 ノ１イブ１ルツド形成ノクートナーカ（試料中に存在し得るいずれの突然変異又 は非突然変異樟的ポリヌクレオチドともハイブリッド形成するために適した条件 下でインキュベートされる。相補的配列が／シブリッド形成すると、）１イブリ ・ノド形成ノ（−トナーと標的ポリヌクレオチドのハイブリッドが形成される。

形成されたハイブリッドを、ミスマツチ−結合蛋白質が突然変異標的ポリヌクレ オチドに結合するのに適した条件下で、ミスマツチ−結合蛋白質と合わせる、又 は接触させる。これによりミスマツチ−結合蛋白質が、標的ポリヌクレオチドが 突然変異標的ポリヌクレオチドであるハイブリッドに結合することになる。ハイ ブリッドに結合したミスマツチ−結合蛋白質の存在の検出は、試料中のポリヌク レオチドの配列中に突然変異が存在することを示す（すなわち突然変異標的ポリ ヌクレオチドの存在を示す）。

上記において、ハイブリッド形成パートナ−はＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ又は合成 オリゴヌクレオチドであることが好ましい。標的ポリヌクレオチドはＤＮＡ又は ＲＮＡであることができる。好ましいＲＮＡはｍＲＮＡである。

上記の方法で、好ましいミスマツチ−結合蛋白質はＭｕｔＳｉ白質あるいはその 機能的誘導体である。

方法の態様の１つにおいて試料は、存在するいずれの核酸も放出し、変性する（ １本鎖とする）のに十分な状態に会わせた生物学的液体である。場合により放出 された核酸につき、変性の前に制限エンドヌクレアーゼ切断の段階を行う。

ある態様の場合、ポリヌクレオチドハイブリッド形成パートナ−を固体担体上に 固定し、得られた固体担体−結合ハイブリッド形成パートナ−を突然変異標的ポ リヌクレオチドの存在に関して評価されるべきポリヌクレオチドの試料と共にイ ンキュベートする。好ましい固体担体はニトロセルロース膜である。

検出段階は、ミスマツチ−結合蛋白質と結合する検出可能な標識をした第１結合 パートナーを加えることを含むのが好ましい。第１結合パートナーは例えばミス マツチ−結合蛋白質に特異的な抗体、又は検出される着色反応生成物の形成を触 媒する酵素であることができる。

他の態様の場合、検出段階はミスマツチ−結合蛋白質と結合し、検出可能な標識 をされていない第１結合パートナー１及び第１結合パートナーと結合する第２結 合パートナーを加え、第２結合パートナーの存在を検出することを含む。第２結 合パートナーはそれ自身検出可能な標識をされていることができ、又は第２結合 パートナーに結合する検出可能な標識をされた第３結合パートナーを用いること もできる。好ましい第２結合パートナーは第１結合パートナーに関する抗体であ る。他の態様の場合、第２結合パートナーはＭｕｔＬ蛋白質又はその機能的誘導 体、好ましくはＭｕｔＬと検出の可能な第２蛋白質又はペプチドの間の融合蛋白 質である。融合蛋白質における好ましい第２蛋白質はベーターガラクトシダーゼ である。

他の態様の場合、ミスマツチ−結合蛋白質は融合蛋白質の１成分であり、その第 ２成分は直接（すなわちそれ自身が検出可能）又は間接的に（すなわち検出可能 な試薬を用いて）検出することができる第２蛋白質又はペプチドである。この態 様の場合、検出段階は融合蛋白質中に存在する第２蛋白質又はペプチドと結合す る、検出可能な標識をした結合パートナ−を加えることを含むのが好ましい。第 ２蛋白質は色素原酵素基質からの着色反応生成物の形成を触媒することができる 酵素であることができる。検出段階は、色素原基質を与えて着色反応生成物を視 覚化することを含む。好ましい第２蛋白質はベーターガラクトシダーゼである。

本発明はさらに、試料中の１本鎖樟的哺乳類ポリヌクレオチドの非突然変異配列 から突然変異配列を検出（区別）する方法を目的とする。この方法では既知の方 法を用いて哺乳類ポリヌクレオチドの試料（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を得る。例えば ＤＮＡ又はＲＮＡを細胞から得、それを処理して１本鎖とし、非突然変異標的哺 乳類ポリヌクレオチドの配列と相補的である少なくとも１つの１本鎖塩基配列で ある１本鎖ポリヌクレオチドハイブリッド形成パートナ−と共にインキュベート することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡ及びハイブリッド形成パートナ−を、ハイ ブリッド形成パートナ−が試料中に存在し得るいずれの突然変異又は非突然変異 標的ポリヌクレオチドとむハイブリッド形成するために適した条件下でインキュ ベートする。相補的配列がハイブリッド形成すると、ハイブリッド形成パートナ −と標的ポリヌクレオチドのハイブリッドが形成される。形成されたノゾブリッ ドを、標的ポリヌクレオチドが突然変異標的ポリヌクレオチドであるハイブリッ ドとミスマツチ−結合蛋白質が結合するのに適した条件下で、ミスマツチ−結合 蛋白質と合わせる、又は接触させる。ハイブリッドに結合したミスマツチ−結合 蛋白質の存在の検出は、試料の哺乳類ポリヌクレオチドの配列中に突然変異が存 在することを示す（すなわち突然変異標的ポリヌクレオチドの存在を示す）。

本発明は試料中の突然変異配列ポリヌクレオチドの検出（非突然変異標的ポリヌ クレオチド配列からの突然変異標的ポリヌクレオチドの区別）に有用なキットを 含む。キットは以下を含む・（ａ）標的ポリヌクレオチドの非突然変異配列に相 補的（すなわち非突然変異標的ポリヌクレオチドに相補的）な少なくとも１個の １本鎖塩基配列を含む１本鎖ポリヌクレオチドハイブリッド形成パートナ−を含 む第１容器： （ｂ）ミスマツチ−結合蛋白質を含む第２容器：及び（Ｃ）ミスマツチ−結合蛋 白質のハイブリッドへの結合を検出することができる試薬又は試薬群を含む第３ 容器あるいは複数の容器。

上記のキットにおいて、ミスマツチ−結合蛋白質はＭｕｔＳ又はその機能的誘導 体が好ましい。試薬又は試薬群は、ミスマツチ−結合蛋白質に結合することがで きる検出可能な標識をされた第１結合パートナーを少なくとも１個含むのが好ま しい。好ましい第１結合パートナーはミスマツチ−結合蛋白質に特異的な抗体で ある。

キットの別の態様の場合、試薬又は試薬群は検出可能な標識をされていない第１ 結合パートナーを含み、第１結合パートナーはミスマツチ−結合蛋白質と結合す ることができ、抗体などの第２結合パートナーが第１結合パートナーに結合する ことができる。第２結合パートナーは検出可能な標識をされていることができる 。第２結合パートナーが標識されておらず、第２結合パートナーに結合すること ができ、検出可能な標識をされた第３結合パートナーを含むキットも意図されて いる。

好ましいキットの態様の場合、第１結合パートナーはＭｕ　ｔ　ＬｆＪ白質又は その機能的誘導体、例えばＭｕｔＬと検出できる第２蛋白質又はペプチド、好ま しくはβ−ガラクトシダーゼの間の融合蛋白質である。第２結合パートナーはＭ ｕｔＬ蛋白質又はその融合パートナ−蛋白質に結合することができ、例えばβ− ガラクトシダーゼに特異的な抗体である。

上記のキットにおいて、ハイブリッド形成パートナ−は固体担体上に固定されて いるのが好ましい。好ましい固体担体はニトロセルロース膜である。

キットの他の態様において、ミスマツチ−結合蛋白質は酵素と融合した融合蛋白 質であり、試薬は酵素に関する色素原基質を含む。

図面の簡単な説明 図１はオリゴヌクレオチドの形態のハイブリッド形成パートナ−又はｃＤＮＡハ イブリッド形成パートナ−の、試験又は“標的”ＤＮＡとのハイブリッド形成を 示す略図である。図の下部はミスマツチ含有ハイブリッドの形状を示す。ｃＤＮ ＡがゲノムＤＮＡフラグメントとハイブリッド形成した場合、ゲノムＤＮＡの非 ハイブリッド形成部分（イントロン）は環状に突き出ることが示されている。

図２は本発明の突然変異検出検定の略図である。この特定の態様の場合、ミスマ ツチ−結合蛋白質の存在は、ミスマツチ−結合蛋白質に特異的な抗体である第１ 結合パートナーを用いて検出される。この抗体は検出可能な標識をされることが でき、又は検出可能な標識をされた試薬により検出されることができる（右下） 。代わりに検出段階は第２結合パートナー１この場合第１抗体に特異的な抗体（ “抗−Ａｂ　（Ａｎ　ｔ　ｉ　−Ａｂ）”）を用いて増幅することができる（左 下）。

図３は実施例に記載されている特定の検定型式の略図であり、この場合圧及び負 の標準がニトロセルロースフィルター上に置かれており、ミスマツチが存在しな い場合に目に見える“マイナス”の印が得られ、標的ＤＮＡが突然変異（ミスマ ツチ）を含む場合に目に見える”プラス”の印が得られる。

図４は溶液中でアニールされたヘテロ２本鎖におけるミスマツチ検出の結果を示 す。

図５は固定オリゴヌクレオチドにアニールされたヘテロ２本鎖におけるミスマツ チ検出の結果を示す。

図６は競争オリゴヌクレオチドの存在下でアニールされたベテロ２本鎖における ミスマツチ検出の結果を示す。

好ましい態様の説明 本発明者等は、１個の塩基の変化のような小さい改変でさえＤＮＡ配列中の改変 を検出するための、広く適用でき、比較的簡単な新規方法を計画した。バクテリ アＤＮＡのミスマツチ修復機構は、塩基対のミスマツチを含む２本鎖ＤＮＡを認 識してそれと結合する１個の蛋白質又は蛋白Ｓ蛋白質はＥ、コリのミスマツチ修 復系におけるそのような成分とじてＮａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３ ：５０５７−５０６１　（１９８６）；Ｄｏｈｅｔ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：５０３−５０５　（１９８５ ）；Ｃｈｏｙ。

Ｈ，Ｅ、　を匹　ａｌ、、Ｍｕｔａｔ、Ｒｅｓ、１４２：９３−９７（１９８５ ）；Ｊｏｎｅｓ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｌ、１旦４　： 　５６２−５６３　（１９８１））。サルモネラ　チフィムリウム（Ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のＭｕｔＳ（Ｌｕ、Ａ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ 、、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１８：５９３−６００　（１９８８）；Ｈａｂｅｒ、 Ｌ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１ヱＯ＋１９７−２０２　（ １９８８）：　Ｐａｎｇ、Ｐ。

Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６３：１００７−１０１５　（ １９８５）　）及Ｕストレプトコックス　ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ ｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のｈｅｘＡ蛋白質（Ｐｒｉｅｂｅ、Ｓ、Ｄ、 ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１７０＋１９０−１９６　（１９８８）　：Ｈａｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、同上 ）を含む類似の蛋白質が他のバクテリア種で既知である。

精製ＭｕｔＳ蛋白Ｓ蛋白質マツチ塩基を含むＤＮＡと結合するが、ミスマッチを 含まないＤＮＡ、又は１本鎖ＤＮＡに結合しない。ＭｕｔＳ−ＤＮＡ相互作用は ＤＮＡの分解又は改変を生じない。

本方法は、突然変異ＤＮＡの鎖と野生型ＤＮＡの“相補的”鎖がハイブリッド形 成した場合に形成されるミスマツチＤＮＡへテロ２本鎖の検出に基づいている（ 図１を参照）。ミスマツチの存在は、最初にＭｕｔＳ蛋白Ｓ蛋白質リなどのミス マツチ−結合蛋白質をＤＮＡ２本鏑と結合させることにより、特異性の高い方法 で検出することがで門る。結合したミスマツチ−結合蛋白質の存在を、その後多 くの方法のいずれか１つを用いて、例えばミスマツチ−結合蛋白質に特異的であ り、検出可能な標識をした抗体、例えば抗−ＭｕｔＳ抗体を用いることにより検 出する。

この方法は、ミスマツチ塩基対にて、又はその近辺でＤＮＡを破壊することがで きるミスマツチ切断ヌクレアーゼ酵素を用いる先行技術の方法と対照的に、その まま保つ。この方法の概略に関して、図２を参照せよ。

本発明の方法により、試料中の特定の“標的”核酸分子又はポリヌクレオチドの 存在を検出することができる。そのような試料は典型的に生物試料、例えば血液 、精子、便、血清、尿、唾液、培地など、ならびに非生物試料、例えば排水又は 飲料水、牛乳あるいは他の食物、空気などである。

本発明の方法により検出される標的ポリヌクレオチド又は核酸分子はＤＮＡ又は ＲＮＡであることができるが、ＤＮＡが好ましい。ハイブリッド形成パートナ− がｃＤＮＡの場合、標的核酸はＤＮＡ又はｍＲＮＡであることができ、ｍＲＮＡ がより高いコピー数で存在する。本明細書で用いられる“標的核酸”、“標的ポ リヌクレオチド”又は゛標的配列“という用語は、検出及び／又は定量されるべ き問題の配列を含む核酸を言う。それは野生型配列を含むこともでき、その場合 それは野生型又は非突然変異標的ポリヌクレオチドあるいは非突然変異標的配列 と言われる。別の場合それは改変又は突然変異（野生型から突然変異した）を含 むことができ、その場合それは突然変異標的ポリヌクレオチドと言われる。標的 核酸における標的配列は、ポリヌクレオチド内に改変又は突然変異が存在しても プローブＤＮＡ　（ハイブリッド形成パートナ−）とハイブリッド形成するのに 十分な長さでなくてはならない。標的配列は、本方法により検出されるために３ ０塩基より大きいことが好ましい。態様の１つの場合、ミスマツチ−結合蛋白質 の結合及びそれに続く検出ができるために、標的配列に関する必要なミスマツチ を含む配列を有する“ハイブリッド形成パートナ−”ポリヌクレオチド又はオリ ゴヌクレオチドの構築を可能にするために、標的ヌクレオチド配列が既知でなけ ればならない。

他の態様の場合、ｃＤＮＡ分子がハイブリッド形成パートナ−として用いられる 。この場合、標的ヌクレオチド配列をあらかじめ知る必要はない。ゲノムＤＮＡ フラグメントとｃＤＮＡがハイブリッド形成すると、ｃＤＮＡ中に与えられてい ないイントロンが不対ループを形成しく図１を参照）、これはミスマツチ−結合 蛋白質に検出されないし、１個の塩基不対合又は１−４塩基対の付加又は欠失に よって起こるミスマツチにミスマツチ−結合蛋白質が結合するのを妨げもしない 。

本発明の方法は、多くのより最近考案された突然変異検出検定で共通に必要な、 突然変異標的核酸分子の増幅を必要とせずにそのような分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ ）を検出することができるという利点を有する。本発明は、１個又はそれより多 い野生型標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を有する、ｃＤＮＡ分子を含む１ 個又はそれより多いハイブリッド形成パートナ−オリゴヌクレオチド又はポリヌ クレオチド分子の構築及び利用によりこの目標を達成する。ハイブリッド形成パ ートナ−は標的核酸分子とハイブリッド形成することができ、塩基対のミスマツ チ又は不対塩基が起こった場合、このミスマツチ又は不対塩基がミスマツチ−結 合蛋白質により認識される。

好ましい態様の場合、ハイブリッド形成パートナ−は１本鎖核酸分子であり、１ 本鎖ＤＮＡが最も好ましい。

標的核酸分子は、例えば真核細胞、原核細胞、ウィルス、ウィロイドなどからの ＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。標的核酸分子は哺乳類起源のものが好ま しく、ヒト起源のものが最も好ましい。実際は”標的”核酸分子のヌクレオチド 配列又は起源に制限はない。

付加又は欠失の小さなフレームシフト突然変異も、ミスマツチ−結合蛋白質が結 合するような方法で野生型配列と対合する配列を生ずる。例及びストレプトコッ クス　ニューモニアエ　ＨｅＸミスマツチ修復系の両方共、１個の塩基の付加又 は欠失から生ずるミスマツチに作用することが知られている。２又は３個の塩基 対、ならびに程度は少ないが４個の塩基対の付加又は欠失も修復されるが、５個 の塩基対の付加又は欠失は修復されない。従って本発明の方法は１−４個の塩基 対の小さな付加又は欠失突然変異の検出に有用である。

２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ中の特定の１個の塩基の突然変異を検出する検定の場合、 ２個の突然変異ＤＮＡ鎖のそれぞれに１個の塩基を除いて相補的である２個の野 生型ハイブリッド形成パートナ−配列を用いるのが、１個のハイブリッド形成パ ートナ−のみを用いた場合と比較して検定の感度が２倍に向上するので好ましい 。しかし検定は十分感度が良く、感度が２分の１に低下（２個のハイブリッド形 成パートナ−を用いる場合に比較して）しても本方法の有用性は低下しないので 、２個のＤＮＡ鎖の１個のみに相補的な１個のハイブリッド形成パートナ−配列 を用いることもできる。

例えばＭｕｔＳなどのミスマツチ−結合蛋白質はすべての可能なミスマツチに等 しい効率で結合しないので（Ｄｏｈｅｔ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、。

１９８５、同上；Ｊｏｎｅｓ、Ｍ、ｅ±　ｌ±　、１９８７．同上）、ある種の 標的配列の場合は問題の領域における両鎖に相補的なハイブリッド形成パートナ −を調製し、与えられたｄｓＤＮＡ野生型配列から２個の可能なミスマツチの両 方を形成して２１ＩＩＩの突然変異の少なくとも１個を検出することが必要であ る。

ハイブリッド形成パートナ−は、ＩｇｊＡより多い塩基対がミスマツチしている より大きな標的配列に相補的な１個の連続したポリヌクレオチドセグメントであ ることができる。別の場合、標的ＤＮＡの１個のフラグメント上で約３０塩基か 又はそれ以上隔てられた２個の突然変異を、それぞれが１個の標的フラグメント 上の別々の配列とハイブリッド形成する２個か又はそれ以上の個別のハイブリッ ド形成パートナ−を用いて検出することができる。

態様の１つにおいて、標的配列に相補的なハイブリッド形成パートナ−の領域は 、ハイブリッド形成可能部分がその中でミスマツチ−結合蛋白質がミスマツチを 認識して結合する少なくとも約３０ヌクレオチドの安定なヘテロ２本鎖を形成す るならば、３゛又は５″末端にて非ハイブリッド形成配列によりフランキングさ れていることができる。

ＲＮＡ又はＤＮＡハイブリッド形成パートナ−は多様な周知の方法で調製するこ とができる。従来の方法を用いた化学的オリゴヌクレオチド合成によりオリゴヌ クレオチドハイブリッド形成パートナ−を調製するのが最も好ましい。オリゴヌ クレオチドの合成法は、例えばＷｕ、Ｒ，。

且±　見上、、Ｐｒｏｇ、Ｎｕｃ１．Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、Ｍｏ１ｅｃ。

Ｂｉｏｌ、λ１　：１０１−１４１　（１９７８）’）により開示されている。

別の場合ＲＮＡハイブリッド形成パートナ−は、細胞の天然の産物として、例え ばｍＲＮＡ分子として単離することができる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡハイブリッド 形成パートナ−は組み替えＤＮＡ法によっても調製することができる。（例えば Ｇｒｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌｌ　３２：６８１　（１９８３）を参照）。

ＤＮＡハイブリッド形成パートナ−は当該技術分野における熟練者に容易に明ら かになる多様な供給源のいずれからも、例えば天然に存在するＤＮＡの制限エン ドヌクレアーゼ切断又は化学的切断により調製することができる。

Ｅ、コリＭｕｔＳが１６塩基のへテロ２本鎖に結合しくＪｉｒｉｃｎれるヘテロ ２本鎖の大きさが８−１２塩基程の小ささである（Ｓｕ、Ｓのハイブリッド形成 パートナ−の大きさの下限は約１０ヌクレオチドである。合成経費を安く保ちな がらハイブリッド形成の忠実度を増すために、より大きなハイブリッド形成パー トナ−１好ましくは約２０−約１００ヌクレオチドが好ましい。オリゴヌクレオ チド合成の経費を考慮し、より好ましいオリゴヌクレオチドハイブリッド形成パ ートナ−は約２０−約４０ヌクレオチドを有する。本明細書に記載する組み替え 法を製造に用いることができるので、ハイブリッド形成パートナ−の大きさに上 限はない。従って別の態様の場合、ｃＤＮＡ分子そのままがハイブリッド形成パ ートナ−である。

本発明の方法で用いるために、ハイブリッド形成パートナ−配列は固定可能な形 態であるか、より好ましくは固相担体又はキャリヤー上に固定されている（図３ を参照）。ハイブリッド形成パートナ−の固定可能な形態は、一般にハイブリッ ド形成反応の後に簡単に固定することができる形態である。最後にハイブリッド 形成パートナ−が固定される方法は本発明に重要ではなく、ハイブリッド形成パ ートナ−と標的核酸配列の間で形成されたハイブリッド力かイブリッド形成パー トナ−の性質により固定されれば、利用できるいずれの方法を取ることもできる 。

固定された形態でハイブリッド形成反応に導入される場合、ハイブリッド形成パ ートナ−は、ハイブリッド形成パートナ−及びそれと結合する反応混合物のいず れの成分も、後で残りの混合物がら単離又は分離することができるようないずれ の適した形態であることもできる。分離は遠心、濾過、クロマトグラフィー、デ カンテーションなどにより行うことができる。

当該技術分野における通常の熟練者は、本発明に従って有用な固定ハイブリッド 形成パートナ−の多様な組成及び形状が分かるであろう。例えばハイブリッド形 成パートナ−は凝集又は池の場合沈澱させる、不溶性材料、ポリマー又は担体に 結合する、あるいはアガロース又はポリアクリルアミドなどのゲル中に閉じ込め ることができる。（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、↓λ旦：６３５　（１，９６ ８）；Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　５ユニ８０７　（１９７０）　）。最も好ましいの は、ハイブリッド形成パートナ−が共有結合又は非共有結合により結合又は固定 された固体担体である。適度に安定で強い結合を与える方法を用いた吸着による 非共有結合が好ましい。これは又、ハイブリッド形成パートナ−へのアミノ修飾 基を用いても行うことができ、アミノ修飾基を用いてハイブリッド形成パートナ −を固体担体（例えば膜又はフィルター）に“ひっかける（ｈｏｏｋ）”又は結 合する。所望のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを選ばれた固体担体に 結合する方法は当該技術分野における通常の熟練者に周知である。

“固相担体”はオリゴ−又はポリヌクレオチドを結合することができるいずれの 担体も意味する。周知の担体又はキャリヤーには天然又は変性セルロース、例え ばニトロセルロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキスト ラン、ナイロン、ポリアクリルアミド及びアガロースが含まれる。実際に担体材 料は、固定されたハイブリッド形成パートナ−が標的核酸分子とハイブリッド形 成することができ、ミスマツチ−結合蛋白質がその後ハイブリッド形成パードナ ｍ−標的ポリヌクレオチドハイブリッドに結合することができれば、いずれの可 能な構造的形状であることもできる。かくして担体形状は微粒子、ビーズ、多孔 質及び不透過性ストリップ及び膜、試験管及びミクロタイタープレートなどの反 応容器の内表面などを含むことができる。好ましい担体にはニトロセルロース円 板又はストリップが含まれる。当該技術分野における熟練者はオリゴ−又はポリ ヌクレオチド／％イブリッド形成パートナ−を結合するための多くの他の適した 担体を知っているか、又は日常的実験によりそれを知ることができるであろう。

ニトロセルロース膜上にハイブリッド形成パートナ−を吸着する好ましい方法は 、ハイブリッド形成パートナ−の溶液にヨー化ナトリウムを飽和させ、アリコー トを膜上にスポット又は濾過することを含む（Ｂｒｅｓｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、 ＤＮＡ　２：２４３　（１９８３））。別の場合ハイブリッド形成パートナ−を グリオキサル（１Ｍ以下）で処理し、その後膜上に吸着させることができる。真 空下の８０℃近辺にて約２−３時間ベーキングすることによりハイブリッド形成 パートナ−を固定すオリゴヌクレオチドハイブリッド形成パートナ−の共有結合 固定も行うことができる。共有結合固定で有用な多数の担体材料及びカップリン グ法が知られている。例にはカーポジイミド又はカルポニルジイミダゾ４１１− ３４１８　（１９７４）　）、又はｍ−ジアゾベンゾイルオキシメチルセルロー ス上のジアゾ基のハイブリッド形成パートナ−のＧ及びＴ残基との反応（Ｎｏｙ ｅｓ、Ｂ、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５：３０１−３１０　（１９７５）： Ｒｅ１ｓｅｒ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、８５：１１０４−１１１２　（ １９７８））が含まれる。多糖担体は、水溶性カーポジイミド活−性化によりオ リゴヌクレオチドの末端リン酸基と担体のヒドロキシル部分の間で形成されるホ スホジエステル結合を介して（Ｒｉｃｈｗｏｏｄ。

プロミド−活性化担体のカップリングにより（八ｒｎｄｔ−Ｊｏｖｉｎ。

Ｄ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５４：４１１−４１８　 （１９７５））カップリングすることができる。さらにノーイブリッド形成パー トナ−の３′　ヒドロキシ末端を過ヨー素酸塩で酸化し、アミン又はヒドラジド 基を有する担体とのシッフ塩基形成によりカップリングすることができる（Ｇｉ 　ｌｈａｍ、Ｐ、Ｔ、、Ｍｅ　ｔｈｏｄ、Ｅｎｚｙｍｏ　１．２１　：１９１− １９７　（１９７１）；Ｈａｎｓｓｋｅ、Ｈ。

Ｄ、、ｅｔａｌ−１、Ｍｅｔｈｏｄ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、５９：１７２−１８１　 請求核部位を有する担体はシアヌル酸塩化物と反応させ、その後ポリヌクレオチ ドと反応させることができる（）（ｕｎｇｅｒ、Ｈ，Ｄ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ ｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　６５３：３４４−３４９（１９８１）） 。

一般に、標的配列に相補的な配列を試料核酸にハイブリッド形成するために利用 できれば、いずれの方法もハイブリッド形成パートナ−の固定に用いることがで きる。特定の方法又は材料は本発明に重要ではない。

直接固定ハイブリッド形成パートナ−を用いる代わりに固定可能形態を用いるこ とができ、速度論がより速い溶液中でハイブリッド形成段階を行うことができる 。そのような態様の場合典型的に、固定形態の反応パートナ−に露出すると反応 パートナ−と安定な共有結合又は非共有結合を形成して固定形態となることがで きる反応性部位を含む／％／Ｉ’ブリッド形成パートナーが用いられる。ハイブ リッド形成パートナ−中のそのような反応性部位は、固定反応パートナ−として 働くアビジン又は抗体などの結合物質と特異的非共有結合が可能なビオチン又は ハブテン部分などの結合部位である。

基本的にいずれの物質の対も安定な結合、すなわちその後の検定段階、主に分離 及び検出段階の間、実質的にそのままで残る結合又はカップリングを形成する相 互作用のための適した親和性を示す反応性部位／反応性パートナ一対を含むこと ができる。ノ＼イブリッド形成ツクートナー上の反応性部位は“結合部位”と呼 ばれ、反応パートナ−はそれが具有又は非共有結合を形成する“結合物質”と呼 ばれる。

態様の１つにおいて、結合部位はハイブリッド形成ノく一トナーの非ノλイブリ ッド形成部分に存在し、ハイブリッド形成ノ（−トナーの化学的修飾の結果であ ることが好ましい。ヌクレオチド配列内に存在する結合部位の例は、プロモータ ー蛋白質により結合することができるプロモーター配列、リプレッサー蛋白質に より結合することができるオペレーター配列、又は特異的抗体により結合するこ とができる修飾ヌクレオチド、例えば５−ブロモデオキシウリジン又は５−ヨー ドデオキシウリジン（英国特許出願第２．１２５，９６４号明細書）、チミング リコール（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ　ｅｔ　ｌ±、、Ｒａｄｉａｔ、Ｒｅｓ、９ オリゴヌクレオチドハイブリツド形成パートナ−の化学的修飾により導入される 結合部位は特に有用であり、通常特異的結合対の１つのメンバーをハイブリッド 形成パートナ−に結合させることを含む。その中力蔦ら選ばれるべき有用な結合 対にはビオチン／アビジン（卵白アビジン及びストレブタビジンを含む）　、／ ％ブテン（又は抗原）／抗体、炭水化物／レクチン、酵素／阻害剤などが含まれ る。結合対が蛋白質メンノ（−及び非蛋白質メンバーを含む場合、蛋白質メンバ ーは／１イブリ・ノド形成の変性条件下で不安定なので非蛋白質メンバーを）１ イブリ・ノド形成ノく一トナーに結合するのが通常好ましい。好ましい系は、／ Ｘイブ１ルノド形成Ｉく・−トナーをビオチン又はハプテンに結合し、それぞれ 固定アビジン又：よ抗−ハブテン抗体試薬を用いることを含む。

固定可能形態でハイブリッド形成パートナ−がノーイブリッド形成反応に導入さ れる場合、それに続く形成された２本鎖の固定及びミスマツチ−結合蛋白質なら びに検出のための試薬の添加の段階は、いずれの所望の順序で行うこともできる 。固定及びミスマツチ−結合蛋白質ならびに他の試薬の添加は、必要な試薬及び 材料の同時の添加、あるいは洗浄又は分離段階の介在する、又は介在しないいず れかの順序の順次添加により行うことができる。順次添加に従う場合もちろん、 形成されたハイブリッドを過飽和し、ミスマツチ−結合蛋白質及び検出試薬との 相互作用を阻害しないように、加えられる試薬の濃度を考慮する。

好ましいミスマツチ−結合蛋白質は、１本鎖ポリヌクレオチド又は完全に対合し ているハイブリッドを有意に排除し、ハイブリッド形成パートナ−と相補的な標 的試料核酸の間で形成されたＤＮＡ−ＤＮＡ　（又はＤＮＡ−ＲＮＡあるいはＲ ＮＡ−ＲＮＡ）塩基対ミスマツチハイブリッドと結合する能力を有することを特 徴とする。好ましい態様の場合、Ｅ。

コリからの本来のＭｕｔＳ蛋白質そのままを用いる。しかし本明細書で用いられ る“ミスマツチ−結合蛋白質”という用語は、本来の蛋白質そのままの機能的誘 導体も含むものとする。゛機能的誘導体”は、本発明に従い、ミスマツチ核酸へ テロ２本鎖に結合する能力を保持している蛋白質の“フラグメント、“変異体” 、“類似体”又は゛化学的誘導体”を意味する。

ミスマツチ−結合蛋白質の゛フラグメント”は、分子のサブセット、すなわちよ り短いペプチドを言う。蛋白質の゛変異体”は蛋白質全体又。

はそのＤＮＡ−ハイブリッド−結合フラグメントに実質的に類似の分子を言う。

ミスマツチ−結合蛋白質、例えばＭｕｔＳの変異体は、当該技術分野において周 知の組み替えＤＮＡ法により調製することができる。

ＭｕｔＳの好ましい機能的誘導体は、Ｅ、コリＭｕｔＳの他のバクテリア種にお ける同族体、例えばサルモネラ　チフィムリウムのＭｕｔＳ蛋白質（Ｌｕ、　Ａ 、Ｌ、ｅ±　ｌ上６．同上；Ｈａｂｅｔ　Ｌ、　Ｔ、ｅｔａ±９．同上；Ｐａｎ ｇ、Ｐ、Ｐ、旦　見１．．同上）又ハストレブトコックス　ニューモニアエのｈ ｅｘＡ蛋白質（Ｐｒｉｅｂｅ　Ｓ。

Ｄ、見上　見工１．同上：　Ｈａ　ｂ　ｅ　ｒ　見±　見上０．同上）である。

さらにＭｕｔＳ又はＨｅｘＡの可能な真核同族体、例えばヒト、マウス又はハム スターＤＮＡにおいて同定された相同配列によりコードされるものも用いること ができる（Ｓｈｉｍａｄａ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、λ６４：２０１７１　（１９８９）；Ｌｉｎｔｏｎ。

Ｊ、ｅ±−ａｔ、、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、７：３０５８−ミスマツ チ−結合蛋白質の゛化学的誘導体”には、融合蛋白質の場合のような追加された 範囲のアミノ酸を含む、通常は蛋白質の一部でない付加された化学的部分が含ま れる。ペプチドの共有結合による修飾は本発明の範囲内に含まれる。そのような 修飾は、蛋白質の標的とされたアミノ酸残基を、選ばれた側鎖又は末端残基と反 応することができる有機誘導剤と反応させることにより分子中に導入することが できる。そのような誘導の例はハブテン−修飾であり、その場合トリニトロフェ ニルなどのハブテン性基が蛋白質と共役し、検出可能な標識をした検出目的の結 合パートナ−の簿的として働く。別の場合蛋白質をビオチン基の共役により修飾 することができ、検出可能な標識をしたアビジン又はストレプタビジンを検出目 的の結合パートナ−として用いることができる。

ミスマツチ−結合蛋白質の好ましい化学的誘導体は、ミスマツチ−結合蛋白質と 他の蛋白′Ｍ（”融合蛋白質パートナ−“）の間の融合蛋白質であり、その場合 他の蛋白質が構造的又は機能的特徴を与えて融合蛋白質を検出に有用なものとす る。例えば融合蛋白質パートナ−は、検出目的で抗体が結合することができる抗 原性部位に寄与することができる。

ミスマツチ−結合蛋白質又は機能的誘導体及び酵素の間の融合蛋白質は、例えば 当該技術分野において周知の通り融合蛋白質の酵素部分が色素原基質からの着色 反応生成物の形成を触媒する能力があるために、検出のためのより直接的な手段 を与える。

好ましい融合蛋白質は、ＭｕｔＳ又は機能的誘導体と酵素β−ガラクトシダーゼ の間の融合蛋白質である。この態様の場合、固体担体へのβ結合の存在をこの酵 素の色素原基質を用いて検出することができる。そのような基質の例はＮＡＢＧ 　（ナフトール　ＡＳ−８１−β−ｄ−ガラクトピラノシド）である。

ミスマノチー結合蛋白質の融合蛋白質誘導体は、当該技術分野において周知の方 法を用いて調製することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ。

Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ ｒ、ＮＹ、１９８９を参照）。

本検定の方法に有用な蛋白質の選択は、当該技術分野における通常の熟練者が従 来の方法を用いて行うことができる。従って例えば本発明において有用なミスマ ツチ−結合蛋白質の存在に関して供給源を評価する場合、Ｊｉｒｉｃｎｙ　ｅｔ 　ａｌ、（その参照文献の記載事項は引用することにより全体が本明細書の内容 となる）により記載されているようなミスマツチ−結合検定を行うことができる 。フィルター結合検定（ｆｉｌｔｅｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｓｓａｙ）を用いる のが好ましい。

オリゴヌクレオチドへテロ２本鎖の調製のために、好ましくは１６塩基のオリゴ ヌクレオチドをキナーゼ反応を用いて３２ｐで、及びＴ４−ポリヌクレオチドキ ナーゼなどのキナーゼを用いてガンマ−”Ｐ−ＡＴＰで標識する。その後５゛− 樟識オリゴヌクレオチド（これは−２０℃で保存できる）を、１個の塩基対ミス マツチを有する相補的オリゴヌクレオチドと標準的条件下でアニーリングする。

アニーリングされた１６塩基対ヘテロ２本鎖を過剰の試験するべき蛋白質と混合 し、氷上に３０分間保つ。その後混合物を検定緩衝液中で予備湿潤させたニトロ セルロースフィルターに適用する。穏やかに数秒間吸引し、フィルターを氷−冷 検定緩衝液で強力に洗浄する。その後フィルターを空気乾燥し、ンンチレーショ ン液に警濁し、カウントする。フィルターに付着した蛋白質のために、フィルタ ー上のカウントはすべて推定ミスマツチ−結合蛋白質の結合に帰することができ る。そのような蛋白質がない場合、標識されたオリゴヌクレオチドへテロ２本鎖 はフィルターを通過する。従ってそのような簡単な検定を用いることにより、本 発明の方法で有用なミスマツチ−結合蛋白質を容易に検出し、選択することがで きる。

当該技術分野において既知の通り、種々のハイブリッド形成条件を本発明の方法 で用いることができる。典型的にハイブリッド形成はわずがな高温、例えば約３ ５°Ｃ−７５℃、通常約６５℃にて、約６−８のｐｉ−１で適したイオン濃度（ 例えば２Ｘ　ＳＳＣ，ここでＩＸ　５ＳＣ＝０゜１５Ｍの塩化ナトリウム及び０ ．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）の緩衝液、ウシ血清アルブミン などの蛋白質、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪにより販売されているスクロース及びエビク ロロヒドリンのコポリマーを限定する商標）ポリビニルピロリドン、及びコウシ 胸腺又はサケ精子からなどの変性異種ＤＮＡを含む溶液中で行われる。ハイブリ ッド形成が起こるために必要な試料及びハイブリッド形成ノ々−トナー鎮の間の 相補性の程度は、条件の緊縮度に依存する。／％イブリ・ラド形成の程度及び特 異性は、以下の主条件により影響される。

１、核酸試料の純度。

２、Ｇ−Ｃ塩基対の含有率：Ｇ−Ｃ塩基対はＡ−Ｔ又はＡ−Ｕ塩基対より高い熱 安定性を示す。従ってＧ−Ｃ含有率の高い／％イブリ・ソドは高温で安定である 。

３、相同塩基配列の長さ：例えば６塩基より短いなどの短い塩基配列は多くの核 酸において繰り返しの可能性が高い。そのような短い配列を含むハイブリッド形 成においては特異性が低いか、又は得られない。本発明のハイブリッド形成パー トナ−配列は、オリゴヌクレオチドの場合少な（とも約３０塩基で最高約１００ 塩基、ｃＤＮ八分子分子合それより多くさえ含むことが好ましい。

４、イオン濃度：再アニーリングの速度は、インキュベージコン溶液のイオン濃 度の増加と共に増す。）１イブリツドの熱安定性も向上する。

５、インキュベーション温度：最適再アニーリングは、与えられた２本鎖の融点 （Ｔｍ）より低い約２５−３０℃の温度で起こる。最適よりかなり低い温度でイ ンキュベートすると、関連性の低い塩基配列をハイブリッドさせる。

６、核酸濃度及びインキュページ目ン時間：通常反応をハイブリッド形成に駆動 するために、ハイブリッド可能試料核酸又はハイブリッド形成パートナ−核酸の １つが過剰に、通常１０〇−倍過剰かそれ以上で存在する。

７、変性試薬：ホルムアミド及びウレアなどの水素結合切断試薬の存在は、ハイ ブリッド形成の緊縮度を増す。

８、インキュベーション時間：インキュベーション時間が長い程ハイブリッド形 成はより完全になる。

９、体積排除試薬（ｖｏｌｕｍｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ａｇｅｎｔ）：デキス トラン及びデキストランサルフェートを例とするこれらの試薬が存在すると、ハ イブリッド形成成分の有効濃度が向上し、それにより得られるハイブリッド形成 の速度が増すと思われる。

通常、ハイブリッド形成の場合に選ばれる温度条件は、形成されたハイブリッド へのミスマツチ−結合蛋白質の結合、又はミスマツチ−結合蛋白質への抗体又は 他の結合パートナ−の結合に適合しない。従ってミスマッチー結合蛋白質及び結 合パートナ−試薬の結合段階及び標識検出段階は、ハイブリッド形成段階の完了 後に行う。通常反応混合物を約３℃−約４０℃の範囲の温度とし、その後ミスマ ツチ−結合蛋白質及び追加の試薬の結合ならびに検出段階を行う。

ＲＮＡハイブリッド形成パートナ−を用いた特定の検定の場合、ＲＮＡがホスホ ジエステル結合のアルカリ加水分解により、又はリボヌクレアーゼ（Ｒｎａｓｅ ｓ）の存在により部分的に分解されることが予想される。前者の場合、ハイブリ ッド形成パートナ−を約１０より高いｐＨに暴露するのを避けることにより加水 分解を抑制することができる。ＲＮａｓｅｓは、ドデシル硫酸ナトリウム、アラ リントリカルボン酸、リボヌクレオチドバナジル錯体、ヘパリンジエチルピロカ ーボネート及び哺乳類供給源から単離された蛋白質性ＲＮａｓｅ阻害剤などの物 質の存在により有効に阻害することができる。

ハイブリッド形成パードナー−標的ポリヌクレオチド（ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ −ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＲＮＡ）ハイブリ、ソドに結合したミスマツチ−結合蛋白 質は、直接又は間接に検出することができる（図２を参照）。直接検出は、ミス マツチ−結合蛋白質を検出可能な標識、例えば放射性標識、蛍光標識、共役酵素 などで標識することを意味し、それは下記にさらに詳細に記載する。別の場合、 上記の通り組み替えＤＮＡ法により、ミスマツチ−結合蛋白質を検出の容易な融 合ノ（−トナーとの融合蛋白質として生産することができる。融合蛋白質ならび に検出可能な標識をされた、又は共役したミスマツチ−結合蛋白質が本来の、改 変されていないミスマツチ−結合蛋白質の反応性及び結合特異性を保持している ことが重要である。この反応性及び特異性は、当該技術分野における通常の熟練 者が、日常的試験、例えば本明細書に記載の検定により確かめることができる。

間接的検出は、ミスマツチ−結合蛋白質又はミスマ・ソチー結合蛋白質に共役し た反応性部分、あるいはミスマツチ−結合蛋白質の融合蛋白質パートナ−に特異 的な結合パートナ−を用（％る方法を意味する。ミスマ、。

チー結合蛋白質がＭｕｔＳの場合、好ましい結合〕噌−トナーは抗−ＭｕｔＳ抗 体（又はその抗原−結合フラグメント）である。

本発明の方法で有用な抗体試薬のいずれも抗体全体、抗体フラグメント、多機能 抗体凝集体（ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎｔｉｂ。

ｄｙ　ａｇｇｒｅｇａｔｅｓＬあるいは一般に抗体からの１個又はそれ以上の特 異的結合部位を含む物質を含むことができる。抗体は免疫グロブリン　イソ型、 例えばＩｇＧＳ　ＩｇＭなどのいずれかであることができる。そのような抗体の 抗原−結合フラグメントのいずれか、例えばＦａｂ’又はＦ（ａｂ’）ｔフラグ メントを用いることもできる。さらに免疫グロブリン又はそのフラグメントの凝 集物、ポリマー、誘導体及び共役体を場合により用いることができる。

抗体試薬のための免疫グロブリン供給源は、従来のポリクローナル抗血清の調製 、又はモノクローナルあるいはキメラ抗体の調製などのいずれの方法によっても 得ることができる。抗血清は、マウス、ウサギ、モルモット又はヒツジなどの動 物をＭｕｔＳ蛋白質などの適した免疫原で免疫化することを含む十分に確立され た方法により得ることができる。

別の場合結合パートナ−は、ミスマツチ−結合蛋白質と融合した融合蛋白質パー トナ−１例えばβ−ガラクトシダーゼに特異的な抗体であることができる。さら にミスマツチ−結合蛋白質分子に共役したハプテン基に特異的な抗体を用いるこ とができる。他の結合パートナ−は、ミスマツチ−結合蛋白質がビオチンの付加 により修飾された場合のアビジン又はストレプタビジンであることができる。さ らに別の態様の場合、結合パートナ−は免疫グロブリン分子に結合する性質を有 する非免疫グロブリン蛋白質、例えば当該技術分野において周知のスタフィロコ ッカスのプロティン八又はストレプトコッカスのプロティンＧであることができ る。結合パートナ−はそれ自身が検出可能な標識をされているか、又は検出可能 な標識をされた第２結合パートナー１例えば第１抗体に特異的な第２抗体により 間接的に検出することもできる。かくしてウサギ−抗−ミスマツチ−結合蛋白質 抗体が第１結合パートナーとして作用する場合、標識されたヒツジ−抗−ウサギ 免疫グロブリン抗体は第２結合パートナーである。他の態様の場合、ミスマツチ −結合蛋白質の融合蛋白質パートナ−の存在により生成される信号を、その融合 蛋白質に特異的で検出可能な標識をされた抗体（例えば抗−β−ガラクトシダー ゼ抗体）を用いた反応により増幅する。当該技術分野における通常の熟練者は、 不必要な実験を行うことなく当該技術分野で周知の従来の方法を用い、そのよう な第１及び第２結合パートナー系として可能な多（を考案することができる。

さらに別の態様の場合、結合パートナ−はＥ、コリ、Ｓ、チフィムリきる。好ま しい機能的誘導体はＭｕｔＬと検出の容易な第２融合パートナー蛋白質、例えば β−ガラクトノダーゼとの融合蛋白質である。分子量が９０ｋＤａの精製Ｍｕｔ Ｌ蛋白質はＡＴＰの存在下でＭｕｔＳ及び核酸へテロ２本鎖の複合体に選択的に 結合することが知られている。ＭｕｔＬはミスマツチ−含有へテロ２本鎖又は遊 離のＭｕｔＳに直接は結合しない。ＭｕｔＬ蛋白質はバクテリア中でクローニン グされ、発現された（Ｐａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、同上）。かくして本発明に従っ て用いる場合、好ましくは検出可能な標識をされた形態のＭｕｔＬ蛋白質又は機 能的誘導体はＡＴＰの存在下で突然変異検出検定に加えられる。その後結合Ｍｕ ｔＬを検出する。別の場合、上記の通り非標識ＭｕｔＬを第１結合パートナーと して用い、その後ＭｕｔＬに結合する標識第２結合パートナ−を用いるか、ある いは非標識第２結合パートナ−を用いてから検出可能な標識をした第３結合パー トナーを用いることができる。ＭｕｔＳ結合パートナ−に関して上記で記載した 通り、ＭｕｔＬのための第２結合パートナーはＭｕｔＬに特異的な抗体、Ｍｕｔ Ｌに共役したハブテンに特異的な抗体、ビオチンがＭｕｔＬに共役している場合 アビジン又はストレブタビジン、ＭｕｔＬの融合パートナ−蛋白質に関する抗体 などであることができる。

上記の第１又は第２結合パートナーが抗体である場合、検出はエンザイムイムノ アッセイ（ＥＴＡ）（Ｖｏｌ　ｌｅｒ、Ａ、、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｈｏｒｉ ｚｏｎｓ　２：１−７．１９７８．Ｍｉｃｒｏｂｉ。

ｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ　Ｐｕｂｌ　１ｃ ａｔ　ｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌ　ｌｅ、ＭＤ：Ｖｏｌ　１ｅｒＡ、ｅｔ　 ａｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、３１：５０７−５２０　（１９７８）： 米国再発行特許第３１，００６号明細書：英国特許第２゜０１９．４０８号明細 書：Ｂｕｔ　ｌｅｒ、Ｊ、Ｅ、、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、７３：４８２−５ ２３　（１，９８１）；Ｍａｇｇｉｏ、Ｅ。

（ｅｄ、）、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、Ｂｏ ｃａ　Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、１９８０）又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）　（ Ｗｉ　ｅｎ　ｔ　ｒａｕｂ、Ｂ、、Ｐｒ　ｉｎｃ　ｉｐ　Ｉｅｓｏｆ　Ｒａｄｉ ｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、５ｅｖｅｎｔｈ　Ｔｒａｉｎｉｎｇ　Ｃｏｕｒｓ ｅ　ｏｎ　Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ　Ａｓ５ａｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈ ｅ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　５ｏｃｉｅｔｙ、Ｍａｒｃｈ　１９８６．Ｉ）Ｉ）、 １−５．４６−４９及び６８−７８）を含む従来の多様なイムノアッセイのいず れを用いても行うことができる。

好ましい態様の場合、ＭｕｔＳ−特異的抗体又は抗体フラグメントに、それを酵 素に結合することにより検出可能な標識をし、ＥＩＡ又は酵素−結合イムノソル ベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で用いる。今度は後でこの酵素を、例えば分光光 度測定、蛍光測定又は最も好ましくは視覚による手段で検出できる化学的部分を 与えるような方法で基質に暴露する。

基質は裸眼で見ることができる反応生成物を生成する色素原基質であることが好 ましい。

ＭｕｔＳ−特異的抗体などのミスマツチ−結合蛋白質のための結合パートナ−に 検出可能な標識をするために用いることができる酵素には、アルカリ性ホスファ ターゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイド イソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファーグリセロホスフェ ートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、アスパラギナー ゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェー トデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが含ま れるがこれらに限られるわけではない。

結合パートナ−１例えばＭｕｔＳ−特異的抗体を放射性標識することにより、ラ ジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）を用いて固体担体に結合したＭｕｔＳを検出す ることができる。放射性同位体は、ガンマカウンター又はシンチレーションカウ ンターを用いるなどの方法で、あるいはオートラジオグラフィーにより検出する ことができる。本発明の目的に特に有用な同位体は：　３Ｈ，”’Ｉ、”Ｓ、” Ｃ，及び好＊ｔ、＜は＋ｚｓｒである。

第１又は第２結合パートナーを蛍光化合物で標識することもできる。

蛍光標識した抗体を適した波長の光に暴ｎすると、その存在を蛍光により検出す ることができる。最も普通に用いられる蛍光標識化合物には、フルオレセインイ ソチオシアナート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィ コンアニン、０−フタルアルデヒド及びフルオレサミンがある。

第１又は第２結合パートナーは、それを化学発光化合物にカップリングさせるこ とにより検出可能な標識をすることもできる。その後化学発光−付加抗体の存在 を、化学反応の経路で生ずる化学発光の存在を検出することにより決定する。特 に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマチッ ク（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジ ニウム塩及びオキザレートエステルである。

同様に、生物発光化合物も第１又は第２結合パートナーの標識に用いることがで きる。生物発光は、生物系で見られる種類の化学発光であり、その場合触媒蛋白 質が化学発光反応の効率を増加させる。生物発光蛋白質の存在は発光の存在の検 出により決定される。標識の目的に重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシ フェラーゼ及びエクオリンである。

検定するべき試験試料はいずれの問題の媒体中にあることもでき、一般に医学的 、獣医学的、環境的、栄養的、又は工業的に重要な試料である。特にヒト及び動 物試料及び体液を、それらが核酸を調製できる細胞を含んでいれば、本方法で検 定することができる。好ましい供給源には血液、精子、他の組織、母乳、尿、脳 を髄液、喀痰、便、肺吸引物（ｌｕｎｇ　ａｓｐｉｒａｔｅｓ）、咽頭スワブ、 性器スワブ及び滲出液、直腸スワブ及び鼻咽頭吸引物が含まれる。

試料が主に細胞中に天然に存在するＤＮＡなどの２本鎖核酸を含む場合、最初に 試料を処理して細胞から核酸を放出させるが、それは機械的破壊（例えば凍結／ 乾燥、摩砕、音波処理）、物理的／化学的破壊、例えば洗剤処理（例えばＴｒ　 ｉ　ｔｏｎＳＴｗｅｅｎ、又はドデシル硫酸ナトリウム）、浸透圧ショック、熱 又は酵素ライシス（リソチーム、プロテイナーゼに１ペプシンなと）により行う ことができる。

本発明の方法に従い、放出ｄｓＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ酵素により切断 し、所望の配列を含む検定に適した長さのフラグメントを形成することができる 。制限酵素の選択は所望の標的配列、及びその配列の両側に存在する適した制限 酵素認識部位に依存する。当該技術分野における通常の熟練者は不必要な実験を 行わずに部位を同定し、酵素を選択することができるであろう。例えばＳａｍｂ ｒｏｏｋ、Ｊ、ｅｔエ　見１１．同上を参照せよ。

制限酵素消化の後、煮沸水中の加熱又はアルカリ処理（例えば０．ＩＮ水酸化ナ トリウム）により核酸の変性を行うのが好ましい。得られる試験媒体は１本鎖の 形態で核酸を含み、その後それを本発明の方法に従って検定することができる。

本発明の方法はヒトにおける特定の突然変異の検出の方法及びキットも提示する 。下記の表１は、本発明の方法を用いて検出できるヒトの突然変異の一覧表を示 すが、これらに限られるわけではない。その記載事項が引用することにより本明 細書の内容となるＣｏｏｐｅｒ、Ｄ、Ｎ。

ｅｔ　ａｌ、　、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、　８５：５５−７４　（１９９０） も参照せよ。

本発明は、上記の方法の実行に有用なキット又は試薬系も目的としている。その ようなキットは本明細書に開示されている方法に従う検定を行うのに必要な必須 の成分から成る試薬の組み合わせを含む。試薬系は商業的に包装された形態で、 試薬の相溶性が許せば組成物又は混合物として、試験装置の形状で、あるいはよ り典型的に試験キットとして、すなわち試薬を入れた１個又はそれより多い容器 、装置などを組み合わせ、通常検定を行うために書かれた指示を含んで包装して 与えられる。本発明のキットは本明細書に記載の種々の検定型式を行うためのい ずれの形状及び組成物を含むこともできる。

すべての場合に試薬系は（１）本明細書に記載の固定可能な、又は固定されたハ イブリッド形成パートナ−１及び（２）ミスマツチ−結合蛋白質又は機能的誘導 体を含む。ミスマツチ−結合蛋白質は場合により検出可能な標識をされているこ とができる。キットは場合によりミスマツチ−結合蛋白質のための第１結合パー トナー１例えば抗−ＭｕｔＳ抗体、ＭｕｔＬ蛋白質又は機能的誘導体、及び追加 の結合パートナ−又は検出可能な標識をした試薬を含むことができる。本発明の キットはさらに補助的化学品、例えばハイブリッド形成溶液の成分、試験試料中 の２本鎖核酸を１本鎖形態に変換することができる変性剤、又は試料核酸のフラ グメントを形成するための制限酵素を含むことができる。

ここで本発明を一般的に記載してきたが、以下の実施例を参照することにより本 発明をさらに容易に理解することができるであろう。実施例は例として示すもの であり、本発明を制限するものではない。

実施例１ 突然変異ＤＮＡ配列に関する血液からの試料の検定検定型式は図３に一般的に記 載されている。試料ＤＮＡは、１個の塩基対により、又は１個あるいは数個の塩 基対の付加又は欠失により野生型と異なる特定の突然変異の存在に関して調べる 血液細胞から得る。その後ＤＮＡを変性し、その時点で検定の準備ができる。

約３０ヌクレオチドの試験ＤＮＡハイブリッド形成パートナ−を、問題の突然変 異の付近の野生型遺伝子配列に対応する配列を有するように構築する。ミスマツ チに関する正の標準として、鎌状赤血球ヘモグロビンの点突然変異を用いる。突 然変異配列を有するオリゴヌクレオチド（エクソン１０）を製造する。検定のた めの負の標準として、野生型配列のものであることが既知のオリゴヌクレオチド 、エクソン１０の野生型ヒトヘモグロビン配列を製造する。

ハイブリッド形成パートナ−ＤＮＡをニトロセルロースフィルター上に以下の要 領で固定する： （ａ）　“プラス”の印の垂直線の形態の試験ハイブリッド形成パートナＤＮＡ ０ （ｂ）正の標準のＤＮＡを同一の“プラス”の印の水平線の形態でフィルター上 に固定する。

（Ｃ）負の標準のＤＮＡを“プラス”の印の近辺の点の形態でフィルターに適用 する。

フィルターを処理してオリゴヌクレオチドを固定し、従来の方法を用いてすべて の非反応部位を遮蔽し、検定中のＤＮＡ及び蛋白質の非特異的結合を防ぐ（Ｓａ ｍｂｒｏｏｉ＜　ｅｔ　ａｌ、、同上）０試料ＤＮＡを１０−１００μｇ／ｍｌ の濃度で加え、０．　１−０．　３ＭＮａＣｌ中の４５−５５℃でハイブリッド 形成反応を行い、３個のオリゴヌクレオチドフラグメントへの適した制限フラグ メントの結合を起こす。

フィルターを洗浄し、ＭｕｔＳをフィルターに加えて結合させ、再度フィルター を洗浄する。

ポリクローナル　ウサギ抗−ＭｕｔＳ抗体をフィルターに加えて結合させ、非結 合抗体を洗い流す。

その後ホースラディツシュパーオキシダーゼ−共役ヒツジ抗−ウサギ免疫グロブ リン抗体を加え、結合さぜ、非結合抗体を洗い流す。

ホースラディツシュパーオキシダーゼに関する色素原基質を加え、着色線（又は プラスの印）が現れるまで発色反応を展開させ、線が現れた時点で反応を止める 。

結果は以下のように現れるであろう： Ａ、ＤＮＡ中に点突然変異がない試料の場合（陰性）：（１）点（負の標準のハ イブリッド形成パートナ−）は見えず、検定が誤った陽性ではないことを示す。

（２）水平線のみが見える。患者はおそらく正常なＨｂ遺伝子を有し、正の標準 のオリゴヌクレオチドハイブリッド形成パートナ−が突然変異配列を有するので 反応が起こる。

（３）かくして着色“マイナス”の印がフィルター上に現れ、試料中の突然変異 ＤＮＡに関する試験において陰性の結果を示す。

Ｂ、ＤＮＡ中に点突然変異を有する試料の場合（陽性）：（１）点（負の標準の ハイブリッド形成パートナ−）は見えず、検定が誤った陽性ではないことを示す 。

（２）“プラスの印”が見える。患者はおそらく正常なＨｂ遺伝子を有し、正の 標準のオリゴヌクレオチドハイブリッド形成パートナ−が突然変異配列を有する ので反応が起こり、水平線が見える。この試料からのＤＮＡは標的ＤＮＡ配列中 に点突然変異を有するので、“プラスの印”の垂直線が着色反応生成物を与える 。

実施例ＩＩ ＭｕｔＬ結合パートナ−を用いた突然変異ＤＮＡ配列に関する検定一般的検定型 式は、実施例Ｉの記載と同様である。試料ＤＮＡは１個の塩基対により、又は１ 個あるいは数個の塩基対の付加又は欠失により野生型と異なる特定の突然変異の 存在に関して調べる血液細胞から得る。

その後ＤＮＡを変性し、その時点で検定の準備ができる。

約３０ヌクレオチドの試験ＤＮＡハイブリッド形成パートナ−を、問題の突然変 異の付近の野生型遺伝子配列に対応する配列を有するように構築する。ミスマツ チに関する正の標準として、鎌状赤血球ヘモグロビンの点突然変異を用いる。突 然変異配列を有するオリゴヌクレオチド（エクソン１０）を製造する。検定のた めの負の標準として、野生型配列のものであることが既知のオリゴヌクレオチド 、エクソン１０の野生型ヒトヘモグロビン配列を製造する。

ハイブリッド形成パートナ−ＤＮＡをニトロセルロースフィルター上に以下の要 領で固定する： （ａ）　“プラス”の印の垂直線の形態の試験／１イブリツド形成ノ（−トナＤ ＮＡ０ （ｂ）正の標準のＤＮＡを同一の“プラス”の印の水平線の形態でフィルター上 に固定する。

（Ｃ）負の標準のＤＮＡを“プラス”の印の近辺の点の形態でフィルターに適用 する。

フィルターを処理してオリゴヌクレオチドを固定し、従来の方法を用いてすべて の非反応部位を遮蔽し、検定中のＤＮＡ及び蛋白質の非特異的結合を防ぐ（Ｓａ ｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、同上）。

試料ＤＮＡを１０−１００μｇ／ｍｌの１１度で加え、０．　１−０．３ＭＮａ Ｃ１中の４５−５５℃でハイブリッド形成反応を行い、３個のオリゴヌクレオチ ドフラグメントへの適した制限フラグメントの結合を起こす。

フィルターを洗浄し、ＭｕｔＳをフィルターに加えて結合させ、再度フィルター を洗浄する。

ＭｕｔＬ−β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質を第１結合パートナーとして加え、 結合させ、非結合材料を洗い流す。

第２結合パートナー、ポリクローナルウサギ抗−β−ガラクトシダーゼ抗血涜を フィルターに加え、結合させ、非結合抗体を洗い流す。

その後第３結合パートナ−、ホースラディツシュパーオキシダーゼ共役ヒツジ抗 −ウサギ免疫グロブリン抗体を加え、結合させ、非結合抗体を洗い流す。

ホースラディツシュパーオキシダーゼに関する色素原基質を加え、着色線（又は プラスの印）が現れるまで発色反応を展開させ、線が現れた時点で反応を止める 。

結果は以下のように現れるであろう： Ａ、ＤＮＡ中に点突然変異がない試料の場合（陰性）：（１）点（負の標準のハ イブリッド形成パートナ−）は見えず、検定が誤った陽性ではないことを示す。

（２）水平線のみが見える。患者はおそらく正常なＨｂ遺伝子を有し、正の標準 のオリゴヌクレオチドハイブリッド形成パートナ−が突然変異配列を有するので 反応が起こる。

（３）かくして着色“マイナス”の印がフィルター上に現れ、試料中の突然変異 ＤＮＡに関する試験において陰性の結果を示す。

Ｂ、ＤＮＡ中に点突然変異を有する試料の場合（陽性）（１）点（負の標準のハ イブリッド形成パートナ−）は見えず、検定が誤った陽性ではないことを示す。

（２）“プラスの印”が見える。この試料からのＤＮＡは標的ＤＮＡ配列中に点 突然変異を有するので、“プラスの印“の垂直線が着色反応生成物を与える。

実施例ＩＩＩ 組織試料中の突然変異ｐ５３発癌遺伝子の検出ｐ５３遺伝子は腫瘍抑圧遺伝子で あると思われ（Ｌｅｖｉｎｅ、Ａ且±　ｌ±、、Ｎａｔｕｒｅ　３５↓　４５３ −４５５　（１９９１））、その中の多（の部位における突然変異が腫瘍、特に 大腸肛門癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の発現を生ずる。例 えばＫ　ｉ　ｎｚｌｅｒ、に、Ｗ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２５１：１ ３６６−１３７０　（１９９１）　；Ｋｅｒｎ、Ｓ、Ｅ、　ｅｔ　ａｔ、、Ｏｎ ｃ。

ｇｅｎｅ　６：１３１−１３６（１９９１）；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ。

Ｂ、、Ｎａｔｕｒｅ　３４８：６８１−６８２　（１９９０）；Ｂａｋｅｒ、Ｓ 、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９：９１２−９１５（１９９０）も 参照せよ。

腫瘍組織からヒ１−ＤＮＡを単離する。単離されたＤＮＡを標準的条件下で剪断 する。その後ＤＮＡを変性し、その時点で検定の準備ができる。

標準的方法でｐ５３遺伝子に対応するｃＤＮＡ分子を製造しくＳａｍｂｒｏｏｋ 　ｅｔ　且±１．同上）、ハイブリッド形成パートナ−とする。既知の突然変異 が内在する領域はｐ５３配列全体に分散されている。

ハイブリッド形成パートナ−ＤＮＡを以下のようにしてニトロセルロースフィル ター上に固定する（図３を参照）：（ａ）　“プラス”の印の垂直線の形態の試 験ハイブリッド形成パートナ−（ｐ５３ｃＤＮＡ）をスポットする。

（ｂ）正の標準のＤＮＡを同一の“プラス”の印の水平線の形態でフィルター上 に固定する。

（Ｃ）負の標準のＤＮＡを“プラス“の印の近辺の点の形態でフィルターに適用 する。

フィルターを処理してハイブリッド形成パートナ−ポリ−又はオリゴヌクレオチ ドを固定し、従来の方法を用いてすべての非反応部位を遮蔽し、検定中のＤＮＡ 及び蛋白質の非特異的結合を防ぐ。

試料ＤＮＡを反応物に加え、ハイブリッド形成温度が５５−６０℃であること以 外は（上記の通りの）ハイブリッド形成条件下でインキュベートし、３個のハイ ブリッド形成パートナ−ポリ−又はオリゴヌクレオチドフラグメントへの適した ＤＮＡフラグメントの結合を起こす。

フィルターを洗浄し、ＭｕｔＳをフィルターに加えて結合させ、再度フィルター を洗浄する。

ポリクローナルウサギ抗−ＭｕｔＳ抗体をフィルターに加えて結合させ、非結合 抗体を洗い流す。

その後ホースラディソノユパーオキシダーゼー共役ヒツジ抗−ウサギ免疫グロブ リン抗体を加え、結合させ、非結合抗体を洗い流す。

ホースラディツシュパーオキシダーゼに関する色素原基質を加え、着色“マイナ ス”又は”プラス”の印が現れるまで発色反応を展開させ、印が現れた時点で反 応を止める。

結果は以下のように現れるであろう： Ａ、突然変異ｐ５３発癌遺伝子がない試料の場合：（１）点（負の標準のハイブ リッド形成パートナ−）は見えず、検定が誤った陽性ではないことを示す。

（２）水平線のみが見える。患者はおそらく正の標準のＤＮＡに相補的な非突然 変異配列を有し、正の標準のオリゴヌクレオチドハイブリッド形成パートナ−が 突然変異配列を有するので反応が起こる。

（３）かくして着色“マイナス“の印がフィルター上に現れ、試料ＤＮＡの突然 変異ｐ５３発癌遺伝子に関する試験において陰性の結果を示す。

Ｂ、突然変異ｐ５３発癌遺伝子を有する試料の場合：（１）点（負の標準のハイ ブリッド形成パートナ−）は見えず、検定が誤った陽性ではないことを示す。

（２）”プラスの印”が見える。患者はおそらく正常なＨｂ遺伝子を有し、正の 標準のオリゴヌクレオチドハイブリッド形成パートナ−が突然変異配列を有する ので反応が起こり、水平線が見える。この試料からのＤＮＡは標的ＤＮＡ配列中 に少なくとも１個の点突然変異を有するので、“プラスの印”の垂直線が着色反 応生成物を与える。

ヒトｍＲＮＡを従来の方法により腫瘍組織から単離する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅ ｔ　立±　、同上を参照）。標準的方法でｐ５３遺伝子に対応するｃＤＮＡ分子 を製造しくＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅ工　ｌ１０．同上）、ハイブリッド形成パート ナ−とする。検定型式は、図３に一般的に記載されている。

ハイブリッド形成パートナ−ＤＮＡを以下のようにしてニトロセルロースフィル ター上に固定する： （ａ）　″プラス”の印の垂直線の形態の試験ハイブリッド形成パートナ−（ｐ ５３ＤＮＡ）をスポットする。

（ｂ）正の標準のＤＮＡは、腫瘍組織中で発現されることが知られており、改変 された塩基を１個有する遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを含む。このＤＮ Ａを同一の゛プラス“の印の水平線の形態でフィルター上に固定する。

（Ｃ）正の標準として用いたオリゴヌクレオチドの野生型配列を含む負の標準の ＤＮＡを“プラス”の印の近辺の点の形態でフィルターに適用する。

フィルターを処理してハイブリッド形成パートナ−ポリ−又はオリゴヌクレオチ ドを固定し、すべての非反応部位を遮蔽し、検定中のＤＮＡ及び蛋白質の非特異 的結合を防ぐ。

試料ｍＲＮＡを加え、反応物をハイブリッド形成条件下でインキュベートし、３ 個のハイブリッド形成パートナ−ポリ−又はオリゴヌクレオチドへのｍＲＮＡの 結合を起こす。

フィルターを洗浄し、ＭｕｔＳをフィルターに加えて結合させ、再度フィルター を洗浄する。

ポリクローナル　ウサギ抗−ＭｕｔＳ抗体をフィルターに加えて結合゛　させ、 非結合抗体を洗い流す。

その後ホースラディツシュパーオキシダーゼ−共役ヒツジ抗−ウサギ免疫グロブ リン抗体を加え、結合させ、非結合抗体を洗い流す。

ホースラディツシュパーオキシダーゼに関する色素原基質を加え、着色“マイナ ス”又は“プラス”の印が現れるまで発色反応を展開させ、印が現れた時点で反 応を止める。

結果は以下のように現れるであろう： Ａ、野生型ｐ５３遺伝子を発現する試料の場合；（１）点（負の標準のハイブリ ッド形成パートナ−）は見えず、検定が誤った陽性ではないことを示す。

（２）水平線のみが見える。従って着色“マイナス”の印がフィルター上に現れ 、試料ｍＲＮＡ中の突然変異ｐ５３発癌遺伝子の発現に関する試験における陰性 の結果を示す。

Ｂ、突然変異ｐ５３遺伝子を発現する試料の場合：（１）点（負の標準のハイブ リッド形成パートナ−）は見えず、検定が誤った陽性ではないことを示す。

（２）”プラスの印”が見える。患者はおそらく正の標準のＤＮＡに相補的な非 突然変異配列を有し、正の標準のオリゴフクレオチドノ＼イブリッド形成パート ナ−が突然変異配列を有するので反応が起こり、水平線が見える。この試料から のｍＲＮＡは標的配列中に少なくとも１個の点突然変異を有するので、゛°プラ スの印”の垂直線が着色反応生成物を与える。

材料及び方法 ｊａｍ、ｍｕ　ｔＳ発現プラスミドｐＭｓ３１２　（Ｓｕ　ａｎｄ　Ｍａｄｒｉ ｃｈ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、３３：５０５７．１９ ８６）の導入により１．２Ｌ（ラムダ　ｃ１８５７　Ｎ↑ΔＨｋｉヒ）をｍｕｔ ｓ過剰生産者株とした。

匹且工５（７）＄１１１１．　ｍｕ　ｔ　Ｓ精製案は、Ｓｕ及びＭｏｄｒｉｃｈ （同上）により記載された方法の修正法である。１．２Ｌ　（ｐＭｓ３１２）細 胞を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む８リツトルの８６９培地（１０ｇ／ｌ のＢａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ　（Ｄｊ　ｆｃｏ）　、５ｇ／Ｉの酵母抽出物（ Ｄｉ　ｒｃｏ）　、５ｇ／ＩのＮａＣ１）中の３０℃にて０Ｄｓｓ。

＝１．　３−１．　８まで成育した。培養物を６０℃に予備加温した８６９培地 中で１２に希釈し、４２℃で５時間インキュベートした。培養物を冷却し、遠心 により細胞を収穫し、細胞ペーストを一７０℃で保存した。細胞ペースト（１５ −２９グラム）を水上で解凍し、細胞を等体積の緩衝液Ａ（２０ｍＭのＫＰＯ４ 、ｐＨ７，４，１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭの２−メルカプ トエタノール）に再懸濁した。

細胞を氷−アセトン洛中の音波処理によりラインスした。ライセードを遠心によ り透明とした（４０．０００ｇ：３０分）。上澄み液を緩衝液Ａ中の２５％（Ｗ ／Ｖ）のストレプトマイシンサルフェート１／４体積で処理し、４℃で４５分間 撹拌した。不溶性物質を遠心により除去した（４０．０００ｇ；３０分）。硫酸 アンモニウム（上澄み液１ｍｌ当たり０．２ｇ）を１５分間かけて加え、懸濁液 を４℃にてさらに４０分間撹拌した。遠心により沈澱を集め（４０，０００ｇ； ３０分）、１０ｍ１の緩衝液Ａに再懸濁した。１ｍｌの留分を０．０２５ＭのＫ ＣＩを含む緩衝液Ｂ　（２０ｍＭのＫ　Ｐ　Ｏ４、ｐＨ７，４，１１ｍＭのＥＤ ＴＡ。

１ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール）中で１：１０に希釈 し、直後に１．５／３０ｃｍのＨｅｐａｒ、１ｎ−３ｅｐａｒ。

ｓｅ　ＣＬ６Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに２ｍｌ／分にて適用した。カ ラムを０．１ＭのＫＣＩを含む１００ｍ１の緩衝液Ｂで洗浄し、緩衝液Ｂ中のＫ ＣＩの直線勾配（０，１−０，５Ｍ）を３００ｍ１用いて溶離した。１００個の ３ｍｌ留分を集めた。試料を還元条件下で４−２０％１７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ ル上で移動させ、〉９５％のｍｕｔＳ蛋白質（９７ｋＤａ）を含む留分をプール した。プールした物質に２０％の最終濃度までグリセロールを加え、アリコート を一７０℃で保存した。

オリゴヌクレオチド、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｓからオリゴヌクレオチド を得た。オリゴヌクレオチドの配列は、ヒトβ−グロブリン遺伝子中の鎌状赤血 球突然変異の部位の回りの３０塩基からとった。オリゴヌクレオチドをニトロセ ルロースフィルターに固定するために、５’２５ｍｅｒポリーＣ”尾部”及び５ ゛アミノ修飾基を有する選ばれたオリゴヌクレオチドを調製した。これらの実験 で用いた配列を表２に示す。（記：実際の鎌状赤血球突然変異はＡ：Ｔ−４７： Δトランスバージョンである。）オリゴヌクレオチドを種々の組み合わせ中でア ニーリングし、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ｃ及びＧ：Ｃミスマツチ、（野生型配列を有するオ リゴヌクレオチドを１個の塩基の付加又は欠失突然変異を有するオリゴヌクレオ チドにアニーリングした場合に形成されるような）１個の不対塩基を有するヘテ ロ２本鎖、及び２ｆｆｉＪの異なるホモ２本鎖、すなわち完全に相補的な２本鎖 を形成した。アニーリング条件は下記に記載する。

ランド白ウサギ（Ｐｅｌ　Ｆｒｅｅｚ）に精製ｍｕｔＳ蛋白質を注射することに より得た血清から調製した。蛋白質Ｇ−セファロース（Ｐｈａｒｍａ　ｃ　ｉ　 ａ）カラムクロマトグラフィーにより抗体を部分的に精製した。ドツトプロット 分析において、１０μｇ／ｍｌの抗−ｍｕｔＳ抗体はｌｎｇの精製ｍｕｔＳ蛋白 質を検出することが見いだされた。

図４に示されているデータは、Ｇ：Ｔ及びＧＡＧ含有へテロ２本鎖がｍｕｔＳ蛋 白質により検出されることを示す。検出はｍｕｔＳに依存しており、ヘテロ２本 鎖ＤＮＡと競争することができるがホモ２本鎖ＤＮＡと競争しない。Ａ：Ｃミス マツチ及び１個の不対塩基を有するヘテロ２本鎖の場合にも同様の結果が得られ た（データは示さない）。

固定オリゴヌクレオチドへのアニーリング“ティリングされた（ｔａｉｌｅｄ） ”オリゴヌクレオチドをフィルター上にスポットし、３０ｍｅｒのオリゴヌクレ オチドをそれにアニーリングした。結果（ｒｊ！Ｊ５）は溶液中でアニーリング することにより調製したヘテロ２本鎖の場合に得た結果（図４）と同一である。

ホモ２本鎖（固定オリゴヌクレオチドの３０ｍａｒ部分と正確に相補的な３Ｑｍ ｅｒオリゴヌクレオチドを用いて形成した）は検出されなかった。

競争オリゴヌクレオチドの存在下のアニーリング相補的３Ｑｍｅｒｓをアニーリ ングすることによりホモ２本鎖を調製した。その後“ティリングされた”オリゴ ヌクレオチドを加え、ホモ２本鎖を変性し、混合物を再アニーリングした。試料 をフィルター上にスポットした。図６はそのような条件下でＧ：Ｔミスマツチが 検出されることを示し、“ティリングされた”オリゴヌクレオチドが相補的オリ ゴヌクレオチドに関して３０ｍｅｒｓと有効に競争することを示している。

そのような条件は、突然変異検出検定で用いられ得る条件と一致している。その ような検定では、試料ＤＮＡは制限酵素により切断されるか（ゲノムＤＮＡの場 合）、又はＰＣＲにより調製される。いずれの場合もＤＮＡは２本鎖であり、従 ってプローブとして用いられるティリングされたオリゴヌクレオチドと同一でそ れと競争することができる配列を含んでいる。

図４に示されている結果は以下の要領で行われた実験から得た：等量のオリゴヌ クレオチドをアニーリングすることによりヘテロ２本鎖及びホモ２本鎖を調製し た。“ティリングされた”オリゴヌクレオチドは５５塩基長なのでほとんど２倍 過剰の３Ｑｍｅｒｓがあり、すべての“ティリングされた”オリゴヌクレオチド が２本鎖となる傾向が増加する。ＴＮＥ　（１０ｍＭのトリス、ｐＨ８，０，０ ，１ＭのＮａＣ＋、１ｍＭのＥＤＴＡ）中の５μｇ（５０μｍ中）のそれぞれの オリゴヌクレオチドを混合し、７０℃に１０分間加熱し、３０分間室温に冷却し 、氷上で冷却した。アニーリングされた分子（２μｍ中１μｍ）を２５ｍｍのニ トロセルロース円板（孔径０．４５ミクロン、５ｃｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ ｃｈｕｅｌｌ）上にスポットした。第１（抗−ｍｕｔＳ）及び第２抗体ならびに アルカリ性ホスファターゼ発色系のための正の標準として１０ｎｇの精製ｋｕｔ Ｓをフィルター上にスポットした。フィルターを空気乾燥し、２ｍｌの反応緩衝 液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７゜４．０、ＱｌｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＭ 　ｇ　Ｃｌ　２．０．０１ｍＭのＤＴＴ）及び３％（ｗ／ｖ）＠脂肪乾燥乳を含 む６ウエルの組織培養板（Ｆａ　Ｉ　ｃｏｎ）に移し、穏やかに振りながら４℃ で終夜インキュベートした。フィルターを冷反応緩衝液（４ｘ２ｍりで洗浄し、 １本鎖結合蛋白質（Ｐ　ｒ　ｏｍｅ　ｇ　ａ）溶液（反応１１１ｉ液中１００　 ｕ　ｇ／ｍ　ｌ　ニて１ｍ１）と共にインキュベートした（４℃で３０分間）。

フィルターを冷反応緩衝液（４ｘ２ｍｌ）で洗浄し、（ｉ）１ｍｌの反応緩衝液 、（ｉ　ｉ）１ｍｌの反応緩衝液及び１０ｕｇ／ｍｌのｍｕｔＳ、又は（目ｉ） １ｍｌの反応緩衝液及び１０μｇ／ｍ＋のｍｕｔｓ及び１Ｍｇ／ｍｌの上記の通 りにアニーリングしたホモ２本鎖又はへテロ２本鎖３０ｍｅｒｓと共にインキュ ベートした（４℃で３０分間）。フィルターを冷反応緩衝液（４ｘ　２ｍ　ｌ　 ）で洗浄し、抗−ｍｕｔｓ抗体（反応緩衝液及び３％の無脂肪乾燥乳中５０μｇ ／ｍｌにて２ｍ１）と共にインキュベートした（４℃で２時間）。フィルターを 冷反応緩衝液（４ｘ２ｍｌ）で洗浄し、アルカリ性ホスファターゼに共役させた ヒツジ抗−ウサギＩ　ｇＣ（Ｂ　１ｏ−Ｒａｄ）の１　：　１０００希釈（反応 緩衝液及び３％の無脂肪乾燥乳中）２ｍ１と共にインキュベートした（４℃で１ 時間）。

フィルターを冷反応緩衝液（４ｘ　２ｍ　ｌ　）で洗浄し、２ｍｌの新しい現像 緩衝液（１００ｍＭのトリス、ｐＨ９，５，１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭ ｇＣｌ、、０１６５ｍｇ／ｍ１のブロモクロロインドイルホスフェート（ジメチ ルホルムアミド中の保存溶液から１：１００に希釈）　、０．３３ｍｇ／ｍｌの ニトロ−ブルーテトラゾリウム（ジメチルホルムアミド中の保存溶液がら１　： 　１００に希釈））と共にインキュベートした（室温で１０−２０分間）。フィ ルターを水で数回洗浄し、反応を止めた。

図５に示されている結果は、以下の要領で行われた実験がら得た・１Ｍｇ（２μ ）の“ティリングされた”オリゴヌクレオチドをニトロセルロースフィルター上 にスポットした。フィルターを空気乾燥し、２ｍｌのＴＮＥを含む６ウエル板に 移した。２μｇ（４μｍ）の３Ｑｍｅｒオリゴヌクレオチドを加えた。板を７０ ℃の水浴中に１０分間浮かせ、室温で３０分間インキュベートし、氷上に置いた 。その後フィルターを、図４に示す結果と関連して上記に記載した通りに処理し た。

図６に示されている結果は、以下の要領で行われた実験から得た：等量の３Ｑｍ ｅｒオリゴヌクレオチドを図４に対する説明中に記載の通りにアニーリングした 。等数の“ティリングされた１オリゴフクレオチドを加え、混合物を８５℃に１ ０分間加熱し、その後室温で３０分間インキュベートした。その後の段階はすべ て図４に対する説明中に記載の通りである。

アニーリングを容易にするために、１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質の代わりにｒｅｃＡ 蛋白質を用いることができることを指摘しなければならなむ＼。

表２ オリゴヌクレオチド配列 １）　＊ｃｃｃ、、、ｃｃＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＴＣ ＴＧＣＣＧＴ　突然変異体１２）　”ｃｃｃ、　、　、　ｃｃＧＣＡＣＣＴＧＡ ＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＣＧ丁　野生型３）　ＣＧＴＧＧＡＣ ＴＧＡＧＧ八ＣＴＣＣＴＣＴＴＣＡへＡＣＧＧＣ＾　野生型４　）ＣＧＴＧＧＡ ＣＴＧＡＧＧＡＣＧＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＣＧＧＣＡ　突然変異体５）　ＣＧＴ ＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＣＧＧＣＡ　突然変異体６）　 ＣＧＴＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＣＴＴＣ＾６＾ＣＧＧＣ＾　突然変異 体（＋１塩基） 京−５′アミノ修飾基 １−ポリＣ尾部及び５′アミノ修飾基なしでも調製表２への凡例 オリゴヌクレオチドアニーリング　配列番号１＋３＝Ｇ　：　Ｔミスマツチ　１ ）　ＳＥＱ　ＩＤ　＃１１＋４＝Ｇ：Ｇミスマツチ　２）　ＳＥＱ　ＩＤ　＃２ １＋５＝ホモ２本＃Ｊｌ　３）　ＳＥＱ　ＩＤ　＃３１＋６＝付加／欠失ヘテロ ２本鎖　４）　ＳＥＱ　ＩＤ　＃４２＋３＝ホモ２本鎖　５）　ＳＥＱ　ＩＤ　 ＃５２＋５＝Ａ　：　Ｃミスマツチ　６）　ＳＥＱ　ＩＤ　＃６同等例 ここで本発明を完全に記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく 、及び不必要な実験を行うことなく同等のパラメーター、濃度及び条件の広い範 囲内で同一のことが行えることは、当該技術分野における熟練者にわかるであろ う。

本発明をその特定の態様に関連して記載してきたが、さらに修正が可能であるこ とは理解されるであろう。本出願は、一般に本発明の原理に従い、本発明に関連 する技術内で既知の又は通常行われる実行に含まれ、添付請求の範囲内に示す通 り前記に示されている必須の特徴に適用することができる本開示からのずれを含 むいずれの変更、利用又は適用も含むものとする。

配列番号：１ 配列の長さ＝３５ 配列の型、核酸 鎖の数＝１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＣＣＣＣＣＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＣＣＧＴ 配列番号二２ 配列の長さ：３５ 配列の型・核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー・直鎖状 配列の種類：　ＤＮＡ 配列 ＣＣＣＣＣＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＡ　ＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＣＣＧＴ 配列番号　３ 配列の長さ・３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＣＧＴＧＧＡＣＴＧＡ　ＧＧＡＣＴＣＣＴＣＴ　ＴＣＡＧＡＣＧＧＣＡ配列番号 ＝４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＣＧＴＧＧＡＣＴＧＡ　ＧＧＡＣＧＣＣＴＣＴ　ＴＣＡＧＡＣＧＧＣＡ配列番号 ：５ 配列の長さ＝３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー二直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＣＧＴＧＧＡＣＴＧＡ　ＧＧＡＣＣＣＣＴＣＴ　ＴＣＡＧＡＣＧＧＣＡ配列番号 ・６ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鏑の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類　ＤＮＡ 配列 ＣＧＴＧＧＡＣＴＧＡ　ＧＧＡＣＣＣＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＣＧＧＣ突然変異の 存在に関して調べるべきＤＮＡハイブリットの略図変性及びアニーリング ↓ ミスマツチ含有ＤＮＡハイブリットの略図ミスマツチ（突然変異）検出の原理 抗−Ａｂを含む試薬を介した検出 ＦＩＧ、　２ ■試薬ＤＮＡ　（又はＲＮＡ）とのハイブリット形成■　フィルター遮蔽処理 ヒｌ（、ｉ、ｂ ＦＩＧ、６ 国際調査報告 １＋＋＋＋＋＠＋＋ｌＡ−、自ＰＣＴ／ＵＳ９２１０６０４５、−癲一、ム、、 １．　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０６０４５

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）試料を、標的ポリヌクレオチドの非突然変異配列に相補的な少なくと も１個の１本鎖塩基配列を含む１本鎖ポリヌクレオチドハイブリッド形成パート ナーと共に、該ハイブリッド形成パートナーが試料中に存在し得る該標的ポリヌ クレオチドの突然変異又は非突然変異配列にハイブリッド形成をしてハイブリッ ドを形成するのに適した条件下でインキュベートし、 （ｂ）段階（ａ）で形成されたハイブリッドをミスマッチー結合蛋白質と接触せ さ、 （ｃ）該ハイブリッドに結合したミスマッチー結合蛋白質の存在を検出する段階 を含み、それによりミスマッチー結合蛋白質の存在の検出が試料のポリヌクレオ チドの配列中の突然変異の存在の指標となることを特徴とする、試料中の１本鎖 標的ポリヌクレオチドの非突然変異配列から突然変異を検出する方法。
2. ２．該ポリヌクレオチドハイブリッド形成パートナーがＤＮＡであることを特徴 とする、請求の範囲１に記載の方法。
3. ３．該ハイブリッド形成パートナーＤＮＡがｃＤＮＡであることを特徴とする、 請求の範囲２に記載の方法。
4. ４．該標的ポリヌクレオチドがＤＮＡであることを特徴とする、請求の範囲１に 記載の方法。
5. ５．該ミスマッチー結合蛋白質がＭｕｔＳ蛋白質又はその機能的誘導体であるこ とを特徴とする、請求の範囲１に記載の方法。
6. ６．該試料がその中に存在する核酸を放出し、変性させるのに十分な条件に会わ せた生物学的試料又は液であることを特徴とする、請求の範囲１に記載の方法。
7. ７．放出された該核酸につき、該変性の前に制限エンドヌクレアーゼ切断段階を 行うことを特徴とする、請求の範囲６に記載の方法。
8. ８．該ポリヌクレオチドハイブリッド形成パートナーを段階（ａ）の該インキュ ベートの前に固体担体上に固定することを特徴とする、請求の範囲１に記載の方 法。
9. ９．該固体担体がニトロセルロース膜であることを特徴とする、請求の範囲８に 記載の方法。
10. １０．該検出段階が検出可能な標識をされ、該ミスマッチー結合蛋白質に結合す ることができる第１結合パートナーの添加を含むことを特徴とする、請求の範囲 １に記載の方法。
11. １１．該第１結合パートナーが該ミスマッチー結合蛋白質に特異的な抗体である ことを特徴とする、請求の範囲１０に記載の方法。
12. １２．該検出段階が、該ミスマッチー結合蛋白質に結合でき、検出可能な標識を されていない第１結合パートナー、及び該第１結合パートナーに結合することが できる第２結合パートナーの添加、及び該第２結合パートナーの存在の検出を含 むことを特徴とする、請求の範囲１に記載の方法。
13. １３．該第２結合パートナーが該第１結合パートナーに特異的な抗体であること を特徴とする、請求の範囲１２に記載の方法。
14. １４．該第２結合パートナーがＭｕｔＬ蛋白質又はその機能的誘導体であること を特徴とする、請求の範囲１２に記載の方法。
15. １５．該第２結合パートナーがＭｕｔＬ及び検出可能な第２蛋白質あるいはペプ チドの融合蛋白質であることを特徴とする、請求の範囲１４に記載の方法。
16. １６．該第２蛋白質がべーターガラクトシダーゼであることを特徴とする、請求 の範囲１５に記載の方法。
17. １７．段階（ｂ）の該ミスマッチー結合蛋白質が検出可能な第２蛋白質又はペプ チドと融合した融合蛋白質であることを特徴とする、請求の範囲１に記載の方法 。
18. １８．該検出段階が該第２蛋白質又はペプチドに結合することができる第２結合 パートナーの添加及び該第２結合パートナーの存在の検出を含むことを特徴とす る、請求の範囲１７に記載の方法。
19. １９．該第２蛋白質がべーターガラクトシダーゼであることを特徴とする、請求 の範囲１８に記載の方法。
20. ２０．該第２蛋白質が色素原酵素基質からの着色反応生成物の形成を触媒するこ とができる酵素であり、該検出段階が該色素原基質を与えて該着色反応生成物を 視覚化することを含むことを特徴とする、請求の範囲１７に記載の方法。
21. ２１．（ａ）試料を、標的ポリヌクレオチドの非突然変異配列に相補的な少なく とも１個の１本鎖塩基配列を含む１本鎖ポリヌクレオチドハイブリッド形成パー トナーと共に、該ハイブリッド形成パートナーが試料中に存在し得る該哺乳類標 的ポリヌクレオチドの突然変異又は非突然変異配列にハイブリッド形成をしてハ イブリッドを形成するのに適した条件下でインキュベートし、 （ｂ）段階（ａ）で形成されたハイブリッドをミスマッチー結合蛋白質と接触せ さ、 （ｃ）該ハイブリッドに結合したミスマッチー結合蛋白質の結合を検出する段階 を含み、それによりミスマッチー結合蛋白質の結合の検出が試料の哺乳類ポリヌ クレオチドの配列中の突然変異の存在の指標となることを特徴とする、試料中の １本鎖標的哺乳類ポリヌクレオチドの非突然変異配列から突然変異を検出する方 法。
22. ２２．その中に１個又はそれより多い容器を与えられるように適合させられ、 （ａ）標的ポリヌクレオチドの非突然変異配列に相補的な少なくとも１個の１本 鎖塩基配列を含む１本鎖ポリヌクレオチドハイブリッド形成パートナーを含む第 １容器： （ｂ）ミスマッチー結合蛋白質を含む第２容器；及び（ｃ）ミスマッチー結合蛋 白質の該ハイブリッドヘの結合を検出することができる試薬又は試薬群を含む第 ３容器あるいは複数の容器を含む、試料中の標的ポリヌクレオチド配列の非突然 変異配列から突然変異配列を検出するのに有用なキット。
23. ２３．該ミスマッチー結合蛋白質がＭｕｔＳ又はその機能的誘導体であることを 特徴とする、請求の範囲２２に記載のキット。
24. ２４．該試薬又は試薬群がミスマッチー結合蛋白質と結合することができる少な くとも１個の第１結合パートナーを含むことを特徴とする、請求の範囲２２に記 載のキット。
25. ２５．該第１結合パートナーがミスマッチー結合蛋白質に特異的な抗体であるこ とを特徴とする、請求の範囲２４に記載のキット。
26. ２６．該試薬又は試薬群が、該ミスマッチー結合蛋白質に結合でき、検出可能な 標識をされていない第１結合パートナー、及び該第１結合パートナーに結合でき る第２結合パートナーを含むことを特徴とする、請求の範囲１９に記載のキット 。
27. ２７．該第２結合パートナーが該第１結合パートナーに特異的な抗体であること を特徴とする、請求の範囲２６に記載のキット。
28. ２８．該第１結合パートナーがＭｕｔＬ蛋白質又はその機能的誘導体であること を特徴とする、請求の範囲２６に記載のキット。
29. ２９．該第１結合パートナーがＭｕｔＬ及び検出可能な第２蛋白質又はペプチド の間の融合蛋白質であることを特徴とする、請求の範囲２８に記載のキット。
30. ３０．該第２蛋白質がベーターガラクトシダーゼであることを特徴とする、請求 の範囲２９に記載のキット。
31. ３１．該第２結合パートナーが該ＭｕｔＬ蛋白質又は機能的誘導体に結合できる ことを特徴とする、請求の範囲２９に記載のキット。
32. ３２．該ハイブリッド形成パートナーを固体担体上に固定することを特徴とする 、請求の範囲２２に記載のキット。
33. ３３．該固体担体がニトロセルロース膜であることを特徴とする、請求の範囲３ １に記載のキット。
34. ３４．該ミスマッチー結合蛋白質が酵素と融合した融合蛋白質であり、該試薬が 該酵素のための色素原基質を含むことを特徴とする、請求の範囲１９に記載のキ ット。