JPH0649723B2

JPH0649723B2 - 水溶性架橋グリコサミノグリカン及びその製造法

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Publication number: JPH0649723B2
Application number: JP59132885A
Authority: JP
Inventors: 勝清桜井; 義夫上野; 隆奥山
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1984-06-29
Filing date: 1984-06-29
Publication date: 1994-06-29
Anticipated expiration: 2009-06-29
Also published as: JPS6112701A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、架橋グリコサミノグリカン及びその製造法に
関し、更に詳しくは、グリコサミノグリカン（以下「Ｇ
ＡＧ」という）又はその塩を多官能性エポキシ化合物で
架橋させて成る水溶性架橋ＧＡＧ及びその塩並びにその
製造法に関するものである。

［従来技術及びその問題点］ＧＡＧとして現在までに知られているものに、非硫酸化
ＧＡＧとしてヒアルロン酸及びコンドロイチン（以下
「Ｃｈ」という）があり、硫酸化ＧＡＧとしてコンドロ
イチン硫酸（以下「ＣｈＳ」という）、ヘパリン（以下
「Ｈｅｐ」という）、ヘパラン硫酸（以下「ＨＳ」とい
う）、ケタラン硫酸（以下「ＫＳ」という）及びケタラ
ンポリ硫酸（以下「ＫＰＳ」という）があり、ＣｈＳの
中にはＣｈＳ−Ａ、ＣｈＳ−Ｂ、ＣｈＳ−Ｃ、ＣｈＳ−
Ｄ、ＣｈＳ−Ｅ、ＣｈＳ−Ｆ及びＣｈＳ−Ｈ等がある。
これらのＧＡＧが各組識及び細胞の発生、成長、老化や
病的状態に関与し、各々重要な働きをしていることが解
明されてきている。一般的には、ＧＡＧの機能として、細胞外液の水や電解質のコントロール石灰化線維化創傷治癒・肉芽形成感染抵抗作用潤滑血液凝固阻止・脂血清澄作用透明度の維持等が知られている。

以上のようＧＡＧの有する機能を発現させる目的で外か
ら生体内にＧＡＧを投与する試みは成されているが、時
として、その効果が弱かったり、効果を発現しないと
か、不都合な場所で発現するということがある。それ
は、外から投与するＧＡＧが生体内に存在している時よ
りも精製段階で低分子量になったり、本来の蛋白複合体
を形成しないことにより、水に非常に溶け易く、また、
酵素的分解を受け易く、局所に滞留することができずに
機能を発現する前に消失したり、不都合な場所への拡散
が起こるためと思われる。

このような不都合を解決する目的からＧＡＧにアミノ酸
・ペプチド・蛋白等を結合させたり、脂溶性基を結合さ
せる等の試みが成されてきたが、抗原性の問題や全く別
の性質を示すようになる等の点でいまだ実用化されてい
ない。

一方、従来よりデキストランやアガロースを架橋剤を用
いて架橋する試みは行なわれているが（特開昭４７−１
３２１号）、ＧＡＧを架橋し、水溶性ＧＡＧを得た事例
はない。

そこで、本発明者らは、酵素的分解に対して抵抗性を有
する水溶性架橋ＧＡＧを得ることを目的として鋭意研究
を重ねた結果、ＧＡＧ又はその塩を多官能性エポキシ化
合物で架橋することにより、本発明の目的を達成できる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

［発明の構成］即ち、本発明の水溶性架橋ＧＡＧ及びその塩は、ＧＡＧ
（但し、ヒアルロン酸を除く）又はその塩を多官能性エ
ポキシ化合物で架橋させて成る架橋ＧＡＧであって、架
橋度がＧＡＧの繰り返し二糖１モル当り０．００５以上
０．１６５未満であることを特徴とするものである。

本発明に用いるＧＡＧとしては、Ｃｈ、ＣｈＳ（Ａ，
Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ）、Ｈｅｐ、ＨＳ、ＫＳ、ＫＳ
Ｐなどが挙げられる。但し、ヒアルロン酸については、
特願昭５９−８８４４０号として既に出願している。本
発明に用いるＧＡＧは市販品で充分である。

本発明に用いるＧＡＧは、それが塩形成可能である場合
には、対応する塩を用いてもよい。これらの塩として
は、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩及
びカルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金
属塩等が挙げられる。

本発明において、多官能性エポキシ化合物とは、エポキ
シ基を少なくとも１個有する化合物であって、その他
に、エポキシ基を含めて、ＧＡＧを架橋するに適した官
能基を１個以上有する化合物をいう。

かかる化合物としては、例えば、ハロメチルオキシラン
化合物及びビスエポキシ化合物などが挙げられる。ハロ
メチルオキシラン化合物としては、エピクロルヒドリ
ン、エピブロムヒドリン、β−メチルエピクロルヒドリ
ン及びβ−メチルエピブロムヒドリンなどが挙げられ
る。ビスエポキシ化合物としては、１，２−ビス（２，
３−エポキシプロポキシ）エタン、１，４−ビス（２，
３−エポキシプロポキシ）ブタン、１，６−ビス（２，
３−エポキシプロポキシ）ヘキサン及びビスフェノール
Ａ又はビスフェノールＦのジグリシジルエーテルなどが
挙げられる。

本発明の水溶性架橋ＧＡＧは、架橋ヒアルロン酸に関す
る特願昭５９−８８４４０号記載の方法に従っても製造
することができるが、反応をより効率的に行なうには、
次のような方法に従うことが好ましい。

即ち、ＧＡＧ又はその塩のアルカリ溶液に水溶性有機溶
媒を加えて、得られる水アメ状沈殿物を分取し、該沈殿
物に多官能性エポキシ化合物を加えて、５０℃以下で反
応させると非常に効率的に反応を行なうことができる。
アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウ
ム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属及びアルカリ土類
金属の水酸化物及び炭酸塩等が挙げられ、そのアルカリ
溶液のpHは、８〜１４であることが好ましく、１２〜１
４であることが更に好ましい。水溶性有機溶媒として
は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセ
トン、ジオキサンなどが挙げられ、これらは、単独で又
は混合物として用いられる。これらの水溶性有機溶媒を
加えることにより水アメ状沈殿物が生じる。これを分取
するには、例えば、デカンテーションにより上清を除去
すればよい。反応温度は、通常１０〜５０℃で、最も好
ましいのは２０〜４０℃である。温度が高い程、短時間
で反応を終了させる必要がある。一般的には、４０℃近
辺では２時間程度が、２０℃近辺では２４〜４８時間が
好ましい。

本反応において、ＧＡＧ又はその塩と多官能性エポキシ
化合物とのモル比を変えることにより、得られる水溶性
架橋ＧＡＧ又はその塩の架橋度を調節することができ
る。

本発明で目的とする架橋度がＧＡＧの繰り返し二糖１モ
ル当り０．００５以上０．１６５未満である架橋ＧＡＧ
を得るには、例えば分子量５万前後のＧＡＧにおいて
は、ＧＡＧの繰り返し二糖１モルに対し多官能性エポキ
シ化合物０．１モル以上０．５モル未満用いればよく、
これにより水溶性で曳糸性を有する架橋ＧＡＧ（以下
「ｓ−架橋ＧＡＧ」という）を得ることができる。

ＧＡＧを含む水アメ状沈殿物を分取して行なう本発明の
水溶性架橋ＧＡＧの製造法は、架橋剤として用いる多官
能性エポキシ化合物が効率よく反応に用いられるので、
用いる架橋剤が非常に少量でよいという利点を有する。
本製造法は、特願昭５９−８８４４０号記載の架橋ヒア
ルロン酸を製造するにも、適用することができる。

［発明の効果］本発明の水溶性架橋ＧＡＧ及びその塩は、グリコシダー
ゼに対して抵抗性を示すと共に、ＧＡＧの有する種々の
特性も維持しており、幅広い用途を有する。

ｓ−架橋ＧＡＧは、優れた徐放効果を有しており、徐放
性薬剤の製造に有用である。

［発明の実施例］以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は、本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。

実施例１ (1)ｓ−架橋ＧＡＧ（ＣｈＳ−Ｃ）の合成ＣｈＳ−Ｃナトリウム塩（分子量５３０００）３．１ｇ
を０．７５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に１２．５％にな
るように溶かし、撹拌下、エタノール１容量を加え、生
じたアメ状沈殿物を分取した。このアメ状沈殿物にエピ
クロルヒドリン０．１８mlを加えて充分に練り合わせ、
２０℃で２４時間放置した。反応液に水３０mlを加えて
溶解し、酢酸でpH６．０として、エタノール沈殿を行な
った。再度、水に溶かし、エタノール沈殿を行ない減圧
乾燥した。

(2)ｓ−架橋ＧＡＧ（ＣｈＳ−Ｃ）のゲルクロマトグラ
フィー (1)で合成されたｓ−架橋ＧＡＧ（ＣｈＳ−Ｃナトリウ
ム塩）と合成に使用したＣｈＳ−Ｃナトリウム塩につい
てガラスビーズＣＰＧ３０００(ELECTRO NUCLEONICS.IN
C.社）のカラム（６×８５０mm）を用いて、ゲルクロマ
トグラフィーを行なった。展開溶媒は１．５Ｍ塩化ナト
リウム水溶液を水酸化ナトリウムでpH８．５に調整して
使用し、０．５２mlずつ溶出画分に分け、カルバゾール
−硫酸法でウロン酸を定量した。結果を図１に示す。図
１において、〇印及び●印はそれぞれｓ−架橋ＧＡＧ
（ＣｈＳ−Ｃ）及びＣｈＳ−Ｃの各フラクションのカル
バゾール硫酸法における吸光度を表わし、Ｖoはゲル粒
子外部容積を表わす。図１から、本発明のｓ−架橋ＧＡ
Ｇは原料ＧＡＧに比し、非常に高分子になっていること
がわかる。

(3)ｓ−架橋ＧＡＧ（ＣｈＳ−Ｃ）の徐放効果 (1)で合成されたｓ−架橋ＧＡＧ（ＣｈＳ−Ｃ）と原料
ｈＳ−Ｃの１％生理食塩水溶液について、透析膜をVisk
ing tube(Visking CompAny製18/32)と１％パラニトロフ
ェノール生理食塩水溶液（以下「ＰＮＰ溶液」という）
を用いて薬物に対する徐放効果を検討した。

透析膜に、それぞれ、（生理食塩水５ml＋ＰＮＰ溶液１
ml）、（１％ｓ−架橋ＧＡＧ（ＣｈＳ−Ｃ）溶液５ml＋
ＰＮＰ溶液１ml）、（１％ＣｈＳ−Ｃ溶液５ml＋ＰＮＰ
溶液１ml）を入れ、空気を除いて密封し、透析外液（２
００mlの生理食塩水）に透析されてくるＰＮＰの回収率
を３１５ｎｍにおける吸光度の測定により算出した。

結果を図２に示す。図２において、●印、〇印及びは、それぞれ、生理食塩水、ＣｈＳ−Ｃ及びｓ−架橋Ｃ
ｈＳ−ＣのＰＮＰの透析に与える影響を表わす。

この結果から、本発明のｓ−架橋ＧＡＧが薬物の徐放に
効果的であることがわかる。

(4)ｓ−架橋ＧＡＧ（ＣｈＳ−Ｃ）のグリコシダーゼ抵
抗性ＣｈＳ−Ｃナトリウム塩（分子量５３０００）を原料と
して実施例１(1)に準じて次に示す２種のｓ−架橋Ｃｈ
Ｓ−Ｃを合成した。

実施例１(1)並びにこれら２種のｓ−架橋ＣｈＳ−Ｃ及
び合成に使用したＣｈＳ−Ｃナトリウム塩をそれぞれ
０．４Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８．０）に１０％の濃度
に溶解し、粘度を測定（２０℃、ずり速度１．０ｓｅｃ
^−１）したところ次のとおりであった。実施例１(1)の
ｓ−架橋ＣｈＳ−Ｃをｓ−架橋ＣｈＳ−ＣC)として表わ
す。

ｓ−架橋ＣｈＳ−Ｃ(A) ３１００センチポアーズｓ−架橋ＣｈＳ−Ｃ(B) １４５００センチポアーズｓ−架橋ＣｈＳ−Ｃ(C) ４４０００センチポアーズＣｈＳ−Ｃナトリウム塩１５００センチポ
アーズこれらの溶液に０．０５重量％になるようにコンドロイ
チナーゼＡＢＣを加え、３７℃で反応させ、５、１０、
２０、３０、６０、１２０分後に粘度を測定し、反応前
の粘度に対する割合を算出した。

結果を図３に示す。図３において○印、△印、□印及び
●印は、それぞれ、ｓ−架橋ＣｈＳ−Ｃ(A)、(B)、(C)
及びＣｈＳ−Ｃナトリウム塩の０．４Ｍトリス塩酸（pH
８．０）溶液の各反応時間における反応前の粘度に対す
る割合を表わす。

図３から、本発明のｓ−架橋ＣｈＳ−Ｃは、ＣｈＳ−Ｃ
に比し、コンドロイチナーゼＡＢＣに対する抵抗性が高
く、その程度は、架橋度が高い程顕著であることがわか
る。同様に他のｓ−架橋ＧＡＧもグリコシダーゼに対し
て抵抗性を有することは容易に類推される。

実施例２ｓ−架橋ＧＡＧ（ＣｈＳ−Ｃ）の合成ＣｈＳ−Ｃナトリウム塩（分子量５４０００）１．２５
ｇを０．７５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に１２．５％に
なるように溶かし撹拌下、エタノール１容量を加え、生
じたアメ状沈殿物を分取した。このアメ状沈殿物にエピ
クロルヒドリン０．５９mlを加えて充分に練り合わせ、
２０℃で２４時間放置した。反応液に水１５mlを加えて
溶解し、酢酸でpH６．０として、エタノール沈殿を行な
った。再度、水に溶かし、エタノール沈殿を行ない減圧
乾燥した。

実施例３ｓ−架橋ＧＡＧ（Ｈｅｐ）の合成Ｈｅｐナトリウム塩（分子量１５０００）０．４ｇを
１．３Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１mlに溶解し、エタノ
ール１．５mlを加え、生じたアメ状沈殿物を分取した。
このアメ状沈殿物にエピクロルヒドリン０．０２６mlを
加えて充分に練り合わせ、２０℃で２４時間反応させ
た。反応物に水５mlを加えて溶解し、酢酸で中和後、エ
タノールを加えて得た白色粉末を減圧乾燥した。

実施例４架橋ＧＡＧの架橋度ＣｈＳ−Ｃナトリウム塩（分子量５３０００）１．２５
ｇを０．７５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、エタ
ノールを等容量加えた。上清を廃棄し生じたアメ状沈殿
物に¹⁴Ｃ−標識化合物である［２−¹⁴Ｃ］エピクロルヒ
ドリン（アマシャム・ジャパン社から入手）を加え、充
分に練り合わせ、２０℃で放置した。４８時間後、反応
液に水２０mlを加えて溶解し、酢酸でpH６．０とした
後、３倍量のエタノールで沈殿させた。次いで、水２０
mlに沈殿物を溶解し、３倍量のエタノールを加えて白色
粉末を得た。エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。上記
調製試料５mgに０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．５
mlを加え、６０℃で１時間加温し、粘度を低下せしめ、
これに１．０Ｎ塩酸０．５mlを加えて中和した。この溶
液について、液体シンチレーションカウンターで放射活
性を測定し、架橋度を算出した。結果を表２−２に示
す。

表２−２から、ｓ−ｓ−架橋ＧＡＧにおいては、架橋度
と粘度とが比例関係にあることがわかる。

【図面の簡単な説明】

図１は、ｓ−架橋ＧＡＧ（ＣｈＳ−Ｃ）とＣｈＳ−Ｃと
のゲルクロマトグラムを示す図である。図２は、ｓ−架
橋ＣｈＳ−Ｃ及びＣｈＳ−ＣのＰＮＰの透析に与える影
響を示す図である。図３は、ｓ−架橋ＣｈＳ−Ｃ及びＣ
ｈＳ−Ｃのコンドロイチナーゼに対する抵抗性を示す図
である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グリコサミノグリカン（但し、ヒアルロン
酸を除く）又はその塩を多官能性エポキシ化合物で架橋
させて成る架橋グリコサミノグリカンであって、架橋度
がグリコサミノグリカンの繰り返し二糖１モル当り０．
００５以上０．１６５未満であることを特徴とする、水
溶性架橋グリコサミノグリカン及びその塩。
【請求項２】グリコサミノグリカン又はその塩のアルカ
リ溶液に水溶性有機溶媒を加えて、得られる水アメ状沈
殿物を分取し、該沈殿物に多官能性エポキシ化合物を加
えて、５０℃以下で反応させることを特徴とする、水溶
性架橋グリコサミノグリカン又はその塩の製造法。