JPH06500173A - インシュリン依存性真性糖尿病の早期検出及び処置のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２２、　６４に蛋白質に相同性を有するウィルスに対する抗体を生じるワクチン 組成物であって、その抗体が、膵臓の島細胞又はそれのインシュリン製造能力を 破壊しないものである、人又は動物のインシュリン依存性糖尿病に対して免疫を 与えるワクチン組成物。

２３、　人又は動物のインシュリン依存性糖尿病への免疫を与えるワクチン組成 物であって、該ワクチンは弱毒化ウィルスを含み、該ウィルスは弱毒化されてい ない形態では６４に蛋白質と相同性を有するので感受性の人又は動物に感染でき て６４に蛋白質又はすい臓の島細胞を認識し攻撃する抗体を含む免疫応答を生じ 、ウィルスを抑制できる免疫応答を起こすが６４に蛋白質を表現する細胞を攻撃 する能力のある抗体を起こすエピトープを欠いているアミノ酸配列を該弱毒化ウ ィルスが含んでいる、ワクチン組成物。

２４、　ウィルスがコクサキ、Ｉ１１疹及びＥＭＣウィルスから選択される請求 項２３に記載のワクチン。

２５、　毒素と共に、６４に抗原、又はその免疫学的均等物を含んでいる有効量 のハイブリッド蛋白質を投与することからなる、インシュリン依存性糖尿病を有 する人を処置する方法。

２６、　毒素と共に、８４に抗原、又はその免疫学的均等物を含んでいる有効量 のハイブリット蛋白質を投与する二とからなる、移植された＊＊細胞の免疫拒絶 を減少する方法。

２７、　ＩＤＣを有する疑いのある人からのＴリンパ球検査を含み、該検査がＣ ＡＤ、６４ＫＮ白質、又は６４ＫＡと免疫反２性である合成ペプチドに応答して Ｔリンパ球が増殖するかどうかを測定することを含む、ＩＤＤの開始を検出する 方法。

明　細　書 発明の名称　インシュリン依存性真性糖尿病の早開検出及び処置のための方法及 び絹成物 関連出頓へのクロスリファレンス この出願は現在放棄された１９８８年１２月１３日に出願の連続番号０７７２８ ３．６３３の一部継続出願である１９８９年ｌＯ月２５日に出願された連続番号 ０７７４２７．０５１の一部継続出願である、１９９０年８月１７Ｂに出願され た連続番号０７１５６９　、３２４の係統中の出願の一部継続出願である。

発明の背景 糖尿病は人々の健康の大きな問題となっている。国立糖尿病諮問委員会の、糖尿 病を駆逐する国の長期計画、１９８７年リポートで報告されるように、米国の６ ００万の人々が糖尿病を有することが知られており、更に５００万が診断されて いないこの病気を有し、毎年５０万を超える新しい糖尿病患者が見つけられてい る。　１９８４年には糖尿病は３５，０００人のアメリカ人の死亡の直接の原因 であり、更に９５　、０００人に対し死亡の要因に寄与していた。

糖尿病の目の併発症は米国で２０〜７４才の人々における法律で定義されている 盲目の新しい患者の主要な原因である。下肢を切断する危険は糖尿病でない個人 よりも糖尿病を有する個人は１５倍大きい。この評価は糖尿病を有する人が米国 で毎年実施されているおよそ１２５．０００人の足の切断の半分を超える切断を 経験していることを示唆している。

間約な腎臓病に対して処置を受けた米国におけろすべての新たな患者のおよそ３ ｏｚが糖尿病を有している。このパーセントは毎年およそ２Ｉの速度で増加して おり、従って次の！Ｏ年閏以内に、糖尿病と関連する腎臓病は、末期段階の腎臓 病のプログラムにおけるすべての登録者の半分を超えるものとなるであろう。

糖尿病を有する個人はまた、歯周病に対する危険も増加している。歯周の感染は 急速に進行し、歯を失う二とのみならず妥協的な代謝抑制にもつながる。糖尿病 を有する女性は妊娠の重大な併発症の危険がある。現在の統計は糖尿病を有して いる母親の胎児がおよそ７ｘの死亡率であることを示唆している。

糖尿病に対する経済的な負担も大きい、毎年糖尿病を有する患者又はその併発症 を有する患者は病院において２４００万の患者・日を使い果たしている。糖尿病 に帰因する１年当りの合計コストを控え目に見積っても少なくとも２４０億ドル （アメリカ糖尿病協会評価、１９８８）であり、この病気の経済全体に対する影 響は、追加的な医療の出費がしばしば糖尿病自体よりも糖尿病の特定の併発症に かかるので、もっと大きいものとなる。糖尿病は、体が適正に炭水化物、脂肪及 び蛋白質を維持及び使用することができなくなる慢性の複雑な代謝病である。糖 尿病は種々の遺伝的及び環境的な因子の相互作用から生し、インシュリン生産が できないか又はその利用が損われることによって生じる高い血糖水準によって特 徴づけられる。

糖尿病の多くのケースは２つの臨床的な種類に当てはまる。インシュリン依存性 の真性糖尿病（ＩＤＤＭ又は１０Ｄ）と非インシユリン依存性の真性糖尿病（Ｎ ＩＤＤＭ又はＮＩＤＤ＞である、それぞれのタイプは異なる予後、処置及び原因 を有している。

およそ５〜１（Ｈの糖尿病患者は、人生の初期、通常は幼年期又は思春期に現れ たために以前は若年性糖尿病と呼ばれていた、１００を有している。１００はイ ンシュリンをつくることが部分的又は完全にてきないことによって特徴づけられ る。１００を有する患者は彼等の病気を抑制するために毎日インシュリンの注射 をしなければ死んでしまう。

糖尿病の病因の解明は１９７０年代の中頃までほとんど進歩はなされなかったが 、その頃になって１００が自己免疫的な病因を有することを示唆する証拠が蓄積 し始めた。

現在では１００がインシュリンを製造している膵臓のβ細胞の慢性的な自己免疫 破壊から生じるということが一般に受け入れられている。リンパ球及び他の炎症 性の細胞が新たに診断された１００の患者のランゲルハンス島内に観測され、そ して他の細胞形態のものよりもβ細胞で構成された再生している（ランゲルハン ス）洛中により多く見出される。この活性な免疫過程はβ細胞の庸＠貢及び膜抗 原、インシュリン及びインシュリンレ七ブタ−に対する種々の自己抗体と関連し ている。

従ってＩＤＤは自己抗体で充満した病気である。これらには細胞質型の島ｍ胞自 己抗体（ＩｃＡ）（ボツタゾ（Ｂ　ｏ　ｔ　ｔ　ａ　ｚｏ）、　Ｇ、Ｆ、、　Ａ 、フローリンークリステンセン（Ｆｌｏｒｉｎ−Ｃｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）、及び り、ドニアツク（Ｄｏｎｉａｃｈ）［１９７４］　Ｌａｎｃｅ、２：１２７９− １２８３）、島細胞表面自己抗体（ＩＣ５Ａ）（マクラレン（Ｍａｃｌａ「ｅｎ ）、Ｎ、、Ｓ、−、ファング（Ｈｕａｎｇ）＋及びＪ、フォグ（Ｆｏｇｈ）［１ ９７５］Ｌａｎｃｅｔ、を二９９７−１０００）、インシュリン自己抗体（ＩＡ Ａ）（バルマー（ＰａｌｌＩｌｅｒ）、Ｊ、Ｐ、、Ｃ，Ｍ、アスブリン（Ａｓｐ ｌｉｎ）、及びＰ。

クレモンス（Ｃｌｅａｍｏｎｓ）［１９８３］　５ｃｉｅｎｃｅ　２２２：１３ ３７−１３３９）及び可能なアンチ遺伝子型インシュリンレセプター自己抗体（ Ｉｎｓ、Ｒ，Ａ、）（マーロン（Ｍａｒｏｎ）、　Ｒ，、Ｄ、エリアス（Ｅｌｌ ａｓ）、　Ｍ、ｄｅ　Ｊ−バーテルト（Ｂａｒｔｅｌｔ）、　Ｇ、Ｊ、プルイニ ング（Ｂｒｕｉｎｉｎｇ＞＋　Ｊ、Ｊ、パンロード（Ｖａｎ　Ｒｏａｄ）、　Ｙ 、シエヒター（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ）、及び　１．シコーエン（Ｃｏｈｅｎ）　［ １９８３］　Ｎａｔｕｒｅ３０３：８１７−８１８）が含まれる。　１９８２年 において６４，０ＯＯ１’ｌ、島細胞抗原に対する抗体が１００患者中で検出さ れたことが報告されたくベラケスコツ（Ｂｅｋｋｅｓｋｏｖ）、Ｓ、ら　［１９ ８２］　Ｎａｔｕｒｅ　２９８：１６７−１６９）、後の刊行物でベラケスコツ らは６４．ＯＱＯし抗体がＢＢラットモデルにおいてＩＤＤと関連していること を報告した（ベラケスコツ（Ｂ　ｋｋｅｓｋｏｖ）、Ｓ、ら　［：１９８４］　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：１３４８−１３５０）ｓ後に追跡試験によってｌＤ［ ｌを有する、従って＠策を生しる危険のある二とが知られている個人と関連して いる患者が調べられた（ベラケスコツ（８ｅｋｋｅｓｋｏｖ）　、Ｓ　、ら　［ １９８７］　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、１ｎｖｅｓｔ、７９：９２６−９３４）。

この後の研究の結果は６４．０００Ｍ、抗体が臨床的な症状の現れの前に幾人か のＩＤＤ患者中に存在しているかもしれないことを示唆した。しかし同じ研究で ヘラケスコツらは６４．０００Ｍ、Ｉ白の機能が未知であり、二のデータが６４ ．０００Ｍ、抗体がβ細胞機能の減少が開始される前に存在するかどうかについ て結論づけることができないことを報告し・ている。

種々のβ細胞に特異的でない分子に対する池の抗体が＋　００　＝、者に増加し て存在することが報告されている。これらにはツブリン（ｔｕｂｕｌ　ｉｎ）、 単−鎖及び二重鎖ＤＮＡ、胃壁細胞、固有因子副腎皮質細胞、甲状腺パーオキシ ダーゼ酵素及びテロダブリンに対する抗体が含まれる。ＩＤＤ患者はＢ−リンパ 球のポリクロナル活性化の徴候を有し、種々の抗原に対する増加した抗体力価は その結果てあり得る。

更に過去１０年間の研究は１００を有する患者が、＋００に対するかかりやすさ と関連している組織適合性（ヒストコンパチビリティ−）抗原と呼ばれる遺伝マ ーカーを有していることを示している。これらの遺伝的な感受性マーカーは１０ ０の発生に必要であるが十分てはないので、いまだ知られていない何らかの追加 的な環境的な因子が、β細胞の破壊の開始及び糖尿病の発生に必要であるようで ある。環境因子はウィルスであれ化学剤であれ、β細胞に対する免疫応答を開始 し、遺伝的にかかりやすい人のβ細胞の免疫的な破壊を許してしまう（アトキン ソン（へｔｋｉｎｓｏｎ）、Ｍ、Ａ、、　Ｎ、に、マクラレン（Ｍａｃｌａｒｅ ｎ）、　［１９９０１Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｅｉｃａｎ　７：６２− ６７）。従って、糖尿病患者を糖尿病前の状態で見つけ出すことは、この病気の 発生を予防する努力において必須のものである。おそらく過去２０年間の糖尿病 研究における最も重要な単一の進展は、β細胞の自己免疫破壊が完了するまでに 何カ月も何年もかかるということの認識である。現在糖尿病の臨床的な診断は、 破壊過程がほとんど完了するまで、そして死亡を防ぐためにインシュリン注射が 必要とされるまでほとんどなされないが、インシュリン生産細胞が非可逆的に破 壊されてしまう以前に干渉することは、糖尿病とその併発症の進行を防止する方 策を与え得る。

従って病気が臨床段階に進行する前に１００の開始を正確に予測する手段を見つ けることが必須である。

多くの生物学的なマーカーがＩＤＤと関連しているが、現在までこれらのマーカ ーのどれもが病気の臨床的な徴候の開始前に均一に存在することが示されていな い（マクラレン（Ｍａｃｌａｒｅｎ）、Ｎ、に、　［１９８８］　Ｄｉａｂｅｔ ｅｓ　３７：１５９１１５９４）。そのような初期の存在は病気の有用な予測試 験として定性化するためには化合物に対し必須である。しかしながら初期の存在 だけては正確な初期の検出法に対し十分てはない、特定なマーカーの存在又は非 存在に基づく予測試験は、その予測マーカーが１［）Ｄを有することとなる人に のみ存在し、そうでない人には存在しない場合のみ貴重なものである。糖尿病の 処置ならびにその病気の心理的な衝撃は診断される人の健康に対し重大な影響を 有し得るので、特異的であるから間違って陽性としてしまう二とが非常に少ない 予測試験を開発するのが重要である。

臨床的な症状が現れる何年も前に病気の開始を認識できる予測試験を見つけ出す ことも重要である。早期発見は、臨床段階の１００と間違する重大な健康問題に 対し機先を制し又はこれを予防することができる処置を行う機会を提供する０例 えばシクロスポリンＡ、アザチオプリン及びステロイドなとの薬物での非特異的 な免疫抑制試験が新たに診断された患者で実施されてきた。それらの使用の最初 の年にわたっては限られた数の病気の小康が得られたが、これらの患者はβ細胞 が限られた再生能力しか有さなかったので正常には決して戻らず、診断の時に始 まる治療はほとんど遅すぎることが多い。

現在までこれらの要求を満たすＩＤＣに対する適当な予測試験は見つかっていな い。多くの自己抗体がこの病気と間違しているが、むらなく予測させる自己抗体 を同定する研究はうまくいっていない。例えば１９７６年も昔に島纏抱のグルカ ゴン分泌（α）Ｉ！胞の細胞質と反応する自己抗体（ＡＣＡ）が記載されている くボ・ソタゾ（Ｂｏｔｔａｚｏ）、Ｇ、Ｆ、。

及びＲ，レンドラム（Ｌｅｎｄｒｕａ＋）　［１９７６］　Ｌａｎｃｅｔ　２： ８？３−８７６）。内分泌腺に対する自己抗体は、病気の臨床的な開始の前に生 しるか開始に伴うことが見出されているので、ＡＣＡが島纏抱のホルモンである グルカゴンの欠乏に対する予測マーカーであり得ると思われた。不幸にして、後 の研究によってＡＣＡは欠陥α！ＩＩ胞機能と間違せず、ＩＤＤと間違せず、又 どんな同定できる膵臓の病理とも間違しなＩＩＡよってあることが明らかにされ た（ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）＋Ｗ、Ｅ、、　Ｎ、に、マクラレン（Ｍａｃｌ ａｒｅｎ）、　Ｗ、Ｊ、リレー（Ｒｉｌｅｙ）。

Ｒ，Ｈ，アンガー（Ｕｎｇｅｒ）、　Ｍ、ノイフオルド（Ｎｅｕｆｅｌｄ）、及 びＰ、Ｔ、オザンド（Ｏｚａｎｄ）　［１９８４］　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３３（ ５）：４３５−４３７）。

膵臓及びＩｆ）Ｄの臨床段階と関連する他の抗体の予測価値への研究がこの病気 の早期発見の手段をつくりだした。

例えば、インシュリン自己抗体（ＩＡＡ）と島細胞自己抗体（ＩｃＡ）の両方が 多くの新たに診断された患者に存在することが見出されている。　ＩＣＡはｌ［ ｌＤの臨床段階の前に存在することが示されており、特にＩＤＣの危険性のある 糖尿病でない親戚に見出されている。しかし、ＩｃＡもＩＡＡもＩＤＯに対する ほとんど絶対的な特異性及び感受性を与えるような予測試験を提供しない。

従って臨床症状が開始する前及びインシュリン療法が必要となる前に、初期段階 において＋００を検出するより正確な手段が、実質的に、そして長い間にわたっ て必要と感じられてきた。

発明の簡単なまとめ 本明細書に記載された発明は、インシュリン依存性の真性糖尿病（ｌ［ＩＤ）を 早い段階で正確に発見する新しい手段に間するものである。より詳しくは１００ はβ！ｉｌ胞機能の有意義な消失の前に発見てきる。又、初期段階においてＩＤ Ｃを治療する手段が記載される。

より詳しくは、島細胞６４　、０００Ｍ、蛋白質に対する自己抗体は、１００の 臨床的な出現が観測される数年も前までに存在していることがわかった。この抗 体は６４に八と命名される。この体をだめにしてしまう可能性を秘めた病気の早 期発見は、非可逆的な破壊が広がりを見せる病気の後の段階において有効ではな い干渉的な治療をすることを容易にする。

＋００の開始を検出し予測するために６４にＡは単独で使用できるか、又はＩＤ Ｃと関連することが知られているＩＣＡやＩＡＡなとの他の自己抗体と組み合わ せて使用することもできる。本明細書に記載される６４ＫＡはＩＤＤに対し高度 に病気に特異的である。６４にＡは＋００の開始に先立つて何カ月も何年も前に 試験された子供や若い成人においてむらなく存在することがわかった。この病気 と間違する他の抗体ができないにもかかわらず、６４にＡ試験はＩＤＤの開始を 予測することがわかった。

６４にＡと反応性の蛋白質抗原がＩＤＤの治療に有用であることも見出された０ 本発明の一部として、＋００を治療するか又は１０００開始を遅らせる新規な手 段がここζこ記載される。治療の新規な手段は、新規なハイブリツドβ細胞６４ に蛋白質を構築すること、すなわち１００の病因に関与している免疫学的な媒介 物の能力を奪うことができる毒素生成物を構築することである。

本発明の更に別の面は、６４にハイブリッド毒素分子を投与することによって、 新しい膵臓の、免疫と間違した破壊及び拒絶反応を最小限にすることによって、 膵臓の島細胞移植の切迫した破壊を診断し予防するために６４ＫＡを使用するこ とである。更に本発明は干渉療法の手段として６４にＡに対するアンチ遺伝子型 抗体を使用することここ間する。

本発明は更に膵臓の６４に蛋白がグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＣＡＤ）蛋 白質と配列の相同性を有するとｔｌう発見に更に間している。更に６４に蛋白質 はＧＡ［）酵素に対する抗体と免疫学的な反応性を有している。従って本発明の 更に別の要素はＣＡＤ蛋白質又は免疫学的に活性のその断片を１００の診断、予 防、及び処置に使用することζこ開本明細書に記載された発明は、１００の開始 の正確で特異的な早期指標示として、６４に自己抗体を使用することに関する。

　＋［）Ｄに対する有用な予測マーカーとしての６４に＾が見出されたのは、Ｉ ＤＣと間違する多数の化合物に着目して行った徹底的な生化学的研究から生じた ものである。

６４にＡの１００に対する高い特異性、ならびにＩＤＤの開始の何年も前に人中 に６４ＸＡがしばしば存在することは、両方、とも予想外である。これらの６４ にＡの性質はＩＤＤの早期発見の手段として６４にＡをを眉なものとする。

特定の物質がＩＤＤの開始の有効な予測物かどうかを確かめるために、これらの 物質が糖尿病の臨床的な症状の起きる前に存在するかどうかを決定する必要があ る。この糖尿病前の期間は、病気にかがフた発端者の多数の危険度が高い親戚に ついて、感受性の人を同定するために循環している自己抗体のスクリーニングを しなければならず、糖尿病のβ細胞不全の自然の歴を文書化するために長期間の 観測が必要であるから、研究するのが困難である。従って、人の試験に対して得 られるデータを増加させ、更に確認するために動物モデルが使用された。

肥満していない糖尿病（ＮＯＤ）マウスは人１００に対する有用な動物モデルで ある。　ＮＯＤマウスの研究は病因事象のシーケンスに対し重要な識見を与え、 そして自己免疫過程において関与する標的島細胞自己抗原の性質の理解につなが る。１００に対する別の重要なモデルはバイオブリーディング（ＢＢ）ラットで ある９本発明は人、ＢＢクラットびＮＯＤマウスを含めた研究及び試験の結果発 見された。

人及び８Ｂラツトモデルにおいて高細胞自己免疫が相対分子量（Ｍ、）６４，０ ００（６４Ｋ）のβ細胞蛋白質に対する自己抗体と間違していることが発見され た。又、新たに診断されたＮＯＤマウスからの血清は同様に３８５メチオニン標 識化ねずみ高細胞の洗剤溶解物からの６４に抗原を免疫沈殿させる自己抗体を含 有していることが決定された（アドキンス（Ａｔｏｋｉｎｓｏｎ、Ｍ、　、及び Ｈｌに、マクラレン（Ｍａｃｌａｒｅｎ）　［１９８Ｂ］　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　 ３Ｂ：１５８７−１５９０）、　ＮＯＤマウスにおいてこの自己抗体は乳離れの ときまでに検出可能であり、これは糖尿病開始の数週閏内に消失し、より年をと った非糖尿病マウスならびに試験された全ての３つの非糖尿病体貢対照系統にお いて存在しなかった０人においては、後の１００の開始が３５才よりも下であっ た人のうちの９６％において、臨床的な診断の前に６４にＡが存在した。６４に ＡはＩＤＤの臨床的な出現の十分以前に予測可能に存在することがわかフた。又 ６４にＡの存在はＩＤＣに対し高度に特異的であることがわかった。　ＩＡＡ又 はＩＣＡと異なって６４にＡはＩＤＣを生じることについて高い危険性がない、 又は増加した危険性がない個人には観測されなかった。

１に亙１遣 高細胞調製 人の膵臓の島を以前に報告したように死体の膵臓からｍａｔ、た（Ｄｉａｂｅｔ ｅｓ　３？：４１３−４２０．１９８８）、島の全てのバッチを、補充した培地 ＣＭＲＬ１０６６中でインビトロ（試験管内）で保持した。バッチ当り平均８４ ，９４６士目、０６ｆ（ｘ±ＳＥＭ、ｎ＝１２）の単離された人の島が得られ、 平均の高純度９１．２±２゜３ｚ、そして島当りインシュリン含量０．４±０． １ａ＋ＩＪインシユリンであった。　６０ｍｇ／ｄｌ・３００１ｇ／ｄｉの交互 のグルコース濃度でのクレブス（ＫＲＥＢＳ）の潅流試験によって４．６８±０ ．６６（Ｇ３００／Ｇ６０）の平均インシュリン刺激インデックスが与えられた 。全てのバッチは７日間以内に標識された。

高細胞の代謝標識化 最小で３６時間のインビトロの培養に続いて（６０００島１５０■Ｉ　ＲＰ旧１ ６４０培地に１６ａ＋Ｍのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、　１００ｕＵ／ ｓｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２＄（ｖ／ｖ）正常な 人血清を補充したもの、３７℃、９５１空気／　５　ＫＯ□）、これらの島を再 植え付けし、メチオニンが欠けている補充したＲＰＭ＋１６４０培地（１０００ 島／１）中で１５分間培養した０次に細胞を、０．５■Ｃｉ／Ｉχ１０３島細胞 の濃度で３６５メチオニン（＞５００Ｃｉ／１ｍｏｌ）を加えておいたメチオニ ンのない培地（１０００島１−１）中テ３７℃テ（９５％空気１５ＸＣＯ２）５ 時間培養した。ＩＩ胞を次に補充したメチオニン含有（０，５ｍＭ）ＲＰＭ１１ ６４０培地（１０００島／ｍｌ）と３０分間培養し、２度（２００ｘｇ、５分間 ）２０１Ｍ　）リス（ｐＨ７，４）、１５０５Ｍ　Ｎａｃｌ、１００にＩＥ／１ アプロチニン及び２■門フエニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を 含有している緩衝液で洗浄し、そして次にそれらの洗剤の抽出までスナップ（一 時的急冷却）凍結させた（−８０℃）。

６４に自己抗原の免疫沈殿 上記緩衝液中で溶解させた。不要物を超遠心で除去した（＋００．ＯＯＯｘｇ、 ３０分、４℃）、溶解物を次に免疫沈殿に先立って水相、蔗糖相及び洗剤相に分 離したくボルディア−（Ｂ。

ｒｄｉｅｒ）、Ｃ，［１９８１１Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＊　２５６：１０６４− １０６７）−溶解物を正常な対照人血清（１００μｍの上澄み当りｌＯμ＋、　 １時閏、４℃）とともに培養し、続いてプロティンＡセファロースＣＬ−４８の 過剰に吸着させた（１００μｍの膨潤プロティンＡセファ０−スを２５μｍの血 清に対し使用）、結合しない（予備透明化）溶解物のアリコー）　（５−１０ｘ ｌＯ’ｃｐ■を含有している１００μｍ）を２５μｍの試験血清（ＩＤＯ又は対 照のいずれか）とともに１８８時間培養たく４℃）、試験された各々の血清試料 に対する１０００個の島からの洗剤抽出物を使用した。各検定試験管に対し、予 備膨潤化プロティンＡセファロースＣＬ−４８を加え、反応混合物を４５分間培 養した（４℃）、プロティンＡセファロースＣＬ−４８を次に０．５！　）リド ン”Ｘ−１１４緩衝液中で遠心させること（２００ｘｇ、１０秒問）によって５ 回洗浄し、水冷２回蒸留水（２００ｘｇ、３０秒問）中で１度洗浄した。結合し た蛋白質を溶出させ、８０■ｉトリス（ｐＨ６，８）、３．（Ｈ（ｗ／ｖ）ドデ シル硫酸ナトリウム（５０５）、１５！（ｖ／ｖ）シュークロース、Ｏ，０ＯＩ Ｘ（ｖ／ｖ）ブロムフェニルブルー、及びｓ、０Ｘ（ｖ／ｖ）β−メルカプトエ タノールを含有している試料緩衝液中で３分閏沸騰させることによって変・　性 させた。セファ０−スビーズを遠心分離で除去しく２００人ｇ＋１分間）、そし て上澄み液を不連続５Ｏ５ＩＯＸポリアクリルアミド分離ゲルを通して電気泳動 させ、続いてクマシーブリリアントブルー染色とエンハンス（Ｅｎｈａｎｃｅ） 　にューイングランドニュークリアー、マサチューセッツ州、（ノイフエルド（ Ｎｅｕｆｅｌｄ）、　Ｍ、Ｎ、マクラレン（Ｍａｃｌａｒｅｎ）＋ν、リレイ（ Ｒｉｌｅｙ）、　Ｄ、リゾッテ（Ｌｅｚｏｔｔｅ）、　Ｈ，マクロ−リン（Ｍｃ Ｌａｕｇｈｌｌｎ）、　Ｊ、シルバースタイン（ｓ＋１Ｖｅｒｓｔｅｉｎ）。

及びＡ、ロゼンプルーム（Ｒｏｓｅｎｂｒｏｏｇ）　［２９８０］　Ｄｉａｂｅ ｔｅｓ２９：５８９−５９２）中に記載されるように血液群０型クリオカッ）　 （ｃｒｙｏｃｕｔ）ｌｉ　ＩＩ切片に対し、閉接的な螢光抗体法によってＩＣＡ を検定した。すべての結果はコード化された試料に対して読み取られ、各バッチ 中で対照陰性及び陽性血清を用いた。血清は組織の螢光抗体が膵臓の島内で観測 されるときは陽性と考えられた。陽性の結果は、糖尿病の免疫学研究会（１ｍｇ ＋ｕｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ）（ＩＤＶ） によって定義され、ノニル（Ｎｏｅｌ）に、マクラレン（Ｍａｃｌａｒｅｎ）に よって管理された世界的なＩｃＡ熟練者試験プログラムによって標準化された、 １０若年性糖尿病基金（ＪＤＦ）の濃度（又は力Ｍ）を、自己抗体が超える場合 に陽性である。

ンシュリン自己抗体結合手順 ＩＡ＾を検出するのに使用されるＲＩＡ法をＩＤＤに対する特異性を失うことな しに感受性を最大にするために変更した。平均血清インシュリン結合値は＋００ の家族層がない９４人の非糖尿病白人子供及び実験室の人員から得られた血清か ら計算されたく平均年齢１３．７±７．７オ、５１人の男性７４３人の女性）、 これらの対照個人は誰もＩｃＡに対し陽性ではなかった。　Ｏ，１５ｎｇ／ｍｌ の濃度でＡ１４の位置において１２８■で放射標識されたモノヨウ素化された人 インシュリンを使用して最適の結果が見出された。より最近では、検定の改良さ れた特異性が、過剰の標識されていないインシュリンの添加を通して置き換え可 能である、特定の結合の測定によって達成できた。

ために、静脈内グルーコース許容試験（ＩＶＧＴＴ）を実施したが（スリカンタ （Ｓｒｉｋａｎｔａ）、Ｓ、、　０．Ｐ、ガング（Ｇａｎｄａ）、　Ｇ、Ｓ。

アイゼンバース（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ）、及び　Ｊ、Ｓ、ノニルドナー（Ｓｏ ｅｌｄｎｅｒ）　［１９８３］　Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、　３０８：３２２ −３２５）、投与グルコースの量は２〜４分にわたフて正確に静脈内に与えられ た０、５ｇ／Ｋｇである。血清の試料をグルコース注入後−１Ｏ１１，３，５， １０％１５．３０．及び６０分において集めた。

インシュリンの欠乏は１分と３分におけるインシュリン水準がともにＩｃＡ陰性 の非＋００の人の対照個体群に対して、＜３ｒｄ百分位数（ｐｅｒｃｅｎｔｉ　 Ｉｅ）であるときと定義される（ｒＦ！５０．年＠　２０．３±１０．２才、範 囲２〜５９年）、この分析に対し７０μＩＵ／ｍ１（１５０人の対照に対し、〈 ３「ｄ百分位数）未満のインシュリン値をインシュリンノペニック（ｉ　ｎｓｕ 　Ｉ　ｉ　ｎｏｐｅｎ　ｉｃ）と考えｋ。

ＨＬＡ　ＯＲ血液型判定法 １（Ｌ＾ＯＲ血液型判定法はパンロッド（Ｖａｎ　Ｒｏｏｄ）及びパンロウエン （Ｖａｎ　Ｌｅｕｗｅｎ）（パンロッド（Ｖａｎ　Ｒｏａｄ）、Ｊｌ、＋Ａ、パ ンロウエン（Ｖａｎ　Ｌｅｕｗｅｎ）、及びＪ、Ｓ、ＰＩｏｅｍ　［１９７６］ 　Ｎａｔｕｒｅ　２６２ニア９５・７９７）によって記載される方法から適合化 されるように実施した。標準対照抗血清を血液型判定法に使用した。

島ｃＤＮ＾ライブラリーの構築 大島細胞に対するｃＤＮＡライブラリーをラムダｇｔｔｔベクター中で構築した （ヤング（Ｙｏｕｎｇ）、Ｒ，Ａ、、及びディビス（Ｏａｖｉｓ）、Ｒ，Ｗ、　 ［１９８３］　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８０：＋ １９４−＋１９８）、メツセンジャーＲＮＡを単離し、チルブライン（Ｃｈｉｒ ｇｗｉｎ）らの方法の変法に従っておよそ２００，０００の精製した人の島から 単離及び精製したくチルブライン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）。

Ｊ、Ｍ、、　Ａ、Ｅ、ブリジビラ（Ｐｒｚｙｂｙｌａ）、　Ｒ，Ｊ、マクドナル ド（ＭａｃＤｏｎａｌｄ）、　Ｗ、Ｊ−ルター（Ｒｕｔｔｅｒ）　［１９７９］ 　Ｂｉｏｃｈｅｖｉｓｔｒｙ１８：５２９４−５２９９）、島を１Ｍ２−メルカ プト：Ｌ　９　／　−／Ｉ、及び０゜団トリス−ＨＣＬ（＋）８７．４）を含有 している４Ｍグアニジンチオシアネート中で溶解した。溶解物をＣｓＣＩの５． ７Ｍクッション上に層にし、！７時閏ベックマンＳ１，１５０．１０−ター中で ３７゜ｏｏｏｒｐ■において遠心分離にかけた。　ＲＮＡペレットを除去し、滅 菌水中に再懸濁し、続いて無水エタノール３容量で沈殿させた。この最終段階を ３回繰り返してＲＮＡのきれいな調整物を得ることを確実にした。ライブラリー に対するｃＤＮＡを鋳型として人の島の全ＲＮＡを使用し、そして人の胎盤のり ボヌクリアーゼ阻害剤、オリゴ（ｄＴ）プライマー、及び４つのデオキシリボヌ クレオチドトリフオスフェートの存在下で酵素リバーストランスクリブターゼ（ 逆転写酵素）を使用して合成した。混合物を４０度で２時間培養したｅ　ｃＤＮ Ａの第２のストランドを第１のストランドの反応生成物及び酵素大腸菌ＤＮＡポ リメラーゼ！及び大腸菌リボヌクレアーゼＨを使用して合成した。混合物を順次 １２℃で６０分間遠次に２２℃で６０分間遠培養し、続いて６５℃でｌＯ分分間 下活性化させた＊　ｃＯＮＡの末端がフラッシュエンドであることを確実にする ために混合物を３７℃で１０分１’ｊ１７Ｔ４ｆｌＮＡポリメラーゼとともに培 養した。この二本鎖ｃＤＮ＾（ｄｓ−ｃＤＮＡ）のこの混合物を次に等しい容量 の緩衝液飽和フェノール／クロロホルムでの抽出、続いて等しい容量のクロロホ ルムでの抽出を用いて精製した。取り込まれていないヌクレオチドを等しい容量 の４Ｍ酢酸アンモニウムの添加、続いて２容量の無水エタノールの添加によって 除去した。ドライアイス上で１５分間遠却後、混合物を１２，０００ｒρ−でミ クロ遠心機中でｌＯ分間遠心しな。

この沈殿段階を２回繰り返して、取り込まれていないヌクレオチドの完全な除去 を確実にした。

Ｓ−７デノシルーメチオニンの存在下で酵素ＥｃｏＲＩメチラーゼとともに３７ ℃で１時間培養することから始めて、一連の変更段階によってベクター中にクロ ーニングするためにｄｓ−ｃＤＮＡｔｔＩｌ製した。このメチレート化ｃＤＮＡ をＴ４ＤＮＡリガーゼ及びＡＴＰの存在下で１５℃で一夜合成ＥｃｏＲＩリンカ −に連結させた。粘着性（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）εｃｏＲｌ末端を３７℃で５時間 ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼで消化することによってリンカ−にしたｃＤＮＡ 上に生じさせた。この段階に続いて過剰のリンカ−をカラムクロマトグラフィに よフて混合物から除去した。この方ラムのボイドボリューム（空間容量）中で溶 離された物質はメチレート化されている、モしてＥｃｏＲ１リンカ−に連結され そして寸法が選択されているｄｓ−ｃＤＮＡを表している。

この材料をＥｃｏＲＩで消化され、そしてアルカリフォスパターゼで処理された ラムダｇｔｌｌベクターに連結した。

連結はＴ４−ＤＮＡリガーゼ及びＡＴＰの存在下で１５℃で一夜進行した。各連 結混合物を市販の抽出物（ストラテジーン）を使用してファージラムダコート蛋 白質中にパッケージした。パッケージ化されたファージの水準を大腸菌宿主菌株 Ｙ１０８Ｂ上での力価測定によって決定した。ライブラリーの複雑性はおよそ２ ．０ｘｌＯ’ｐｆｕと測定され、プロモークロロ−インドリル−ガラクトシド（ ＢＣＩＧ）指示薬上の色の不存在によって検出されるように、そのうち８１Ｘが 挿入されたｃＤＮＡを含有していた９組み替えライブラリーをオリゴヌクレオチ ドプローブでのスクリーニングに先立って増幅させた。

以下は本発明を実施するための最良の形態を含めた手順を説明している。これら の実施例は限定的には解釈されるべきではない、ｆｌ！＋に記載されない限りす べてのパーセントは重量により、すべての溶媒混合物割合は容量による。

統計分析はヤテ（Ｙａｔｅ）の補正因子が適用された後のカイ二乗分析及びフィ ッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）の正確な試験（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ　ｅｘａｃｔ　ｔｅ ｓｔ）の両方を含む（スネデコル（Ｓｎｅｄｅｃｏｒ）ｅＴ、Ｎ、及びＶ、Ｃ， コクラン（Ｃｏｃｈｒａｎ）　［１９６？］　ＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌＭｅｔｈ ｏｄｓ、アイオワ州アメスのアイオワステートユニバ５つの群の人を６４にＡ試 験のために選択した。確立されたナショナル糖尿病データグループ（ＮＤＯＧ） 基準に従フて定義された＋００を有する３１人の新、たに診断された患者が存在 した（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｄａｔａ　Ｇｒｏｕｐ　［１９７ ９］　ｒ真性糖尿病の分類と診断及びグルコースイントレランス（ブドウ糖不耐 性）の他のカテゴリーＪ’　、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　２８：１０３９−１０５７） 、又１ｃＡを欠いており、自己免疫病のどんな家族歴も知られていない２６人の 糖尿病患者でない対照の人；前記の新たに診断された患者の、糖尿病でないＩＣ ＡとＩＡＡを欠いている４０人の親戚；３６人の非糖尿病ではあるがＩＣＡが陽 性の人達であって、そのうち２８人が１００を有する発端者の一親等の親戚で、 ４人が明らかに健康な正常な対照であり、４人が自己免疫アジラン病又は甲状腺 炎を有する患者である人達；、ＩＤＣを有する発端者のかかっていない親戚であ る、ＩＣＡ陰性であるが高い力価のＩＡＡ陽性の子供５人；及び血清が彼等の１ ００の文書化された開始の前に集められた２８人の追加の人達も試験された。

上記の患者は＋００の発端者の５０００人を超える一親等の親戚の現在も行われ ている将来的ＩＣＡスクリーニングの母集団研究の２つ、そして８２００人の正 常な対照の人を通じて得られ、正常な対照の人のうちおよそ５０００人が学校の 生徒であった。すべての血清は２０℃で１週間〜７年間自己抗体分析に先立って 貯蔵された。

６４ＫＡは、新たに診断された＋　００　＝、者の８４Ｋに存在したという点、 及び試験された対象の母集団には完全に存在しなかった（ｐ（０，０００１）と いう点で極めてこの病気に特異的であることがわかった。

実施例２−１００の指標としての６４にＡｌ２Ｏの開始を実際に予測する６４に Ａの能力を分析するために２８人の個人からの血清試料を６４にＡについて分析 した。

血清試料は＋００のどんな臨床的な出現の開始にも先立って採取された。彼等の 人生の後の時点において２８人の人のそれぞれがＩＤＣの臨床的な症状を生じた 。これらの２８人のうち２５人が３５才前に臨床的な症状を生じた。

臨床的な＋００の開始において３５才以下である人２５人のうちの２４人中に（ ９６Ｘ）に６４ＫＡが存在していることが見出された。これらの人からの試験さ れた血清試料は１００の臨床的な開始の前３ケ月〜７年間（平均２７ケ月）のど こかで採取されている。臨床症状の開始の７年も前に６４ＫＡの存在が生じてい る。

ＩＣＡとＩＡＡの存在に対しても同じ血清試料が試験された。

全てのケースの８２ｚに存在する６４ＫＡと比較して、ＩＣＡはｎの試料のうち の２２人（７８４）に存在し、ＩＡＡは２７の試料のうちのたった１３（４８： ）に存在するにすぎなかった。これらの結果は表１〜４に示される。明らかにＩ ＤＤに対する６４ＫＡの予測価値はすべての３つの自己抗体のうちで最良である 。

病気開始の９人の１００患者の別の分析において、応答罐５ＴＡＣＡＬ”の保持 対島細胞インシュリンの保存量の消失はＩｃＡよりも６４にＡとより良い相聞を 示した。従って６４にＡは又、残っているβ細胞の量の指標も提供している。

表　１ リュ部瓜−」よ」Ｌ呈」Ｌ生ｊ口東Ｓ 群　Ｄ　１すｉＡ　Ｉ　ＣＡ 対照　２６　０（０）　０（０） 新たに診断した１００　３１　２６（８４）　２５（８１）ＩｃＡ−／ＩＡＡ− 親戚　４０　１（２）　０（０）ＩｃＡ＋親戚　２８　２３（８２）　２８（ｔ ｏｏ）ＩＣＡ＋その他　８　７（８７）　８（１００）ＩｃＡ−／ｌＡＡ＋＜年 齢５才　５　４（８０）　０（０）表　２ ＩＣＡ陽性のためｌ［ｌ［＋の危険のある非糖尿病恵者発見まとめＭ　６　３． −　ＩＤＣ家族調査　８０　＋　−１４４（４０）Ｍ　９　３，１　１（ＩＤ家 族調査　４０　＋　−５７（＜１）Ｆ　ＩＩ　３．４１ＤＤ家族調査　８０　＋ 　＋　ＮＯＭ　１１　３．４１００家族調査　３Ｑ　＋　＋　１０５（２０）Ｆ 　１２　４．３　＋００家族調査　４０　＋　−１９４（６０）Ｆ　１３　２， ４１ＤＤ家族調査　４ｏ　＋　＋　６２（（３）Ｍ　１７　３．４　１ＤＤ家族 調査　２０　＋　−６７（＜３）Ｍ　２０　２，４１ＤＤ家族調査　４０　＋　 ＋　５８（＜１）Ｆ　２９　３，４　１ＤＤ家族調査　４０　＋　−５７（＜１ ）Ｆ　３０　３．−　ＩＤＣ家族調査　１６０　＋　−８２（１０）Ｆ　３３　 ３，８１ＤＤ家族調査　２０　＋　−１２５（３０）Ｆ　３４　３，４　＋００ 家族調査　４０　＋　−１６７（５０）Ｍ　４４　４，１　＋００家族調査　２ ０　−　−　ＮＯＦ　１０　４，８　＋００家族調査３６０　＋　−９８（２０ ）Ｆ　３８　４．−１［）Ｄ家族調査　２ｏ　＋　＋　７１（５）Ｍ　７　４． ８１ＤＤ家族調査　４０　＋　＋　１１４（２５）Ｍ　７　３．４１ＤＤ家族調 査　２０　＋　＋　１１６（２５）Ｍ　１０　４．−　１００家族調査　１６０ 　＋　＋　５２（＜１）Ｆ　１０　５．９　ＩＩ）Ｃ１家族調査　２０　＋　十 　夏２８（３０）Ｆ　４３　３．＋　１ＤＤ家族調査　８０　−　−　２９３（ ７０）Ｆ　１３　１．３１００家族調査　８０　−　−　１１００（２０）　５ 　２．４１ＤＤ家族調査　４０　＋　−１２５（３０）Ｆ　３９　４．−　ＩＤ Ｃ家族調査　ｓｏ　＋　＋　１ｔ２（２５）門　目　３．４　１０１）家族調査 　４ｇ　＋　＋　５６（＜Ｉ）Ｆ　３５　４，７　＋００家族調査　４０　＋　 −４２０（９０）Ｍ　４３　３．７１００家族調査！６０　・　−ＮＯＦ　３８ 　３．４１ＤＤ家族調査　２０　−　−　１８４（６０）Ｆ　２６　ＮＤ　ＩＤ Ｃ家族調査　４０　す　＋　”（０Ｍ８３．４学校調査　１６０　＋　＋　６７ （＜３）Ｍ　１０　３．４学校調査　１６０　−　−　２６８（７５）Ｆ　１３ 　４，６学校調査　４０　＋　−６７（＜３）Ｍ　１１　３．４学校講査　３２ ０　’＋　＋　１２４（３０）Ｍ　１８　３．４アジソン＠１６０＋−ＮＤ甲状 腺炎 Ｍ　３２　３，４アジソン病　８０　÷　−１９７（６０）甲状腺炎 Ｆ　４１　３，４アジソン病　３２０　＋　＋　６９（＜３）甲状腺炎 Ｍ　１２　３．４アジソン病　１６０　＋　−１４９（４０）甲状腺炎 ＩＤＦ単位 表　３ Ｉｆ）ｌ）発生＃試験された悪書から人手できる最初の血清試Ｍ　３，３　５　 ＋００家族調査　９　十　−Ｍ　４．６　１０　１００家族調査　３４　２０　 ＋　＋Ｆ　４，７　ＩＩ　ＩＤＣ家族調査　３４　４０　＋　＋Ｍ　３，３　＋ ２　１１）Ｄ家族調査　８　４０　＋　−Ｆ　４，６　１５　１ＤＤ家族調査　 ３　８０　＋　−Ｍ　３，４　＋５　１ＤＤ家族調査　１９８０　÷　十Ｍ　３ ，４　１７　１ＤＤ家族調査　１４＋−Ｍ　３，４　＋９　１００家族調査　３ 　４０　＋　−Ｍ　ＮＤ　２１　１ＤＤ家族調査　３２　８０　＋　−Ｆ　４． −　３３　１０［ｌ家族１１ＩＥ　１４　１０　＋　＋Ｆ　４，５　３８　１Ｄ Ｄ家族調査　２８０Ｍ　３，４　４２　＋００家族調査　４２　８０　＋　＋Ｍ 　４，６　５　＋ＤＩ）家族調査　３０　−−−　−”　＋Ｍ　３，４　１５　 ＋００家族調査　６　＋　＋Ｍ　３，４　３０　＋００家族講査　１３　１６０ 　＋　ＮＯＭＮＤ４１ＤＤ家族調査　３２０ Ｍ　６，１　３３　１ｔ）Ｄ家族調査　１４　−−−　＋　−Ｆ　４，６　３７ 　１００家族調査　３８０Ｆ３，４７　フートーウ糖不耐性　１　＋（ＮＴ）＋ 　＋Ｍ　４，４　１５　フ゛ドつ糖不耐性　２　８０’　＋　＋Ｆ　３，６　１ ７　フ”ト”つ糖不耐性　２　２０　＋　−Ｍ　２，３　１８　フ゛ドつ糖不耐 性　１２　４０　＋　−ＭＮＤ２７　フ゛白糖不耐性　６　４０　＋　＋Ｆ　２ ．３　４０　フードつ糖不耐性　１９　＋（ＮＴ）−−Ｆｌ、４９　学校調査　 ３　４０　＋　＋Ｆ　３，４　１２　学校調査　４４　３２０　＋　＋Ｆ　３， ３　２４　クーレーフ゛ス病　７２”＋−Ｆ　１，４　＋４　甲状腺炎　７５　 ＋（ＮＴ）÷　＋（７８：）　（８２％）　（４ＥＨ） ＮＴ＝ＪＤＦ力価測定せず ＮＯ＝測定せず 一＝ＪＤＦ単位 °°＝後の試料データで自己抗体陽性に変換された表　４ ＩＡＡＡ性のためＩＤＤの危険のある非糖尿病患者発見まとめＦ　２　４，５＋ ００家族調査　−＋　＋　１２９（４０）Ｍ　３　２．ＩＩＤＤ家＋！１ｌｌＥ 　−＋　＋　２７（＜１）Ｆ　５　ＮＤ　ＩＤＤ家族調査　−＋＋ＮＯＭ　Ｏ， ５１，６１００家族調査　−＋　＋　３４２Ｆ　３　ＮＤ　Ｉ００家族調査　− 一十ＮＯ実施例３−ＮＯＤマウスにおける６４にＡと１００の関連最近２種類の 動物（ＢＢクラットびＮＯＤマウス）が人１００の研究のためのモデルとして役 に立つことができるものとして開発されている。＋００の指標として評価するた めに動物モデルを使用することは、感受性のある人を見つけるために循環してい る自己抗体をスクリーニングしなければならない病気の発端者の危険の高い親戚 の数が多いために、糖尿病前期前は研究困難なため、そして病気におけるβ細胞 不全の自然の歴を文書化する必要性がある長期間の観察のため、非常に貴重であ る。ＮθＤマウスとＢＢクラット人１００において関与する病因事象シーケンス に重要な識見を与える。これらの動物の分析は又、自己免疫過程において関与す る標的島細胞自己抗原の性質の理解につながる。我々は従ってＮＯＤマウスと８ ８ラツトをＩＤＣの開始前及び後の両方においてそれらの存在するかもしれない ６４に自己抗体について試験した。

種々の年齢の雄及び雌のＮＯＤ及び対象（ＢＡＬＢ／ｃ、ｃ５７ＢＬ／６゜Ｃ２ Ｈ／Ｈｅｊ）系統のマウスから血清を得た。ＮＯＤマウスのＩＤＤの診断：よそ れらののどのかわきと体重減少及び２４０ｍｇ／ｄｌを超える過血糖症の持続に よって特徴づけられた。健康の維持のため全ての糖尿病動物は１日当り０．５〜 ２．０単位のプロタミン−亜鉛インシュリン（エリ　リリー（Ｅ！ｉ　Ｌｉ１１ ｙ）、インディアナポリス、インディアナ州）の毎日のインシュリン投与を受け た。

ブルンシュテット（ブルンシュテット（Ｂｒｕｎｄｓｔｅｄｔ）Ｊ−。

ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）、Ｊ、Ｈ９＋ラーンマーク（Ｌｅｒｎｍａｒｋ） 、　Ａ。

及びハゲドルン（Ｈａ３ｅｄｏｒｎ）スタディグループ　、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ 　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｊ、ラーナー（Ｌａｒｎｅｒ）、Ｓ、 Ｌ、ボール（Ｐｏｈｌ）編［ジョンウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｌｅｙ 　＆　５ｏｎｓ）−ニューヨーク、　１９８７年］）の方法に従って８ＡＬＢ／ ｃ島を単離し、モして３６５メチオニンでラベルした。高細胞を補充したＲＰＭ １１６４０（ＧＩＢＣＯ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）培地（２，０！牛脂児血清、１０ ０単位／１ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中で２度（４℃ ）高細胞を洗浄し、続いて２０Ｉ！１Ｍトリス（ｐＨ７，４）、＋５０ｍＭ　Ｎ ａＣｌ、１００ＯＫＩＥ／ｍｌ　）レイシロール及び２謂呵ＰＭＳＦを含有して いる緩衝液中で１度洗浄した。細胞を次にＩＩノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）　 Ｐ−４０（ＮＰ−４０）（ｖ／ｖ）を含有している上記緩衝液中で溶解した。不 要物質を超遠心（＋００．０００＼８，３０分）で除去した。溶解物を正常なマ ウス血清（８ａｌｂ／ｃ）（１００μｌ上澄み当りｌ（１／ｊ１．１時間、４℃ ）とともに培養、続いて過剰のプロティンＡセファロースＣＬ−４８に対して吸 着された。この培養／吸着手順は３回繰り返された。アリコー）　（１００μｍ ）の非結合（予備透明化）溶解物を２５μｍ０ＮＯＤ血清又は対照の血清のいず れかとともに１８時間（４℃）培養した。各検定試験管に１００μｍの予備膨潤 プロティンＡセファロースＣＬ−４８を加え、そして反応混合物を４５分間培養 した（４℃）。プロティンＡセファ０−スＣＬ−４８を次に０．５＄ＮＰ−４０ 緩衝液中ての遠心（２００ｘｇ、１０秒間）によって５回そして冷たい水中での 遠心（２００ｘｇ、３０秒間）で１回洗浄した。結合した免疫複合体を８０１１ ＩＭトリス（ｐＨ６゜８）、３．０：（ｉｒ／ｖ）　Ｆデシ／Ｌ　１ｉｉｌ酸ｆ 　）　’Ｊ　’７　ム（ＳＤＳ）、１５１蔗糖、０．００１ブロモフエニルブル ー及び＜５．ＯＸ　ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノールを含有している試料緩衝 液中で５分閏沸騰させることによって、変性させた。セファ０−スのビーズを遠 心分離で除去しく２００　ｘ　ｇ　ｙ　１分間）、そして上澄みを５０５１２ｇ ポリアクリルアミド分離ゲルを通して電気泳動させ、続いてクマシー染色とオー トラジオグラフィーを行った・ 最初の試験はＮＯＤマウス中て６４ＫＡが生じたかどうかを知るためてあった。

血清は新たに診断されたＩｆ）Ｄを有する８匹の１のＮＯＤマウス（開始におけ る平均年齢１０４．５±ｌ３．５日、範囲９３〜１３４日）及びＢＡＬＢ／ｃ（ ｎ＝５）、Ｃ５７ＢＬ／６（ｎ＝４）、　Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（ｎ＝２）系統の１１ 匹の健康な対照マウス（２匹の雄及び９匹の雌、平均年齢９７．７±３０．４日 、範囲５０〜１２０日）から血清を得た。

それらの糖尿病の開始において、６４にＡがＮＯＤの８０中で検出されたが、非 糖尿病体質の対照系統のいずれにも６４にＡは検出されなかった（Ｐ＜０．００ １）。新たに診断された１００を有するＮＯＤマウスに高いパーセントで６４Ｋ に対する自己抗体が存在することは、年齢がマツチしている非糖尿病体質対照マ ウス中に６４にＡが存在しないことと合せて、６４にＡが１００に対し、そして その前徴状態に対し特異的であることを意味する。６４ＫＡが存在することは又 、検出可能な最初の事象の一つでもあり、インシュリティス（ｉｎｓｕｌｉｔｉ ｓ）が見つけられる最も早い年齢である離乳の時又は離乳の前にさえも一般に存 在する。

実施例４−　ＮＯＤマウス中のＩＤＤの指標としての６４ＫＡＩＤＤに間して６ ４にの自己抗体の自然な歴について知るために、離乳期において５匹のマウス（ ２匹の雄及び３匹の雌、年齢２３〜２５日）から得た血清試料を分析し、それら の膵臓をインシュリンについてＭＩｌ学的に調べた。インシュリンは５又はそれ 以上の島を含有しているヘマトキジロン及びエオシン染色膵臓セクション上のリ ンパ球のはっきりした島内浸潤として検出された。６４にＡは既にこれらのマウ スの８０％（４１５）中に存在した。同時に初期のインシュリティスもそれらの 膵臓の組織が分析された４匹のマウスの３匹中に存在した。対称的に１００を全 く生しなかった１９０日以上の年齢で試験された２匹の動物（両方とも雄）は、 両方がインシュリティスを有するのに６４にＡを有さな８８ラツ）　（ｎ＝８） 中に見られた１００の研究において、６４に蛋白質に対する自己抗体は病気の自 然の歴の初期に現れ、かなりの特異性を１００のマーカーとして示している（６ 匹のりューイスラットの対照中に存在しない）、人、ＮＯＤマウス、及びＢＢク ラットおける６４ＫＡの発見は、Ｍ、６４，０００島細胞蛋白質に対する自己免 疫がかなり病因上重要なものであって、６４に蛋白が正常なβ細胞で重要な生理 学的機能を有し得ることを示唆している。

実施例６−６４に抗原の生死　的な特性化生化学的な特性化に間しては、６４に 蛋白質のゲルのより高い解像度は、これが２つの成分（６３，５００及び６４， ０００Ｍ、）の閏でおよそ０．５キロダルトン、たけ異なっているダブレットか らなり得ることを示唆している。６４に成分は還元性の条件下ではＭ、６４，０ ００範囲に移り、そして非還元性条件下では二量体（およそ１３０Ｋ）として見 出され得る。８４に蛋白質は６．４と６，７の等電点を有するという点て荷電の 不均一性を示している。６４に成分は洗剤相抽出物のイムノブレシビテーション （免疫沈殿）において観測される疎水性のために一体の癌細胞膜蛋白質を表して いる可能性が最も強い、この特許出願て使用される「６４に抗原」という用語− よここに記載される方法°Ｃゲル上で挙動する化合物、化合物類又は複合体を指 している。６４に抗原は又、以下に記載される抗−ＣＡＤ抗体との免疫的な反応 性によって同定することもできる。

我々は又、＋０１）を有する人から血清によって大島！ｌ胞蛋白質から洗剤抽出 されたイムノブレシビテーション（免疫沈殿）がしばしばＭ、６７．０ＯＯｉｉ 白質の同定を生じることも発見した。我々は米国の学校の生徒及び１００を有す る発端者の親戚の母集団中でこの６７．０００Ｍ、抗原に対する抗体について分 析した−　６７．０００Ｍ、蛋白質に対する自己抗体は、新たに診断された１０ ０患者の６０％（１２／２０）に観測され、そして１８人の対照のたった１人に しか観測されなかった（５＄Ｐ＜０．００１）。コノ１００母集団中テロ７．０ ００Ｍ、ニ対する自己抗体はしばしば（７３％　１１／１５）　６４ＫＡに対し て陽性である人で観測されたが、６７．０００Ｍ、自己抗体陽性の人は図にＡを 欠いている患者ではたった１人しか発見されなかった。６７．０００Ｍ、蛋白質 に対する自己抗体は６４にＡ、島細胞細胞質自己抗体及びインシュリン自己抗体 の両方を欠いている非糖尿病の一等親の親戚３４人中のたった１人（３ｚ）にし か存在しなかった。クマシー染色５０５−ＰＡＧＥゲルの分析は、６７．０００ Ｍ、蛋白質に対する自己抗体の存在は７０，０００卜の強い染色の蛋白質としば しば間違していた。この７０゜０００Ｍ、　蛋白質のガス柑アミノ酸配列決定は 、これが免疫グロブリンｖ−ｒｎｔｉ域鎖であり、それによって抗体のＩｇ？１ クラスに向けられていることを明らかにしている。従って、６７．０００Ｍ、抗 原に対する免疫はＩｇＭクラス抗体で増加されるがこれに制限されないかもしれ ない、又、我々はほとんど全ての６７．０００Ｍ、自己抗体陽性患者が６４ＫＡ も含有していることを明らかに示したが、６７．０００Ｍ、自己抗体陽性である が６４ＫＡ陰性の人は稀にしかみられない。従って我々は６４　、０００及び６ ７　、０００Ｍ、島細胞抗原の間の抗原的な交差反応性が存在し得ること、そし てこれらの蛋白質に対する自己抗体がこれらの免疫学的な交差反応性のエピトー プを同定できることを信じている。

この出願で使用される「免疫学的に６４に抗原と均等なもの」とは６４にＡと反 応するペプチド類を指している。刺ＫＡ又は６４に自己抗体という用語は６４に 抗原と反応する化合物又は化合物類を指している。

６４．０００Ｍ、蛋白質が両親媒性を示しているので我々は６４に蛋白質が本質 的に細胞の原形質膜に限定されるかどうかを観測するために、そしてもしもそう であれば正常な高細胞中でこの蛋白質の表面表現（ｓｕｒｆａｃｅ　ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ）に対する証拠があるかどうかのための実験を行った。

我々の生化学的な特性決定試験は６４に蛋白質のグリコジル化の証拠すなわち表 面表現蛋白質に対する共通の特徴を示さなかった。蛋白質炭水化物グリコジル化 の共通の形態を検出する一連の幅広い酵素スペクトラムを使用した。この分析は 酵＊　Ｎ−ＧＬＹＣＡＮＡＳＥ”’（Ｎ−結合炭水化物に対するもの）、〇−結 合炭水化物に対する処置、ニューラミニダーゼ（シアル酸基に対するもの）及び β−エンドガラクトシダーゼ（ガラクトース基に対するもの）を使用した。炭水 化物基の一つが６４に蛋白質上に存在するならば、酵素はその炭水化物を開裂す るであろうし、その後の５Ｏ５−ＰＡＧＥ分析の時に６４に蛋白の易動性が増加 するであろうし、そして減少した分子量の蛋白質を示すてあろう。

この特定の一連の酵素での蛋白質の処理の後に、Ｓ　ＯＳ　−ＰＡＧＥゲル中で の６４に蛋白質の易動性における差は検出されなかった。又、我々は一連の１９ 個の幅広い、そして狭いスペクトラムの炭水化物結合しクチン類を使用してグリ コジル化の存在に対して６４に蛋白質を徹底的に分析した。

しかしながら、これらのレクチンのいずれも６４に蛋白質に結合しなかった。従 って６４に蛋白質にグリコジル化は存在しないように見える。

最後に１２５１での放射能標識化細胞表面蛋白質の標準技術を使用して、６４に 蛋白のどれもが糖尿病患者からの血清で表面標識高細胞からイムノブレシピテー ション（免疫法＠）できなかったことが以前に示されている（コルマンダ［１９ ８７コＤｉａｂｅｔｅｓ　３６．１４３２−１４４０）。表面表現に対する証拠 は従って存在しないことをその研究は提案した。

しかし、その一般の技術はチロシンを標識しており（その蛋白質の細胞外部分に 存在しないかもしれない比較的稀なアミノ酸である）そして、性質上条件が苛酷 なものであった。従って６４ＫＩ白質の抗原結合位置を破壊するのに十分苛酷で あり得、従って抗体は蛋白質にもはや結合しないことがあり得る。しかしながら 、我々は新たに記載した技術を使用した（トンプソン　Ｊ、ら［＋９８７１８ｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６，７４３−７５０）　＊これは化学的性質がずっと 苛酷てないものであり、リジンか（チロシンよりずっと一般的なアミノ酸である ）又はＮＨ２−末端アミノ酸を放射標識するものであり、コルマン等の文献で使 用した方法よりもずっと高い特異的な活性を有する細胞表面蛋白質を標識するこ とが示されるものである。細胞表面アミノ基は１２５１スルホサクシミジイル（ ヒドロキシフェニル）プロピオネートによって１２６１　（ヒドロキシフェニル ）プロピオニル基て誘導化された。しかし、これらの検定改良をもってしても６ ４ＫＩ白質は無傷の細胞表面標識化大島細胞からは免疫沈殿されなかった。

原形質膜内に実際に６４に蛋白質が存在することを確認するために、我々は高細 胞の粗製膜調製物をつくり、そして試薬トリトンＸ−１１４を使用して１００を 有する患者からの血清を使用して６４に蛋白質をイムノブレシビテーション（免 疫沈殿）させた。次に我々は６４に蛋白に対する自己抗体の検出のための改良方 法を開発した。この方法は洗剤を使用せず、そして解釈するのがより容易であり 、そして実施するのがより迅速である結果を生した。二の方法は３６５メチオニ ン標識島綱胞の粗製膜：Ａ製物をつくり、続いて４℃で６０分間トリプシン処理 をすることを含んでいる（２ｍｇ／ｍｌ　５０＋ｗＭ　）リス緩衝液ρ）１７． ４）。この材料を次に遠心分離し、続いて我々の標準のイムノブレシビテーショ ン（免疫沈殿）技術を行う。ゲル電気泳動とオートラジオグラフィに続いて４０ にバンドが糖尿病患者の血清からの免疫沈殿物で観測されるが対照では観測され ない。チロシンで処理した単離された６４に蛋白質も４０に蛋白を示すことを既 に我々は示しているので、トリプシン処理島から直接免疫沈殿されたこの４０に のバンドは同じ蛋白質を表している可能性が非常に強い。４０に蛋白質に対する 検定は、６４ＫＡのより簡単な検出のための改良であるばかりではなく、イモピ ロン（ｉｎ＋ｍｏｂｉｌｏｎ）膜を使用するガス相配列分析によりずっとなじみ やすい生成物を生じる。この改良の理由は４０に断片はアブライドバイオシステ ムズのガス相セクエンサーを使用するイノピロン（ＩＭＭＯＢＩＬＯＮ）”に結 合した６４に蛋白のＮ末端アミノ酸配列の我々の決定において困難性を生じた主 要な疎水領域がない可能性が非常に強いからである０強疎水性領域を有する蛋白 質がガス相セクエンサーにおいて使用される溶媒で可溶化されること、従ってこ の蛋白質を直接配列決定する技術的に主要なハードルとなっていることが確立さ れている。また６４．０００Ｍ、範囲におけるよりも、４０゜０００〜ｒ、ＷＰ 、囲て二よより低いパックグラウンド染色であるため、　ＳＤＳ　ｐａｇｅゲル の銀染色においては６４に蛋白質よりも。

４０に蛋白質を見ることができるようにするのがずっと容易である。

無傷の６４に蛋白質、又は４０にのチロシン間裂断片の何れかのガス相アミノ酸 配列決定は、ＮＨ２−末端封鎖を明らかにした。この情報は４０に断片の可溶性 とともに、４０に蛋白質がそのＣ０ＯＨ末端近くてβ細胞原形質膜中にとりつけ られていることを示唆している。特定していうと、我々は３〜４個の一連の高度 に荷電したアミノ酸に続いて、疎水性アミノ酸のストリングがＣ０ＯＨ末端の最 も近くのｎ０個のアミノ酸中に存在することを予言するであろう。

実施例７−６４に蛋白質のホスホリル化多くの鍵となる制御蛋白質が細胞中にホ スホリル化された、又は脱ホスホリル化された形態で存在し、それらのホスホリ ル化の定常状態水準が相互変換プロセスを触媒するプロティンキナーゼとプロテ ィンホスファターゼの相対活性に反映している。ホスホリル化は生化学的及び生 物的な性質を変えるこれらの蛋白質中における小さな立体配置の変化をトリガー する。ホルモン及び他の細胞外シグナルがこのメカニズムを経由して情報を伝達 する。

人の島内のホスホリル化の役割の全容はいまだ同定されていないが、ＩＤＤで生 じる自己免疫破壊において多くが役割を有している全てのホスホリル化蛋白質を 同定する方法として血清及び島ＩＩ抱蛋白質を使用するインビトロ（試験管内） キナーゼ検定を適用した。

２群の人（個人）をインビトロホスホリル化検定試験の為に選んだ。確立された ナショナル糖尿病データグループ（ＮＤＤＧ）基準に従って診断され（ナショナ ル糖尿病データグループＤｉａｂｅｔｅｓ、　１９７９；　２８：ｌ０３９−５ ７）、ユニバーシティーオブフロリダ糖尿病りリエックスてＩ！＠された７人の 新たに開始した＋００患者がいた。我々はまた、自己免疫病のどんな知られた家 族歴も有さない８人の非糖尿病対照者を試験した。死体の膵臓から単離した人の 膵臓の島は９１．２±２．３％純度であり、そして島当り０．４±０．１＋＋ｌ Ｊのインシュリン含量を有していた。正常な人血清のみの使用を含めた４８時間 のインビトロ培養に続いて高細胞を以下の様に免疫沈殿させた。免疫複合体を１ ００を有する患者又は対照者のいずれかからの血清で調製したが血清を高細胞洗 剤抽出物とともに培養し、続いてガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰとともに培養し、そし てインビトロでホスホリル化した生成物を５０５−ＰＡＧＥゲル上で分析した。

高細胞（１，０００／試験血清）を５０ｍＭ　）リス緩衝液（２％　トリトン　 Ｘ　−１１４，アプロチニン、ＰＭＳＦ、　ＮａＦ）中で溶解した（３時閏、４ ℃）、洗剤溶解物を正常な人の血清（１００μｌ　／　１．０００島）とともに 培養し、続いて過剰のプロティンＡセファロースＣＬ−４８に対し吸着させられ た（ファルマシア）、未結合（プレクリアート）溶解物を含有するアリコートを ＩＤＤ又は対照者血清のいずれかとともに培養した（２５μｍ、１８時閏、４℃ ）、免疫グロブリンのプロティンＡセファ０−スＣＬ−４８との培！Ｉ（２時閏 、４℃）に続いて、複合体を次に０．１％ＳＯ５，１，０％　トリトンＸ　−１ １４，及び２　ｍＭ　ＥＤＴＡヲ有シテイル５０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７， ４）で３回、そして５０１Ｍ　）リス−ＭＣＩ　（＋）８７．４）で２回洗浄し た。キナーゼ反応はＩＯＩＭ　ＭｎＣｌ２．１０５Ｍ　ＭｇＣｌ２．１％　トリ トン　Ｘ　−１１４及び２０μ（ｉのアデノシン（ガンマ−３２Ｐ）５’）リホ スフエート（アメルシャム、〉５，０００　Ｃｉ／ｓモル）を含有している５０ ａ＋Ｍ　ＨＥＰＥＳｉｉ衝液（ｐＨ７，４）１０μｍを加えることによって開始 した。沈殿物を懸濁し、そして３０°でＩＯ分間遠養した０反応を電気泳動試料 緩衝液の添加によって停止させ、そして９５℃で４分閏加熱した。３２ｐ標識生 成物を不連続ＳＤＳ　１５％ポリアクリルアミド分離ゲルによって分離し、続い て増強（インテンシファイイング）スクリーン（コダック、Ｘ　−ｏｍａｔ　Ａ Ｒ５）で６〜７２時閏オートラジオグラフィーを行なった。１００患者の血清は 特異的にＭ、６４，０００蛋白質を免疫沈殿させ、これは対照血清では観測され なかった。

最後にインビトロのキナーゼ反応によって検出されたＭ、６４，０００蛋白質の 同定が代謝的に標識された高細胞の免疫沈殿で観測されたものと同じであるかど うかを分析するために、トリブチツクペプチドマツピング実験を実施し・た。１ ００血清て免疫沈殿された３５５メチオニンＩｌｉ識島纏胞Ｍ、６４．０００蛋 白質の処理はインビトロホスソリル化Ｍ１６４．０００１白質のもと類似のトリ ブチツクペプチドマツピングを示した。

特定していうと、６４．０００Ｍ、及び１２５．０００Ｍ、蛋白質を５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥゲルから切取り、そして蛋白質を１ｆｆ１呂／１のトリプシン（３〜３０ 分、４℃）で処理した。生しる蛋白質を５ＤＳ−Ｐ４ＧＥゲル上で再度走らせた 。　１２５，０００Ｍ、蛋白質は二の処理では影響されなかった。しかし、６４ 　、０００Ｍ、蛋白質は易動性を４０　、０００Ｍ、範囲に増加した。従ってこ の６４，０００３２Ｐ標識島細胞蛋白質はトリプシンで処理したときにＭ、６４ ．０００３６５メチオニン標識島細胞蛋白質で我々が観測したのと同じＭ、　（ ４０，０００）を示した。

実施例８６４に自己抗原の別の生化学的な同定６４に自己抗原がグルタミン酸デ カルボキシラーゼ（ＧＡＯ）と相同性を示すことそして抗−ＧＡＤ抗体に対し、 免疫反応性であることを我々は確立した。　ＣＡＤ酵素は脳、そして膵臓のβ細 胞に局在している０文献におけるＣＡＤの生化学的な特徴付けは哺乳類の脳にお ける主要な抑制的なニューロトランスミツター（神経伝達物質）であるガンマ− アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の形成における役割に限られていた。コバヤシ等ここよ って公開されているこのＣＡＤ配列もの（コバヤシ　Ｙ、、Ｄ、Ｌ、カウフマン 及びＡ、Ｊ、　）ビン［１９８７］　ｒグルタミン酸デカルボキシラーゼ　ｃＤ ＮＡ二酵素的に活性な融合蛋白質をコート化してｔするヌクレオチド配列Ｊ　Ｊ 、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　７（９）：２７６８−２７７２）が表６に本明細 書に再現されている。

ＣＡＤと６４ＫＩ白買の閏の抗原的な交差反応性が確認された。６４に蛋白質に 対する自己抗体及びＣＡＤに対し向Ｇすられているモノクローナル抗体を使用す る一連の免疫沈Ｗｉコよ、６４に蛋白質に対する結合の競争を確認した。ＣＡＤ 蛋白質と反応するモノクローナル抗体は例えばアメリカンタイプカルチャーコレ クション（ＡＴＣＣ）アメリカ合衆国２０８５２ミツドランド州ロツクビル　パ ークローンドライブ　１２３０１から当業者に容易に入手できる。モノクローナ ル抗血清ＣＡＤ−１（ＡＴＣＣ）１８１８４）がＣＡＤに対する結合に特異的で ある。

これらの研究の為に人の高細胞を３１５５メチオニンで代謝的に標識し、そして 前記の様に洗剤相は分離した０次に高細胞抽出物を同じ容量の２つの試料に分割 した。各試料をいずれかの対照（６４に自己抗体のないもの）又はＩＤＯ（６４ に自己抗体含有物）血清のいずれかで２度プレクリヤーした。このＩＤＣ血清で のプレクリヤ一段階は、島細胞蛋白質調製物からの６４に蛋白質の量を除去する か又は著しく減少させる一方、対照血清でのプレクリヤーは６４に蛋白質の量に いちじるしく影響しない０両方のプレクリヤーした試料（対照及び１０Ｄ）をＣ ＡＤに対するモノクローナル抗体で個々に免疫沈殿させた。結果は対照（６４に 自己抗体陰性）の血清でプレクリヤーすることは島纏胞の６４ＫＩ白貿を免疫沈 殿するモノクローナル抗−ＣＡＤ抗体の能力に影響を与えなかった。しかしプレ クリアー剤として６４に自己抗体含有の１００血清は島細胞の６４に蛋白質を免 疫沈殿させるモノクローナル抗ＧＡＤ抗体の能力を著しく減少した。このことは ６４に自己抗原とＧＡＤの間の抗原的な交差反応性を実証している。

１５人の新たな開始したＩＤＤ患者、及びＩＤＣ開始２〜３年後に得られたサン プルの個人からの血清、５〜ＩＯ年間の持続期閏のＩＤＣを有する１０人の個人 、２０人の対照個人及び＋００の高い危険性がある５人の個人を含めた６５人の 個人からの血清を抗ＧＡＤ活性について試験した。ＣＡＤに対する自己抗体の形 態の免疫は明らかに１００と間違していた。

上の実施例６に記載するように、１００血清て島繍胞を免疫沈殿させることは、 ときには６４に蛋白の同定を生じるのみならず、当人かは６７．０００Ｍ、の蛋 白質を免疫沈殿させた。この観測は、洗剤相の調製物が水性（主として細胞質ゾ ル）及び洗剤相（膜関連）蛋白の間のはフきすした分離を生じない時に特に認め られた。従って６４に蛋白質は２つの形態で島細胞内に見出すことが出来る。即 ち６７．０００Ｍ、可溶性（細胞質ゾル）型並びに６４，０００Ｍ、疎水性（膜 ）型である。１００中の主要な自己抗原は６４　、０００Ｍ、型のものであるが 、６７　、０００型に対する自己免疫も存在する。

３６５−標識化大島細胞から単離された６４に自己抗原のガス相アミノ酸配列決 定は、表６に示される６４に蛋白質及びＣＡＤ配列の間に相同性を示している。

この相同性は以下のようにして発見された。

６４に自己抗原を前記の様に３６５−標識大島細胞から単離した。５０５−ＰＡ ＧＥの後、ゲルからの蛋白質をイモピロン（ＩＭＯＢ　Ｉ　ＬＯＮ）−ＰＴ門膜 に移し、オートラジオグラフィーで見ることが出来るようにした。６４にバンド を局在化し、切取り、そしてメチオニン残基てペプチド鎖を開裂するシアノゲン ブロマイドで処理した。生じるペプチド断片をＰＢＯＦ膜から溶出し、そしてＳ ［）Ｓ−ＰＡＧＥ上で再度走らせたのち、イモピロン（ＩＭＯＢＩＬＯＮ）−Ｐ 丁−に移した。バンドをオートラジオグラフィーで見ることが出来るようにし、 そしてＭ１３３　、０００における断片を切り取り、そしてガス相ペプチド配列 決定にかけた。例えば次の配列プロフィールが得られた。

ＭＥＴ−Ｉ　ＬＥ−ＰＲＯ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＬＹＳ我々は６４にアミノ酸配列 とＣＡＤの間に２つの水準で高度の類似性を見つけだした。第１に前に述べたよ うに、我々の６４に蛋白質をシアノゲンブロマイドで処理すると、３３．０００ Ｍ、のペプチド断片を生じる。人はこの断片がおよそ３００コドン（９００ヌク レオチド）からなることを予測するであろう。表６に示されたＣＡＤ配列を調べ ると、全蛋白質中に６２５のコドン、モして１８７５のヌクレオチドのオーブン リーディングフレームが示される。その配列のヌクレオチド位置９１６〜９３３ は次のアミノ酸に対しコートしている。

ＰＨＥ−ＰＨＥ−ＰＲＯ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＬＹｓ従って６４にペプチド配列は 、アミノ酸配列においてＣＡＤ配列と高い類似性を示す。さらにこのＣＡＤペプ チド配列は、ＰＨＥないしＭＥＴアミノＩｇ！置換がその部分でなされたならば 、シアノゲンブロマイドで開裂すると、３３，０００Ｍ、ペプチドを観測するこ とが期待される蛋白質の領域に位置している。第２にヌクレオチドは解明された アミノ酸配列（ＭＥＴ−ＰＨＥ−ＰＲＯ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＬＹＳ）の間に違い を有し、そしてヌクレオチド配列９１６〜９３３は単にわずかなヌクレオチド置 換を伴うに過ぎない。事実フェニルアラニンでなくてメチオニンがこの蛋白質の ６４に配列の第１の位置にあるようであり、なぜならばこのペプチドは、メチオ ニンに対し特異性を示すシアノゲンブロマイドて開裂されるからである。従って 我々は、我々のＤＮＡライブラリーからの人の膵臓細胞６４に蛋白質に対してコ ードしている遺伝子を同定する為のプローブを構築する為に、上記の配列情報を 使用した。

次の配列の混合オリゴヌクレオチドが合成された。

この合成オリゴヌクレオチドは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとガンマ−３２ Ｐ−ＡＴＰを使用して放射性標識がされ、そして大島ｃＤＮＡライブラリーのプ ローブとして使用された。およそ１２０．０００のクローンがスクリーニングさ れ、そして３つの陽性のプラークが検出された。このようにして６４ＫＩ白質に 対しコードしているＤＮＡが同定され、単離された。

６４に蛋白質に対しコートしているＤＮＡは、多量の組替え蛋白質を製造する為 の適当な原核表現ベクター中に導入することができる。この生成物は糖尿病前の 患者における抗６４に抗体の水準の決定のため、又は糖尿病前の個人を診断する ため、検定法（例えばＥＬＩＳＡ、　ＲＩＡなど）の開発の為に使用することが できる。適当な真核表現ベクターもネイティブな６４にの真核細胞中での製造の 為に用いることができる。これは細面が６４に前駆体を適正に処理することがで きないので、自己抗体で認識されるという可能性を克服している。

免疫系のエフェクターによって認識される蛋白質に最近、かなりの興味が集中し てきた（ベンジャミン００、Ｊ、ペンシフスキー、１．イースト、Ｆ、ガード、 Ｃ，ハンナム、Ｓ、リーチ［：１９８４］　ｒ　Ｔ　ｍ胞によって認識される蛋 白質抗原構造：蛋白質の抗原構造；再評価Ｊ　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｉｎ＋ｗｕｎｏ１．２：６７−１０１）　＊　Ｔ及びβ細胞エピトープを予測し ているアルゴリズムに基づいて、多量の知識がＴ細胞と抗体の結合エピトープに ついて入手できる（デ　リシ、Ｓ、及びＪ、　Ａ、ベルシフスキー［１９８５］ 　ｒ　Ｔ細胞抗原場所は、両親媒性の構造の傾向がある」Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　８２ニア０４８−７０５２；　Ｈｏｐｐ、　Ｔ、　Ｐ、及びに、Ｒ， ウッズ［１９８１３ｒアミノ酸配列からの蛋白賀抗原性デターミナントの予測」 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７８：３８２４−３８２８） 　。

ざらにチトクロームＣ等のモデル蛋白質抗原に対する実験的な研究がＴ及びＢ！ １胞場所の厳密な局在化を可能とし、そして認識に重要な臨界的なアミノ酸残基 の特性化を可能とした（ミリチ、Ｄ、　Ｒ，［１９８９］　ｒ合成Ｔ及びＢ細胞 認識位置；ワクチン開発の為の示唆」ディクソン、Ｆ。

３０編、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｌａｍｕｎｏｌｏｇｙ、４５巻　アカデミツ クプレス、ロント′ン１９８９；　１９５−２８２）。しかし、人の臓器に特異 的な自己免疫病において、自己抗原の性質とその入手可能性についての知識の不 足はエピトープの研究を制限している（マツケイ、１．Ｒ１及び門、Ｅ、ゲルシ ュウイン［１９８９］　ｒ原発性の拒食の硬変中てのミトコンドリア自己反応性 の分子的基礎Ｊ　ｌａ＋＋ｗｕｎｏ１．　Ｔｏｄａｙ　１０：３１５−３１８） 　＊臓器特異的な自己免疫病において、ＴＲ１胞と自己抗体によって認識される 自己抗原領域の性質の決定は、組織損傷病を駆逐するために拮抗剤及び免疫調整 化合物の設計を可能とする。

本発明の一つの面は、６４に蛋白質のエピトープからなる免疫反応性ペプチドの 同定である。これらの研究について、大關薗中の紹替え蛋白質として６４に抗原 の選択されたセグメントを表現するためにＣＡＤのクローン化されたｃＤＮＡ鋳 型をＤＮＡ増幅技術と連係させて使用することができる。平均すると８０個のア ミノ酸残基の、複数のオーバーラツプした異なる組替え断片、及び分子の全体の 細胞外領域を包含している、より大きな断片を製造することができ、そして自己 抗体結合位置が、放射性同位元素で標識された前駆体の存在下で成育する表現さ れた細菌の生成物の免疫沈殿によって分析される。これらの手順を使用すること は、ＣＡＤ分子の正確な抗原アミノ酸配列のエピトープマツピングを可能にする 。６４に蛋白の抗原エピトープからなる合成ペプチドは、本明細書に記載するよ うに診断的、及び治療的な目的のための両方に使用できる。

本発明の一つのそのようなペプチドは、上に記載したＰＲＯ−ＧＬｕ−ＶＡＬ− ＬＹＳ配列からなフている。従って診断又は治療目的の為にここに記載されるよ うに使用できる一つノベブチドは、ＰＲＯ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＬＹＳ配列を含ん でいる約８〜約３０のアミノ酸を含みうる。最も有利にはそのようなペプチドは 約ｌＯ〜約２０のアミノ酸でありうる。ペプチドは、ＣＡＤ蛋白質の一つの配列 又は６４に島細胞蛋質白自身を有しうる。正確なアミノ酸配列が異なりうるＧＡ Ｏのいくつかの形態が存在することが良く知られている。ラット、豚、牛、猫及 び人からのＣＡＤの単離は全て報告されている０例えばクラム、Ｏ，Ｓ、、Ｌ、 　Ｄ、バーネット、Ｊ、　Ｌ、ジヨセフ、Ｌ、　Ｃ，ハリマン（Ｈ］９１）　ｒ 脳及び膵臓の島からの人のグルタミン酸デカルボキシラーゼｃＤいのクローニン グと部分的なヌクレオチド配列Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ ｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　１７６（３）＝１２３９−１２４４ニスピンク　Ｏ，Ｃ， 、Ｔ、　Ｇ。

ポーター、Ｓ、つ、０、し、マーチン（＋９８７）　ｒラット脳中の反応速度論 的に異なる複数型のグルタメートデカルボキシラーゼ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　 ４２１：２３５−２４４；デンナー　Ｌ、Ａ、、Ｓ、　Ｃ，ウェイ、Ｈ，Ｓ、リ ン、Ｃ，Ｔ、リン、Ｊ、　Ｙ、つ（１９８７）「脳Ｌグルタメートデカルボキシ ラーゼ、精製とサブユニット構造Ｊ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　、Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８４：６６８−６７２；チャン　ｙ、　ｃ、、Ｄ、１．ゴツト リーブ（＋９８８）　ｒグルタミン酸デカルボキシラーゼに対するモノクローナ ル抗体で精製された蛋白質の特性決定Ｊ　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　８８：２ １２３−２１３０＋　、７：ピンク　Ｄ、　Ｃ，、Ｔ、　Ｇ、ポーター、Ｓ、　 Ｊ、つ、Ｄ、　Ｌ、マーチン（＋９８５）　ｒ豚の脳からのグルタメートデカル ボキシラーゼの３つの反応速度論的に区別される形態の特性決定Ｊ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　Ｊ、　２３１：６９５−７０３ニブリンダ−マン　Ｊ、　Ｍ、、門、マ イットレ、し、オソラ、Ｐ、マンデル（１９７Ｂ）１人の脳からのし一グルタメ ートデカルボキシラーゼの精製と幾つかの性質Ｊ　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、　８６：Ｉ４３−１５２；及びファン Ｗ、、Ｍ、、Ｌ、Ｉ／−ドホークウｘト、Ｅ、つ、　Ｊ、　Ｙ、つ（１９９０） Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ　８７：８４９１− ８４９５゜これらのＣＡＤ配列の各々は、６４に自己抗体と免疫反応性であるエ ピトープを含みうる。従って本発明に従ってこれらの種々の形態のＣＡＤからの ペプチド類は、治療的又は診断的な目的に使用できる、またこれらの種々のＣＡ Ｄ配列は臨界的な免疫反応性を維持しながら６４に配列において造られることが できるアミノ酸置換の種類についての情報を提供するのに使用することができる ０本発明の合成ペプチドは、以下の様に表わすことができる。

Ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ＶａｌＬ、ｙｓ−８式中ＡとＢの両方は、両方とも長さが ０〜約２０のアミノ酸の配列からなり、ここてＡ及びＢは合成ペプチドが全体と して６４に自己抗体と免疫反応性であるか、又はＴ細胞又はβ側１こよって認識 されるように、６４にと十分な相同性を有している。二の相同性は例えば、６４ Ｋ又はＧＡＯ蛋白質と約９０％でありうる。本明細書に記載した合成ペプチドは 、典型的には約５０未満のアミノ酸であり、いかなることがあてもＣＡＤ又は６ ４に蛋白質の完全な長さ未満である 我々がここに記載した６４に蛋白質は、少なくとも２つの形態で存在する。即ち 約６３〜６５にの大きさを有する形態又は複数の形態、及び約６７にの大きさを 有する形態。

これらの形態は明らかに区別される。上に記載したようにより小さな分子量の形 態がダブレットとして観測された。上に記載したように６４にの複数形態の存在 は、糖尿病にかかる危険性のある人が何らかの形態の６４に抗原に対する抗体を 有するかどうかを決定するのに、６４Ｋを診断目的のために有利なものとしてい る。１々の形態の６４Ｋが相同性を共有しているが、これらはまた異なる免疫反 応性を生じ得る非相同領域も有している。従ってほとんどの十分な診断、又は治 療計画は、６４Ｋに対する自己抗体の各形態と免疫反応性である配列からなる、 複数のペプチド（又はハイブリッドペプチド）の使用を含むであろう０本発明に 従って、ペプチドを診断又は治療用途のために作るに当って、当業者は種々の形 態のＣＡＤ又は６４　Ｋ　＃）らの配列を使用することが出来るか、又は種々の アミノ酸置換で修飾された配列も使用できる。本発明の範囲に入る為には、これ らのペプチドは６４に蛋白質に対する抗体に対し免疫反応性である。

この出願で使用する類似体という用語は、別の化合物と実質的に同じであるが、 例えば追加のアミノ酸又は側鎖を加えることによって修飾されている化合物をさ している６本明細書で使用される突然変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）及び変異体（ｖ ａｒｉａｎｔｓ）という用語は、別の配列と実質的に同じであるが、アミノ酸配 列においである場所でアミノミ置換を有しているアミノ酸配列をさしている。断 片とは、より長いアミノ酸配列の靜分をさしている。

本発明は特定のＣＡＤ及び６４にアミノ酸配列の使用を包含している０本発明は さらにこれらの配列の類似体及び突然変異体、並びに配列の断片及び断片の類似 体及び突然変異体をさらに包含している。これらの類似体、突然変異体、及び断 片は、類似体、断片又は突然変異体が６４Ｋに対する抗体と同じ免疫反応性を実 質的に侃持しているかぎり、本発明の範囲内に包含される０例えば、コンサーア バティブなアミノ酸置換を行なうことは、当業者の技術の範囲内である０例えば アミノ酸は次のクラスに分類できる：塩基性、疎水性、酸性、極性、及びアミド 。

一つのクラスのアミノ酸が同じ種類の別のアミノ酸で置き換えられる置換はその 置換が実質的に化合物の生物的な活性を変更しないかぎり、本発明の範囲内に含 まれる。

次の表は各クラスに属するアミノ酸の例をリストしてい非極性　Ａｌａ、　Ｖａ ｌ、　Ｌｅｕ、　ｌｉｅ、　Ｐｒｏ、　Ｍｅｔ、　Ｐｈｅ、　Ｔｒｐ極性　Ｇｌ ｙ、　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ、　Ｃｙｓ、　Ｔｙｒ、　Ａｓｎ、　Ｇｌｎある場合に は非コンザバティブな置換も行ないうる。

種々の突然変異体の構築が合成遺伝子のカセット突然変異誘発によって発生でき る。この工程はどんな当業者にも知られている。これらの置換が６４Ｋに対する 抗体との免疫学的な反応性を実質的に変更しないという範囲内で、生しる化合物 は、本発明の範囲内に含まれる。コンザバティブなアミノ酸置換は、本発明の主 題の範囲内である単に一つの修飾の種類の例に過ぎない。

ころの合成ペプチドは、上；こ記載した組替え蛋白質で開発された類似の検定法 で使用されるべき診断試薬の開発に使用されるであろう。合成ペプチドはまた、 ワクチン開発一般のためのその目的と類似のＩＤＣの予防の為のワクチンを作る のに使用することもてきる（ミリチ［１９８９］、上記参照）。

実施例９　インシュリン依存性糖尿病におけるグルタメートデカルボキシラーゼ に対する抹消血液Ｔリンパ球応答の同定 インシュリン依存性糖尿病（Ｉ［ｌＤ）はインシュリンを生産する膵臓のβ細胞 の自己免疫破壊から生じるようである。グルタメートデカルボキシラーゼ（ＣＡ Ｄ）と免疫反応性である抗体が早期に出現し高い頻度であることは、この蛋白質 が糖尿病のなかにおいて、標的抗原でありうることを示唆している。しかしなが ら、この病気はＴリンパ球に依存してい３と信じられているので、我々は新たに 診断された１００を有する子供、及び＋００を生じる高い危険及び低い危険の人 からの組替えＣＡＤに対する抹消血液単核細胞応答を分析した。

＋００の臨床的な開始における膵臓高細胞の単核細胞種！４＜インシュリティス ）は病気の病理学的な品質証明である。この病巣は主としてＴ−リンパ球が提案 されており、ＩＤＤの病気の発生におけるピボット的な役割を果たすと考えられ ているのはこれらの細胞である。この考えを支持する証拠には、ＩＣＡＯ力価は 上昇しないが、すい臓の移植を受けた長期間の糖尿病患者内にインシュリティス が再発するという観測が含まれる。又、免疫抑制剤は１０Ｄを有する人の代謝の 可能性を改良するのに有効であることが示されている。１０Ｄの自発的な動物モ デルにおいて（ＮＯＤマウス）、糖尿病はＣ［）４及びＣ［１８Ｔリンパ球の変 換を通じて非糖尿病体質のマウスに導入できる。　ＮＯＤマウス中で病気は抗− ＣＤ４療法の使用を通じても予防できる。

しかしながら、この自己免疫現象に対し役割を担っている標的抗原の性質は不明 確なままである。

我々はここで１００の開始の時期において、ならびに病気の危険が増大している 母集団内で、Ｔ−リンパ球の反応性が特徴的かどうかを試験した。

組み替えＣＡＤ抗原をラットの脳ＣＡＤ６５０ＰＥＴ表現から製造した。末梢血 液単核細胞をｒフィコール−ハイバク（Ｆｉｃｏｌｔ−Ｈｙｐａｑｕｅ）Ｊ密度 遠心によって単離した（シグマ、ミズーリ州、セントルイス）　ｅ　１ｘｌＯ’ の単核細胞を２４個のウェルの組織培養トレー中でｌＯμｇ／ｌの抗原の存在下 で７日間培養した。培ＩＩＳ日後に１．０μＣ１３Ｈチミジン（プラウエア州、 ウィルミントンのＮＥＮ）を各ウェルに加えた。

培養基を１８時間後に半自動的に収穫し、チミジン取込みを液体シンチレーショ ン計数によって評価した。細胞増殖は刺激インデックス（Ｓｌ）から抗原の非存 在下（培地のみ）で取込まれたｃｐ鱈こよって抗原の存在下で取込まれたｃｐｓ を割ったものを引いたものとして表現した。３以上（≧３）の５１は統計的に陽 性の応答と決定された。

我々の試験はＣＡＤに対するＴ−リンパ球の反応性がＩＤＤの開始において起こ り、そしてＩＤＤの増加した危険性を有する人において起きることを示した。Ｃ ＡＤに対するこのＴ細胞の反応性は健康な人には存在しない。これらの発見はＣ ＡＤがＴ−リンパ球の抗原エピトープを含んでいて、従って１００の病気の原因 に間与し得るという仮説を支持している。新たに開始した１００の患者内でＴ− リンパ球の応答の程度とＩｃＡ力価、病気の開始における年齢、性又はＨＬＡ型 の間に相間間係はない。従って、このＧ、ＡＤに対するＴ−リンパ球の反応性は 追加的な情報を与えることに貢献し、病気を診断する別の方法を提供する。

実施例１０−６４に自己抗体の検出のための生物体液の収集５００マイクロリツ トルよりも多くの容量の全血を６４ＫＡ自己抗体の試験をするために人から集め た。血液を直接ガラスの真空容器中に引き込むか、又は注射に引き込み、続いて ガラス真空容器管に移した。血清を得るために（凝結因子がない血液）、使用し た共通の真空容器管をレッドトップ管（ナトリウムヘパリンが存在しない）、又 は血清セパレーター（ＳＴＳ）管と呼ぶ。共通のレッドトップ管が使用されたと きはこの管は凝固させられ（１０分より長い期間）、そして凝固は除去された。

この期間にいずれかの試料の管を室温で１０００ｒｐ−において５分間遠心分離 できる。試料内の血清を除去し、プラスチック貯蔵ビンに入れ、そしてしっかり と封をした。試料を一２０℃で６４に自己抗体分析まで凍結することができる。

実施例１１−生物体液を試験するのに使用するための６４に乱ｌ亘１ｊ 試料が６４に自己抗体に対し試験できる前に人の高細胞調製物は、６ＬＫ抗原の 給源を提供するために、単離されて代謝的に標識されなければならない０人の高 細胞調製物はりコーディらの方法（リコーディ（Ｒｉｃｏｒｄｉ）、Ｃ，、レー ジ−（Ｌａｃｙ）、Ｐ、Ｅ、！フィンヶ（Ｆｉｎｋｅ）、Ｅ、Ｈ，、オラック（ ０１ａｃｋ）＋Ｂ、Ｊ、＋及びシャープ（Ｓｃｈａｒｐ）、Ｄ、Ｗ、［１９８８ ］　ｒ人膵臓島の単離のための自動化方法Ｊ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ３７：４１３− ４２０）に従って詳細に概略が示されるように、死体の人の膵臓提供物から単離 できる。高細胞は５０１のＣＭＲＬ培地中で６，０００島／Ｔ−１５０フラスコ の濃度でＴ−１５０プラスチック組織培養基フラスコ中に貯蔵できる。

試験前にＣＭＲＬ培地を除去し捨てる。各フラスコに５０−１のＲＰＭ＋１６４ ０培地（１６曽阿グルコース、１００μＵ／ｍｌペニシリン、１００μＧ／ｍｌ ストレプトマイシン及び２！Ｖ／Ｖ正常な人血清を補充）を加え、そして３７℃ で培養基中で一夜、９５１空ｆｉ　１５ｔＣ０２の雰囲ス中で培養した。島は試 験管当り５０ｍ１の培地の濃度で遠心管中に集められた。

試験管にキャップをし、室温て１１０００ｒｐて３分間遠心した。上澄みを除去 し、捨てた。少量（およそ４１）のＲ門１標識培地（１６ｍＭグルコース、２Ｏ ｎ＋Ｍ　ＨＥＰＥＳ、２ｚ正常な人血清を補充しており、アミノ酸メチオニンが 存在しない）を各試験管に、穏やかな混合をしながら試験管当りおよそ３０秒間 加えた。全ての高細胞を次に５０１のポリプロピレン遠心試験管に集め、そして １１００Ｏｒｐで５分間遠心した。

上澄みを除去し、捨てた。高細胞を次にＲＰＭ＋標識培地（＋０００島／ｍｌ培 地）中に再懸濁し、１００ａ＋ｎ＋プラスチツク組織培養基ペトリ皿に移した。

島を１５分間３７℃で培養しく　９５１！気１５ｚＣＯ２）、その後３５５メチ オニンを０．５ｍＣ１／１ｘ１０４細胞の濃度で培地に加えた。高細胞を再度５ 時開３７℃で培養した（９５Ｉ空気１５＄Ｃ０８）、ペトリ皿内の培地を高細胞 を攪拌（又は収集）することなしに吸引し、そして培地を処分した。

細胞に次に１０００島／１の濃度で等しい容量のＲＰＭ　＋１６４０培地を加え 、ソシテ３７℃（９５ｚ空気１５＄Ｃ０２）　テ３０分間培養した。高細胞とそ れらの培地を１５１の円錐形のポリプロピレン遠心管中に集めた。試験管を１５ ａ＋１のマーキングまで２０ｍＭ　）リス（ｐＨ７，４）、１５０ＩＩＭ　Ｎａ Ｃｌ、１０００にＩＥ／１アブロチン及び２ｍＭフェニルメチルスルホニルフル オライドで満たし、蓋をし、遠心しく１１０００ｒｐ、５分間）、そして上澄み を捨てた。ベレットを含有している試験管を次にイ東結させた（−８０℃）。

実施例＋２−６４に抗原の洗剤抽出及び６４に自己抗体に対する生物体液の試験 試験血清を使用する６４に抗原の免疫沈殿（イムノブレシビテーション）を実施 するために高細胞を氷上の試験管内でゆっくりと解凍した。一旦解凍されたら洗 剤抽出緩衝液（２０ｍＭ　）リス（ｐＨ７，４）、１５０１Ｍ　ＮａＣｌ、１０ ０ＯＫ　Ｉ　Ｅ／ｍ　Ｉアブロチン及び２ｎ＋Ｍフェニルメチルスルホニルフル オライド及び２Ｘ）リドン”Ｘ−１１４）を試験管に加え、島を氷上で３時間溶 解した。更に合計で６０秒間（各超音波処理の間に氷上で１５秒間の間隔て１分 間の休憩をおいて４回）、洗剤抽出物中に挿入された超音波プローブを使用して 、試験管内で高細胞を超音波処理した。１５分の間隔て島は又機械的にも破壊さ れた。

等しい容量の抽出物を遠心管にピペットで取り、バランスのとれた試験管をベッ クマン型５０ローターに入れ、そして試験管を超遠心（１００，ＯＯＯｘｇ、３ ０分、４℃）することによって洗剤抽出された島から不溶材料を除去した。

上澄みを除き、新たなポリプロピレン試験管に入れた。

ベレットは捨てることができる。高細胞溶解物（上澄み）を次に免疫沈殿試験の 前に水相、蔗糖相及び洗剤相に分離できる。

洗剤相の抽出のための方法がボーディール（ボーディ−ル（Ｂｏｒｄｉｅｒ）、 、Ｃ，［１９８１］　ｒ　）リドン”Ｘ−１１４溶液中で一体の膜蛋白質の相分 ［Ｊ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５６：１６０４−０７）の方法にそのまま従 って行った。

抽出の後、島細胞溶解物の洗剤相を次に蓋をした１　、　５ｍ１エビントルフ管 中で正常な人血清（１０μｍの試験血清を１００μｍの洗剤相上澄み当り含有、 １時間、４℃［氷浴］）とともに培養し、続いて予備膨張したプロティンＡ七フ ７０−スＣＬ−４８に吸着させた（スウェーデンのファルマシアから購入するこ とができる）。１００μｍの膨潤したプロティンＡセファロースＣＬ−４８が、 蓋をした１５ｍ１の円錐形の遠心管中で、各々の４００μｍ試験血清／洗剤相混 合物に加えられ、そして４℃で振盪プラットホーム上に保たれた（　３００ｒｐ ｍで２時間）、その時に試験管は１１０００ｒｐで１分間遠心分離することがで き、上澄みを除去する。プロティンＡセファロースベレットを捨てることができ る。非結合（ブレクリアーされた）溶解物（上澄み）のアリコ−）　（５−１０ ｘ１０’ｃｐｍを含有している１００μｍ）を１．５１のエビンドルフ遠心管に 分配し、そして６４に自己抗体の存在について試験されるべき２５μｍの血清と ともに培養した。

次に試験管に蓋をし、４℃で１８時間培養したく水浴中）。

各検定試験管に予備膨潤したプロティンＡセファロースＣＬ−４８１００μｌを 加え、そして反応混合物を４℃で３００ｒｐｍの振盪プラットホーム上で２時間 培養した。試験管にプロティンＡセファロースＣＬ−４８を洗うために９００μ ｍの０．５Ｘ　）リドンＴ”Ｘ−１１４＊衝液を加えた６試験管を各々について ｌＯ秒間渦巻かせ、続いて１０秒間！０００ｒｐｍで遠心分離した。

上澄みを吸引で捨て、ペレットは試験管に残したままとした。別の９００μｍ０ ０．５％）リドンＴＭｆｃ浄緩衝液を試験管に加え、洗浄手順を更に５回繰り返 した。１回の最後の洗浄段階は０．５！　）リドンＴｉ１１衝液の代りに氷冷水 の洗液に置き換えて行われた。この時点て試験管はプロティンＡセファ０−スＣ Ｌ−４８及び抗体及び／又は膜蛋白質の閏で形成された任意の免疫複合体のみを 含有するはずである。

結合した免疫複合体は除去でき、８０５Ｍ　）リス（ｐＨ６，８）、３゜０Ｘ（ ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）、１５％蔗糖、０．００１ブロモフ エニルブルー及び（５，０＄　ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノールを同じ栓をし た１、５１エビンドルフ試験管中に含有している１００μｍの試料緩衝液中で３ 公開沸騰させることによって変性させることができる。セファロースのビーズを 次に試験管の遠心で除去しく　１１０００ｒｐ、１分間）、そして上澄みを注意 深く除去する。５０μｍの試料を次に不連続な５ｏｓｉｏｘポリアクリルアミド 分離ゲルを通して電気泳動させ、続いてラエムリの方法［ラエムリ（Ｌａｅｇ＋ ｍ１ｉ）。

Ｕ、に、１９７０．バクテリオファージＴ４の頭の組み立ての閉構造蛋白質の開 裂Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０−８５１に従って、クマシーブリリアントプル ー染色を行い、続いて市販製品のエンハンス（Ｅｎｈａｎｃｅ）中に詳細に記載 されている方法を使用してフルオログラフィーを行うにューイングランドニュー クリアー）。

電気泳動に続いてゲルをろ紙上に置き、２時間６０℃で電気泳動ゲルドライヤー 中で乾燥させる。一旦乾燥し・たらゲルを除いて、増強スクリーンを有するフィ ルムカセット中のＸ線フィルム（コダックＸＲＱＭＡＴ）上に置き、そして−８ ０℃で３週Ｗ装置く。フィルム（フルオロラジオグラムと呼ぶ）を標準のＸ線フ ィルム写真加工を使用して処理する。試験試料はそれらのそれぞれの陽性及び陰 性対照と比較した後に陽性か又は陰性として採点する。

実施例１３−６４ＫＡを検出する方法 実施例１１に概略を示した免疫沈殿技術を使用する他ａこ本発明は６４にＡの存 在の検出を促進する任意の手順を使用して実施できる０例えば、使用することが できる他の免疫学的な方法には酵素結合イミュノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ） 及びラジオイミュノアツセイ（ＲＩＡ）が含まれる。これらの手順の原理と実験 方法は当業者によく知られて（する。

この検定は６４にＡと結合する天然又は組み替え蛋白質を使用することによって 迅速かつ効率的に実施できる。全体の細胞及び細胞溶解物の両方の手順はこの分 野で研究を行っている人によく知られ、そして本発明の６４にＡを検出するのに 容易に用い得る。

例えば実施例８に記載されるように、表６に示されるアミノ酸配列は免疫学的に 反応性のエピトープを確認するために分析できる。これらのエピトープは６４に Ａと免疫学的に反応するであろうアミノ酸配列である。これらの手順に従って使 用できる合成ペプチドは実施例８に詳細に記載されている。これらの配列は次に 組み替えにより製造することができる。組み替え製造についてはエピトープをコ ードしているＤＮＡをベクターに挿入し、ベクターを次に適当な宿主細胞を形質 転換するために使用し、宿主細胞は次に所望のアミノ酸配列を表現させられる。

細菌、昆虫、酵母及び哺乳類の細胞はすべて適当な宿主として役立ち得るが、エ ピトープの反応性において蛋白質の折畳みが重要な因子であるならば、真核細胞 が好ましい宿主である。

精製された蛋白質、又は蛋白質を製造している細胞の溶解物を検定に使用するこ とができる。

又、６４にＡを検出するために６４に抗原を使用する別の方法として、それ以外 については抗６４にＡ抗体として知られている６４にＡに対し生じた抗体を使用 することである。この抗体は６４にＡと免疫沈殿し、そして検出は上記の様に実 １００を有する悪者又はこの病気を生じる過程にある愚者は、彼等の血清中に６ ４に抗原を含む免疫複合体を有することが予測できる。これらの免疫複合体は典 型的にはいくつかの免疫グロブリンで囲まれている６４に自己抗原からなってい る。この病スを有しない個人、又はこの病気を生じようとしていない人はこれら の免疫複合体を有さないであろうから、これらの複合体を検出することはこの病 気の検出のための検定の基礎を提供する。

最初に１００試験がされる愚者又は対照から採血される。

血液試料から赤血球細胞をスピニングアウト（遠心分１ｌｌ）させることによっ て血清が得られる。ＩＤＤを有する患者又はこの病気を生じようとしている患者 については、二の血清は６４に抗原を含む免疫複合体を含有していることが予測 できる。次に血清の試料はプロティンＡセファロースと培養できる。血清と共に 培養される試料の容量は少量であり、例えば２５μｍである。プロティンＡセフ ァロースＣＬ・４Ｂと免疫グロブリンの培養に続いて（２時間、４℃）、複合体 を次ＣＺＯ，ｌ＄ＳＯ５，１，０Ｘ）　Ｉ）トンＸ−１１４、及ヒ２＋ｇＭ　Ｅ ＤＴＡを有する５０ｍＭ　）リス−〇ＣＩ（ｐＨ７，４）で３回、そして５０ｍ Ｍ　）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）で２回洗浄できる。上記の様にセファロース を洗浄することによって外の血清蛋白質が洗い去られ、プロティンＡセファ０− スに結合した免疫グロブリンのみが残る０次に６４に自己抗原の放射能活性ホス ホニル化をキナーゼ反応を利用して達成できる。キナーゼ反応ハ１０ｍＭ　Ｍｎ Ｃｌ２、ＩＯ＋ｗＭ　ＭｇＣｌ２．１ｚトリトンＸ−１１４、及び２０μＣｉの アデノシン（γ−３２ｐ　）　５　を三燐酸（アメルシャム＞　５０００Ｃｉ／ ｍｍｏｌ）を含有している５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ　Ｈ７゜４）１０８ ｍを添加することによって開始できる。沈殿物は懸濁され、そして３０℃で１０ 分間培養できる０反応を次に電気泳動試料緩衝液の添加により滲出てき、９５℃ で４分間加熱される。３２ｐ標識生成物は不連続５ＤＳ１５＄ポリアクリルアミ ド分離ゲルによって分離でき、続いて増強スクリーンで６〜７２時間オートラジ オグラフィーを行う（コダック、Ｘ−ｏｍａｔ　ＡＲ５）　、　ＩＤＣ患者の血 清は特異的にシロ４゜０００蛋白質を免疫沈殿させ、これは対照の血清ではＩＩ 測されない。

実施例１５−ハイブリッド蛋白質ワクチンを使用する＋００の処置 糖尿病の開始の引金を引く特定の事象又は試薬は解明されていない。６４に抗原 と類似の抗原を有しているウィルスはウィルスに対する正常な免疫応答と、ウィ ルスとの分子的な模倣を通じての６４に抗原に対する、異常な自己免疫応答との 両方を生じ得る。従って遺伝的な感受性は、病気の行程を開始する環境的な因子 に対する誇張された、又は長引かされた免疫応答によって表現される。

又、６４に蛋白質が個体発生において島細胞の発達における遅れた表現を有する 可能性もあり、生命の初期の段階ではそれに対する耐性が発達していないので、 それを抗原とすることが可能であり得る。

病気の開始の機構と関わりなく、β細胞の破壊は少なくとも２つの方法で進行し 得る。６４にＡが開始する外来の抗原に結合し、そして免疫系の他の化合物を刺 激し、抗体結合βｍ抱を破壊する。又はＴ−リンパ球が６４に抗原を認識し、細 胞を直接殺す。いずれの場合も６４に蛋白質を使用して破壊行程に干渉し・、そ れによって１００を遅らせ又は防止する二とが可能である。

本発明の新規な治療法は、６４に抗原の精製された形態に結合した毒素の血流へ の注射を含む。抗原毒素複合体は迅速にリンパ節に到達し、そこで複合体は通常 は６４　ＫＡをつくり出す免疫細胞によって取り上げられる。又、抗原毒素複合 体はβ細胞上で６４に抗原を認識するＴ−リンパ球によって結合されるであろう 。従って、β細胞破壊に関与する特定の免疫細胞は毒が与えられて不活性化され 、非破壊性の免疫細胞は無害のままに残す。

ハイブリッド蛋白は例えば６４に抗原と一緒になったジフテリア毒素からなるも のであり得る。その様なハイブリッド毒素の構築は例えば、米国特許第４，６７ ５，３８２　（マーフィー）のハイブリッド蛋白質についての開示に従って進行 させることができる。

別の方法は６４に様の蛋白質の表現を欠いているが、感染性を保有している変更 されたウィルス（ウィルスの病気開始クラスからのもの）をつくり出すことを含 んでいる。二の弱毒化されたウィルスは１００に対して高い遺伝的な危険のある 人、すなわちＨＬＡが相同の兄弟姉妹又はＩＤＯの初期段階にある人に対してワ クチン注射するために使用できる。６４に蛋白質を模倣するウィルスの候補、従 つて病気の行程を開始する候補にはコクサキウイルス、風疹ウィルス及びＥＭＣ ウィルスが含まれる。ワクチン組成物は６４に蛋白質と共通したエピトープに対 し非弱毒化ウィルスが免疫応答を生じるような弱毒化したウィルスからなるもの としてつくることができる。弱毒化した形態ではワクチンウィルスはウィルスに 対する免疫応答を生じるが６４に蛋白質に対しては生しない。

実施例１６−膵臓移植と間違した６４ＫＡの使用ＩＤＣを有する患者の処置の好 ましい方法は、損なわれた又は破壊されたβ細胞に対する置き換え物としての正 常な島を移植することである。糖尿病を有する多くの患者において部分的及び全 膵臓の移植がうま〈実施されている。しかし、移植を維持し、拒絶を防止するた めに永久的な免疫抑制療法が常に必要とされる。連続的な免疫抑制療法のもとて の部分的又は全体の膵臓移植は、糖尿病を有するいく人かの患者で正常な水準の 血液グルコースを生じている。膵臓の移植は糖尿病の過程で遅い時期に行われ、 おそらく腎臓病などの併発症を逆転させず、事実網膜症を悪化させるであろう。

重要なことは、−卵性双生児の間の膵臓の移植の成功は免疫抑制なしに維持され てきたが、自己免疫島細胞破壊が生じて糖尿病が再発した。従って、移植が拒絶 されないときも、病気の再発を予防するために免疫療法が必須である。移植され た島の破壊（拒絶）は少なくとも部公的には自己免疫破壊の原図となっている自 己抗原の再出現のためである。自己免疫破壊（移植された島／すい臓の拒絶）を 予防する特定の免疫療法は現在存在しない。

移植された島細胞又はすい臓の自己免疫破壊を予防するために実施例１１に詳細 に記載したようなハイブリッド毒素を使用して、特異的な免疫療法を島細胞破壊 を予防するのに使用できる。免疫療法の組合せ使用は島細胞／膵臓移植を１［） Ｄの処置の治療の道具にする。

実施例ｌ７−６４ＫＡの検定のためのキット本明細書に使用した新規な手順を使 用して、血清試料の便利な分析法を促進する試薬キットが提供できる。キットは ６４にＡ検出のための抗原としての役目をする組み替え又は合成的につくられた 無傷の６４に蛋白質又は免疫反応性のペプチドを使用するようにつくることがで きる。

別の方法として、６４にＡを検出するために特に開発された抗体も有用である。

抗体を検出するためのＥＬ　Ｉ　ＳＡ及びＲＩＡ技術の原理と方法は十分に確立 されている。

例として、ＥＬＩＳＡ検定のためには、その様なキットは次の成分からなる。

１．６４に蛋白質、ペプチド又は抗−６４にＡ抗体２、酵素（例えばパーオキシ ダーゼ） ３、コンシュゲイト（複合化）した動物の抗人免疫グロブリン、及び ４、陽性及び陰性の対照 上ｌ己のキ・ントは、９６Ｍのウェルのプラスチ・ツクプレート、比色試薬、Ｅ ＬＩＳＡリーダー、封鎖試薬及び洗浄緩衝液を含むように変更することができる 。

又、例としてＲＩＡのためにはその様なキットは次の成分からなるものであり得 る。

１、放射標識６４に蛋白質、ペプチド又は抗−６４にＡ抗体２、洗浄緩衝液 ３、ポリエチレングリコール ４、ヤギ又は羊の抗人沈殿（第２）抗体、及び５、陽性及び陰性対照 上記キットのいずれかは適当な実験備品の任意のものを含めるように変更できる 。

本明細書に記載した実施例及び具体例は説明目的のみのものであり、上記に照し て種々の変更又は変化が当業者に示唆され、本出願の精神と範囲内に含まれるべ きであり、添付の特許請求の範囲に含まれるべきである。

表６．猫のグルタミン酸デカルボキシラーゼｍＲＮＡのヌクレオチド及び誘導さ れた配列 補正帯の写しくａ訳文）提出書（特許法第１８４条の８）１　国際出願番号　Ｐ ＣＴ／ＵＳ　９１１０５９２０組成物 ンター　ホール　２２３ 名称（氏名）　ユニバージティー　オア　フロリダ請求の範囲 １、　インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤ）が起きるだろうということを実質的 にβ細胞が損傷を受ける前に発見する方法であって、試料中の６４に自己抗体を 検出するために、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）蛋白質又はペプチド を使用することからなる方法。

２、ＣＡＤ蛋白質又はペプチドを、ＩＤＤを有する疑いのある人又は動物からの 生物体液の試料と接触させるが、ここでＣＡＤペプチドは６４に自己抗体又はそ の免疫学的な均等物と特異的に結合可能であって免疫複合体を形成し、そして免 疫複合体が形成したかどうかを測定する請求項１に記載の方法。

３、　該測定が、免疫複合体と結合できる検出可能に標識された蛋白質と免疫複 合体を接触させ、そして標識された免疫複合体の存在を検出することからなる、 請求項２に記載の方法。

４、　検出可能に標識された蛋白質が標識された動物の抗人免疫グロブリンであ る請求項３に記載の方法。

５、ＣＡＤ蛋白質又はペプチドが検出可能に標識されている前記特許請求の範囲 のいずれか−に記載の方法。

６、（ａ）人又は動物の血清の試料を固定されたプロティン＾と接触させ、 （ｂ）存在する全てのＧＡＧを、キナーゼ反応を通じて３２ｐで標識し、そして （ｃ）全ての標識されたＧＡＯＩ白貿の存在を検出することからなる請求項１に 記載の方法。

７、Ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−８ｃ式中Ａ及びＢはそれぞれ０〜２ ０個のアミノ酸の配列であり、そのペプチドは６４に自己抗体と免疫反応性であ る］によって表される８〜３０個のアミノ酸のペプチド。

８、　ペプチドが請求項７に定義した通りである、請求項１〜６のいずれか−に 記載の方法。

９、　島細胞調製物から単離でき、１００と関連している、６４に蛋白質に対し コードしている遺伝子。

１０、請求項７に定義されるペプチドに対しコードしている遺伝子。

１１、別々の容器に入れられているＣＡＤ蛋白質又はペプチド及び６４に自己抗 体に結合できる動物の抗人免疫グロブリンを含む、血清試料中で糖尿病を検出す るためのキット。

１２、ＧＡＤ蛋白質又はペプチドが請求項６〜７の何れか−に定義される通りで ある請求項１１に記載のキット。

１３、　免疫グロブリンが検出可能に標識されている請求項１１又は請求項１２ に記載のキット。

１４、試料中のＴ−リンパ球がＣＡＤ、６４に蛋白質、又は−に＾と免疫反応性 である合成ペプチドに応答して増殖するかどうかを測定することからなるＩＤＣ の開始を検出する方法。

１５、　１００の治療又は予防において使用するための医薬の製造のためのＣＡ Ｄ蛋白蛋白はペプチドの用途。

１Ｂ、ペプチドが請求項７に定義される通りである、請求項１５に記載の用途。

１７、すい臓の島細胞を又はそのインシュリンを製造する能力を破壊せず、６４ に蛋白質に対し相同性を有し、ウィルスに対するものである抗体を起こさせるア ミノ酸配列を含んでいるワクチン組成物。

１８、弱毒化ウィルスを含むワクチン組成物であって、該ウィルスは弱毒化され ていない形態では６４に蛋白質と相同性を有するので感受性の人又は動物に感染 できて図に蛋白質又はすい臓の島細胞を認識し攻撃する抗体の免疫応答を生じ、 ウィルスを抑制できる免疫応答を起こすが６４に蛋白質を表現する細胞を攻撃す る能力のある抗体を起こすエピトープを欠いているアミノ酸配列を該弱毒化ウィ ルスが含んでいる、ワクチン組成物。

１９、ウィルスがコクサキ、風疹及びεＭＣウィルスから選択される請求項１８ に記載のワクチン。

手続補正書 ｌ　事件の表示　平成０３年特許願第５１５６５１号２””サイ＞’、ｉ−ｚ＋ ）＞＊Ｗ’ａｌＬｍｍｆｆ４（Ｄ’？−Ｕ４ＷｊｒｅＢＥｔ、ＵＩＭｌ。ｔｈｈ ＯＭｉｂＥｔ、Ｕ組成物 ３　補正をする者 事件との間係　特許出願大 佐　所　アメリカ合衆国　３２６１１　フロリダ州　ゲインスピル　グリンター 　ホール　２２３ 氏名（名称）　ユニバージティー　オア　フロリダ４代理人 住　所　東京都新宿区新宿２丁目８番１号新宿セブンビル５０３号６　補正によ り増加する発明の数　増加せず特許請求の範囲を以下に訂正する。

１、　インシュリン依存性糖尿病（１００）が起きるだろうということを実質的 にβ細胞が損傷を受ける前に発見する方法であって、試料中の６４に自己抗体を 検出するために、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＣＡＤ）蛋白質又はペプチ ドを使用することからなる方法。

２、ＣＡＤＩ白質又はペプチドを、＋００を有する疑いのある人又は動物からの 生物体液の試料と接触させるが、ここでＣＡＤペプチドは６４に自己抗体又はそ の免疫学的な均等物と特異的に結合可能であって免疫複合体を形成し、そして免 疫複合体が形成したかどうかを測定する請求項１に記載の方法。

３、　該測定が、免疫複合体と結合できる検出可能に標識された蛋白質と免疫複 合体を接触させ、そして標識された免疫複合体の存在を検出することからなる、 請求項２に記載の方法。

４、　検出可能に標識された蛋白質が標識された動物の抗人免疫グロブリンであ る請求項３に記載の方法。

５、ＣＡＤ蛋白質又はペプチドが検出可能に標識されている前記特許請求の範囲 のいずれか−に記載の方法。

６、（ａ）人又は動物の血清の試料を固定されたプロティンＡと接触させ、 （ｂ）存在する全てのＣＡＤを、キナーゼ反応を通じて３２ｐで標識し、そして （Ｃ）全ての標識されたＣＡＤ蛋白質の存在を検出することからなる請求項１に 記載の方法。

７、Ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｖａｔ−Ｌｙｓ−８［式中Ａ及びＢはそれぞれ０〜２ ０個のアミノ酸の配列であり、そのペプチドは６４に自己抗体と免疫反応性であ る］によフて表される８〜３０個のアミノ酸のペプチド。

８、　ペプチドが請求項７に定義した通りである、請求項１〜６のいずれか−に 記載の方法。

９、　島細胞調製物から単離でき、ＩＤＤと間違している、６４に蛋白質に対し コードしている遺伝子。

１０、請求項７に定義されるペプチドに対しコ−ドしている遺伝子。

１１．　別々の容器に入れられているＣＡＤ蛋白質又はペプチド及び６４に自己 抗体に結合できる動物の抗人免疫グロブリンを含む、血清試料中で糖尿病を検出 するためのキット。

１２、ＣＡＤ蛋白質又はペプチドが請求項５〜７の何れか−に定義される通りで ある請求項１１に記載のキット。

１３、免疫グロブリンが検出可能に標識されている請求項１１又は請求項１２に 記載のキット。

１４、試料中のＴ−リンパ球がＣＡＤ、６４に蛋白質、又は６４ＸＡと免疫反応 性である合成ペプチドに応答して増殖するかどうかを測定することからなるＩＤ Ｏの開始を検出する方法。

１５、　１ＤＤの治療又は予防において使用するための医薬の製造のためのＣＡ Ｄ蛋白質又はペプチドの用途。

１６、ペプチドが請求項７に定義される通りである、請求項１５に記載の用途。

１７、すい臓の高細胞を又はそのインシュリンを製造する能力を破壊せず、６４ に蛋白質に対し相同性を有し、ウィルスに対するものカある抗体を起こさせるア ミノ酸配列を含んでいるワクチン組成物。

１８、　弱毒化ウィルスを含むワクチン組成物であって、該ウィルスは弱毒化さ れていない形態では６４に蛋白質と相同性を有するので感受性の人文・は動物に 感染できて６４に蛋白質又はすい臓の高細胞を認識し攻撃する抗体の免疫応答を 生じ、ウィルスを抑制できる免疫応答を起こすが６４に蛋白質を表現する細胞を 攻撃する能力のある抗体を起こすエピトープを欠いているアミノ酸配列を該弱毒 化ウィルスが含んでいる、ワクチン組成物。

１９、　ウィルスがコクサキ、風疹及びＥＭＣウィフロントページの続き （７２）発明者　カスターン、ウィリアムアメリカ合衆国　３２６０８　フロリ ダ州　ゲインスピル　４７ス　ロード　ニス、ダブリュ、　８１２３

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤ）を臨床症状が見られる前に発見する方 法であって、インシュリン依存性糖尿病の疑いのある人又は動物の体液試料中の 、６４Ｋ自己抗体又はその免疫学的均等物を検出することからなる方法。
2. ２．インシュリン依存性糖尿病の開始を検出する方法であって、ＩＤＤを有する の疑いのある人又は動物からの体液試料を、６４ＫＡ又はその免疫学的均等物が 存在するかどうか分析することからなり、該６４ＫＡ又はその均等物が存在する ことがＩＤＤの開始が生じていることを示すことからなる方法。
3. ３．インシュリン依存性糖尿病の早期発見のための請求項２に記載の方法であっ て、 （ａ）蛋白質を生物試料と接触させるが、該蛋白質は６４ＫＡと特異的に結合し て該６４ＫＡに結合した該蛋白質からなる免疫沈殿物を形成し、 （ｂ）該試料中に存在する任意の該６４ＫＡに該蛋白質を結合させる適当な条件 下で、該蛋白質を該試料と接触させて該沈殿を形成し、そして （ｃ）該免疫沈殿のどれかが形成されているかどうかを決定することによりイン シュリン依存性糖尿病を検出する段階を含んでいる方法。
4. ４．該蛋白質が抗６４ＫＡ抗体である請求項３に記載の方法。
5. ５．該方法が、該生物体液に対し全編胞又は編胞溶解物ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡの 実施を含んでおり、該ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡは６４ＫＡに特異的に結合できる蛋 白質を表現する組み替え微生物を使用して実施される請求項２に記載の方法。
6. ６．該方法が、ＩＣＡ又はＩＡＡの存在について該生物体液を分析することを更 に含む請求項２に記載の方法。
7. ７．該方法がβ−細胞機能が実質的に損われる前にインシュリン依存性糖尿病の 発生を検出する請求項２に記載の方法。
8. ８．ＧＡＤ蛋白質に対する自己抗体を検出することを含む、インシュリン依存性 糖尿病の開始をβ−細胞が実質的に損われる前に検出する、請求項２に記載の方 法。
9. ９．（ａ）インシュリン依存性糖尿病の試験をされるべき人又は動物から血清試 料を得て、 （ｂ）該血清試料を固定されたプロテインＡと接触させ、 （ｃ）存在する任意のＧＡＤをキナーゼ反応を通じて３２ｐで標識し、 （ｄ）任意の標識されたＧＡＤ蛋白質の存在を検出する、 以上の段階を含む、請求項８に記載の方法。
10. １０．該生物試料を６４ＫＡと免疫反応性である合成ペプチドと接触させること を含む、請求項２に記載の方法。
11. １１．該ペプチドが、 【配列があります】 ［式中Ａ及ひＢはそれぞれ長さが０〜約２０個のアミノ酸の配列であり、該合成 ペプチドは６４Ｋと十分相同性であるので該ペプチドは６４Ｋ自己抗体と免疫反 応性である］によって表される約８〜約３０個のアミノ酸のものである請求項１ ０に記載の方法。
12. １２．該ペプチドがＧＡＤ蛋白質と相同である請求項１１に記載のほうほう。
13. １３．インシュリン依存性糖尿病の早期発見に使用し、６４Ｋ抗原又は６４ＫＡ と反応できるその免疫学的均等物を含む組成物。
14. １４．６４Ｋ抗原の免疫学的均等物が抗６４ＫＡ抗体である請求項１３に記載の 組成物。
15. １５．該ペプチドが、 【配列があります】 ［式中Ａ及びＢはそれそれ長さが０〜約２０個のアミノ酸の配列であり、該合成 ペプチドは６４Ｋと十分相同性であるので該ペプチドは６４Ｋ自己抗体と免疫反 応性である］によって表される約８〜約３０個のアミノ酸のものである請求項１ ３記載の組成物。
16. １６．６４Ｋ抗原又はその免疫学的均等物と毒素を含んでいるハイブリッド蛋白 質。
17. １７．該蛋白質が島細胞調製物から単離されインシュリン依存性糖尿病と関連し ている６４Ｋ蛋白質をコードしている遺伝子。
18. １８．【配列があります】 ［式中Ａ及び８はそれぞれ長さが０〜約２０個のアミノ酸の配列であり、該合成 ペプチドは６４Ｋと十分相同性であるので該ペプチドは６４Ｋ自己抗体と免疫反 応性である］によって表される約８〜約３０個のアミノ酸の合成ペプチドをコー ドしている遺伝子。
19. １９．【配列があります】 〔式中Ａ及びＢはそれぞれ長さが０〜約２０個のアミノ酸の配列であり、該合成 ペプチドは６４Ｋと十分相同性であるので該ペプチドは６４Ｋ自己抗体と免疫反 応性である］によって表される、約８〜約３０個のアミノ酸の合成ペプチド。
20. ２０．別々の容器に入れられている成分、即ち、６４Ｋ蛋白質又はペプチド又は 抗６４ＫＡ抗体、酵素、及びコンジュゲイト動物抗人免疫グロブリンを含み、血 清試料中で糖尿病の証拠を検出するためのキット。
21. ２１．６４ＫＡに特異的に結合できる組み替え蛋白質を表現できるように形質転 換されている組み替え微生物又は真核細胞。
22. ２２．６４Ｋ蛋白質に相同性を有するウィルスに対する抗体を生じるワクチン組 成物であって、その抗体が、膵臓の島細胞又はそれのインシュリン製造能力を破 壊しないものである、人又は動物のインシュリン依存性糖尿病に対して免疫を与 えるワクチン組成物。
23. ２３．人又は動物のインシュリン依存性糖尿病への免疫を与えるワクチン組成物 であって、該ワクチンは弱毒化ウィルスを含み、該ウィルスは弱毒化されていな い形態では６４κ蛋白質と相同性を有するので感受性の人又は動物に感染できて ６４Ｋ蛋白質又はすい臓の島細胞を認識し攻撃する抗体を含む免疫応答を生じ、 ウィルスを抑制できる免疫応答を起こすが６４Ｋ蛋白質を表現する細胞を攻撃す る能力のある抗体を起こすエピトープを欠いているアミノ酸配列を該弱毒化ウィ ルスが含んでいる、ワクチン組成物。
24. ２４．ウィルスがコクサキ、風疹及びＥＭＣウィルスから選択される請求項２３ に記載のワクチン。
25. ２５．毒素と共に、６４Ｋ抗原、又はその免疫学的均等物を含んでいる有効量の ハイブリッド蛋白質を投与することからなる、インシュリン依存性糖尿病を有す る人を処置する方法。
26. ２６．毒素と共に、６４Ｋ抗原、又はその免疫学的均等物を含んでいる有効量の ハイブリッド蛋白質を投与することからなる、移植された膵臓細胞の免疫拒絶を 減少する方法。
27. ２７．ＩＤＤを有する疑いのある人からのＴリンパ球検査を含み、該検査がＧＡ Ｄ、６４Ｋ蛋白質、又は６４ＫＡと免疫反応性である合成ペプチドに応答してＴ リンパ球が増殖するかどうかを測定することを含む、ＩＤＤの開始を検出する方 法。