JPH06500466A

JPH06500466A - Ｇｄｆ―１

Info

Publication number: JPH06500466A
Application number: JP3514623A
Authority: JP
Inventors: リー，セ　―　ジン
Original assignee: カーネギーインスチチューションオブワシントン
Priority date: 1990-06-15
Filing date: 1991-06-14
Publication date: 1994-01-20
Also published as: CA2085134A1; ES2137931T3; DE69131580T2; US20040039162A1; AU8496491A; WO1992000382A1; EP0652951B1; EP0652951A1; US20030040611A1; ATE184052T1; DE69131580D1; CA2085134C; AU666291B2; HK1013847A1; EP0652951A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、一般にトランスフォーミング成長因子ベータ玉料の蛋白質をコードするＤＮＡ分節に関するものである。本発明は、特にＧＤＦ−１をコードする分節およびその固有の断片に関する。更に、本発明は、哺乳動物ＵＯＧ−１蛋白質およびそれをコードするＤＮＡ分節に関する。

２、背景情報胚形成の間の分化過程の制御において、臨界的な役割を演じる多くのポリペプチド因子か、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）に対して構造的に相同性を育することか見出されている。これらのうちには、雄性分化においてミュラー管の退縮を生じるミュラー管阻害物質（Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ：ＭＩＳ）［Ｃａｔｅら、Ｃｅ１ｌ　４５：６８５−６９８　（１９８６）］　；新規な（ｄｅ　ｍｏｖｏ）軟骨および骨形成を誘導し得る骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ　−ｓ）　［Ｗｏｚｎｅｙら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４２　：　１５２８−１５３４　（１９８８）］　；下垂体細胞による生殖腺刺激ホルモンの分泌を制御し、またアクチビンの場合には赤血球分化に影響を与えるインヒビン類およびアクチビン類［Ｍａｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３１８　：　６５９−６６３（１９８５）　；　Ｆｏｒａｇｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ８３：３０９１−３０９５　（１９８５）；Ｅｔｏ　ら、ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍ　１４２　：　１０９５−１　１０３　（１９８７）；およびＭｕｒａｔａら、Ｒｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８５　：　２４３４−２４３８　（１９８８）コ　：成虫原基の形態形成に加えて背側−腹側の特定に影響を与えるショウジヨウバエのデカペンタブレシック（ＤＰＰ）遺伝子生成物［Ｐａｄｇｅｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ　３２５　：　８１−８４（１９８７）］、卵の成長現象の極に集中するキセノブス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）Ｖ　ｇ　−１遺伝子生成物［Ｗｅｅｋｓら、Ｃｅ１１５１　：８６１ −８６７　（１９８７）］　；Ｖｇ−１との相同性に基づいて遺伝子が同定され、マウスの胚形成の間に発現することが示されているＶ　ｇ　ｒ　−１［Ｌｙｏｎｓら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６　：　４５５４ −４５５８（１９８９）］がある。加つるに、最も有力な中胚葉−誘導因子の一つであるＸＴＣ−ＭＩ　Ｆも、構造的にＴＧＦ−βに関連していると思われる［　Ｒｏｓａら、５ｃｉｅｎｃｅ２３９ニア８３−７８５　（１９８８）；およびＳｍ１ｔｈら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０３　：　５９１−６００　（１９８８）　］。

ＴＧＦ−β自体は、脂質生成、筋発生、軟骨形成、造血、および上皮細胞分化を含む広範な分化過程に影響を与えることかでき［Ｍａｓｓａｇｎｅｊ、、Ｃｅ１ｌ　４９　：　４３７−４３８（１９８７）コまた、少な（とも１種のＴＧＦ− β、すなわちＴＧＦ−β２は、カエル胚において中胚葉形成を誘導し得る［　Ｒａ５ａら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９　：　７８３−７８５（１９８８）］　。

本発明は、ＴＧＦ−β上科の新規構成物およびそれをコードするヌクレオチド配列に関するものである。この新規遺伝子およびコートされる蛋白は、この上杆の他の構成物と同様に、細胞分化に関連する発生決定への媒介において重要な役割を演じるであろう。

発明の要約新規な細胞分化調節因子およびそれをコードするヌクレオチド配列を提供することが、本発明の全般的な目的である。

一実施態様において、本発明は哺乳動物のＧＤＦ−１の全体もしくは固有の部分をコードするＤＮＡ分節、または該ＤＮＡ分節に相補的なりＮＡ断片に関するものである。

他の実施態様において、本発明は、天然に非共有結合的に結合する蛋白質を実質的に含まないＧＤＦ−１に関するものである。

更なる実施態様において、本発明は、図２に与えられるアミノ酸配列の全体または固有の部分を有する、組換え的、または化学的に産生されたＧＤＦ−１蛋白質、またはその機能的に同等な変異体に関するものである。

他の実施態様において、本発明は、本発明のＤＮＡ分節およびベクターを含んでなる組換えＤＮＡ分子に関するものである。本発明は、教祖換え分子により安定して形質転換された宿主細胞にも関する。

本発明の種々の池の目的および優位点は、以下の本発明の図面および記述から、当業者には明確であろう。

図面の簡単な記述図１は、胚性ＲＮＡのノーサン分析を示す。交尾後（ｐ、ｃ、）８．５日目のマウス胚から単離して２度のポリへ−選択を行なったｍＲＮＡ２μｇを、ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースに移し、ＧＤＦ−１ｃＤＮＡを用いたプローブにかけた。

図２は、ＧＤＦ−１の配列を示す。単一のｃＤＮＡクローンから誘導されたＧＤＦ−１の全ヌクレオチド配列が、下側の推定されるアミノ酸配列と共に示されている。

ポリＡテイルは示していない。数字は、クローンの５′末端からの相対的なヌクレオチドの位置を示す。

図３は、推定されるＧＤＦ−１アミノ酸配列と、ＴＧＦ−β上科の既に記述された構成物のアミノ酸配列との比較を示す。

（Ａ）：　ＧＤＦ−１のＣ−末端アミノ酸配列（アミノ酸２３６から始まる）と、キセノブスＶｇ−１［Ｗｅｅｋｓ　ら、Ｃｅ１ｌ　５１　：８６１−８６７　（１９８７）］、ネズミＶ　ｇ　ｒ　−１［Ｌｙｏｎｓ　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、８６：４５５４−４５５８’（１９８９）］、ヒトＢＭＰ２ａ、２ｂおよび３　［Ｗｏｚｎｅｙら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４２．１５２８−１５３４　（１９８８）］、ショウジョウバより　Ｐ　Ｐ　［Ｐａｄｇｅｔｔ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３２５　：　８１−８４（１９８７）］、ヒトＭ　Ｉ　Ｓ　［Ｃａｔｅら、Ｃｅ１１４５：６８５−６９８　（１９８６）コ、ヒトインヒビン α、βＡ、およびβＢ　［Ｍａｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　ＲｅｓＣｏｍｍ　１３６：９５７−９６４　（１９８６）］、ヒトＴＧＦ−βｌ　［Ｄｅｒｙｎｃｋ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１６　：　７０１−７０５　（１９８５）］、ヒトＴＧＦ−β２　［ｄｅ　Ｍａｒｔｉｎ　ら、ＥＭＢＯＪ６：３６７３−３６７７（１９８７）］、ヒトＴＧＦ−β３　［ｔｅｎ　Ｄｉｊｋｅ　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ　８５：４７１５−４７１９　（１９８８）；およびＤｅｒｙｎｃｋ　ら、ＥＭＢＯＪ７：３７３７−３７４３（１９８８）コ、ニワトリＴＧＦ−β４　［Ｊａｋｏｗｌｅｗら、Ｍｏ１Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　２　：　１　１８６−１１９５　（１９８８）　］、およびキセノブスＴＧＦ−β５　［Ｋｏｎｄａｉａｈら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２６５　：　１０８９−１０９３　（１９９０）コの対応する配列との整列。７個の不変のシスティンには影をつけた。ダッシュは、整列を最大化するために導入したギャップを示す。

（Ｂ）：　上杆の異なる構成物間のアミノ酸相同性。

数は、Ｃ−末端から第１の保存されるシスティンから計算された各対間の同等性の百分率を表わす。

（Ｃ）：　推定される２塩基開裂部位の上流側におけるＧＤＦ−１とＶｇ−１との間の相同性。２種の異なる領域が示されている。１個のアミノ酸の単一のギャップか、整列を最大化するためにＶｇ−１配列に導入されている。数字は、各蛋白質におけるアミノ酸位置を示す。

図４は、ＧＤＦ−１のインビトロ翻訳生成物のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示している。インビトロにおいて転写され、キャップされたアンチ−センス（レーンｌ）およびセンス（レーン２−１３）ＲＮＡを、ウサギ赤血球溶解物を用いて［”Ｓ］　メチオニンの存在下に、イヌ膵臓ミクロゾームと共に（レーン３．５．７．９．１１および１３）または無しで（レーンｌ、２．４．６．８、および１２）翻訳した。レーン＝２および３、完全長ＧＤＦ−１テンプレートからの翻訳生成物：４および５、推定される単一配列を欠く削除テンプレートからの翻訳生成物：６および７、完全長ＧＤＦ−１テンプレートからのエンド−Ｈ（Ｅｎｄｏ−Ｈ）処理翻訳生成物＝８および９完全長ＧＤＦ−１テンプレートからのトリプシン処理翻訳生成物：ｌＯおよびｌｌ、推定される単一配列を欠く削除テンプレートからのトリプシン処理翻訳生成物＝１２および１３、トライトンＸ−１００の存在下にトリプシン処理した完全長ＧＤＦ−１テンプレートからの翻訳生成物。単一の翻訳反応で調製された生成物の等量を、レーン２．６．８および１２に対し、レーン３．７．９および１３に対し、レーン４およびｌＯに対し、ならびにレーン５および１１に対して使用した。左側の数字は、分子量標準の大きさを示す。位置４１Ｋ、３９゜５に、および３８には、これらの標準の移動量に相対的に計算した。

図５は、ＧＤＦ−１のゲノムのサザン分析を示している。ＣＨＯ細胞（ハムスター）、ＢＮＬ細胞（マウス）、またはＢ　ｅ　Ｗ　ｏ細胞（ヒト）から単離された１０μｇのゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲｌ　（Ｅ）　、ＢａｍＨＩ　（Ｂ）またはＨｉｎｄＩ［［（Ｈ）を用いて消化し、１％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、ＧＤＦ−１にてプローブにかけた。左側の数字は、標準品の大きさくｋｂ）を示す。

図６は、胚ＲＮＡのノーサン分析を示している。示された妊娠日数におけるマウス胚から単離され、２度ポリＡにて選択された２μｇのｍＲＮＡを、ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、ＧＤＦ−１のｃＤＮＡを用いてプローブにかけた。バンドの大きさの付与は、ＲＮＡ標準品の移動量に基づいている。

図７は、マウス組織中でのＧＤＦ−１の発現を示している。種々のマウス組織から単離され、１度ポリＡにて選択された５μｇのｍ　ＲＮ　Ａを、ホルムアルデヒドゲル上で電動泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、ＧＤＦ−１のｃＤＮＡを用いてプローブにかけた。バンドの大きさの付与は、ＲＮＡ標準品の移動量に基づいている。

図８は、中枢神経系におけるＧＤＦ−１の発現を示している。胎児、新生期および成体の脳、ならびに成体を髄、小脳および脳幹から単離され、２度ポリＡにて選択された２μｇのｍＲＮＡを、ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、ＧＤＦ−１のｃＤＮＡを用いてプローブにかけた。バンドの大きさの付与は、ＲＮＡ標準品の移動量に基づいている。

図９は、細菌中でのＧＤＦ−１の発現を示している。

ＧＤＦ−１ｃＤＮＡの部分をｐＥＴ３ベクター中にクローン化し、ＢＬ２＋　（ＤＥ３）細胞中に形質転換させた。全細菌抽出物を、！５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、クーマシーブルーにて染色した。最上部の数字は、各構築物に含まれるＧＤＦ−１の最初／最後のアミノ酸を示している。左側の数字は、分子量標準の大きさを示している。右側の矢印は、ＧＤＦ−１を表わすバンドの位置を示す。

図１Ｏは、脳ｃＤＮＡライブラリーから単離されたクローンの模式的表現を示す。（Ａ）オリゴｄＴ−プライマ付け、および無作為ヘキサヌクレオチドプライマ付けされたネズミ脳ｃＤＮＡライブラリーを、ＲＮａｓｅＨ法［Ｏｋａｙａｍａ　ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　２　：　１６１　（１９８２）　：　Ｇｕｂｌｅｒら、Ｇｅｎｅ２５　：　２６３　（１９８３）コを使用してラムダＺＡＰＩ［ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅおよびＡｍｅｒｓｈａｍにより各々提供される指示に従って調製した。０．７百万（ライブラリｌ）および２百万（ライブラリ２）の組換えファージからなる２種の別個のオリゴｄＴプライマ付はライブラリ、ならびに１゜３百万（ライブラリ３）の組換えファージからなる無作為プライマ付はライブラリを、１ライブラリあたり２μｇの２度ポリＡにより選択された成体脳ｍＲＮＡから得た。ライブラリｌは、スクリーニング前に１度増幅し、その一方、ライブラリ２および３は、増幅せずにスクリーニングにかけられた。ハイブリダイゼーションを、１Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、および１０Ｘデンハルト中にて、６５°Ｃで行なった。最終の洗浄を、ｏ、５ｘｓｓｃ中で６８℃にて行なった。

（Ｂ）　ヒト成人小脳およびヒト胎児脳（１７−１８週の流産）のｃＤＮＡを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手した。ハイブリダイゼーションを、最終の洗浄か２ＸＳＳＣ中で６５°Ｃにて行なわれた点を除いて図１０（Ａ）についてと同様に行なった。スケール上側の数字はｋｂを表わしている。ＵＯＧ−１およびＧＤＦ−１の開いた読取り枠の位置は、それぞれ実線および点線の箱により示した。

すべてのクローンは、両末端の配列の決定により配向させ、整列させである。

図１１は、ＵＯＧ−１およびＧＤＦ−１をコードするネズミおよびヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。

ネズミ（Ａ）およびヒト（Ｂ）ｃＤＮＡクローンの両者のＤＮＡ配列を、ジデオキシ鎖停止法［Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　７４　：　５４６３　（１９７７）　コ　をにより、エキソヌクレアーゼＤＩ／Ｓ　１ヌクレア一ゼ手法［Ｈｅｎ１ｋｎｆｆ、Ｇｅｎｅ　２８　：　３５１　（１９８４）　］を使用して決定した。

完全配列を収集するために配列決定された特定のクローンとして示されたものは、下記の例に記述されている。数字は、５′末端に対するヌクレオチドの位置を示している。ＵＯＧ−１およびＧＤＦ−１の演鐸されるアミノ酸配列か下に示されている。

図１２は、ｍＵＯＧ　ｌのハイドロパシシティ（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）の概要を示す。平均疎水性値を、Ｊ。

ＫｙｔｅおよびＲ，Ｆ、ＤｏｏｌｊｔｔｌｅのＪ、Ｍｏ１．Ｂｊｏｌ、ｌ　５７　：　ｌ　０５（１９８２）の方法を用いて計算した。正の数は、疎水性の増大を表わす。

図１３は、ネズミおよびヒト配列の整列を示す。

ｍＧＤＧ−とｈＧＤＦ−１（Ａ）、またはｍＵＯＧ−１とｈＵＯＧ−１（Ｂ）の整列は、５ＥＱＨＰ局所相同性プログラムを使用して実行した。数字は、各蛋白質のＮ−末端に対するアミノ酸番号を表わす。ダッシュは、整列を最大化するために導入されたギャップを表わす。ＧＤＦ−１配列中の７個の不変システィンには影を付しである。予想される二塩基性開裂部位を箱で囲んだ。

ｍＧＤＦ−１配列の１４５位の箱は、ＧＤＦ−１ａ（システィンまたはＧＤＦ− １ｂ（セリン）についてのこの位置の選択的アミノ酸を示す。（Ｃ）ネズミおよびヒトヌクレオチド配列のＤＩＡＣＯＮプロットを、２ｏのウィンドウおよび１４の厳密性によって実行した。ＵＯＧ−１およびＧＤＦ−１の開かれた読取り枠の位置は、それぞれ実線および点線によって示されている。数字は、ヌクレオチド位置を１０００単位で示している。

図１４は、ＧＤＦ−１のゲノムのサザン分析を示している。ＢＮＬ細胞（ネズミ）またはＢ　ｅ　Ｗ　ｏ細胞（ヒト）から単離された１０マイクログラムのゲノムＤＮＡを、ＨｉｎｄＩ［（Ｈ）　、ＢａｍＨＩ　（Ｂ）またはＥｃｏＲＩ（Ｒ）により消化し、１％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、図１Ｏの要約に記述したように全ネズミまたはヒトＧＤＦ−１のコード配列を用いてプローブにかけた。相同的種由来のプローブとハイブリッドしたフィルタを、０．２ＸＳＳＣ中で６８°Ｃにて洗浄し、一方、ｍＧＤＦ−１を用いてプローブにかけたヒトＤＮＡを含むフィルタを、ＺＸＳＳＣ中で６８℃にて洗浄した。左側の数字は、標準品の大きさをｋｂにて示している。

発明の詳細な記述本発明は、トランスフす−ミング成長因子βの上杆の構成物であるＧＤＦ−１の全（または固有な部分）をコードするＤＮＡ分節に関する。本発明は更に、コードされる蛋白質（またはポリペプチド）ならびにその対立遺伝子および種変異に関する。ここで使用される“固有な部分”は、少なくとも５個（もしくは６個）のアミノ酸、または対応して、少なくとも１５個（もしくは１８個）のヌクレオチドを含む。更に本発明は、上記ＤＮＡ分節を含む組換えＤＮＡ分子、およびそれにより形質転換された宿主細胞に関する。

特に、本発明は、図２に与えられる全アミノ酸配列をコードするＤＮＡ分節に関する（図２に与えられる特定のＤＮＡ分節は、単にそのような一例である）。本発明に関するＤＮＡ分節は、例えば図２のアミノ酸配列の対立遺伝子変異および機能的同等物を含めて、図２に示されるものと実質的に同じ蛋白質をコードするものも含んでいる。更に、本発明は、図２に示される配列と実質的に同等なりＮＡ分節に関する。“実質的に同等な″配列は、その相補体か、図２の配列に６８ ℃にてＩＭＮａＣＩ！てハイブリッドし、かつ６８℃にて０．１×食塩水／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を用いた洗浄に付した場合に結合か保たれるものである（注：２０ＸＳＳＣ＝３Ｍ塩化ナトリウム１０．３Ｍクエン酸ナトリウム）。

また、本発明は、そのようなりＮＡ分節に相補的なヌクレオチド断片に関する。

該ＤＮＡ分節の固有の部分、または相補的断片は、ＤＮＡ　（またはＲＮＡ）試料中の各相補鎖の存在を検出するためのプローブとして使用され得る。

更に本発明は、通常、非共存的に結合している蛋白質を実質的に含まないＧＤＦ −１、またはその蛋白質の固有なペプチド断片に関する。当業者は、蛋白質精製の標準的方法を用いてＧＤＦ−１を精製し得る。該ＧＤＦ−１蛋白質（またはその機能的に同等な変異体）、またはそのペプチド断片は、本発明に係るものであって、既知の方法を使用して化学的に合成されたものも含む。当業者は、ＧＤＦ −１遺伝子の多重複写物か存在し得ることを認識するであろう。コードされる蛋白質の各々は、図２の蛋白質に類似するか、または同等な機能をするであろう。

従って、ＧＤＦ−１なる用語をこれらの形態にも適用する。

ＧＤＦ−１は、潜在的なＮ−結合グリコシル化部位を有している。従って、当業者は、必要以上の実験を要せずに標準的方法論を使用してＧＤＦ−１蛋白質から天然のグリコジル基を、修飾し、部分的に除去し、または完全に除去することができる。従って、本発明の蛋白質およびペプチドは、グリコジル化されていてもグリコジル化されていなくともよい。

本発明は、組換え的に産生される、図２に与えられたアミノ酸配列を有するＧＤＦ−１または対立遺伝子、または機能的に同等な変異に関するものである。教祖換え的に産生される蛋白質は、グリコジル化されていなくともグリコジル化されていてもよい（グリコジル化のパターンは、天然に産生される蛋白質と異なっていてもよい）。更に、本発明は、組換え的に産生されるＧＤＦ−１の固有なペプチド断片に関する。

本発明は、組換えＤＮＡ分子およびそれにより形質転換される宿主細胞にも関する。この技術分野で周知の標準的方法論を使用して、ベクターおよびＧＤＦ−１またはその固有部分をコードするＤＮＡ分節を含む組換えＤＮＡ分子は、構築され得る。本発明において使用するために適したベクターは、限定されるものではないが、昆虫細胞中で発現するためのバキュロウィルス−誘導ベクター［Ｐｅｎｎｏｃｋ　ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　４　：　３９９−４０６（１９８４）］、細菌中にて発現するためのＴ７−基礎発現ベクター［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ　５６　：　ｌ　２５−１３５（１９８７）］および哺乳類細胞中で発現するためのｐ　Ｍ　Ｓ　Ｘ　Ｎ　Ｄ発現ベクター［ＬｅｅおよびＮａｔｈａｎｓ、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３　：　３５２１−３５２７　（１９８８）］を含む。該ＤＮＡ分節は、ベクター中に例えばプロモータ（例えばポリヘトリン、Ｔ７またはメタロチオネインＩ（Ｍｔ−Ｉ）プロモータ）機能可能に連結されて存在し得る。教祖換えＤＮＡ分子は、原核性または真核性細胞の形質転換に好適である。

本発明の組換えＤＮＡ分子は、当業者により該技術分野で周知の方法を用いて適切な宿主細胞中に導入され得る。適切な宿主細胞は、細菌等の原核細胞、酵母等の下等真核細胞、哺乳類細胞および昆虫細胞等の高等真核細胞を含む。

本発明の蛋白質および固有ペプチドは、該技術分野で知られた方法を使用してＧＤＦ−１特異的抗体を創生ずるための抗原として信用することができる。従って、本発明は、モノクローナルおよびポリクローナルＧＤＦ−■特異的抗体にも関連する。

ＴＧＦ−β上科は、広範囲の分化過程に影響を与える蛋白質群を包含する。ＧＤＦ−１と公知のＴＧＦ−β上科の構成物との間の構造的相同性、および胚生成時のＧＤＦ−１の発現パターンは、ＧＤＦ−１が成長および分化因子のこの科の新規な構成物であることを示している。

この上杆の他の構成物の既知の性質に基づいて、ＧＤＦ−１は、臨床的舞台において診断および／または治療的利益をもたらす生物学的性質を存するものと期待される。

例えば、診断手段としてのＧＤＦ−１の有力な用途は、通常ＧＤＦ−１を発現する細胞型から生じる腫瘍の存在についての特異的マーカとしての用途である。そのようなマーカの入手可能性は、未知の原因の一次的または転移性新生物を同定するため、あるいは特定の治療方法に対する同定された新生物の応答を監視するために貴重である。これに関して、この上杆の一構成物、すなわちインヒビンは、ある種の卵巣腫瘍に対するマーカとして有用であることが示されている［　Ｌａｐｐｏｈｎら、Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ。

Ｍｅｄ、３２１ニア９０　（１９８９）］。

ＧＤＦ−１に関する第２の有力な診断的用途は、起こり得る先天的欠陥についての出生前スクリーニングにおける発生学的異常の存在に対する指示薬としてのものである。例えば、血清または羊膜水の異常に高いＧＤＦ−ｌレベルは、発達中の胎児における構造的欠陥の存在を示すものであり得る。実際に、他の胚性マーカであるアルファフェト蛋白質は、現在、神経管欠陥の出生前スクリーニングにおいて常用されている［ＨａｄｄｏｗおよびＭａｃｒｉ、ＪＡＭＡ　２４２：５１５　（１９７９）］、逆に言えば、異常に低いＧＤＦ−ルベルは、正常にはＧＤＦ−■を発現する組織に直接に関連する発達の異常の存在を示すであろう。

ＧＤＦ−１に関する第３の有力な診断的用途は、ＧＤＦ−１の発現または機能に直接関連するか、あるいはＧＤＦ−１遺伝子に密接に結びつく遺伝子性疾患の出生前スクリーニングにおける使用である。他の有力な診断的用途は、ＧＤＦ−１の発現および機能に関する更なる特徴付けにおいて明らかになるであろう。

治療道具としてのＧＤＦ−１の有力な用途は、この上杆の他の構成物の既知の生物学的活性によっても示唆される。例えば、これらの蛋白質の数種は、細胞−特異的成長阻害剤として作用することから、ＧＤＦ−１の有力な治療的用途は、通常ＧＤＦ−１に応答性である細胞型から誘導される腫瘍の成長を阻害するための抗腫瘍剤としての使用である。実際、この上杆の一構成物であるミュラー阻害物質は、ヒト卵巣および子宮内膜腫瘍細胞に対し、培養物中での生育［Ｄｏｎａｈｏｅら、５ｃｉｅｎｃｅ　２０５：９１３　（＋９７９）：Ｆｕｌｌｅｒら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、５４　：　ｌ　０５１　（１９８２）　］またはヌードマウス内に移植された場合［Ｄｏｎａｈｏｅら、Ａｎｎ。

Ｓｕｒｇ、１９４　：　４７２　（１９８２）　：　Ｆｕｌｌｅｒら、Ｇｙｎｅｃｏｌ、０ｎｃｏ１．２２　：　１３５　（１９８４）　］のいずれについても細胞毒性であることが示されている。

逆に言えば、ＧＤＦ−１が特定の細胞型に対する成長刺激因子として機能するのであれば、他の潜在的な治療的用途は明らかであろう。例えば、この上杆の一構成物であるアクチビンは、神経細胞生存分子として機能することが示されている［　５ｃｈｕｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ　３４４　：　８６８（１９９０）］。

ＧＤＦ−１が、中枢神経系における特異的発現によって示されているように（下記参照）、同様な活性を有するのであれば、ＧＤＦ−１は、インビトロにおいて最終的移植のためのニューロン培養物の維持のため、またインビボにおいて軸索損傷もしくはニューロンの退行を導く疾患状態でニューロンを救助するために有用であることが示されるであろう。別法として、神経系におけるＧＤＦ−１の標的細胞か、支持細胞である場合に、ＧＤＦ−１は脱髄を導く疾患過程の処置において治療的に有益であることが示されるであろう。

この上杆の多くの構成物は、ＧＤＦ−１を含めて、組織の修復および再成形のために臨床的に有用であろう。

例えば、新たな骨成長を誘導する骨形態発生蛋白質の顕著な能力［Ｕｒｉｓｔ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２０　：　６８０　（１９８３）］は、損傷、手術、または骨粗しよう症等の退行性疾患を原因とする骨欠陥の処置に対する有用性を示唆した。実際、骨形態発生蛋白質は、骨折および他の骨格欠陥の処置において、すでにインビボで試験されている［ＧＩｏｗａｃｋｉら、Ｌａｎｃｅｔｉ　：９５９　（１９８１）　：Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ｃｌ１ｎ、０ｒｔｈｏｐｅｄ、Ｒｅ１ａｔ、Ｒｅｓ、　２２７　：　２６５（１９８８）　；　Ｊｏｈｎｓｏｎ　ら、Ｃｌ１ｎ、　０ｒｔｈｏｐｅｄ、　Ｒｅ１ａｔ、　Ｒｅｓ。

２３０：２５７　（１９８８）］。

ＧＤＦ−１が、診断または治療の道具として使用されるであろう特定の臨床的舞台の決定は、正常な生理学的条件および疾患状態の両者において、ＧＤＦ−１の発現パターンおよび生物学的性質の更なる特徴付けをまたねばならない。この上杆の他の構成物か、臨床的利益のために使用されるであろう広範囲の舞台に基づいて、ＧＤＦ−１および／またはＧＤＦ−１に対する抗体類は、極めて強力な臨床的道具であることか証明されるであろう。

ＧＤＦ−１の潜在的用途は、限定されるものではないが、上述の臨床的舞台の形式を多分含むであろう。更に薬剤の特定の組織または特定の細胞への分配方法が改良された場合には、ＧＤＦ−１のような分子の別の用途も明らかになるであろう。

以下に示す限定を意図するものではない例は、本発明を理解する手段を提供するものである。加えて、例に示されたデータ（特に、例７および８参照）は、脳ｃＤＮＡクローンから誘導されたネズミおよびヒト配列の比較を可能とする。この比較は、２個の重複しない開放された読取り枠の高度な保存性を明らかにしている。一方において、下流側の開いた読取り枠かＧＤＦ−１をコードしており、また上流側の開いた読取り枠は、ＵＯＧ−１と称される複数の推定される膜−拡張領域を含む蛋白質をコードしている。該データは、このｍＲＮＡが２種の異なる蛋白質を与えることを示している。このＵＯＧ−１およびＧＤＦ−１の２重シストロン性の（ｂｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ　）機構は、真核性ｍＲＮＡでは一般的ではない。しかしながら、原核生物の多種シストロン性ｍＲＮＡは、しばしば関連する生物学的機能をはだす蛋白質をコードしている。従って、ＵＯＧ−１およびＧＤＦ−１は、機能的に相互作用するであろう。ＵＯＧ−１における複数の推定される膜走査領域の存在は、それが多分ＧＤＦ−１のレセプタであり得ることを示している。

例以下の技術的解説は、下記の例に関連するものであるすべての胚材料は、ＣＤ− １マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）の無作為のつがいから得られた。マウスは、実験動物の保守管理に関するＮＩＨ基準に従って管理された。膣栓が認められた日を０．５日ｐ、ｃ、とじた。胚を子宮から切除し、胚外膜を取除き、急速冷凍した。全ＲＮＡを、グアニジニウムチオシアネート緩衝溶液にホモジナイズし、該溶解物を塩化セシウム緩衝剤を通して遠心分離することにより調製した［Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｌ　８：５２９４−５２９９　（１９７９）コ。ポリＡ−含有ＲＮＡを、オリゴ−ｄＴセルロースを用いて２回選択することにより得た［Ａｖｉｖ、Ｈ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ６９　：１４０８−１４　１２　（１９７２）　コ　、ｃＤＮＡ　ライブラリーを、ｓｔｒａｔａｇｅｎｅにより提供される指示書に従ってＲＮａ　ｓ　ｅＨ法［Ｏｋａｙａｍａ　ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　２　：１６１−１７０　（１９８２）；およびＧｕｂｌｅｒら、Ｇｅｎｅ２５：２６３ −２６９　（１９８３）］を使用し、ラムダＺＡＰＩＩベクター中に構築した。

組換えプラーク（３゜２百万）を、２μｇの出発ＲＮＡから得た゛。該ライブラリーを、末端かポリヌクレオチドキナーゼで標識さたオリゴヌクレオチド５　” −ＧＣＡＧＣＣＡＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴ−３＝　（アミノ酸配列ＮＭＶＶＥＥＣＧＣに対応する）を用いてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションを、６ＸＳＳＣ，ＩＸＸシンルト溶液、０．０５％ビロリン酸ナトリウム、１００μｇ　／　ｍｌの酵母ｔＲＮＡにおいて５０”Ｃで行なわせた。

フィルターを６ＸＳＳＣ，０，０５％ピロリン酸ナトリウム中で６０°Ｃにて洗浄した。

両鎖のＤＮＡ配列決定を、ジデオキシ鎖停止法［Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４　：　５４６３−５４６７　（１９７７）コにより、エキソヌクレアーゼ１１１／Ｓ　１ヌクレアーゼ技術［Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ　Ｓ、Ｇｅｎｅ　２８　：　３５１−３５９　（１９８４）］を使用して行なった。

ノーサン分析のために、ＲＮＡをホルムアルデヒドゲル上で電気泳動にかけ［Ｌｅｈｒａｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６：４７４３−４７５１　（１９７７）；およびＧｏｌｄｂｅｒｇ。

Ｄ、Ａ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７　：　５７９４−５７９８（１９８０）］、ニトロセルロースに移し、そして５０％ホルムアミド、５ｘｓｓｃ、４Ｘデンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、０．１％ビロリン酸ナトリウム、１００μｇ／ｄサケＤＮＡ中において５０°Ｃでハイブリッドさせた。

サザン分析のために、ＤＮＡを１％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移し、ＩＭＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、１０ｘデンハルト溶液中で、６５°Ｃにてハリブリッドさせた。最終的洗浄は、２ＸＳＳＣ中にて６８℃で行なった。

インビトロ翻訳実験：完全長の１３８７ｂｐ　ＧＤＦ−１ｃＤＮＡまたは最初の２５１個のヌクレオチドを欠く削除型変異体をブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブクローン化し、センスまたはアンチセンスＲＮＡを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅにより記述されるようにｃａｐ類似体の存在下にＴ３またはＴ７ブロモータ［Ｇｏｌｏｍｂら、Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、２１　：　７４３−７５２　（１９７７）；およびＭｃＡＩＩｉｓｔｅｒら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、８　：　４８２１−４８３７（１９８０）］からイイントロで転写した。インビトロ翻訳は、０．５μｇＲＮＡ、１７．５μ！ウサギ赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２０℃Ｍ非標識アミノ酸混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２０μＣｉ　［”Ｓコメチオニン（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）を、１０当量のイヌ膵臓ミクロソーム（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下または非存在下で、３０”Ｃにて６０分間インキュベートすることにより行なわれた。エンドグリコシダーゼ消化は、翻訳反応物の１：３０の希釈を１００ｍＭ酢酸ナトｌＪウムｐＨ５，５，０，１％ｓＤＳ、１７ｍＵ／ｍｔ’ のエンドグリコシダーゼＨ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行なうことにより実施された。プロテアーゼ消化は、翻訳反応物の１：２０の希釈を０．１％トライトンＸ−１００の存在下または不在下で、Ｐ　Ｂ　Ｓ、１　■／ｍｌ　トリプシン（Ｂｏｅｈｒｉｒ＋ｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行なうことにより実施された。すべての消化は、３７°Ｃにて３時間で行なわれた。翻訳生成物は、１０％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動［Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ２２７　；　６８０−６８５　（１９７０）］、および引続いて増感による螢光分析（ＮｅｗＥｉｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）によって行なわれた。

興↓ ＧＤＧ−１のクローニングおよびヌクレオチド配列マウスの胚発生に重要であろうＴＧＦ−β上科の新たな構成物を同定するために、ｃＤＮＡライブラリーを、８．５日ｐ、ｃ、にて単離した全胚由来のポリＡ選択ＲＮＡを使用してラムダＺａｐＩ［中に構築した。上記したように、ライブラリーを、玉料の構成物間の保存的領域の推定アミノ酸配列に基ついて選択されたオリゴヌクレオチドを用いてスクリーニングした。スクリーニングした６００．０００の組換えファージ中、該オリゴヌクレオチドは３個のクローンとハイブリダイズした。配列分析は、３個のｃＤＮＡクローンが、ＧＤＦ−１と称される同じ遺伝子から誘導されるｍＲＮＡを代表するであろうことを明らかにした。

ＧＤＦ−１プローブを使用する８、５日令胚性のＲＮＡのノーサン分析は、長さ約１．４ｋｂの単一な主なｍＲＮＡ種を検出した（図１）。元々の３個のｃＤＮＡ単離物は、すべて１．４ｋｂより小さいものであったので、最も長いクローンの部分を、完全長クローンを単離するためのライブラリーの再スクリーニングを使用した。ハイブリッドする組換えファージは、約２゜ｏ、ｏｏｏ個に１個の頻度でみられた。

ＧＤＦ−１をコードする得られた最長のｃＤＮＡクローンの全ヌクレオチド配列を、図２に示す。１３８７ｂｐの配列は、２１７位のヌクレオチドの開始ＡＴＧから始まり、潜在的に３５７個のアミノ酸を育し分子量３８．６００をもった蛋白質をコードする。単一の長い開いた読取枠を含む。推定される開始ＡＴＧの上流には、２個の枠内の停止コドンがあるが、付加的ＡＴＧはない。

１２５９から１２８５位までのヌクレオチドは、元のスクリーニングのために選択されたオリゴヌクレオチドの相補体と２５／２７の合致を示した。該クローンの３′末端は、正統のＡＡＵＡＡＡポリアデニル化シグナルを含まない。４個の別個のｃＤＮＡクローン（すべて、５′末端において異なる）３′末端の配列分析は、２個のクローンか同一のヌクレオチドで終り、また池の２個のクローンが、７個のヌクレオチド分、更に下流側の部位で終わることを示した（これらのクローンは、３′末端に付加的なＡＡＡＡＡＴＴ配列を含んでいた）。

このスクリーニング過程で単離された２個のｃＤＮＡクローンは、それらの配列中に図２に示したものとは異なる僅かな変異を示した。ヌクレオチド配列が決定された限定された分節において、これらの２個のクローンは、各々２個のヌクレオチド変化を示し、１個は、１４５位アミノ酸においてシスティンからセリンへの置換を生じ、第２のものはアミノ酸配列を変えない第３番目の位置の変化を示した。これらの差異は、それらが独立して単離されたクローン中に見出されることから、クローニングの人工産物とは思われない。これらの変化は、対立遺伝子的差異であることを示すか、あるいは複数のＧＤＦ−■遺伝子の存在を示すのであろう。

予想されるアミノ酸配列は、ＴＧＦ−β上科の新たな構成物としてＧＤＦ−１を同定した。Ｃ末端の１２２個のアミノ酸と、この科の別の構成物のものとの比較を、図３ａに示す。予想されるＧＤＦ−１配列は、特徴的な間隔をもった７個のシスティン残基を含め、他の科構成物に存在するすべての不変的アミノ酸、ならびに他の多くの高度に保存的なアミノ酸を含んでいる。加うるに、他の科構成物と同様に、予想されるＧＤＦ−１ポリペプチドのＣ末端部分は、２３６−２３７位の潜在的に蛋白質分解的に処理される部位を表わす１対のアルギニン残基により先行される。

図３ｂは、第１の保存的システィンから始まりＣ−末端に延びる領域における、ＴＧＦ−β科の他の構成物とＧＤＦ−１との間の同一残基の百分率の図表化を示す。

ＧＤＦ−１は、Ｖｇ−１に対して最も相同的（５２％）であり、インヒビンーα （２２％）およびＴＧＦ−β類（２６−３０％）に対して最も低い相同性を有する。２つの理由は、ＧＤＦ−１がＶｇ−１のネズミの相同体ではないことを示している。第１には、ＧＤＦ−１はＶｇｒ−１（５９％）　、ＢＭＰ−２ａ　（５９％）およびＢＭＰ−２ｂ　（５７％）よりも低い相同性をＶｇ−１に対して示している。第２には、ＧＤＦ−１はＣ−末端以外ではＶｇ−１に対して拡張される相同性を示さず、また、この科の他の構成物は、蛋白質の全長にわたって種の間で高度に保存的であることが知られている［Ｃａｔｅら、Ｃｅ１ｌ　４５　：　６８５−６９８　（１９８６）　；Ｍａｓｏｎ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１８　：　６５９−６６３　（１９８５）　；Ｆｏｒａｇｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　８３　：　３０９１−３０９５　（１９８６）　；Ｄｅｒｙｎｃｋ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１６　；　７０１−７０５　（１９８５）　；Ｍａｓｏｎ　ら、Ｂｉｏｃｈｅｏ＋。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、１３５　：　９５７−９６４　（１９８６）；およびＤｅｒｙｎｃｋら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ＋、　２６１　：　４３７７−４３７９　（１９８６）コ。しかしながら、ＧＤＦ−１とＶｇ−１とは、図３０に示されるようにＮ−末端から推定される２塩基開裂部位までの限られた相同性の２つの領域を共有している。

例２ＧＤＦ−Ｉ　ＲＮＡのインビトロ翻訳予想されるＧＤＦ−１配列は、潜在的にシグナル配列を提示するＮ−末端の疎水性アミノ酸の核の存在、および潜在的なアミノ酸１９１位のＮ−グリコジル化部位の存在について、特筆されるべきである。これらの配列が機能可能であることを決定し、また翻訳か予想されるように最初のＡＴＧから始まることを確認するために、インビトロ翻訳実験を、ウサギ赤血球溶解物を使用して行なった。

図４（レーン２）に示されるように、転写され、インビトロにてキャップされた完全長センスＧＤＦ−ｌＲＮＡの翻訳は、分子量３９．５Ｋを有する主な蛋白質種を生じ、これは最も上流のＡＴＧから始まる翻訳生成物に対する予想される分子量３８．６Ｋによく一致し、またアンチセンスＧＤＦ−’Ｉ　ＲＮＡ　（レーン１）の翻訳によっては、そのようなバンドはみられなかった。

最も上流のＡＴＧにおける翻訳開始を支持するものは、最初のＡＴＧコドンを通り過ぎて延びる５゛末端の削除を含む出発ＤＮＡテンプレートによるもので、若干短い翻訳生成物を生じ（レーン４）、この場合の翻訳が、次のＡＴＧコドン（ヌクレオチド３０５）から開始されたことを示している。完全長ＧＤＦ−１をイヌ膵臓ミクロソームの存在下で翻訳した場合は、翻訳生成物のいくつかは、完全長生成物（レーン３）より遅く帰巣する。このより遅（帰巣する種（４１Ｋ）は、エンドグリコシダーゼＨを用いた処理によって、３８Ｋに変換され得（レーン７）、４１におよび３８にの種がシグナルペプチドを欠いたＧＤＦ−１蛋白質のグリコジル化および非グリコジル化形態をそれぞれ示すことと一致する。更に、４１に種は（処理されない３９．５に種と異なって）、洗浄剤の不在下（レーン９）でトリプシン処理に対して抵抗性であるが、存在下（レーン３）では抵抗性でなく、４１に種がそのミクロソーム内に存在することによって切断から保護されることを示唆している。

対照的に、シグナル配列を欠く削除テンプレート由来の翻訳蛋白質を用いて行なった並行する実験は、ミクロソーム存在時の高分子量の種への移項（レーン５）およびトリプシン分解に対する保護を示さなかった。合わせて考えると、これらのデータは、ＧＤＦ−１がこの上杆の他の多くの構成物と同様に分泌されるグリコプロティンであることを示している。

例３サザンプロット分析ＧＤＦ−１か単一複写物遺伝子であることを決定すべく、上述したようなマウスゲノムＤＮＡを使用してサザンプロット分析を行なった。図５に示されるように、ＧＤＦ−１プローブは、マウスＤＮＡの３個の異なる消化物において単一の主要バンドを検出した。しかしなから高い厳密条件においても、弱くハイブリツドする付加的バンドか検出された。これらの劣性のバンドは、これらのバンドの多くか主要バンドより小さく、またこれらの劣性バンドか主要バンドに相対的に、洗浄条件の厳密度を低減するに従って増強されることから、部分消化物を表すものとは思われない。

サザンプロット分析を、他の種から単離されたＤＮＡにも広げて実施した。高い厳密条件においても、ＧＤＦ−１プローブは、ハムスターおよびヒトＤＮＡの両者において（図５）、単一の主要バンドを検出し、ＧＤＦ−１が種にまたがって保存的であることが示された。更に、マウスＤＮＡを用いて示されたように、付加的な劣性ノくンドが比較的高い厳密条件においてヒトおよびハムスターＤＮＡの両者で検出された。

匹」ＧＤＦ−１の発現胚発生の間のＧＤＦ−１の発現の時間的パターンを決定するために、８，５．９．５．１Ｏ０５，１２，５，１４，５，１６，５および１８．５日令で単離された全胚由来のポリＡ−選択ＲＮＡを使用してノーサン分析を行なった。該ＧＤＦ −１プローブは、異なる発現パターンを示す２種のｍＲＮＡ種を検出した。長さ１．４ｋｂの１種のｍＲＮＡ種は、８．５および９．５日令の胚において検出されたが、後の段階の胚では検出されなかつた。第２のｍＲＮＡ種は長さ３．０ｋｂを存し、９．５日令で現れ、胚発生を通して存続した。１．４ｋｂ種は、これのみが８．５日令においては検出され得ることから、図２に示されるＧＤＦ−１ｃＤＮＡ配列に対応するものと思われる。

種々の成体組織から調製されたポリへ−選択ＲＮＡを使用してノーサン分析も行なわれた。図７に示されるように、ＧＤＦ−１プローブは、はとんど独占的に脳で発現される３、０ｋｂ　ｍＲＮＡ種を検出した。検出可能な水準であるが、官憲に低いものが副腎皮質、卵巣、および卵管で見られた。１．４ｋｂに対応するノくンドは、これらの成体組織のいずれにも見られなかった。脳における３、Ｏｋｂ　ｍＲＮＡの発現を更に分析するために、ポリへ−選択ＲＮＡを、発生の種々の段階で単離された脳、ならびに成体中枢神経系の種々の側区画から調製した。図８に示されるように、ＧＤＦ−１プローブは、胚性および新生児の脳中に、脳の分化と共に漸次増大する水準をもって３．Ｏｋｂ　ｍＲＮＡを検出した。更に、３、Ｏｋｂ　ｍＲＮＡは、を髄、小脳、および脳幹にも高水準で存在し、３．Ｏｋｂ種の発現が中枢神経系に広範囲に広がるであろうことが示唆される。対照的に、１．４ｋｂ　ｍＲＮＡ種は、これらの試料のいずれにも検出されなかった。

要約すれば、ＧＤＦ−１プローブは、異なる発現ノくターンを示す２種類のｍＲＮＡ種を同定した。図２に示されるｃＤＮＡ配列に対応する１、４ｋｂ種は、８．５日令および９．５日令の胚に検出されたが、後の段階の胚または試験したいずれの成体組織にも検出されなかった。

３、Ｏｋｂ種は、９．５日令で出現し、胚発生を通じて継続し、また成体動物の中枢神経系にほとんど独占的に存在した。該３．０ｋｂおよび１．４ｋｂ種は、２種の異なる遺伝子から誘導されるか、あるいはそれらは、ＧＤＦ−１遺伝子から誘導され、交互的に開始または処理される転写物を表すものであり得る。

例５ＧＤＦ−１に対する抗血清の調製ＧＤＦ−１に対する抗体類は、ＧＤＦ−１を蛋白質の水準で特徴付けるために使用され得る。この目的のために、ＧＤＦ−１蛋白質の種々の部分を、Ｆ、　Ｗ、　５ｔｕｄｉｅｒ博士より提供を受けたＴ７−基礎発現ベクターを使用して、細菌中で過剰産生させた（図９）。ＧＤＦ−１前駆体は、Ｃ−末端から約１２０アミノ酸で開裂されるものと思われることから、これらの過剰産生された蛋白質のうち数種は、成熟Ｃ−末端断片ならびに推定されるブロー領域に対する抗体類を得るための免疫原として使用され得る。

特に、アミノ酸１３位−２１７位（ブロー領域に完全に含まれる）またはアミノ酸２５４位−３５７位（成熟Ｃ−末端断片に完全に含まれる）に伸びるＧＤＦ− １断片、ならびにアミノ酸１３位−３５７位に伸びる過剰産生される蛋白質を、調製用ＳＤＳポリアクリルアミドゲルから切出し、ウサギを免疫するために使用し得る。各ブーストに続いてこれらのウサギから得られた血清は、過剰産生プラスミドを保有する細菌から調製された抽出物のウェスタンプロット分析法［Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１２　：　１９５−２０３　（１９８１）　］によって試験され得る。この分析は、細菌的に産生された免疫原を認識する抗体の産生の有無を明らかにし得る。動物は、このアッセイにより検出されるような存意な正の反応か達成されるまでブーストを受けてよい。これらの抗体か、非変性ＧＤＦ−１をも認識するか否かを測定するために、完全長ｃＤＮＡから誘導されたセンスＲＮＡを転写しくブルースクリプトベクター中のサブクローンのＴ３またはＴ７ブロモータから）、キャップし、そして［”Ｓ］メチオニンの存在下でインビトロにて翻訳され得る。次いで、抗血清が、これらの翻訳生成物を免疫沈殿させる能力について試験され得る。

例６哺乳動物からのＧＤＦ−１の精製生物学的活性をアッセイすべくＧＤＦ−１を得るために、クローン化ｃＤＮＡを用いて該蛋白質を過剰産生させることができる。この１科の構成物のブロー領域は、活性ジスルフィド結合２量体の適切な組立てのために必要であると思われ、また適切な組立ておよび切断は細菌内では起こらないであろうため、ＧＤＦ−１を過剰産生ずる哺乳動物細胞系が構築され得る。この目的のため、ＧＤＦ−１は、ｐＭＳＸＮＤ発現ベクター［ＬｅｅおよびＮａｔｈａｎｓｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６３　：　３５２１−３５２７　（１９８８）］を使用してモルモットの卵細胞内で発現され得る。このベクターは、Ｍｔ−１プロモータ、固有のＸｈｏｌクローニング部位、ＳＶ４０から誘導されるスプライスおよびポリアデニル化シグナル、Ｇ４１８に対する選択マーカ、ならびにＳＶ４０初期プロモータの制御下にあるネズミジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を含む。３ ′非翻訳領域内の旧ｎｄＩ［Ｉ部位で切断されるＧＤＦ−１ｃＤＮＡが、ＭＴ− １プロモータの下流側にクローン化される。固有のＰｖｕ　Ｉ部位で線状化されて（この非必須領域における統合を増大させるため）得られた構築物を、リン酸カルシウム法を使用してＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした［ＦｒｏｓｔおよびＷｉｌｌｉａｍｓ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　９１　：　３９−５０　（１９７８）　；Ｖａｎｄｅｒ　ＥｂおよびＧｒａｈａｍ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５　：　８２６−８３９　（１９８０）］。０４１８−耐性クローンは、ｄｈｆｒ遺伝子を増幅する細胞を選択するためのメソトレキセートの存在下で成育てき、この工程において隣接するＧＤＦ−１遺伝子を、同時に増幅する。このベクターおよび増幅スキームは、過去に、７個の１５０ｃｎｆ組織培養フラスコ中で１■の所望の蛋白質を産生ずる細胞系を構築するために使用された［ＬｅｅおよびＮａｔｈａｎｓ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２６３　：　３５２１−３５２７　（１９８８）］、更に、ＣＨＯ細胞は完全に蛋白質非含有培地中で維持可能であるから［ＨａｍｉｌｔｏｎおよびＨａｍ、ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、１３　：　５３７−５４７　（１９７７）コ、所望の分泌された蛋白質は、培地中の全蛋白質の１０％を示した。このベクターは、この方法で所望の蛋白質を過剰産生させた他の多くの研究者にも入手可能であった［例えば、Ｃｏ１ｏｓｉら、Ｍｏｌ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、２　：　５７９−５８６　（＋　９８８　）参照］。

インビトロ翻訳実験の結果、および科の他の構成物の既知の性質に基づくと、ＧＤＦ−１蛋白質は培地中に分泌されるものと思われる。このことは、ウェスタン分析により過剰産生細胞の条件培地中のＧＤＦ−１の存在を示すことにより証明され得る。完全長ＧＤＦ−１蛋白質が切断されて成熟Ｃ−末端断片が生成するものと思われ、実際に同様にＣＨＯ細胞中で過剰産生されるＢＭＰ−２ａの場合にこのような過程が観察されている［Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ４．０ＳＡ　８７　：　２２２０−２２２４（１９９０）］。ＧＤＦ−１の切断が過剰産生細胞中で起こるか否かについては、Ｃ−末端領域に対する抗体と反応するが、ブロー領域に対する抗体とは反応しない、Ｃ−末端断片に対して予想される大きさの蛋白質の存在を探索（ウェスタン分析より）することによって評価し得る。

成熟ＧＤＦ−１蛋白質は、産生細胞系の条件培地から、標準的蛋白質分離技術を使用して精製され得る。適切な精製スキームは、教科の他の構成物の既知の物理的性質の優位点を用いて経験的に決定され得る。例えば、これらの蛋白質のあるものは、ヘパリンに対して高い親和性を存することが知られている［Ｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２　：　７２１７−７２２１　（１９８５）　；Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８７　：　２２２０−２２２４（１９９０）］。最終スキームは、イオン交換クロマトグラフィ工程、ゲル濾過工程、および逆相ＨＰＬＣ工程を含むことができる。精製の各工程は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上でのカラム分画の電気泳動およびウェスタン分析によるＧＤＦ−１含有分画の特定により監視され得る。各工程での純度は、全蛋白質の銀染色により評価し得る［Ｍｏｒｒｉｓｓｙ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ、　１１７　：　３０７（１９８１）］。精製蛋白質を、Ｎ−末端アミノ酸配列決定に付して、該精製蛋白質がＧＤＦ−１であることを立証し、また前駆体から切断される部位を正確に位置決定することができる。

例７３．０ｋｂ　ＧＤＦ−１転写物のクローニングおよびヌクレオチド配列３．０ｋｂバンドか、ＧＤＦ−１遺伝子から誘導される別の転写物であるか、またはＧＤＦ−１に相同的な異なる遺伝子から誘導される転写物を示すものであるかを決定するために、数種のｃＤＮＡライブラリーをポリ八で選択された成体マウス脳のｍＲＮＡから構築し、１．４ｋｂのＧＤＦ−１プローブを用いてスクリーニングを行なった。２種の別個のオリゴ−ｄｔプライマ付けｃＤＮＡライブラリのそれぞれからスクリーニングした約百万の組換えファージから、高い厳密度においてＧＤＦ−１プローブとハイブリダイズする単一のクローン（ｍＢｒ−１）を単離した。７個のハイブリダイズするクローン（ｍＢｒ−２からｍＢ　ｒ　 −８）を、無作為プライマ付けｃＤＮＡライブラリからの０．６百万個の組換えファージのスクリーニングにより得た。追加の０゜７百万個の無作為プライマ付けｃＤＮＡライブラリー由来の組換えファージを、クローンｍＢｒ−７の５゛部分から誘導されたプローブを用いてスクリーニングし、クローンｍＢｒ−９からｍＢｒ−１４を得た。クローンの末端の部分ヌクレオチド配列分析に基づくと、これらの１４個のクローンは、２，７ｋｂに広がる領域内に整列され得る（図１０８）ＯクローンｍＢｒ−１，ｍＢｒ−２およびｍＢｒ−７の全ヌクレオチド配列の決定により得られた完全な２．７ｋｂ　ｃＤＮＡ配列は、図１１ａに示されている。配列の比較は、先に報告されている１、４ｋｂ配列が２．７ｋｂ配列に基本的に全部含まれる（ヌクレオチド１３１１から２６８７まで）ことを示した。この領域において、２種の配列は、３個のヌクレオチドの相違を示した。クローンｍＢｒ−２およびｍＢｒ−７から誘導される配列は、８．５日令胚ｃＤＮＡクローンから誘導される配列と比較して、１７２５位にてＴに代えてＣ，１９６０位にてＴに代えてＡ１１９７４位にてＡに代えてＧを含む。これらの差異のうちの２個は、推定されるアミノ酸配列を変えない第３位の変化を示すか、差異のうちの１個は、１４５位のシスティンをセリンに変化させる。単純化のために、１４５位のシスティンに対応する配列をＧＤＦ−１ａと称し、また１４５位のセリンに対応する配列をＧＤＦ−１ｂと称する。ＧＤＦ−１ａおよびＧＤＦ−１ｂの発現がそれらか単離された各々の組織に特異的なものであるかを決定するために、８．５日令胚性ｃＤＮＡライブラリーから単離された５個の別個のクローンおよび成体脳ｃＤＮＡライブラリーから単離された７個の別個のクローンのヌクレオチド配列を、ＧＤＦ−１ａとＧＤＦ−１ｂとて異なるヌクレオチド位置に広がる限られた領域で測定した。該配列分析は、５個の胚性クローンのうち３個かＧＤＦ−１ａに対応し、２個かＧＤＦ−１ｂに対応し、また７個の脳性クローンのうち２個がＧＤＦ−１ａに対応し、５個かＧＤＦ−１ｂに対応することを明らかにした。しかして、ＧＤＦ−１ａおよびＧＤＦ−１ｂの両者は、１．４ｋｂ　ｍＲＮＡ種のみが検出される８゜５日令の胚、ならびに３．０ｋｂ　ｍＲＮＡ種のみが検出される成体の脳の両者にて発現されるものと思われる。

ＧＤＦ−１ａおよびＧＤＦ−１ｂは、対立遺伝子の差または２個の異なる遺伝子を提示し得る。

ＧＤＦ−１コード領域の上流側において、２．７ｋｂ配列は１．４ｋｂ配列中に存在しない付加的な１３１０ｂｐを含み、ＧＤＦ−１の開始コドンの上流側の全１５２７ｂｐを残す。予想できなかったことに、この上流領域中に、７４位のヌクレオチドに始まる推定される開始メチオニンコードから始まり、３５０個のコドンにわたり、ＧＤＦ−１開始ＡＴＧの４０４ヌクレオチド上流で停止する第２番目に長い開始された読取り枠が存在する。

単純化のため、この第２の読取り枠をｍＵＯＧ−１（！ｌ！ｐｓｔｒｅａｍ　ｐｆ　！；！ＤＦ−１）と称する。ｍＵＯＧ−１およびｍＧＤＦ−１の間の領域には複数の停止コドンが存在するため、２つの開いた読取り枠を単一の蛋白質として翻訳するためには、少なくとも４回の枠の移動（ｆｒａｍｅｓｈｉｆ　ｔ）が必要であろう。予想されるｍＵＯＧ−１アミノ酸配列および全上流側ヌクレオチド配列のそれぞれを用いたＮＢＲＦおよびＧｅｎＢａｎｋ配列データベースの検索は、既知配列と有意な相同性がないことを示した。しかしながら、予想されるｍＵＯＧ−１アミノ酸配列の水親和性分析は、膜拡張領域を推定させる疎水性残基の複数の群（少なくとも７個）を示した（図１２）。特に衝撃的なことに、これらの群の最も離れたものであって、これは高度に荷電したＣ−末端領域に続く。

複数の膜−拡張領域を有する他のある種の蛋白質と同様に［例えば、ＮａｔｈａｎＳら、Ｃｅ１ｌ　３４　：　８０７　（１９８３）　ＨＤｉｘｏｎ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３２１　：　７５　（１９８６）参照］、ｍＵＯＧ−１は、明らかなＮ−末端シグナル配列を含まない。

ヒトＧＤＦ−１遺伝子の単離ＧＤＦ−１ｍＲＮＡおよび蛋白質配列中の潜在的に有意な保存領域を探索すべく配列の比較をするために、ヒトＧＤＦ−１をコードするｃＤＮＡを、ネズミＧＤＦ−１プローブを使用して単離した。３個のハイブリダイズするクローン（ｈＢｒ−１からｈＢｒ−３）を、ヒト成人小脳ｃＤＮＡライブラリー（オリゴｄＴ− プライマ付け）由来の０，６百万個の組換えファージのスクリーニングから単離し、また５個のクローン（ｈＢｒ−４からｈＢｒ−８）をヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（オリゴｄＴ／無作為ヘキサヌクレオチド−プライマ付け）由来の１．４百万個の組換えファージから単離した（図１０ｂ）。図１１ｂは、クローンｈＢｒ−５の全ヌクレオチド配列、およびクローンｈＢｒ−６、ｈＢｒ−７およびｈＢｒ−８の５′のほぼ４００ヌクレオチドの決定により得た２５１０ｂｐのヒトｃＤＮＡ配列を示す。３′の半分の配列は、１３４７位のヌクレオチドのＡＴＧコドンから始まり、分子量３８．８５３を有する３７２個のアミノ酸の蛋白質を潜在的にコードする長い開かれた読取り枠を含む。推定されるアミノ酸配列は、ネズミＧＤＦ−１に対して有意な類似性を示す（図１３ａ）。

ネズミＧＤＦ−１配列と同様に、ヒト配列は、アミノ酸２５２−２５３に塩基性残基の対（Ｒ−Ｒ）を含み、これは多分、蛋白分解部位を表わすであろう。推定される切断部位に続き、配列は、ＴＧＦ−β上科のすべての構成物に特徴的な７個のシスティン残基を含むすべての不変な、およびほとんどの高度に保存的なアミノ酸を含む。

ネズミＧＤＦ−１配列およびヒト配列は、第１の保存的システィンから始まりＣ −末端まで延びる領域において８７％同等であり、また蛋白質の全長にわたって６９％同等である。ＴＧＦ−β上科の他の構成物は、種にわたってより高度な配列保存性を示すため［Ｃａｔｅら、Ｃｅ１１４５：６８５　（１９８６）；Ｍａｓｏｎ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１８：６５９　（１９８５）；Ｆｏｒａｇｅら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｊ、、ＵＳＡ８３　：　３０９１　（１９８６）　；　Ｄｅｒｙｎｃｋ　ら、Ｎａｔｕｒｅ３１６　：　７０１　（１９８５）　；Ｍａｓｏｎ　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１３５　：　９５７　（１９８６）　；　Ｄｅｒｙｎｃｋ　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６１　：　４３７７　（１９８６）　；　ｄｅ　Ｍａｒｔｉｎ　ら、ＥＭＢＯＪ、６：３６７３　（１９８７）　：　ｔｅｎ　Ｄｉｊｋｅ　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　８５　：　４７１５　（１９８８）　；　Ｄｅｒｙｎｃｈ　ら、ＥＭＢＯＪ、７　：３７３７　（１９８８）　；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ。

３：１１０８　（１９８９）；１ｂｉｄ、ｐ、１９２６；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　６　：　５０５　（１９９０）　］、ネズミおよびヒト配列が同じ遺伝子を表わすが否が決定するためにゲノムのサザン分析を行なった。図１４に示されるように、ＧＤＦ−１開放読取り枠から誘導されたネズミおよびヒトプローブの両者は、ヒトＤＮＡにおいて同様なパターンについてハイブリッドし、ヒト遺伝子か実際ネズミＧＤＦ−１の相同体であることが示される。

ネズミ配列と同様に、ヒト配列もＧＤＦ−１コ一ド配列の上流領域において３５０個のアミノ酸を潜在的にコードする第２の長い開放読取り枠を含む。この上流側の開放読取枠（ｈＵＯＧ−１）のネズミ配列に存在するものとの整列は、上流側読取り枠が、ｍＵＯＧ−１とｈＵＯＧ−１との間の全体のアミノ酸配列の同等性８１％をもって、ＧＤＦ−１に対するものより更に保存的であることを示した（図１３　ｂ）、ｍＵＯＧ−１およびｈＵＯＧ−１の両者についての開放読取り枠は、推定される開始メチオニンの上流に配列の正に５′末端まで延びるが、２つの理由がこれらか実際の開始コドンであることを示唆している。第１には、３ ′末端から種々の距離において無作為へキサヌクレオチドによりプライマ付けされた複数のｃＤＮＡは、ネズミおよびヒト配列の両者の５′末端に極めて近接して停止する（図１０）。第２には、ネズミおよびヒトのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、推定されるＵＯＧ−１に対する開始コドンの上流で、コード配列自体よりも低い保存性を示す（図１３０）。

ｍＵＯＧ−１およびｈＵＯＧ−１の間、ならびにｍＧＤＦ−１およびｈＧＤＦ− １の間に観察される高度な保存性とは対照的に、介在スペーサ領域および推定される５′および３′非翻訳領域は、ネズミおよびヒト配列間でより低い類似性を示す。２個の開放読取枠の選択的保存性は、ネズミおよびヒトヌクレオチド配列を比較するＤＩＡＧＯＮプロットにおいて最も明確な証拠となる（図１３０）。

２個の配列は、ＵＯＧ−１の停止コドンの直後の介在配列中、およびＧＤＦ−１の停止コドンに続く２個のヌクレオチドの３゛非翻訳領域において異なり始める。更に、ネズミ配列における介在スペーサ領域は、４０１ヌクレオチドの長さであり、一方、ヒト配列の対応する領域は、２６９ヌクレオチドの長さにすぎない。ＵＯＧ−１のアミノ酸配列の保存性も、ＵＯＧ−１開放読取枠に広がるネズミおよびヒト配列の間のヌクレオチド差の非無作為パターンの証拠である。この領域の２０９のヌクレオチド差異のうち、５７は第１位の差、２９は第２位の差、および１２３は第３位の差を示し、１２３の第３位の差異のうち、８９は推定されるアミノ酸配列に差異を生じない。

＊＊＊＊＊上述したすべての刊行物を、ここに参考として取入れる。

上述した発明は、明確化および理解を目的としである程度詳細に記述されているが、この開示を読めば、当業者は、態様および細部における種々の変化が、本発明の実際の範囲から離れることなく可能であることが認識されるであろう。

ＦＩＧ、　１００　ロ　０　０　０　０　ロ　。　０ロ　Ｎ　の　９　０　１．０　（Ｎ　（Ｄ　’ｆ　Ｏ１４）ψ　−−へ　（’１　１”ｌ　ｗ　マ　の　リ　ψハムスター　マウス　ヒトＦＩＧ、９ＦＩＧ、　Ｉ　ｌａ１５６１　ＣＴＣＣＴＣＣ丁ＣＣＴＧＣτＣＴτＧＣＴＧＣＣＣＴＣＧＡＣにＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧfＣ１６２０ＦＩＧ、ｌｌａ　Ｃ０ＮＴ、’ ＦＩＧ、　Ｉ　１ｂＦＩＧ、　ｌ　ｌｂ　Ｃ０ＮＴ、’ 残基ＦＩＧ、１２０　１．０　２・ＯｍＵＯＧ−１ｍＧＤＦ−ＩＦＩＧ、　１３ｃＤＮＡ：　ネズミ　ヒト　ヒトプローブ：　ネズミ　ヒト　ネズミ酵素：　ＨＢＲＨＢＲＨＢＲ国際調査報告フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、ＳＥ）、　ＡＵ、　ＣＡ、ＪＰ

Claims

【特許請求の範囲】

１．哺乳動物ＧＤＦ−１蛋白質、もしくはそれに特異的なエピトープをコードするＤＮＡ分節、または前記ＤＮＡ分節に対して相補的なＤＮＡ分節。
２．前記ＧＤＦ−１蛋白質が、図２、１１Ａまたは１１Ｂに定義される配列を有する請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分節。
３．前記哺乳動物がマウス、ハムスターまたはヒトである請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分節。
４．天然に非共有的に結合する蛋白質、または特異的エピトープを実質的に含有しない哺乳動物ＧＤＦ−１蛋白質。
５．グルコシル化されていない請求の範囲第４項に記載の蛋白質。
６．前記哺乳動物がマウス、ハムスターまたはヒトである請求の範囲第４項に記載の蛋白質。
７．前記蛋白質が化学的に合成される請求の範囲第４項に記載の蛋白質。
８．前記蛋白質が、図２、１１Ａまたは１１Ｂに定義される配列を有するか、あるいはその機能的に同等な変異体である請求の範囲第４項に記載の蛋白質。
９．図２、１１Ａまたは１１Ｂに与えられるアミノ酸配列を有する、組換え的に生成されるＧＤＦ−１蛋白質、またはその機能的に同等な変異体。
１０．前記蛋白質がグリコシル化されていない請求の範囲第９項に記載の蛋白質。
１１．ｉ）請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分節；およびｉｉ）ベクターを含んでなる組換えＤＮＡ分子。
１２．請求の範囲第１１項に記載の組換えＤＮＡ分子により安定に形質転換される宿主細胞。
１３．前記細胞が原核細胞である請求の範囲第１２項に記載の宿主細胞。
１４．前記細胞が真核細胞である請求の範囲第１２項に記載の宿主細胞。
１５．請求の範囲第１２項に記載の宿主細胞を、前記分節が発現され、これにより前記ＧＤＦ−１蛋白質が生成される条件下で培養し、および前記ＧＤＦ−１蛋白質を単離することを含んでなる組換えＧＤＦ−１蛋白質またはその機能的に同等な変異体の製造方法。
１６．哺乳動物ＵＯＧ−１蛋白質、もしくはそれに特異的なエピトープをコードするＤＮＡ分節、または前記ＤＮＡ分節に対して柑補的なＤＮＡ分節。
１７．天然に非共有的に結合する蛋白質、または特異的エピトープを実質的に含有しない哺乳動物ＵＯＧ−１蛋白質。
１８．図１１Ａまたは１２Ａに与えられるアミノ酸配列を有する、組換え的に生成されるＵＯＧ−１蛋白質、またはその機能的に同等な変異体。
１９．ｉ）請求の範囲第１６項に記載のＤＮＡ分節；およびｉｉ）ベクターを含んでなる組換えＤＮＡ分子。
２０．請求の範囲第１９項に記載の組換えＤＮＡ分子により安定に形質転換される宿主細胞。
２１．請求の範囲第２０項に記載の宿主細胞を、前記分節が発現され、これにより前記ＵＯＧ−１蛋白質が生成される条件下で培養し、および前記ＵＯＧ−１蛋白質を単離することを含んでなる組換えＵＯＧ−１蛋白質またはその機能的に同等な変異体の製造方法。