JPH06500567A - サイトカイン型の活性を有するタンパク質、およびこのタンパク質をコード化する組換えｄｎａ、形質転換細胞および微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １８、ＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項１７記載の動物細胞。

１９、ＣＯ３細胞であることを特徴とする請求項１７記載の動物細胞。

２０　酵母細胞であるこを特徴とする請求項１５記載の巨核球。

２１、請求項１４記載の発現ベクターにより形質転換されることを特徴とする、 原核微生物。

２２、エシェリキア・コリ種に属することを特徴とする原核微生物。

２３、請求項１６〜１９のいずれか１項記載の動物細胞の培養、ついで組換タン パク質の分離および精製の工程を含むことを特徴とする請求項１〜７記載のＬＸ ずれか１項記載のタンパク質を製造する方法。

２４、請求項２０記載の酵母細胞を培養、ついで組換タンノくり質の分離および 精製の工程を含むことを特徴とする請求項］、〜７のいずれか１項記載のタンノ くり質の製造方法。

２５、請求項１〜７のいずれか１項記載のタンパク質を含むことを特徴とする医 薬。

明　細　書 サイトカイン型の活性を有するタンパク質、およびこのタンパク質をコード化す る組換えＤＮＡ、形質転換細胞および微生物この発明はサイトカイン型の活性を 有する新規タンパク質、その生産のための遺伝子工学的手段、即ち、組換えＤＮ Ａ、この組換えＤＮＡを保有している発現ベクター、この組換えＤＮＡを含んで いる原核微生物および真核細胞、およびこのタンパク質が有効主薬として存在す る特に免疫調節剤として有用な薬物に関する。

免疫系は、細胞性因子およびこの因子によって分泌されるサイトカインと呼ばれ る可溶性物質からなっていることはよく知られている。サイトカイン類は、生物 体の免疫系、または別の生物学的系の何れかに属するエミッター細胞と標的細胞 間の伝達をつかさどるタンパク質である。一般にサイトカイン類はいわゆる多面 的生物活性を有し、即ち標的細胞に対して、増殖、分化、細胞溶解、活性化、走 化性など多面的な活性を有している。これらの分子のうちの幾つかは、すでに治 療上の応用が見いだされている。例えばインターロイキン−２またはインターフ ェロンαは免疫療法により、ある種の腫瘍の処置に使用され、ＧＣ３Ｆ　（顆粒 球コロニー刺激因子）またはＧＭＣ３Ｆ　（顆粒球・単球コロニー刺激因子）の ような造血因子は、血球の増殖および分化を刺激することによって、化学療法の 結果、血球が減弱した血液を強化することができる。

サイトカインに関する以下の情報は具体的に知られている：１）　それらは、分 泌されたタンパク質に対応する。従って、タンパク質、特にサイトカインの分泌 は、培地への成熟タンパク質の排出に際して、前ペプチド配列またはシグナルペ プチドと称する翻訳されたタンパク質の疎水性アミノ末端領域の切断を含む機構 により頻繁に起こる（ポン、ハイシネ、Ｇ、、１９８６年、二ニークレイツク・ アシッズ・リサーチ、１４巻、４６８３〜４６９ｏ頁）。周知のサイトカインの ペプチドの配列の大部分は、事実シグナルペプチドを含む。

２）　一般に、サイトカインは、他のサイトカイン（Ｋ、マツシマ等、１９８８ 年、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メディスン、１６７巻、１８８３ 〜１８９３頁　−シミズ　Ｈｌ等、１９９０年、モレキュラー・アンド・セルラ ー・バイオケミストリー、１０巻、５６１〜５６８頁　）、またはリポ多糖類、 カルシウムイオノファ、例えば、カリマイシン、ジブチリルサイクリックＡＭＰ 、ジメチルスホキシド、レチレイン酸、コカナバリンＡ１植物凝集素（ＰＨＡ− Ｐ）　、およびフォルボールエステル、例えば、フォルボール−２−ミリステー ト−３−アセテート（ＰＭＡ）のような細胞増殖および分化を活性化する化学試 薬（メゲ　Ｋ、およびトランＳ、　Ｋ、等、１９９０年、サイトカイン２．１〜 ８頁　−Ｃ，Ｂ、ｌ−ムソン等、１９８９年、プロシーディンゲス・ナショナル ・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ、８６巻、１３３３〜１３３７頁）、また は表面抗原ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、およびＣＤ４０のような表面分子に対す る抗体（トムソンＣ，Ｅ、等、上記の引例およびロウセット、Ｆ３等、１９９１ 年１、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メディスン、１７７巻、７０３ 〜７１０頁）のうちのいずれかで誘発され得るタンパク質に該当する。

３）　サイトカインの誘発は一過性であるので、サイトカインメッセンジャーＲ ＮＡは不安定である。大部分のサイトカインにおいて、ＡおよびＵｌ特に、配列 ＡＵＵＡ、カッブト等、１９８６年、プロシーディンゲス・ナショナル・アカデ ミ−・オブ・サイエンシイズ・ニーニスニー、８３Ｌ　１６７０〜１６７４頁； Ｇ、ショー等、１９８６年、セル、４６巻、６５９〜６６７頁およびに、ペブル Ｌ１９９１年、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メディスン、１７３巻 、３４９〜３５５頁により証明されたコンセンサス不安定配列に富む領域を有す るである。

４）　周知のサイトカインの大部分は免疫系の細胞、特に、末梢血の単球および 補助Ｔリンパ球により合成される（ウルマンに、Ｓ、等、１９８９年、＾ｎｎ、 　Ｒｅｖ、　ｌ０Ｉｎ、　、８巻、４２１〜４５２頁、およびカルゲル−バレー スイスにより１９８９年に刊行されたＣ、ソルダ、研究「細胞制御因子由来のマ クロファージ」）。それらの合成は、２）に記載された誘発剤で誘発される。

更に、主にリンパ球および単球を含む末梢血単核細胞からの出発し、培養し、植 物凝集素、ファルボールー２−ミリステート−３−アセチレートおよび抗−ＣＤ ２モノクローナル抗体のような種々の誘発剤を使用して刺激し、動物細胞におい て混存相補性ＤＮＡ配列から取り出し、従ってサイトカインをコード化する相補 性ＤＮＡに富む相補性ＤＮＡライブラリーを構築することが可能であることは周 知である（Ｈ，Ｃ，チェン等、１９８９年、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ イムノロジー、１９巻、１０４５〜１０５１頁、Ｐ、Ｆ、シフエル等、１９８９ 年、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、９巻、１０４１〜１０４ ８頁）。

更に、Ｔリンパ球によるサイトカイン（リンホカインと称する）の製造は優れて いる、従って、フォルボール−２−ミスデリート−３−アセテート単一よりフォ ルボール−２−ミリステート−３−アセテートおよび植物凝集素またはフォルボ ール−２−ミリステート−３−アセテートおよび抗−ＣＤ２８抗体の二元性配合 を用いる刺激で、およびフォルボール−２−ミリステート−３−アセテート、植 物凝集素およびサイトカインメッセンジャーＲＮＡの転写に対して明らかに阻害 効果を有する（トンプソン等、上記の引例、およびマッティラ等、１９９０年、 ＥＭＢＯ・ジャーナル、９巻、４４２５〜４４３３頁）シクロスポリンＡの三元 性配合より、フォルボール−２−ミリステート−３−アセテートおよび植物凝集 素の二元性配合を用いての刺激で多量のメツセンジャーＲＮＡに対応することは 周知である（Ｃ，Ｂ、トンプソン等、１９８９年、プロシーディンゲス・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ、８６巻、１３３３〜１３３７頁およ びリントスタンＴ９等、１９８９年、サイエンス、２４４巻、３３９頁）。

種々の刺激条件下サイトカインメッセンジャーＲＮＡのこの分化発現は、後者の 配列を選択する目的でサイトカインのコード化配列を含む相補性ＤＮＡライブラ リーのスクリーニング（分化スクリーニングと称する）に使用され得る（ドール キシ等、１９８０年、デベロップメンタル・バイオロジー、７６巻、４４９〜４ ６４頁、コクランＢ、Ｍ、等、１９８３年、セル、３３巻、９３９〜９４７頁、 およびシフエルＰ、　Ｆ、等、１９８９年、モレキュラー・アンド・セルラー・ ノくイオロジカル、９巻、１０４１〜１０４８頁）。要するに、ここで刺激状態 １および刺激状態２と称する２種の細胞刺激状態に対応する２種のメツセンジャ ーＲＮＡから出発し、刺激状態２は刺激状態１よりサイトカインのコード化メツ センジャーＲＮＡについてより富むと仮定すると、２種のメツセンジャーＲＮＡ の逆転写酵素を使用して得られた転写物であるプローブ１およびプローブ２と称 する２種の放射性プローブを構築することが可能である。それらの２種のプロー ブは、そのライブラリーの相補性ＤＮＡ配列を含む細菌群で７％イブリダイズさ れる。ハイブリゾ−ジョンがプローブ１よりプローブ２の選択された群（誘発可 能なタンパク質に対応する）の場合により大きいとすると、メツセンジャーＲＮ Ａが２種の活性状態の間で多く変化する相補性ＤＮＡを含む細菌群は、２種のプ ローブで異なるシグナルを与えるであろう。

更に、ＳＶ４０ウィルスのＴ抗原を発現するサル腎臓細胞（グルラマン、Ｙ１、 セル、２３巻、１９８１年、１７５〜１８２頁）であるＣＯ８細胞は、ＳＶ４０ ウイスルＤＮＡの複製の起源、動物細胞の遺伝子の発現の研究における選択の構 成宿主および発現されたタンパク質の分泌物を含むベクターの複製を可能である ことは周知である。これら細胞のタンパク質の分泌物は、それを天然に産生ずる 細胞により分泌されることを示す（Ｈ，Ｃ，チェノ等、１９８９年、ヨーロピア ン・ジャーナル・オブ・イムノロジー、１９巻、１０４５〜１０５１頁およびＷ 。

Ｙ、ウェイセル等、１９８９年、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・ オブ・サイエンシイズ・ニーニスニー、８６巻、７４２２〜７５２６頁）。

本発明の主題は、以下のアミノ酸配列（ａｌ）：Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒ ｏ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　ＴＡｕｌ　５ 　１０ 工ｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＴＡｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ工ｌａ　’！’ｈｒ　Ｇｉｎ 　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　ＬｙｓＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　 Ｓａｒ　Ｍａｔ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ工１ｅＡｓｎ　Ｌａｕ　’ｒｈｒ　Ａ ｌａ　Ｘａａ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　入１ａ　Ａｌａ　Ｌａｕ　ＧｌｕＳａ ｒ　Ｌｅｕ工１ａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｓｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ 工１ｅ　ＧｌｕＬｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇ ｌｙ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｈ１ｓＬｙｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌ ｙ　Ｇｌｎ　Ｐｈｉ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　Ｖａ１Ａｒｇ　Ａｓｐ 　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ工ｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｐｈａ　Ｖａｌ　 ＬｙｓＡｓｐ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌ＠ｕ　Ｈｌｓ　ｋｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌａ ｕ　Ｐｈａん＝ｇ　Ｇｌｕｌｏｏ　１０５ Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈａ　Ａｓｎ （配列中、ＸａａはＡｓｐまたはＧｕｙである）を含むサイトカイン型活性を有 するタンパク質、またはタンパク質の前駆体である、または、配列（ａｌ）と高 い相同性を有する配列を表す。

高い相同性とは、アミノ酸が、ニードルマンおよびランシュ、１９７０年、ジャ ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、４８巻、４４３〜４５３頁の最適 配列法に従って最大相同性に基づいて配列されるとき、アミノ酸配列の少なくと も８０％、および好ましくは少な（とも９０％（アミノ酸の合計数に対する同一 アミノ酸の数）同じである相同性を意味する。

全ての可能な配列を考慮、および同一アミノ酸の最大可能な数を対合し、配列の 穴数は最小であるというアルゴリズム的方法は、特に、ライスコンシン大学のＵ ＷＧＣＧソフトウェア（デベリックス等、１９８４年、ニュークレイツク・アッ シズ・リサーチ、１２巻、８７１１〜８７２２頁　−ＧＡＰオプション）に使用 されている。

１１２種のアミノ酸の配列（ａｌ）のペプチド配列と非常に関係が深い既知のペ プチド配列は、Ｋ、　Ｄ、ブラウン等、１９８９年、ジャーナル・オブ・イムノ ロジー、１４２巻、６７９〜６８７頁に記載されたマウスタンパク質Ｐ６００の 相補性ＤＮＡから誘発される１３２種のアミノ酸配列のペプチド配列である。ニ ードルマンおよびランシュ、１９７０年、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ イオロジー、４８巻、４４３〜４５３頁の方法を使用してそれらのペプチド配列 の比較は、１１２種のうち６３種のアミノ酸が同一であり、同一性の約５６％相 同性に等しいことを示している。

本発明のタンパク質は、分泌されたタンパク質であり、特に、Ｔリンパ球により Ｔリンパ球とフォルボール−２−ミリステート−３−アセテートで誘発され得、 この誘発は、サイトカインで予想されるように（上記参照）シクロスポリンＡの 追加存在下植物凝集素で刺激する場合にこの増加に対して阻害作用を有する植物 凝集素または抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体により増幅される。ＮＣ５０と称 する本発明のタンパク質は、サイトカイン型免疫調節活性（細胞増殖、細胞活性 、走化性、および他のサイトカインの合成調節）を有する新規ヒトリンホカイン である。それは、免疫系の少なくとも２種の主要細胞に作用する：単球およびＢ リンパ球。それは、新規インターロイキンである。その性質の幾つかは、インタ ーロイキン−４と共通する：　ＬＰＳ−活性末梢血単球によるインターロイキン −１βおよびインターロイキン−６の合成の阻害、および扁桃腺Ｂリンパ球に対 するＣＤ２３抗原の発現の調節。それらの２種の性質は、インターロイキン、− ４の性質でもある（Ｗ、ボール、１９９１年、ブラッド、７７巻、１９５９年、 およびウオール、メルフイツト等、１９９１年、ジャーナル・オブ・エクスペリ メンタル・メディスン、１７４巻、１１９〜１２２０頁）。

本発明のタンパク質は、リンホカイン型の新規インターロイキンである。腫瘍、 よび免疫変調による感染症および炎症の処置に有効である医薬品の成分として重 要である。

本発明のタンパク質は、配列（ａｌ）のすぐ上流に、１またはそれ以上のアミノ 酸、特に配列：５ｅｒ−Ｐｒｏを含み得る。

このタンパク質は、好ましくはＳＤＳの存在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動 法により決定される見掛は分子量９．０±２または１６．０±２ｋＤａを有する 形態である。特にそれが見掛は分子量１６．０±２ｋＤａを有するとき、有利に はＮ−グリコシド化されたものである。

このタンパク質は、ＳＤＳの存在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により決 定され、銀で視覚化される７０％以上、および好ましくは９０％以上の純度のを 有するのが好ましい。

本発明の主題は、組換ＤＮＡが、細胞溶解産物から得られ得る上記のタンパク質 、または有利には上記のタンパク質の前駆体をコード化することを特徴とする組 換ＤＮＡである。この前駆体は、好ましくはシグナル配列を含む。

宿主細胞により選ばれたこのシグナル配列は、組換タンパクを細胞質から放出す ることを可能にする機能を有し、従って、組換タンパク質が天然タンパク質の配 列に近い構造をとることを可能にし、その精製をかなり容易にする。このシグナ ル配列は、成熟タンパク質によって遊離されたシグナルペプチダーゼによる数工 程、またはこのシグナル配列がシグナルペプチド、またはプレシーフェンスと称 するシグナルペプチダーゼにより除去される配列に加えて、１またはそれ以上の タンパク質分解作用の後半で、除去されるプロシーフェンスを称する配列を含む ときの数工程のいずれかにおいて、切断され得る。

成熟タンパク質のコード化配列は、例えば、以下の配列（Ｎａｌ）：ま〜たは（ Ｎａ　１’）　： ＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＣＡＴＧＧＴＡＴ　ＧＧＡＧＣＡＴＣＡＡ　ＣＣＴＧ ＡＣＡＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＡＣＴ　ＧＴＧＣＡＧＣＣＣＴ　ＧＧＡＡＴＣＣＣ ＴＧ　ＡＴＣＡＡＣＧＴＧＴ（Ｎａｌ’）： の１種である。

例えばエシェリキア・コリのような原核微生物で発現するには、原核微生物によ って分泌されるタンパク質の天然前駆物質をコード化する配列に由来する配列（ 例えばシグナルペプチドＯｍＰＡ　［グレイニブら、１９８４年、ＥＭＢＯ・ジ ャーナル、３巻、２４３７〜２４４２頁］）、またはアルカリ性ホスファターゼ のシグナルペプチド［ミカエリスら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１ ９８３年、１５４巻、３６６〜３７４頁］、または真核性前駆物質をコード化す る配列に由来する非内分泌性配列（例えばヒト成長ホルモンの天然前駆物質の１ つのシグナルペプチド）、または合成シグナルペプチド（例えばフランス特許出 願第２６３６６４３号に報告された Ｍｅｔ＾ｌａ　ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＬＹＥ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｌ ａｕ　ｘＪ＠ｕ　Ｌ＠ｕＰｈａ　論ｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ｐｒ ｏ　Ｓａｒ　’ｒｒｐＡｓｎ　Ａｌａ　ＧｌｙＡｌａ　） で示される配列）の何れかであり得る。

子嚢菌類のような真核細胞、例えば酵母サツカロミセス・セレビシアエ、または 糸状菌クリフォネクトリア・パラシチカで発現するには、このシグナル配列は、 好ましくはこれらの細胞によって分泌されたタンパク質の天然前駆物質、例えば 酵母であればインベルターゼの天然前駆物質（ヨーロッパ特許出願第０１２３２ ８９号）、またはフェロモンαのプレプロ配列の前駆物質（オランダ特許出願第 ２４８４／８４号）、またはクリフォネクトリア・パラシチカであればエンドチ アペプシンのプレプロ配列の前駆物質をコード化する配列に由来する配列：Ｌ７ ！ｉ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐ ｒｏ工ｌａ　Ｐｒ。

６５　・　７０ Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　 Ｓａｒ　’ｒｈｒ　ＳｅｒＧｌｙ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ動物細胞で 発現するためには、分泌することが知られてし）る動物細胞タンノτり質のシグ ナル配列、例えばインターロイキン−２の分泌を起こすことがすで；；知られて いるヒト成長ホルモンの天然前駆物質の１つのシグナルペプチドをコード化する 配列（フランス特許出願第２６１９７１１号参照）力＼、号車の１列（Ｎｂ１） −（Ｎｂ２）、（Ｎｂ３）および（Ｎｂ４）：（ｂｌ） Ｍ＠ｔ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ａ８ｎ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　 Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｉｊｉｌｕの１種をシグナルペプチドとして使用する。

この発明はさらに、その発現に必要な手段とともに上記の組換えＤＮＡを保有し ている発現ベクターに関する。

原核微生物、特にエシェリキア・コリで発現するには、組換えＤＮＡを、特に効 果的なプロモーターを含んでいる発現ベクターへ挿入し、さらに発現される遺伝 子のリポソーム結合部位上流、および発現される遺伝子の効果的な転写終結配列 下流を挿入しなければならない。このプラスミドはまた複製開始点および選択マ ーカーを含んでいなければならない。これらの配列は、すべて宿主細胞にしたが って選択されなければならない。

真核細胞で発現するためには、この発明の発現ベクターは、その発現、真核細胞 でその複製、および形質転換した細胞の選別に必要な手段とともに上記の組み換 えＤＮＡを保有する。好ましくはこのベクターは、例えば受容体真核細胞の変異 を相補するように選ばれ、それによってそれらのゲノムか、または多重コピーベ クターの何れかへ、組換えＤＮＡを多数のコピーとして組込むことができる細胞 を選び得る選択マーカーを保有する。

酵母のような真核細胞、例えばサツカロミセス・セレビシアエで発現するために は、一方は効果的なプロモーター、他方は転写ターミネータ−と認められる配列 の間に組換えＤＮＡを挿入することが適当である。発現カセットと呼ばれるプロ モーター／コード配列／ターミネータ−組立て物は、酵母のための単一コピーま たは多重コピープラスミドベクターでクローン化するか、あるいは多重コピーと して酵母のゲノムへ組込まれる。

子嚢菌類に属する糸状菌、例えばアスペルギルス属、ニューロスポラ属、ポドス ポラ属、トリコデルマ属、またはクリフォネクトリア属のような真菌類の真核細 胞で発現するには、この発明の発現ベクターは、その発現に必要な手段、および 好適であれば選択マーカーおよび／またはテロメア配列とともに、上記の組換え ＤＮＡを保有する。つまり対象となるＤＮＡとして同一のベクター上、または別 のベクター上の何れかに位置した選択マーカーの助けを借りて、対象となるＤＮ Ａを組込んだ形質転換体を選び出すことができ、ここでこれら２つのベクターは 同時形質転換によって導入される。この発明の組換えＤＮＡは、糸状菌のゲノム へ挿入するか、あるいはこのＤＮＡを複製し、これを分配できる配列によって染 色体外の形で保存することができる。

゛　動物細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現するには 、組換えＤＮＡを、好ましくはこの発明の組換えＤＮＡを挿入した単一の発現単 位、および好適であれば効果的なプロモーターの前に選択マーカーを含んでいる プラスミド（例えばｐＢＲ３２２から誘導した）へ挿入するか、または２つの発 現単位へ挿入する。第１の発現単位は効果的なプロモーター（例えばＳＶ４０早 期プロモーター）によって先行される上記の組換えＤＮＡを含む。開始ＡＴＧを 取り巻く配列は、好ましくはコザックが報告した共通配列［Ｍ、コザック（１９ ７８年）、セル、１５巻、１１０９〜１１２３頁］にしたがって選ぶ。イントロ ン配列、例えばマウスα−グロビンのイントロン配列を組換えＤＮＡの上流へ挿 入でき、ポリアデニル化部位を含む配列、例えばＳＶ４０ポリアデニル化配列を 組換え遺伝子の下流へ挿入することができる。第２の発現単位は、選択マーカー 、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（以下、ＤＨＦＲと略称される酵素）を暗号 化しているＤＮＡ配列を含んでいる。このプラスミドを動物細胞、例えばＣＨＯ ｄｈｆｒ−細胞（ＤＨＦＲを発現できない）へ移入する。メトトレキセート耐性 について細胞系を選別する。選び出された系は組換えＤＮＡの多数のコピーがゲ ノムへ組込まれており、このＤＮＡを十分量発現する。

本発明は、上記で定義されたの発現ベクター、特にエシェリキア・コリのそれら により形質転換された原核微生物、およびその発現に必要な方法を用いて上記の 組換ＤＮＡを含む原核細胞に関する。このＤＮＡは、上記の発現ベクターと、ま たは本発明の組換ＤＮＡと形質転換することにより導入され得、時にはそれを発 現させ得る位置でゲノム中に直接組込まれ得る。

有利な原核細胞は、動物細胞である。

組換ＤＮＡは、例えば、上記の発現ベクターと形質転換することにより、それを 担持するウィルスまたはレトロウィルスでの感染により、または微量注射により 、それらの細胞に導入され得る。好ましい動物細胞は、本発明のタンノくり質の 高い生産力を有する系を得るかのが可能であるＣＨＯ細胞、特にＣＨＯｄｈｆｒ −細胞である。

他の有利な原核細胞は酵母細胞、特にサツカロマイセス・セレビシアエである。

本発明は、上記での定義された動物細胞またはこの酵母細胞を培養、ついで組換 タンパク質の分離および精製の工程を含む上記のタンパク質の製造法にもまた関 する。

本発明は、それらの動物細胞またはこの酵母の細胞を培養、ついで組換タンノく り質の単離および精製の工程を含む方法により得られ得る組換タンパク質にもま た関する。

従って、本発明の主題は、活性成分として上記のタンパク質を含む、薬学的に許 容される添加物中、免疫調節により、特に腫瘍学においておよび感染状態および 炎症状態の処置において有効である医薬品にも関する。そのような医薬品は、単 一または他の活性剤、例えば、１またはそれ以上の他のサイトカインと混合して 使用され得る。

本発明のより良い理解のために、実験結果および後半での論議を含むセクション に分けられた以下の記述を提供する。それらのセクションの幾つかは、本発明を 実施する目的で行われた実験、および純粋に詳細に説明するためだけの本発明の 具体的な実施様態に関する。

このセクションに記載した集約的の技術のほとんどは、当技術の熟練者に周知で あり、サンプルツク、フライシエおよびメニアチスによる研究（コールド・スプ リング・ハーバ−・プレス・エディジョン、ニューヨークから１９８２年に出版 された「モレキュラー・クローちイング：ア・ラボラトリ−・マニュアル」　（ 第２版））に詳細に記載されている。

以下の記載のより良い理解のために、Ｆｉｇ、ｌａ、ｌｂ、ＩＣ，２，３，４， ５，６および７を提供する。

第１ａ図は、エシェリキア・コリでクローン化し、動物細胞で発現するためのプ ラスミドであるプラスミドｐｓＥ１の組立て地図である。図中、ライゲーション によって消失した部位をカツフ内に示す。この図で使用した記号はこのプラスミ ドに関する説明のところ（セクション２）で説明する。

第１ｂ図はプラスミドｐｓＥ１の組立てに使用した合成ｒＨｉ　ｎ　ｄＩＩＩへ 結合する部位」〜ＨｉｎｄＩＩＩ断片の配列を示す。

第１ｃ図はＨｉｎｄＩＩＩ〜ＩＥ３ａｍＨＩへ結合する部位」合成断片の配列を 示す。

第２図はＮＣ５０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列であり、下段は誘発されたアミノ 酸配列を示す。翻訳を開始できる２個のＭｅｔを実線で、シグナルペプチドの切 断部位と思われる部分を矢印で、Ｎ−グリコジル化の強い部分を破線で示す。

第３図および第４図は、それぞれニードルマンおよびマンシュの方法［１９７０ 年、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、４８巻、４４３〜４５３ 頁］によるＮＣ５０ｃＤＮＡから誘発されるアミノ酸配列（上段）、およびマウ スタンパク質Ｐ６００のｃＤＮＡから誘発したアミノ酸配列（下段）、およびこ の方法によるＮＣ５０ｅＤＮＡ　（上段）、およびＰ６００タンパク質のＣＤＮ Ａ　（下段）の配列の最大相同配列を示す。

第５図は、アスタリスクで示すＮＣ５０ｃＤＮＡに関するサイレント突然変異部 位である断片Ｂの配列を示す。

第６図および第７図は、ＣＯ８細胞の上清（Ｆｉｇ、６）および酵母（Ｆｉｇ、 ７）から産生じた精製タンパク質ＮＣ５０の濃度を関数としてＢ９系の光学密度 および／または細胞密度の変化を示す。

セクション１　末梢血単核細胞の培養およびＰＭＡおよびＰＨＡ−Ｐによる刺激 　相補的なりＮＡライブラリー作成に使用したメツセンジャーＲＮＡの調製１） 末梢血単核細胞の培養および刺激 末梢血バッグ（輸血センターの３人の健常ボランティア−から採取）から、まず サイドアフェレシスおよびフィコール密度勾配遠心分離［ゴーシャットら（１９ ８９年）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー、１９巻、１０７ ９頁］を行って末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）を豊富に含んだ概略下記の構成［ リンパ球７０％、単球２５％、顆粒球５％（コウルター型ＳプラスＩｖセルカウ ンターを使用して計数した細胞数）］からなる細胞画分を得る。

細胞を２５０１１のフラスコに採取し、ついで３７℃、３００ｇで１０分間遠心 分離する。上清を除き、細胞残留物をグルコース、無機塩、アミノ酸、ビタミン からなるＲＰＭＩ培地と呼ばれる培地（ＲＰＭ１１６４０培地、ギブコＢＲＬ社 ）５０ｍｌですすぎ、ついで前記と同一条件下で再度遠心分離する。

ついで細胞ペレットを１０％ウシ胎児血清（ギブコＢＲＬ社、製品番号：０１３ −０６２９０Ｈ）を補給したＲＰＭＩ培地５００ｍ１へ取り、これに培地１ｍＭ 当たりペニシリン１０単位およびストレプトマイシン１０ａｇ（ペニシリン／ス トレプトマイシン溶液、ギブコ社、製品番号：　０４３−０５１４０Ｄ）を添加 し、さらにＬ−グルタミン（ギブコＢＲＬ社、製品番号：　０４３−０５０３０ Ｄ）を最終濃度２ｍＭとなるまで添加した。

粘着細胞および非粘着細胞を分離するため、細胞浮遊液の１部を大きな四角い４ 枚の培養皿（２４５Ｘ２４５Ｘ２０ｍ＋ａ、ヌンク社、製品番号：１６６５０８ ）に１皿当たり約１００ｍ１の割合で分け、これを３７℃で１時間インキュベー トする。実際、単球の大部分は培養皿へ粘着するが、リンパ球の大部分は浮遊液 に残ることが知られている。

非粘着細胞をピペットで吸い取り、表面積１７５ＣＩＩｌ”のファルコン型培養 フラスコで、上記のように補給したＲＰＭＩ培地の存在下、さらにフォルボール −２−ミリステート−３−アセテート（ＰＭＡ）　（シグマ社、製品番号：Ｐ８ １３９）およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−ｐ）（シグマ社、製品番号：Ｌ ８７５４）を添加し、５％ＣＯ２の存在下３７℃で２４時間これを培養する。

上記と同様に補足し、さらにＰＭＡ　１０ｎｇ／ｌｌ１ｌおよびＰＨＡ−Ｐ　５ ａｇ／ｍｌを添加したＲＰＭＩ培地１００ｍ１を粘着細胞へ加える。細胞を５％ （ｖ／ｖ）Ｃ０２の存在で３７℃で５時間インキュベートする。

細胞浮遊液の残り（以下、全細胞と呼ぶ）を、大きな四角い４枚の培養皿に分け 、上記のように補給し、さらにＰＭＡ　１０ｎｇ／ｍｌおよびＰＨＡ−Ｐ　５ａ ｇ／ｍｌを添加したＲＰＭＩ培地の存在下、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の存在で３７ ℃で、最初の２枚の皿の場合は５時間、他の２枚の皿の場合は２４時間インキュ ベートする。

インキュベーション終了の約２時間前に、シクロへキシミド（シグマ社、製品番 号：Ｃ６２５’５）１０μｇ／ｍｌ　（サイトカイン類のＲＮＡの安定性を増大 させる翻訳阻害剤）［リントスチンら（１９８９年）、サイエンス、２４４巻、 ３３９〜３４４頁参照］をこれらのさまざまな細胞の培養培地へ添加し、さらに ２時間、３７℃でインキュベーションを続ける。

（２）メツセンジャーＲＮＡの調製 ａ）メツセンジャーＲＮＡの抽出 下記の態様で細胞を回収する。

粘着細胞をＰＢＳ　（リン酸緩衝化食塩水、ギブコＢＲＬ社、製品番号：０４１ ０４０４０）で２回洗浄し、ついでゴム製かき取り器でかき取り、遠心分離する 。

これによってペレットＡと呼ばれる細胞ペレットを得る。

非粘着細胞については、細胞浮遊液を含有するフラスコを振とうしたのち、細胞 浮遊液を除いて遠心分離する。これによって細胞ペレットＮＡと呼ばれる細胞ペ レットを得る。

全細胞については、粘着画分を上記のようにＰＢＳで２回洗浄し、上記と同様に かき取り、ついでこれを遠心分離する。非粘着画分を遠心分離する。得られた２ 種類の細胞ベレットをついでプールする。このプールで、全細胞を５ｓ間インキ ュベートした場合は、細胞ベレットＴ（５ｈ）と呼び、全細胞を２４時間インキ ュベートした場合は、Ｔ（２４ｈ）と呼ぶ。

細胞ペレットＡ、ＮＡ、Ｔ　（５ｈ）およびＴ（２４ｈ）を凍結し、−８０℃で 保存する。

凍結した各細胞ベレットを、下記の組成［５Ｍグアニジンチオシアナート、５０ ＩＩＩＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ７，５）およびｌＱ＋ ＭＥＤＴＡ］からなる細胞溶解緩衝液にそれぞれ浮遊させる。浮遊液をウルトラ ・フラックスＮｏ。２３１２５６音波処理機（ジャンケ・アンド・クンケル社） を使用して最大出力で２０秒ずつ４サイクル音波処理する。β−メルカプトエタ ノールを０．２Ｍ添加して、さらに３０秒音波処理サイクルを実施する。塩化リ チウムを３Ｍ添加する。浮遊液上滑を４℃に冷却し、この温度で４８時間静置す る。

ついで６０分間遠心分離によってＲＮＡを単離する。ＲＮＡペレットを３Ｍ塩化 リチウム溶液で１回洗浄し、再度遠心分離し、ついで下記の組成［１％ＳＤＳ。

５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０１ＭｈリスーＭＣＩ　（ｐＨ７，５）コにタンパク分解 酵素Ｋ（ベーリンガー・マンハイム社）１＋ｇ／ｍｌを添加した緩衝液に取る。

４０℃で１時間インキュベーションの後、ＲＮＡ溶液をフェノール／クロロホル ム混合物で抽出する。水層に含まれているＲＮＡを、最終濃度０．３Ｍの酢酸ア ンモニウム溶液およびエタノール２．５容量の溶液で一２０℃で沈殿させる。浮 遊液を１５０００ｇで３０分間遠心分離し、ペレットを保存する。

ｂ）ＲＮＡのポリ（Ａ）＋画分の精製 ペレットを下記の組成［１１０１ＩＩトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）および１ ｍＭＥＤＴＡ］の緩衝液（ＴＥ緩衝液）１ｍＭに取り、撹拌装置によって浮遊さ せる。３型オリゴ（ｄ　Ｔ）−セルロース（コラボレイティブ・リサーチ社、バ イオロジーロ・プロダクト・ディビジョン）を製造会社の指示にしたがい調製す る。オリゴｄＴ−セルロース上にＲＮＡを付着させてゆるやかに振とうし、ボー ド上に浮遊させ、ついで６５℃で１分間加温する。

浮遊液をＮａＣ１で０．５Ｍに調節し、ついでゆるやかに１０分間振とうする。

ついで浮遊液を１０００ｇで１分間遠心分離し、上清を除き、ペレットを０．５ ＭＮａＣ１を含有するＴＥ緩衝液１＋１で２回洗浄する。上清を除（。ビーズを ＴＥ緩衝液ｌｌｌ１ｌに浮遊させることによって、ＲＮＡのポリアデニル化画分 （メツセンジャーＲＮＡを含む）を溶出し、ついでこの浮遊液を６０℃で１分間 加温し、さらに傾斜板上で１０分間振とうする。ついで浮遊液を１０００ｇで１ 分間遠心分離し、溶液中に遊離メツセンジャーＲＮＡを含有する上清の回収がで きるようにする。上記の一連の操作（溶出から）を２回反復する。このようにし て得られた上清をプールし、残留ビーズを遠心分離によって除去し、上清をエタ ノール３容量および最終濃度０．３ＭのＮａＣ１溶液で沈殿させる。

細胞ベレットＡ、ＮＡ、Ｔ　（５ｈ）およびＴ（２４ｈ）から４種類のＲＮＡポ リ（へドの試料を得る。以下これらの試料を、それぞれＲＮＡポリ（Ａ）”−Ａ 、ＲＮＡポリ（Ａ）”−ＮＡ、ＲＮＡポリ（Ａ）”−Ｔ　（５ｈ）　、ＲＮＡボ １バＡ）”−Ｔ　（２４ｈ）という。

セクション２　末梢血単核細胞に特異的な配列を豊富に含んでｕ−６相補的ＤＮ Ａライブラリーの製造 （１）クローニングベクターｐｓＥ１の構築採用方針として、一般に誰にでも入 手できる既存のブラスミドカ）ら得られる断片および現在一般に利用できる技術 によって合成される断片を使用する。採用したクローニング技術は、Ｔ、マニア テイス、Ｅ、　Ｆ、フリ・ソチ、およびＪ、サンプルツクが、「モレキュラー・ クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル」（コールド・スプリング・）＼ −バー・ラボラトリ−１１９８９年）で報告した方法である。オリゴヌクレオチ ドはバイオサーチ・８７００　ＤＮＡ・シンセサイザーを使用して合成する。

以下の説明は、第１ａ図を参照することによって一層明ら力）（こ理解し得る。

プラスミドは、下記の要素を逐次ライゲーションすることによって構築した。

ａ）ＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片 第１ａ図で＋＋＋＋＋＋の記号で表したこの２５２５ｂｐの断片は、プラスミド ｐＴＺ１８Ｒ（ファーマシア社）を制限酵素ＰｖｕＩＩで完全消化することによ り得た。この断片はファージｆ１の複製開始点（第１ａ図、ＯＲＩ　Ｆｌで示す ）、アンピシリン耐性を保有する遺伝子（第１図、Ａｍｐ’）およびこのプラス ミドの複製をエシェリキア・コリで可能にする複製開始点（第１ａ図、ＯＲＩ　 ｐＢＲ３２２で示す）を含んでいる。第１のＰｖｕＩＩ平滑部位は、ｇ）で説明 する断片のＥｃｏＲＶ平滑部位とのライゲーションによりて消失する（このＥｃ ｏＲＶ平滑部位も消失する）。

ｂ）ＰｖｕＩＩ−ＨｐａＩ断片 第１ａ図で■■■■■の記号で表した１１２９９位（ＰｖｕＩＩ制限酵素部位） と１０２３９位（ＨｐａＩ制限酵素部位）［デツカ−および）くン・オーモント 、ジーン、２７巻、１９８４年、１１５〜１２０頁］との間にあるこの１０６０ ｂｐの５型アデノウイルスＤＮＡの断片は、ＲＮＡ　ＶＡ−ＩおよびＶＡ−ＩＩ に関する情報を含んでいる。ＨｐａＩ平滑部位は、（Ｃ）で説明する断片のＰｖ ｕＩＩ平滑部位とのライゲーションによって消失する（このＰｖｕ工Ｉ平滑部位 も消失する）。１１２１８位にあるＡｐａＩ部位は酵素ＡｐａＩで切断し、ファ ージＴ４のＤＮＡポリメラーゼでエクソヌクレアーゼ的に処理し、再ライゲーシ ョンにより除かれた。

ｃ）ＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片 第１ａ図で／／／ｌ／／／の記号で表したこの３４４ｂｐの断片は、制限酵素Ｐ ｖυＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる完全消化によって得られたＳＶ４０　ＤＮ Ａから誘導された。この断片はＳＶ４０　ＤＮＡの複製開始点および早期プロモ ーターを含んでいる［Ｂ、Ｊ、バイオら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ｔＪＳＡ　（１９８３年 ）、８０巻、７２１〜７２５頁参照］。

ＨｉｎｄＩＩＩ部位は、ｄ）で説明する断片のＨｉｎｄＩＩＩ結合部位とのライ ゲーションによって消失する。

ｄ）４１９ｂｐ　ｒＨｉｎｄＩＩＩ結合部位」−第１ａ図で　示されたＨｉｎｄ ＩＩＩ合成断片、（第１ｂ図にその配列を示す）は、ＨＴＬＶＩウィルスの翻訳 されない５°配列［Ｒ，ワイスら、「モレキュラー・バイオロジー・オブ・ツモ ール・ウイルシズ」、第２部（第２版）、１９８５年、コールド・スプリング・ ハーバ−・ラボラトリ−１１０５７１０５フロビン遺伝子の遠位イントロン［Ｙ ．ニシオカら（１９７９年）、セル、１８巻、８７５〜８８２頁］を含んでいる 。

ｅ）ＨｉｎｄＩＩＩ　〜「ＢａｍＨｌへ結合する部位」合成断片第１ａ図でｘｘ ｘｘｘｘの記号で表したこの断片は、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼのプロ モーター、および特にＡｐａＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位を含むポリリ ンカーを含み、その配列を第１Ｃ図に示す。

ｆ）ＢａｍＨｌ−Ｂｃ　１　１断片 第１ａ図でムムムムムムの記号で表したこの２４０ｂｐ断片は、ＳＶ４０ウィル スＤＮＡの酵素ＢｃｌｌおよびＢａｍＨＩによる完全消化によって得られた小断 片であうで、ＳＶ４０後期ポリアデニル化部位［Ｍ．フイツジエラルドら（１９ ８１年）、セル、２４巻、２５１−２６０頁〕を含んでいる。ＢａｍＨＩおよび Ｂｃ１１部位は、それぞれ（ｅ）に記載した断片のｒＢａｍＨＩへ結合する部位 」および（ｇ）に記載した断片のＢａｍＨＩ部位とのライゲーションによって消 失する（このＢａｍＨＩ部位も消失する）。

ｇ）ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片 第１ａ図で０ＯＯＯＯＯの記号で表した：の１９０ｂｐ断片は、酵素ＥｃｏＲＶ およびＢａｍＨＩによるその完全消化後プラスミドｐＢＲ３２２由来の小断片で ある。

したがってプラスミドｐｓＥ１はエシェリキア・コリでクローニングベクターと して使用されるのに必要な要素（エシェリキア・コリにおける複製開始点および プラスミドｐＴＺ１８Ｒに由来するアンピシリン耐性遺伝子）、および動物細胞 における発現ベクター（ＳＶ４０ウィルスのプロモーター、ポリアデニル化部位 、複製開始点）、および配列決定するだめの１本鎖コピー（ファージｆ１の複製 開始点）を含んでいる。

２）末梢血単核細胞に特異的な配列を豊富に含んでいる相補的ＤＮＡライブラリ ーの構成 使用したクローン化技術はカプトらが報告した方法である［プライマー・アダプ ター手法、カプトら、プロシー、ディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ　（１９８６年）、８３巻、１６７ ０〜１６７４頁］。

この方法は、一方でベクターｐｓＥ１をＡｐａＩで消化し、ポリｄｃ尾部を、突 出した３′末端へ付加し、ついで得られたプラスミドをエンドヌクレアーゼＢａ ｍＨＩで消化することからなる。ベクターに対応する断片をセファロースＣＬ４ Ｂカラム（ファーマシア社）で精製する。したがってこの断片は一方の末端でポ リｄａ尾部を含み、他の末端はＢａｍＨｌ型の粘着末端である。

他方、セクション１の最後に得られたＲＮＡ−ポリ（Ａ）３に、下記の配列５’ ＜ＧＡＴＣＣＧＧＧＣＣ　ＣＴＴ’ｒＴＴ’ｌ’ＴＴＴ　ＴＴ？＜３’を有する プライマーを使用して逆転写を行う。即ち、ｃＤＮＡはその５′末端でＢａｍＨ Ｉ粘看末端に相補的な配列ＧＡＴＣＣを有する。

逆転写の作用によって得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドをアルカリ加水分解 することにより、ＲＮＡを除去することができる。ついで１本鎖ｃＤＮＡを末端 トランスフェラーゼで処理し、３゛末端で、ボＩＪ（ｄＧ）を付加できるように し、セファロースＣＬ４Ｂカラムで２回精製を繰り返す。

これらのｃＤＮＡをセクション１、２に記載と同様に製造したＣＯ３３細胞系（ ＳＶ４０ウィルスＴ抗原を発現するサル腎臓細胞系［Ｙ．　グルラマン（１９８ １年）、セル、２３巻、１７５〜１８２頁参照］）に由来するＲＮＡ−ポリ（Ａ ）“とハイブリッド形成する。

ハイブリッド形成しないｃＤＮＡを単離する（末梢血単核細胞に特異的なメツセ ンジャーＲＮＡと相補的なりＮＡ中に豊富に含んでいる画分）。

これらのｃＤＮＡを１本鎖の形でベクターｐｓＥ１へ挿入する。プライマーに相 補的な第２のオリゴヌクレオチド（アダプター）はｃＤＮＡの５゛末端でＢａｍ Ｈ１部位を生じるのに必要である。ベクター、ｃＤＮＡおよびアダプターのハイ ブリッド形成ののち、組換え体分子をファージＴ４のリガーゼの作用によってア ニーリングする。ついで１本鎖領域をファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼによっ て修復する。得られたプラスミドのプールをエシェリキア・コリＭＣ１０６１株 ［カサバダンおよびＳ、コーエン、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（１９ ８０年Ｌ１４３巻、９７１〜９８０頁］のエレクトロポレーションによる形質転 換に使用する。

相補的ＤＮＡライブラリー作成のためのプロトコールａ）相補的ＤＮＡの調製 セクション１の末尾で得られた末梢血単核細胞のＲＮＡ−ポリ（Ａ）−［下記の 構成　ＲＮＡ−ポリ（Ａ）”−Ａ　０．５μｇ、ＲＮＡ−ポリ（Ａ）”−ＮＡ２ μｇ、ＲＮＡ−ポリ（Ａ）”−Ｔ　（５ｂ）　２μｇＸＲＮＡ−ポリ（Ａ）”　 −Ｔ　（２４ｈ）　０．５μｇからなる］５μｇから出発して、組成　５０ｍＭ ｈリスーＨＣｌ　（ｐＨ８，３）　、５ｍＭ　ＭｇＣｈ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、デ オキシヌクレオチドトリポスフエート誘導体の各々領５ｍＭ、［α　３２ｐコー ｄｃＴＰ１００μｃｉおよびＲＮａｓｉｎ（プロメガ社製）１００単位を含む緩 衝液中下記の配列（ＢａｍＨＩ部位を含む）５’＜ＧＡＴＣＣＧＧＧＣＣｃ’ｒ ’ｒ’ｒ’ｒ’ｒ’ｒ’ｒ’ｒ’ｒ’ｒ’ｒ’ｒ＜３’からなる合成プライマー で、”Ｐ−ｄＣＴＰで標識した１本鎖の相補的ＤＮＡを調製する（得られた相補 的ＤＮＡは３０００ｄｐｍ／ｎｇの比活性を有する）。逆転写酵素（ジェノフィ ツト社、Ｅ１０２２）１００単位と４６°Ｃで３０分間インキュベートしたのち 、０５Ｍ　ＥＤＴＡ　４ｍＭを添加する。第１の抽出をフェノール（ＴＥ緩衝液 で飽和）で実施し、ついて第２の抽出をクロロホルムで実施する。

ウシ肝臓転移ＲＮＡ１０μｇ、酢酸アンモニウムＩＯＭ溶液ユ／１０容量、およ びエタノール２５容量を加えて相補的ＤＮＡを沈殿させる。混合物を遠心分離し 、ぺ１．・ットをＴＥ緩＃Ｉ液３０μｌに溶解し、ポリアクリルアミドＰＩＯカ ラム（バイオジェルＰ１０−２００へ一４００メツシュ、製品番号：１５０１０ ５０、バイオラド社）を使用する排除クロマトグラフィーにより、塩類、フェノ ール、クロロホルムのような小分子を除去する。

ｂ）ＲＮＡｍ型のアルカリ加水分解 ＮａＯＨの２Ｎ溶液４．６Ｊ１を加え、６８℃でインキュベーションを３０分間 実施する。ついで２Ｎ酢酸４．６μｍを加え、得られた溶液をポリアクリルアミ ドＰＩＯカラムに通す。

ｃ）ｄＧのホモポリマー付加 末端トランスフェラーゼ酵素（ファーマシア、２７０７３００１）６６単位を使 用して、３″末端をｄＧｒ尾部」で伸長する。３７℃で３０分間インキュベージ Ｂンを、組成：３０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６）　、１ｍＭ塩化コバル ト、１４０ｍＭカコジル酸、０．１ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ｄＧＴＰの緩衝液６ ０μｍ中で行う。ついで０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　４μｌを添加する。

ｄ）セファロースＣＬ４Ｂカラムによる精製合成フライマーヲ除去スルタメ、！ 補的ＤＮＡを３０ｍＭ　ＮａＯＨ／２ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液で平衡化した２つの連 続したセファロースＣＬ４Ｂ　（ファーマシア社）１ｍＭのカラムで精製する。

最初の３つの放射性画分（それぞれ約８０１１１）をプールし、１０Ｍ酢酸アン モニウム溶液１／１０容量およびエタノール２．５容量で沈殿させる。相補的Ｄ ＮＡの量は１μｇである。

ｅ）ハイブリッド形成 相補的ＤＮＡのベレットをＴＥ緩衝液２５μｍに浮遊し、ｃｏｓ細胞系から抽出 し７’：ＲＮＡ−ポ！Ｊ（Ａ）”　１５ｇｇを加え、さら１：３Ｍ　ＮａＣ１溶 液１／１０容ｊｉおよびエタノール２．５容量をこれに添加して、混合物を放置 して一２０℃で沈殿させる。

これを遠心分離し、ベレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、これを下記 の組成［０，１Ｍトリフ、−ＨＣｌ　（１）Ｈ７，５）　、０．３Ｍ　ＮａＣｌ 、お、及び１ｍＭ　ＥＤＴＡ］からなる緩衝液５μｍに溶解し、得られた溶液を 毛細管に加えて、溶封し、ついて６５℃で４０時間インキュベートする。

毛細管の内容物をＴＥ緩衝液１００μｍで希釈し、これに５０ｍ１ｌリン酸ナト リウム緩衝液（ｐ）（６，８）３０ｏＩ＋１を加える。得られた溶液をこのリン 酸緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（バイオラド社、製品番号： 　１３００５２０）へ６０°Ｃで通導する。リン酸緩衝液の濃度勾配（０゜１Ｍ →０２Ｍ）を通導したヒドロキシアパタイトカラムにより、１本鎖物質（ハイブ リッド形成しない相補的ＤＮＡ）および２本鎖物質（相補的ＤＮＡとハイブリッ ド形成したＣＯＳメツセンジャーＲＮＡ）を分離する。１本鎖の相補的ＤＮＡに 対応する画分をプールしく溶出したｃＤＮＡの２５重量％であって、末梢血単核 細胞に特異的な配列を約４倍富化した画分に対応）、これに転移ＲＮＡ２０μｇ を添加し、全容量を１０Ｍ酢酸アンモニウム溶液１／１０容量およびエタノール ２．５容量で沈殿させる。この混合物を遠心分離し、ベレットをＴＥ　２００μ ｌに溶解し、残りのリン酸塩をポリアクリルアミドＰＩＯで除去し、溶液を再度 １０Ｍ酢酸アンモニウム溶液１／１０容量およびエタノール２．５容量で沈殿さ せる。

ベレットを３０ｍＭ　ＮａＯＨ，２ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液３０μｍに溶解する。

残っている合成プライマーを除去するため、相補的ＤＮＡを、３０ｍＭＮａＯＨ １２ｍＭＥＤＴＡの溶液で平衡化した容量１ｍｌのセファロースＣＬ４Ｂカラム （ファーマシア社）へ負荷する。放射性を有する最初の３画分（それぞれ約３０ μｍ）をプールする。これらの画分に含まれているｃＤＮＡを１０Ｍ酢酸アンモ ニウム溶液１／１０容量およびエタノール２．５容量で沈殿させる。この方法で 回収した相補的ＤＮＡの量は２０ｎｇである。

ｆ）クローニングベクターｐｓＥ１および相補的ＤＮＡのアダプター存在下対合 混合物を遠心分離し、ベレットをＴＥ緩衝液３３μｍに溶解し、クローニングベ クターｐｓＥ１　５ｐｌ　（１２５ｎｇ）　、下記の配列（ＡｐａＩ部位を含む ）５１　んυ講ＡλりいＡ　ＡＡＡＧＧＧＣＣＣＧ　３’からなるアダプターｌ ｌ１ｌ　（１２０μｇ）　、および２００ｍＭＮａＣ１溶液１０μｌを添加し、 反応混合物６５℃でインキュベーションを５分間実施し、ついでを室温に放冷す る。

ｇ）ライゲーション クローニングベクターおよび１本鎖ｃＤＮＡを、ファージＴ４のＤＮＡリガーゼ 酵素（ファーマシア社、製品番号：　２７０８７００２）３２．５単位（容量１ ００μｌ）中、１５℃で組成＋５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、１ ０ｍＭＭｇＣｌ□、１ｍＭ　ＡＴＰの緩衝液中１夜ライゲーシヨンする。

ｈ）ｃＤＮＡの第２鎖の合成 フェノール抽出、ついでクロロホルム抽出によってタンパク質を除去し、ついで １０Ｍ酢酸アンモニウム溶液１／１０容量およびエタノール２．５容量を添加す る。混合物を遠心分離し、ベレットを下記の組成［３３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ ７，９）　、６２．５ｍＭ酢酸カリウム、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチ オトレイトール（ＤＴＴ）］からなる緩衝液に溶解する。ファージＴ４のＤＮＡ ポリメラーゼ酵素（ファーマシア社、製品番号＋　２７−０７１８）３０単位、 および４種のデオキシヌクレオチド三リン酸、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、 およびｄＴＴＰの混合物、およびファージＴ４の３２遺伝子タンパク質（）７− マシア社、製品番号：２７０２１３）２単位からなる混合物（容量３０ａｌ）を ３７℃で１時間インキュベートして相補的ＤＮＡの第２鎖を合成する。フェノー ルで抽出を実施し、ポリアクリルアミドＰ１０カラム（バイオシェルＰ１０−２ ００−４００メツシュ、製品番号：１５０１１０５０−バイオラド社）を使用し て微量のフェノールを除去する。

ｉ）エレクトロポレーションによる形質転換バイオラド・ジーン・パルサー装置 （バイオラド社）を使用し、製造会社の指示する条件下で２．５ｋＶで操作する エレクトロポレーションにより、前記により得られた組換えＤＮＡでエシェリキ ア・コリＭＣ１０６１細胞（クローンチック社）を形質転換し、ついで菌を、下 記の組成［バクトドリット２１０ｇ／リットル、酵母抽出物６ｇ／リットル、Ｎ ａＣ１１０ｇ／リットル］からなる所ｙ！ＬＢ培地（サンプルツク、上掲）中１ 時間増殖し、ついでアンピシリン１００μ１ｇ／ｍｌを添加したＬＢ培地で６時 間３０分増殖する。

寒天１．５％（ｗ／ｖ）およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌを添加したＬＢ培 地（以下、ＬＢゲローズ培地と呼ぶ）の皿上接種１時間後、形質転換の１／１０ ００希釈を取り出すことにより、独立したクローン数を測定する。独立したクロ ーン数は５０００００である。

セクション３　差し引いた相補的ＤＮＡライブラリーのスクリーニングおよびク ローンＮＣ５０の選別１）ナイロンフィルター上におけるｃＤＮＡライブラリー の細菌コロニーレプリカの作成 ｃＤＮＡライブラリーの組換え体細菌約４００００個を、ＬＢ寒天培地を含むベ トリ皿（２４５Ｘ２４５ｍｍ）上に分配する（皿１枚当たり約２０００コロニー ）これらの皿からそれぞれから、皿の表面にナイロン膜（ハイボンドＮ１アマ− ジャム社）を被せ、膜を針で突き抜（ことによって照合点を作ることにより、コ ロニーをナイロン膜上へ移す。ついで膜を除き、これをＬＢ寒天培地を含む新し いペトリ皿の表面へ被せる。コロニーを再増殖させるため、この膜を３７℃で数 時間放置する。この最初の膜から、新しい膜（ＬＢ寒天培地に被せることによっ て予め加湿する）を逐次最初の膜と接触させることにより、４枚のレプリカを新 しい膜上に作成する。膜上に得られたレプリカを最後にＬＢ寒天培地の皿に被せ 、３０℃で１夜インキユベートする。

膜上のレプリカを、下記の組成［０，５Ｍ　ＮａＯＨおよび１．５ＭＮａＣｌ］ の溶液で飽和したワットマン３ＭＭシート上にコロニー表面を上に向けて５分間 被せることにより、細菌を溶解し、ＤＮＡを固定することが可能となる。ついで 膜上のレプリカを、今度は下記の組成［１，５ＭＮａＣ１および５Ｍトリス−Ｈ Ｃｌ　（ｐＨ８，０）］の中和溶液で飽和した第２のワットマン３ＭＭシート上 に５分間置く。膜上のレプリカを２ＸＳＳＣ溶液（ＳＳＣ溶液の組成：０．１５ ＭＮａＣ１および０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）ですすぎ、洗浄用脱脂綿で ゆるやかにこすることにより、細菌破片を部分的に除去する。

膜上のレプリカを、ついで下記の組成［１０＋Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８）　 、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　ＮａＣ１、領１％ＳＤＳ］溶液中、タンパク 分解酵素Ｋ（ベーリンガー・マンハイム社）（１００μｇ／ｍｌ濃度）で膜１枚 当たり２０ｍ１の割合で処理する。混合物を振とうしながら３７℃で３０分間イ ンキュベートする。細菌破片のすべての痕跡を完全に除去するため、膜上のレプ リカを再度２×ＳＳＣですすぐ。最後にレプリカを濾紙上で数分間、ついで真空 下＋８０℃で３０分間乾燥する。以上の処理によって、各皿毎に４枚ずつの膜上 レプリカが得られる（以下、これらをレプリカ１、レプリカ２、レプリカ３およ びレプリカ４という）。

２）ｃＤＮＡプローブを作成するために使用するＲＮＡの調製：ａ）　ＰＭＡ、 （ＰＭＡおよび抗−ＣＤ２８）、（ＰＭＡＳＰＨＡ−ＰおよびシクロスポリンＡ ）または（ＰＭＡおよびＰＨＡ−Ｐ）を使用して、末梢血単核細胞の培養および 刺激： 非接着細胞を上記のように製造する。それらを、１０％ウシ胎児血漿（ギブコＢ ＲＬ　−商品番号０１３−０６２９Ｈ）および培地ｍｌ当たりペニシリン２０単 位およびストレイブトマイシン１０μｇ１および最終濃度２ｍＭのし一グルタミ ン（ギブコＢＲＬ　−商品番号０４３−０５０３０Ｄペニシリン／ストレプトマ イシン溶液）を補ったＲＭＰＩ培地の存在下表面積１７５Ｃｍ！のファルコン型 フラスコ中５時間培養する。細胞を下記の刺激条件下１）２）３）および４）の うち１つで５時間刺激する： １）　フォルボール−２−ミリステート−３−アセテ−）Ｌｏｎｇ／ｍｌ　（Ｐ ＭＡ）（シグマ社製、商品番号Ｐ８１３９）の存在下２）　ＰＭＡ１０ｎｇ／ｍ １および抗−ＣＯＤ２８モノクローナル抗体１μｇ／ｍ１　（レアクティフ・工 ・システム社製　商品番号ＡＣＭＯ２８ＯＮＣＯ５０）の存在下 ３）　ＰＭＡ１０ｎｇ／ｍｌ、植物凝集素（ＰＨＡ−Ｐ）（シグマ社製、商品番 号Ｌ８７５４）およびシクロスポリンＡ１μｇ／ｍｌ（サンド社製）の存在下４ ）　ＰＭＡ１０ｎｇ／ｍｌおよびＰＨＡ−Ｐ５　μｇ／ｍ１の存在下要するに、 抗−ＣＤ２８抗体の添加は、Ｔリンパ球でのｍＲＮＡの安定性を増加することに より数種のサイトカイン、特にＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＧＭＣＳＦ のｍＲＮＡの量を増加するということ（リントスチン等、（１９８９年）、サイ エンス、２４４巻、３３９頁）、および免疫抑制剤シクロスポリンＡがＴリンパ 球でのＰＭＡおよびＰＨＡ−Ｐでの活性化により誘発されるサイトカインのｍＲ ＮＡでの増加を抑制するということ（トンプソンＣ，Ｂ　問う、１９８９年、プ ロソーディゲス・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ・ニーニスニ ー、８６巻、１３３３〜１３３７頁）は周知である。

細胞は上記の刺激条件下補集され、各々細胞ペレット１、細胞ペレット２、細胞 ペレット３および細胞ペレット４と称する細胞ペレットを保存する。

ｂ）ＲＮＡ−ポ１バＡ）“の調製 上記の細胞ペレットから、ＲＮＡを抽出し、ポリ（Ａ）“両分を１〜２）ａ）お よびｂ）に記載と同様に精製する。これによってポリ（Ａ）”１画分、ポリ（Ａ ）”２画分、ポリ（Ａ）”３およびポリ（Ａ）“４と呼ばれる４つのＲＮＡ−ポ リ（Ａ）＋画分それぞれを得る。

３）放射能標識したｃＤＮＡプローブの調製ポリ（Ａ）′″画分ポリ（Ａ）＋画 分、ポリ（Ａ）＋およびポ１バＡ）″と呼ばれる４つのＲＮＡ−ポリ（Ａ）′″ 画分ら、下記に説明する態様でそれぞれプローブ１、プローブ２、プローブ３お よびプローブ４と呼ばれる放射能標識したｃＤＮＡプローブを合成する。

下記の組成［５０ＩｎＭトリスーＨＣｌ　（ｐＨ７，５）および１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ］からなる緩衝液２〜３μｍ中で、ＲＮＡ−ポリＡ′″１μｇをオリゴｄＴ＋ ｚ−＋ａ　（ファーマシア社）２００ｎｇと６５℃で２分間インキュベートし、 室温に冷却することにより、ハイブリッドを形成する。下記の組成［５０ｍＭト リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）、５ｍＭＭｇＣｈ、１０ｍＭジチオトレイトール ］の緩衝液（１０ａｌ）に、各５０ｕＭデオキシヌクレオチドトリホスファート 、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（ファルマシア社製）、１０μＭ　ｄＣＴ Ｐおよび１５０μＣ１ｄＣＴＰ　α３２−　（３０００Ｃｉ／ミリモル、アマー ジャム社）、およびＲＮａｓ　ｉｎ　（ＲＮＡ分解酵素阻害剤、アマージャム社 ）４０単位を含有する反応容量中で、放射能標識したＣＤＮＡを合成する。反応 は、逆転写酵素（ジェノフィツト社）１０ｍ２０単位の存在で４６℃で３０分間 実施する。この合成に引き続き、最終容量２０μｍまでの０．３Ｍ　ＮａＯＨ溶 液中でＲＮＡを６５℃で３０分間アルカリ加水分解する。３Ｍ酢酸の添加により 混合物を中和する。容量をＴＥ培地で５０μｍに調節する。これと同量のフェノ ールで抽出を実施し、さらにこれと同量のクロロホルム／イソアミルアルコール 混合物（それぞれの割合は２４／１）で第２の抽出を行う。ＣＤＮＡ鎖の合成中 に挿入されなかったｄＣＴＰα３２ＦはポリアクリルアミドＰ１０カラム（バイ オジェル−２００−４００メツシユ、バイオラド社）による排除クロマトグラフ ィーにより除去する。

ｃＤＮＡの量は６０〜１１００ｎで、Ｉ　Ｘ　１０　’ｄｐｍ／　ｌ１ｇの比活 性を有する。

４）細菌コロニーのレプリカとｃＤＮＡプローブとのハイブリツド形成膜上のレ プリカを、下記の組成［５０％ホルムアミド、５　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ％　５　Ｘチ ンハート溶液、０．１％ＳＤＳ、および音波処理し、１０分間、１０００Ｃで変 性したのち添加したザケ精子ＤＮＡ　１．０　ＯＬ１ｇ／ｍｌＦからなる緩衝液 中で４２℃で２時間プレハイブリッド化する。膜上のレプリカは、レプリカ１の 場合はプローブ１と、レプリカ２の場合はプローブ２と、レプリカ３の場合はプ ローブ３と、レプリカ４の場合はプローブ４と、それぞれ２日間ハイブリッド形 成する。これらのプローブを上記の緩衝液中で４βｇ／ｍｌの濃度で使用する。

５×デンノλ−ト溶液［サムプルツク（前掲）参照］は下記の組成［フィコール （タイプ４００、ファーマシア社）１ｇ／リットル、ポリビニルピロリド２エブ ミン（ＢＳＡ）Ｉｇ／リツトルコを有する。

プレハイブリッド化およびハイブリッド形成は、膜１枚当たり、それぞれ緩衝液 ２５ｍ１および１０ｍ１を使用して、ハイブリッド化オーブン（ハイベイト）中 で試験管内で実施する。

ついで膜上のレプリカを、順次、下記の組成［２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃおよび０．１ ％ＳＤＳ］の緩衝液で、２０°Ｃで１５分間ずつ数回、ついで下記の組成［０． ｌＸ５ＳＣおよび０　１％５ＤＳＩの溶液で５５℃で２回洗浄し、ワットマン３ ＭＭ濾紙上で乾燥し、コダックＸＡＲ　５フイルムでオートラジオグラムに掛け る。

５）既知サイド力インの大多数に対応するオリゴヌクレオチドの混合物との／’ ｔイブリダイゼーンヨン 既知サイド力インのメツセンジャーＲＮＡに相補的なりＮＡを含むクローンを同 定するため、上記と同様に製造した、膜の別の一連のレプリカを、次のサイトカ イン： インターロイキン−１α（フルタニＹ等、１９８５、「ヌクレイツク・アシッズ ・リサーチ」、１３、５８６９−５８８２）、インターロイキン−１β（アラロ ンＰ等、１９８４、「プロシーディンゲス・オン・ザ・ナショナル・アカデミ− ・オン・サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステー７・オン・アメリカ 」、８１、７９０７−７９１１）、インターロイキン−２（デグレープＷ等、１ ９８３、ｒＥＭＢｏジャーナル」、２、３２４９−３２５３）、インターロイキ ン−３（ヤングＹ．Ｃ．等、セル、１９８６、４７、３−１０）、インターロイ キン−４（ヨコトＴ等、１９８６、「プロシーディンゲス・オン・ザ・ナショナ ル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ」、８３、５８９４−５８９８）、イン ターロイキン−５（ヒラノＴ等、１９８６、「ネイチャー」、３２４、７３−７ ５）、インターロイキン−６（メイト等、１９８６、ｒプロシーディンゲス・オ ン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテ ッド・ステー７・オン・アメリカ」、８３、８９５７−８９６１）、インターロ イキン−７（ナーメンＡ等、１９８８、「ネイチャー」、３３３、５７１−５７ ３）、インターロイキン−８（マツシマに等、１９８８、「ジャーナル・オン・ エクスペリメンタル・メディシン」、１６７、１８８３−１８９３）、インター ロイキン−９（ヤングＹ。

Ｃ１等、１９８９、「ブラッド」、７４、１８８０−１８８４）、ＴＮＦα（ベ ニカＤ等、１９８４、「ネイチャー」、３１２、７２４−７２９）、ＴＮＦβ（ グレイＰ等、１９８４、「ネイチャー」、３１２、７２１−７２４）、Ｇ−Ｃ３ Ｆ（ナガタＳ等、ネイチャー、１９８６、３１９、４１５−４１８）、Ｍ−Ｃ３ Ｆ（カヮサキＥ等、１９８５、「サイエンス」、２３０、２９１−２９６）、Ｇ Ｍ−ｃｓＦ（ウォングＧ等、１９８５、「サイエンス」、２２８、８１０−８１ ５）、ＬＩＦ（グラフＮ等、１９８８、「プロシーディンゲス・オン・ザ・ナシ ョナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステー ７・オン・アメリカ」、８５、２６２３−２６２７）、インターフェロンα（ゲ ーデルＤ等、１９８１、「ネイチャー」、２９０、２Ｏ−２６）、インターフェ ロンβ１（タニグチＴ等、１９８０、「ジーン」、１０、１ｌ−１５）、インタ ーフェロンγ（ダレイ　Ｐ等、１９８２、「ネイチャー」、２９５、５０３−５ ０８）、ＴＧＦα（プリンクＲ等、１９８４、「セル」、３８、２８７−２９７ ）、ＴＧＦβ１（プリンクＲ等、１９８５、「ネイチャー」、３１６、７０１− ７０５）、ｂＦＧＦ（ブラッツＨ等、１９８９、「プロシーディンゲス・オン・ ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド ・ステー７・オン・アメリカ」、８６、１８３６−１８４０）、エリスロポイエ チン（シャコブスに等、１９８５、「ネイチャー」、３１３、８０６−８１０） 、ＢＣＧＦ（シャルマＳ等、１９８７、「サイエンス」、２３５、１４８９−１ ４９２）、ＭＩＦ（ワイザーＷ等、１９８９、「プロシーディンゲス・オン・ザ ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ ステー７・オン・アメリカ」、８６、７５２２−７５２６）、ＭＣＰ−１（ヨン ムラＴ等、ｒＦ　Ｅ　Ｂ　Ｓレターズ」、２４４、４８７−４９３）、オンコス タチン−Ｍ（ｖリフＮ等、１９８９、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉ。

１１、９、２８４７−２８５３）およびＥＤＦ（ムラタＭ等、１９８８、「プロ シーディンゲス・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・ オン・ザ・ユナイテッド・ステー７・オン・アメリカ」、８５、２４３４−２４ ３８）に相補的なりＮＡに対応する、各々２０ヌクレオチドを含む２８オリゴヌ クレオチドから成る混合物−混合物Ｃと称すーとハイブリダイゼーションする。

バイオサーチ８７００ＤＮＡシンセサイサーを用いて製造されたこれらのオリゴ ヌクレオチドを、下記プロトコールに従い西洋わさびペルオキシダーゼＥＣ１１ 　１、　１　７（ベーリンガー・マンハイムー参照番号８１４−４０７）と結合 させる。

ワラチャー等、１９８６、「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ」、１４、７９ ８５−７９９４の方法に従い、オリゴヌクレオチドを、合成カラムにおいてカル ボニルジイミダゾール（アルドリック−１１、５５３−３）および１．６−ンア ミノヘキサン（アルドリック−８１．１６９−６）と反応させる。

塩基の脱保護およびアンモニア処理による支持体の開裂後、リチウムイオンに変 換されるアンモニウム対イオンでイオン交換樹脂（キアゲンーダイアゲン５００ ０５１）上でオリゴヌクレオチドを精製する。

Ｍ．ウルデア等、「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ」、１９８８、１６、４ ９３７−４９５６の方法に従い、５′−アミノオリゴヌクレオチドを西洋わさび ペルオキシダーゼ（ベーリンガー・マンハイム−８１４４０７）と結合させる。

オリゴヌクレオチドの混合物は、ライブラリーにおけるクローンの約１０％とハ イブリダイズする。

プローブ１よりもプローブ２による場合プローブ１よりもプローブ４による場合 およびプローブ３よりプローブ４による場合に強いオートラジオグラフィー・シ グナルを与える。これらの２つのクローンを以後クローンＮＣ３ＱおよびＮＣ５ ０の２と称し、選ばれた。それらのクローンは、ｐｓＥｌ−ＮＣ３０と称するプ ラスミドおよびｐｓＥｌ−ＮＣ３０の２と称するプラスミド各々を含む。

セクション４：末梢血単核細胞中クローンＮＣ−３０のｍＲＮＡの発現非付着細 胞（主にリンパ球から成る）をセクション１−１）に記載と同様に製造し、更に 非刺激対照細胞（刺激条件Ｏ）でセクション３−２）−ａ）に記載と同様に刺激 する。５段階の刺激条件下それらの細胞のｍＲＮＡを実施例１−２）−ａに記載 と同様に製造し、ホルムアルデヒドの存在下１％アガロース・ゲル電気泳動（サ ムプルツク、前出）、次いでナイロン膜（ハイボンドＮ＋ーアマ−ジャム）への 移動および下記プロトコールによるハイブリダイゼーションにより分析された。

この膜を、［α−３２Ｆ］　−ｄＣＴＰ（アマ−ジャム）により標識したプロー ブとハイブリダイズする。このプローブは、サムプルツク等（前出）による記載 に従い、ＤＮＡアーゼＩによるＮＣ３０ｃＤＮＡの部分開裂、次いで酵素ＤＮＡ ポリメラーゼＩ酵素によるポリマー化にツク翻訳として知られている技術）によ りＮＣ５０　ｃＤＮＡから製造されたものである。ハイブリダイゼーションは、 ５０％のホルムアルデヒド、１モルのＮａＣ１、５ｘデンハルツ溶液および０． １％のＳＤＳを含む水性培地中１６時間４２℃で行なわれる。これらの膜を、室 温で数回０１％のＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ溶液により洗浄し、次いで５０℃で１ ５分間Ｏ０１％のＳＤＳを含む０．ｌＸ５ＳＣ溶液により２回洗浄する。５×デ ンノ１ルツ溶液は、フィニル（４００タイブーフアーマシア）１ｇ／ｌ、ポリビ ニルピロリドン１ｇ／ｌおよびＢＳＡ１ｇ／ｌという組成を有する。ｌＸ５ＳＣ 溶液は、０．１５モルのＮａＣ１および０．０１５モルのくえん酸ナトリウムを 含有する。

非刺激細胞および条件１）２）３）および４）の条件下刺激した細胞において、 約１．４ｋｂのＲＮＡに対応するオートラジオグラフのバンドが観察される。こ のＲＮＡの発現は、ＰＭＡの存在下増大しく刺激条件１の強さは、刺激条件Ｏの 強さの少なくとも５倍の強度のバンド）、この増強は、ＰＨＡ−Ｐまたは抗−〇 Ｄ２８の付加的存在下−増大し、刺激条件２）および４）は、（刺激条件１）の 約５倍の強度のバンド）し、ＰＨＡ−Ｐおよびシクロスポリンの付加的存在下変 化しない。

精製したＴリンパ球群（純度９５％以上）で行われた別の実験において、ＰＭＡ および抗−Ｃ２８の共刺激後、ＮＣ３０ｍＲＮＡの発現もまた観察される。

セクション５ クローンＮＣ５０のｃＤＮＡ配列の配列決定および分析１）クローンＮＣ５０の ｃＤＮＡの配列決定ａ）１本！ＪＩＤＮＡの製造 クローンＮＣ５０は、ＡｐａＩおよびＢａｍＨ１部位間にｃＤＮＡ（以後、ＮＣ ３０ｃＤＮＡと呼ぶ）をもつベクターｐｓＥ１を含む。

ベクターｐｓＥ１はファージｆ１の複製開始点を含み、下記方法でバクテリオフ ァージＭ１３に０７（ファーマシアー参照番号２７−１５２４）の存在下クロー ンＮＣ５０の培養による１本鎖ＤＮＡの製造が可能となる。

１５ｍ１管において、クローンＮＣ５０を、０．００１％のチアミンおよび１０ ０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補い、バクトドリブトン１６ｇ／ｌ、酵母抽出物 １０ｇ／ｌおよびＮａＣ１５ｇ／ｌという組成を有する２ＸＹＴ培地（サムプル ・ツク等（前出）に記載）２ｍｌ中３７℃で振り混ぜながら、６６０％ｍで約０ ．６０の光学密度になるまで培養する。

−この培養物１００μｍを、１５ｍ１管中１０程度の感染倍率でバクテリオファ ージＭ１３に０７（ファーマシアー参照番号２７−１５２４）により感染させる 。培養物を３７°Ｃで振り混ぜる。

＝１時間後、培地２ｍ１を加える。次いで、培養物を約１６時間３７℃で振り混 ぜながらインキュベーションする。

一培養物１．５ｗｌを、マイクロチューブ中２分間１５０００ｇの遠心分離にか ける。

−上清１ｍｌをマイクロチューブに移し、２．５モルのＮａＣ１を含むポリエチ レングリコール（分子量６０００）の２０％溶液２５０μｍで処理する。混合物 を５分間４℃でインキュベーションすることにより、ファージの沈澱を容易にし 、次いで１５０００ｇで５分間遠心分離する。上清を除去し、ファージのペレッ トを、トリス−ＨＣｌ、１０ミリモル、ｐＨ８およびＥＤＴＡ、１ミリモルとう 組成を有する緩衝液５００μｍに再懸濁する。

−懸濁液を、トリス−ＨＣ１１００ミリモルｐＨ８で飽和させたフェノールによ り１回、次いでクロロホルムにより２回抽出する。

−次いで、１／１０容量の３モル酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）溶液および２． ５容量のエタノールを加えることにより、生成物を沈澱させる。最少限２０分間 −２０℃で沈澱させる。ＤＮＡを１５０００ｇで１０分間遠心分離し、ベレット をエタノールの７０％溶液により洗浄し、次いでトリス−ＨＣｌｌ０ミリモルｐ Ｈ８およびＥＤＴＡＩミリモルという組成を有する緩衝液３０μｍに再懸濁する 。

ｂ）配列決定 ユナイテッド・ステー７・バイオケミカル・シーフェンシング・キット（参照番 号７０７７０）を用いて配列決定反応が行なわれる。この場合、サンガー等、「 プロシーディンゲス・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシー ズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステー７・オン・アメリカＪ、１９７７．１４． ５４６３−５４６７の方法が用いられる。使用されるプライマーは１８ヌクレオ チドのオリゴヌクレオチドであり、これらはＮＣ５０ｃＤＮＡの５′末端近接領 域におけるベクターｐｓＥ１、すなわちＮＣ５０ｃＤＮＡの配列に相補的である 。

２）ＮＣ３０ｃＤＮＡの配列の分析 下記内容は、図２．３および４を参照することによりさらに明確に理解されるは ずである。

ＮＣ５０ｃＤＮＡの配列の分析 （１）ＮＣ３０ｃＤＮＡは、１２８２ヌクレオチドを含み、ポリＡ配列により終 結する。

（２）このヌクレオチド数は、対応するメツセンジャーＲＮＡのサイズ（約１゜ ４　ｋｂ）と一致する（セクション４参照）。

（３）１２６４〜１２６９位において、Ｍ、バーンステイール等、１９８５、「 セル」、４１．３４９に記載された共通配列ＡＡＴＡＡＡと類似した配列ＣＡＴ ＡＡＡは、恐らくはポリアデニル化シグナルであると思われる。８５５〜８６１ ．８７２〜８７訳１１３３〜１１３９および１１５２〜１１５８位において、７ 種のヌクレオチドの配列は、Ｇ、シャク等、１９８６、「セル」、４６．６５９ −６６７に記載された共通不安定性単位ＡＵＵＵＡに対応する配列ＡＴＴＴＡを 含む：ＴＡＴＴＴＡＴ、ＴＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＴＴＡＴおよびＴＡＴＴＴＡＡで あることが判明する。既知サイトカインの大多数の相補的ＤＮＡは、この共通不 安定性単位に対応する配列を有する。

４）ＤＮＡ配列は、１５〜１７位のＡＴＧから翻訳停止コドンに相当する４５３ 〜４５５位のＴＧＡまでの蛋白質の翻訳に関する読み取り可能枠を含む。この読 み取り可能枠には、１５〜１７および５７〜５９位に翻訳を開始し得る２個のＡ ＴＧコドン−１４６個および１３２個のアミノ酸の各々の翻訳されたタンノくり 質に対応する−が存在する。これらの中でも、５７〜５９位のＡＴＧのヌクレオ チド環境は、真核生物における翻訳の開始に関して、コザックＭ、１９７８、「 セル」、１５．１１０９−１１２３に記載された共通配列に最も類似した環境で ある。

（５）シグナルペプチド検索ソフトウェア（以後、ＰＳソフトウェアと呼ぶ）は 、フォノ・ヘイー不、１９８６、「ヌクレオチド・アシッズ・リサーチ」、１４ ．４８３−４９０により記載された方法および情報に従い本出願人により開発さ れた。

このソフトウェアは、この読み取り可能枠において、シグナルペプチドに類似し た疎水性領域および７４〜７５（ＴｈｒとＴｈｒ間）、８６〜８７（ＡｌａとＬ ｅＵ間）　、１１０〜１１１　（ＡｌａおよびＳｅｒ間）および１１６〜１１７ （Ｐｒｏと６１７間）の４つの可能な蛋白質開裂部位を予想する。予想されたシ グナルペプチドは、翻訳を開始し得る２つのＭｅｔのうちの一つとこの４つの開 裂部位のうちの一つの間にある。従って、成熟蛋白質（そのシグナルペプチドか ら開裂された翻訳蛋白質）は、１２６．１２２．１１４および１１２個のアミノ 酸を含む。

同じ予測は、ライスコンシン大学ＵＷＧＣＧソフトウェアを使用して得られた： ドブルクス等、１９８４年、ニュークレイツク・アシッズ・リサーチ、１２巻、 ８７１１〜８７２１選択頁：Ｇ、ボン、ハイシュの方法（上記参照）によりシグ ナルペプチドの試験。

他の周知の配列との比較 成熟タンパク質の１１２個のアミノ酸配列のペプチド配列に最もに密接に関連す る既知のペプチド配列は、Ｋ、　Ｄ、ブラウン等、１９８９年、ジャーナル・オ ン・イムノロジー、１４２巻、６７９〜６８７頁に記載されたマウスタンパク質 Ｐ６００のｃＤＮＡから誘発された１３２種のアミノ酸のタンパク質のペプチド 配列である。このタンパク質をマウスニリン８球（コカナバリンＡを使用して活 性化されたＴｈ２細胞）のサブクラスに発現する。

ウイスコンンン大学のＵＷＧＣＧソフトウェアを使用したニードルマンおよびワ ン／ユ、１９７０年、４８巻、４４３〜４５３頁の方法を使用してそれらのへブ チド配列の比較（ドブル等、１９８４年、ニュークレイツク・アッシズ・リーサ チ、１２巻、８７１１〜８７２１頁、ＧＡＰオプション）は、１１２種中６３種 のにアミノ酸が、同一であり、すなわち約５６％が相同であるということを示す 。Ｆｉｇ、３に示されるように、このアルゴリズム的法は、すべての可能な配列 を男慮し、同一アミノ酸の最大可能な数を対合し、直線配列の穴あきが最小であ る配列を見付けだす。

この方法によるヌクレオチドの配列の比較は、ＮＣ５０ｃＤＮＡコード化配列と マウスタンパク質Ｐ６００のｃＤＮＡ間で約７０％の相同性を示す（Ｆｉｇ。

４参照）。

３）　クローンＮＣ５０ビスのｃＤＮＡの配列決定上記の項目１）で行われた配 列、７５番目の翻訳されたアミノ酸を除いて、クローンＮＣ５０の２についての ＧＡＣでコード化されるＡＳＰおよびＧＧＣでコード化されるＧｌｙである、ク ローンＮＣ５０と同じタンパク賃配列をクローンＮＣ５０の２のｃＤＮＡにつき 見出すことを可能にする。

ＣＯ８細胞は、ＳＶ４０ウィルスのＴ−抗原を発現するサル腎臓細胞である（グ ルラマンＹ１、「セル」、２３．１９８１．１７５−１８２）。ＳＶ４０ウィル スＤＮＡの複製開始点を含むベクター（ベクターｐｓＥ１の場合と同様）の複製 を可能にするこれらの細胞は、動物細胞における遺伝子発現研究用の好ましい宿 主を構成する。

１）ＣＯ８細胞のトランスフェクションおよびＮＣ５０ｃＤＮＡによりコードさ れる蛋白質の一時的発現 直径５ｃｍのベトリ皿（コーニング）中、０．６ｇ／ｌのグルタミンおよび３． ７ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３を含み、５％の割合で牛胎児血清（ギブコ）を補ったダ ルベツコ修正イーグル培地（ギブコ、参照番号０４１−０１９６５Ｘ以後、ＤＭ ＥＭと称す）５ｍｌに５Ｘ１０ＳＣＯ３細胞を接種する。５にの割合で二酸化炭 素を含む雰囲気中３７℃で約１６時間培養後、培養培地を吸引ろ過し、細胞を３ ｍｌのＰＢＳ（ギブコからの燐酸緩衝食塩水）で洗浄する。次いで、１０００μ ｍの（ＤＭＥＭ＋１０％牛脂児血清（ギブコ））、２ＩＯｇ／ｌ１１１の濃度で 平均分子量５０００００のジエチルアミノエチルデキストラン（ファーマシア） １１０μＬ１００ミリモルのクロロキン（シグマ）１．１μｍ、およびアルカリ 性溶解技術、次いで塩化セシウム勾配でのプラスミドＤＮＡの精製により製造さ れたクローンＮＣ５０のプラスミドＤＮＡ（サムブロック等、前出）６μｇから 成る混合物を加える。５％の割合で二酸化炭素を含む雰囲気中３７℃で５時間イ ンキュベーション後、混合物を細胞から回収する。１０％のジメチルスルホキシ ドを含むＰＢＳ（分光分析用、メルク）２！＋１を加える。室温で１分間インキ ュベーション後、混合物を回収し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２％の割合で胎 児牛血清を含むＤＭＥＭ中でインキュベーションを行う。５％の割合で二酸化炭 素を含む雰囲気下、３７℃で４０時間インキュベーションを続行する。

また、プラスミドｐｓＥ１のＤＮＡを用いて上記操作を行うことにより、対照Ｃ Ｏ８細胞を製造した。

２）蛋白質の標識 クローンＮＣ５０のプラスミドＤＮＡによりトランスフェクションされたＣＯ８ 細胞および対照ＣＯ８細胞を用いて、下記操作を全て遂行する。

培養培地を吸引により除き、細胞を３＋１のＰＢＳで２回洗浄する。３ｇ／ｍｉ のグルコースおよび４ミリモルのグルタミンを補ったメチオニン不含有ＭＥＭ（ イーグル最少必須培地）（ギブコー参照番号０４１−０１９００Ｈ）５ａ＋１を 加える。

３７℃で２時間インキュベーションを行う。培養培地を除去し、２００μＣｉの メチオニン５ｓＳ（参照番号５Ｊ１０１５、アマ−ジャム）が加えられた、さら に２ｍ１の同培地を細胞に加える。インキュベージジンを３７℃で６時間行う。

培養培地を除去し、５分間遠心分離にかけることにより、細胞層および懸濁した 細胞を排除し、上清を保持する。

３）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるトランスフェクションＣＯ８細胞の 放射性標識蛋白質の分析 トランスフェクションされたＣＯ８Ｏ８細胞上清１朽ｌびアセトン９ｍｌを一２ ０℃で沈澱させる。懸濁液を遠心分離し、蛋白質ペレットを回収する。それらを 緩衝液（組成ニドリス０．１２５モル、ｐＨ６，８、ＳＤＳ４％およびグリセリ ン２０％）中にとり、混合物を１００℃１０分間加熱する。２０００００ｃｐｍ の放射能に相当する、生成した懸濁液のアリコートを、Ｕ、　Ｋ、レムリ、「ア ナリテイカル・バイオケミストリー」、１９７７．７８．４５９に記載された技 術に従いＳＤＳの存在下１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する 。ゲルを真空乾燥する。放射性標識蛋白質をオートラジオグラフィーにより発色 させる。

オートラジオグラフで、クローンＮＣ５０のプラスミドＤＮＡによりトランスフ ェクションされた細胞について、対照細胞と比較すると、４つの余分のバンド： 見かけ上の分子量９．０±２ｋＤａに対応する高密度の鋭いバンドおよび見かけ 上の分子量１６．０±２ｋＤａに対応する低い強度の分散したバンドの存在が観 察される。従って、クローンＮＣ５０は、分泌されたタンパク質をコード化する （以後タンパク質ＮＣ５０と称する）。９±２ｋＤａバンドに対応する本発明の タンパク質の形態の見掛は分子量は１２３６６Ｄａの１１２個のアミノ酸の成熟 タンパク質で計算された分子量より小さい。この差は、おそらく本発明のタンパ ク質のこの形態の意外な電気泳動移動性によりもたらされる。

見掛は分子量１６．０±２ｋＤａのバンドは、本発明のタンパク質のＮ−グリコ ジル化形態に対応し得る。事実、後者は、Ｎ−グリコジル化され得るアスパラギ ン残基（図２では破線による下線が付されたもので、ドナー等、「ジャーナル・ オフ・セル・バイオロジー」、１９８７．１０５．２６６５に記載された共通配 列に対応する）並びにＯ−グリコジル化され得る幾つかのセリンおよびトレオニ ン残基を有する。

４）１６土２および１７±２ｋＤａの見かけ上の分子量を有する可能なＮ−グリ コジル化の立証 上記２）と同様で行うが、ただし蛋白質Ｎ−グリコジル化阻害物質である１０μ ｇ／ｍｌのツニカナインン（ングマー参照番号Ｔ７７６５）の存在下で、蛋白質 を標識する。

ポリアクリルアミドゲルにおける蛋白質の分析を３）と同様に行う。

オートラジオグラフ上、クローンＮＣ５０のプラスミドＤＮＡによりトランスフ ェクションされた細胞について、対照細胞と比較すると、１つの余分のバンド： 見かけ上の分子量９±２ｋＤａに対応する１つのバンドの存在を示す。これらの 結果は、１６±２ｋＤａの分子量に対応する、３）で観察された組換え蛋白質の 形態がＮ−グリコジル化されていることを示す。

セクション７：ＣＯ３細胞中ＮＣ５０タンパク質の製造４．３ｘｌＯ’ＣＯ８細 胞を、通常ローラーと称する表面積８５０ｃｍ２の円筒の培養フラスコ内グルタ ミン０．６　ｇ／　１およびＮａＨＣＯ３，７ｇ／ｌを含み、５％の割合でウシ 胎仔血清を補足し、ついで二酸化炭素で緩衝化したダルベコ修復イーグル培地（ 以下、ＤＭＥＭという（ギブコ、参照番号０４Ｏ４１−０１９６５））１５０中 に接種した。

約０．２ｒｐｍの回転速度で３７℃約１６時間培養後、培養培地を吸引し、細胞 をＰＢＳ　（ギブコ社製リン酸緩衝食塩水）で洗浄する。次いで下記の混合物を 加える＋ＤＭＥＭ＋１０％胎仔ウシ血清（ギブニア）３５ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌの 濃度にて平均分子量５００．０００のジエチルアミノエチルデキストラン４ｍｌ 　（ファルマシア）、１００ｍＭクロロキノン４０μｍおよびアルカリ融解法に よった後、塩化セシウム勾配におけるプラスミドＤＮＡの精製により製造された （サムプルツク等、上掲）クローンＮＣ５０のプラスミドＤＮＡ１２８μｇｏ５ ％ＣＯ２を含む雰囲気下３７℃５時間インキュベート後、混合物を細胞から回収 する。次いで７％ジメチルスルホキシドを含むＰＢＳ緩衝液３５ｍ１　（分光計 純度、メルク）を４℃で加える。室温で１分３０秒間回転後、混合物を回収し、 細胞をＰＢＳで２回洗浄する。１％ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）を含むＤＭＥＭ培 地（シグマ）１５０ｍｌを回転びんに加え、細胞を５％Ｃｏｔ存在下３７℃イン キュベートする（回転数０．２ｒｐｍ）。トランスフェクション後１日、培地を 吸引して回収し、細胞をＰＢＳで２回すすぐ。血清を含まないＤＭＥＭ培地（シ グマ社製）１５０ｍｌを回転びん毎に加え、回転びんを５日間５％Ｃｏｔの存在 下３７℃で置（（回転数０．２ｒｐｍ）。

トランスフ゛エクシＪン後６日目に採取する。培養培地を７００Ｑｒｐｍで１０ 分間遠心分離する：上清を０．２μｍネルジンフィルターを通して濾過する。

セクシヨンｓ　：　ｃｏｓ細胞中製造されたＮＣ５０タンパク質の精製、および アミノ酸末端配列の決定 １）　ＮＣ５０タンバグ質の精製 見掛は分子量９±２ｋＤａの組換タンパク質の主要成分を、以下の工程を使用し て、セクション７で得られた上清５００ｍ１から精製したニー　溶出液として流 速２ｍ１／分で５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，０）中ＬＭ　ＮａＣ１ 溶液を用いて、５ＱｍＭ酢酸ナトリウム溶液で前以て平衡化したＳファーストフ ロー高速カラム（ファルマシア社製）（１５ｘ１００ｍｍ）でのイオン交換クロ マトグラフィー −溶出物を約１ｍｌの容量にセンタブレツブ膜（アミコン社製）上で濃縮し、つ いで０．１％ＴＦＡを含む溶液中直線勾配３０〜７０％アセトニトリルで、３０ ％アセトニトリルおよび０．　１％ＴＦＡを含む溶液で前もって平衡化したＣ４ カラム（ボーンリー社製）（１００Ｘ２．１ｍｍ）で（逆相）ＨＰＬＣクロマト グラフにかける。組換タンパク質を含む両分（ＳＤＳ存在下ポリアクリルアミド ゲルで電気泳動分析により決定された）を溜める。

２）　見掛は分子量９±２ｋＤａのＮＣ５０タンパク質のアミノ末端配列の決定 １）の終わりで得られたタンパク質をＳＤＳ存在下１６％ポリアクリルアミドケ ルで電気泳動した。タンパク質を、イムモビロン膜（ミリポア社！ｖ）で２５ｍ Ｍトリス−ホウ酸（ｐＨ９，０）　、１０％メタノールの組成の緩衝液中０．８ ｍＡ／ｃｍ”の強度で１時間移動させ、ついでクマシーブルーで視覚化する。

見掛は分子量９±２ｋＤａのバンドを切り取り、アプライド・バイオシステムダ １２ＯＡ型フェニルチオヒダントイン誘導体分析器を連結したアプライド・バイ オシステムダ４フ０Ａ型シークエンサーに入れる。

得られたアミノ末端配列は、以下の配列である（ｔｒ、）：Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖ ａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　入ｒｇ　Ｇｌｕ上記 の配列は、ＰＳＳラフトェアにより予測された４番目の切断部位に対応する（セ クション５のサブセクション２、参照）。

セクション９：酵母中ＮＣ５０ｃＤＮＡの発現ベクターの構築ニブラスミドｐＥ ＭＲ６７３およびこのプラスミドを使用して酵母種の形質転換１）プラスミドｐ ＥＭＲ６７３の構築 プラスミドｐＥＭＲ５８３（ヨーロッパ特許出願４３５７７６に記載）を酵素Ｈ ｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＩＩＩで完全に消化する。２ミクロン複製起点および ＳＴＢ遺伝子座、ＬＥＵ２ｄ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ｐＢＲ３２２起 点、ＰＧＫ遺伝子ターミネータ−１ＵＲＡ３遺伝子、合成プロモーターおよびフ ェロモンアルファのプレプロ領域の出発点を含む、大型フラグメント（以下、フ ラグメントＡと称する。）を精製した。

フェロモンアルファのプロプレ領域の終点および成熟タンパク質をコードしてい るｃＤＮＡを含み、３′末端でＢａｍＩＩＩ制限部位により隣接されたＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＢａｍＩＩＩフラグメント（以下、フラグメントＢと称する）を、プラ スミドｐＳＥ１−ＮＣ３０から出発してＰＣＲ法による増幅により得た。このフ ラグメントの配列はＦｉｇ、５に詳細に記載する。フラグメントＡおよびＢを結 合し、プラスミドｐＥＭＲ６７３を得る。

ａ）ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法の記述ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法は 、当技術の熟練者に周知の方法であり、プライマーとして２種のオリゴヌクレオ チドを使用してあらかじめ変性したＤＮＡの２ストランドを同時に複写すること を可能にする（特に、Ｈ，Ａ、エリツクによる研究：　ｒＰＣＲ法：ＤＮＡ増幅 の原理および適用Ｊ、１９８９年、マツクミリアン・パブリッシャーにより刊行 およびＭ、　Ａ、イニス等：　ｒＰＣＲプロトコールＪ、１９９０年、アカデミ ツク　プレス　Ｉｎｃ、、サンテイエゴ、カルフォルニア、９２１０１、アメリ カ合衆国により刊行）。この技術の原理を以下に要約する。

ＰＣＲ法は、１０〜３０サイクル後、通常Ｔａｑポリメラーゼと称されるテルム ス　アクアチフスのＤＮＡポリメラーゼを使用して、１０〜３０サイクル後、も との鋳型の１００．０００コピーを得ることを可能とする３工程の繰返しに基づ く。３工程は以下である： 鋳型の変性： 二重鎖ＤＮＡを約２分間高温（９２℃〜９６℃）でのインキュベーションにより 一重鎖ＤＮＡに変性する。

プライマーのハイブリダイゼーション これらのプライマーは、増幅される領域の末端とハイブリッドする一対の合成オ リゴヌクレオチドである。２種のプライマーは反射鏡とハイブリッド形成する。

プライマー−鋳型複合物の形成を最適にするためにプライマーを過剰に加える。

プライマーの延長 Ｔａｑポリメラーゼが５′末端から３′末端へプライマー−鋳型複合物を延長す る工程を７２℃で行う。

ＰＣＲ法において、目的の生成物が３回目のサイクルで発現し、次いで顕著に増 幅される。サイクルがおこなわれる間に、増幅生成物は、迅速にプライマーがハ イブリッド形成する鋳型になる。

ｂ）使用されたプライマーの説明 ２種の合成オリゴヌクレオチドを製造する。

以下の配列： ＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡ　ＡＧＣ？ＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＴＣＣＣＣ Ａ　ＧＧＣＣＣＴ　ＧＴＧ　ＣＣＴ　ＣＣ８＠ｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａ ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒ。

領域１　領域２ を有する、プライマー１と称する第１のオリゴヌクレオチドは、２つの異なる領 域二領域１のコード化部分のすぐ前にＨｉｎｄＩＩＩ切断部分を導入することを 可能にするサイレント突然変異によりクルシャン等、１９８２年、第３０巻、９ ３３〜９４３頁に記載の天然配列に関して修飾されたαフェロモンのプレプロ領 域の末端を含む領域１（領域１の１１番目のヌクレオチド）、および１１４個の アミノ酸の成熟タンパク質の起点に対応する（参照セクション５）　、ＮＣ５０ ｃＤＮＡの非コード化ストランドのコード化領域をハイブリダイズすることを意 図する領域である第２領域を有する。

第２のオリゴヌクレオチドは、プライマー２と称し、以下の配列を有する：ＣＧ ＡＣＧＧＡＴＣＣＣＭＡＴＭＴＧＡ　ＴＧＣＴＴＴＣＧＭ　Ｇ領域１　領域２ 第２のオリゴヌクレオチドは、また２種の異なる領域：領域１は、第４番目のヌ クレオチドにＢａｍＨＩを担持し、領域２はＮＣ５０ｃＤＮＡの非翻訳３′領域 に相当するヌクレオチド配列を担持する。この領域はＮＣ５０ｃＤＮＡのコード 化ストランドとハイブリッド形成を意図するものである。

Ｃ）フェロモンおよび成熟タンパク質ＮＣ５０のコード化ｃＤＮＡのプレプロ領 域の末端を示すＨｉｎｄＩＩＩ　−ＢａＩＩＩＨＩ増幅フラグメントの製造プラ スミドｐｓＥ１−ＮＣ３０はタンパク質ＮＣ５０のコード化ｃＤＮＡを担持して おり、これを鋳型として使用した。

プラスミドｐｓＥ１−ＮＣ３０の１１００ｎ、プライマー１の１１００ｎ、プラ イマー２の１１００ｎおよび１〇−倍濃縮反応混合物（最終量：６７ｍＭトリス −ＨＣｌ　ｐＨ８，８，１６，６ｒｎＭ　（ＮＨ４）２Ｓ０４．１ｍＭβ−メル カプトエタノール、６．７ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１５％トリト：／Ｘｌ００，２ ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．２ｍＭ　ｄＮＴＰ、ゼラチン２００ｎｇ）を管に入れ、 混合物の体積をついで水を加えて５０μｌにする。

Ｔａｑポリメラーゼの０５μｍすなわち２５ユニツト（ベーリンガーマン／’１ イム商品番号１１４６−１７３）を加える。ついで、混合物を、水溶液の蒸発を 防ぐためにパラフィンで覆う。

増幅は１５反応サイクル以上でおこり、以下に１サイクルの工程を示す。

９４℃１分間−変性 ５５℃１分間→ハイブリダイゼーション７２℃１分間→重合化 １５サイクル後、酵素反応を２０ｍＭＥＤＴＡの添加により止める。

この方法で増幅されるＤＮＡフラグメントは、約３８０ｂｐの所望の大きさを有 し、ついで単離され、１％アガロースゲル上で精製され、ＰＩＯポリアクリルア ミドゲル（ファルマシア）のカラム上でクロマトグラフにかけて透析され、つい でＨ１ｎｄＩＩＩおよびＢ　ａｍＨＩ粘着性末端を形成するために当技術の熟練 者に周知の常法（サムプルツク等、上掲）により酵素Ｈ１ｎｄＩＩＩおよびＢ　 ａｍＨＩで完全に同時に加水分解される。加水分解後、フラグメントをＰＩＯカ ラム上で精製する。

得られたフラグメントＢの配列はＦｉｇ、５に示す。タンパク質ＮＣ５０のコー ド化部位において、Ｆｉｇ、５のアスタリスクにより示されるＮＣ５０ｃＤＮＡ に関するサイレント突然変異を含む。

フラグメントＡおよびＢを結合させて、プラスミドｐＥＭＲ６７３を得る。

２）プラスミドｐＥＭＲ６１７による酵母菌株ＥＭＹ７６１の形質転換および形 質転換された菌株によるタンパク質ＮＣ５０の発現ヨーロッパ特許０４０８４６ １記載のＥＭＹ７６１株（Ｍａｔ　ａｌｐｈａ、　１ｅｕ２、ｕｒａ３、ｈｉｓ ３）は、ｌ−１０２１の番号のもと１９８９年１２月２７ＢＣＮＣＭに寄託され た株をプラスミド回復して得られ、プラスミドｐＥＭＲ６７３中存在するＬＥＵ ２ｄ欠損選択マーカーおよびＵＲＡ３選択マーカーにより相補され得る突然変異 （１ｅｕ２およびｕｒａ３）を含む。その株を、浸透安定剤、即ちＩＭ濃度のソ ルビトール存在中酵母を原形質処理することを含む、ペックス等（ペックス等、 １９８７年、ネイチャー、第２７５巻、１０４〜１０９頁）により記載された形 質転換技術の変法を使用して、ロイシン原栄養性選択を有するプラスミドｐＥＭ Ｒ６７３と形質転換する。

正確な形質転換プロトコールを以下に示す：ａ）液体ＹＰＧ培地２００ｍ１　（ 下記、第１表参照）を、静止相にある約５×１０６細胞培養物で接種し、この方 法で接種された培養物を３０℃で一夜撹拌する。

ｂ）培養物が約１０７細胞／ｍｌに達するとき、細胞を４００Ｏｒｐｍで５分間 遠心分離し、残渣を１Ｍソルビトール溶液で洗浄する。

Ｃ）細胞を２５ｍＭＥＤＴＡおよび５０ｍＭジチオスレイトールを含む１Ｍソル ビトール溶液５ｍｌ中に懸濁し、３０℃で１０分間インキュベートする。

ｄ）細胞をＩＭソルビトール溶液１０ｍ１で１回洗浄し、ソルビトール溶液２０ ｍ１に懸濁する。チモラーゼ−１００Ｔ（アフィニティーカラム上アルソバクタ ー・ルテウス培養上清の部分精製により得られ、β−１，３−グルカナーゼラミ ナリベンタヒドラーゼを含む、セイカガク　コウギョウ社製市販品）を最終濃度 ２０μｇ／ｍｌになるまで加え、懸濁液を室温で１５分間インキュベートする。

ｅ）細胞をＹＧＰソルビトール培地（第１表、参照）と称するソルビトール含有 の培地２０ｍ１に再懸濁し、静かに撹拌しつつ３０℃で２０分間インキュベート する。

ｆ）懸濁液を２５００ｒｐｍで３分間遠心分離する。

ｇ）細胞を以下の組成の形質転換緩衝液９ｍｌ中に再懸濁する：ソルビトールＩ Ｍ１　トリス−ＨＣｌｐＨ７，５１０ｍＭおよびＣａＣｌ２１０ｍＭ０ｈ）細胞 ０．１ｍｌおよびＤＮＡ溶液５μｍ（約５μｇ）を加え、得られた懸濁液を室温 で１０〜１５分間放置する。

１）以下の溶液１ｍｌを加える：ポリエチレングリコールＰＥＧ４０００　２０ ％、トリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５１０ｍＭおよびＣａＣ１ｚ　１０ｍＭ」）ｌ） で得られた懸濁液０．１ｍｌを、前もって溶解し、約４５℃液状に保ったロイシ ン無含有の固体再生培地（第１表、参照）を含む管に注ぐ。懸濁液をロイシン無 含有の固体再生培地１５ｍ１の固体化された層を含むベトリ皿に注ぐ。

形質転換物が３日後現れ始める。１種の形質転換体はＥＭＹ　７６１　ｐ　ＥＭ Ｒ６１７株と称し、この方法で選択した。

第１表 酵母菌株ＥＭＹ７６１の形質転換のためのプロトコール中に使用された主要培地 の組成および製造 ＹＰＧ液体培地 酵母抽出物１０ｇ（ディフコ社製抽出のバクトー酵母）ペプトン２０ｇ（ディフ コ社製バタトーペプトン）グルコース２０ｇ 蒸留水中に成分を混合する。蒸留水で最終容量１７！にする。１５分間１２０℃ で高圧滅菌する。

ＹＰＧソルビトール培地 液体ＹＰＧ培地の組成を使用して、高圧滅菌後、ＩＭ濃度にソルビトールを加え る。

ロイシン無含有固体再生培地 アミノ酸を含まない酵母窒素ベース（ギフコ社製）６．７　ｇアブ３２２０ｍｇ ウラシル２０ｍｇ Ｌ−トリプトファン２０ｍｇ Ｌ−ヒスチジン２０ｍｇ Ｌ−アルギニン２０ｍｇ Ｌ−メチオニン２０ｍｇ Ｌ−チロシン３０ｍｇ Ｌ−イソロイシン３０ｍｇ Ｌ−リジン３０ｍｇ Ｌ−フェニルアラニン５０ｍｇ Ｌ−グルタミン酸１００ｍｇ Ｌ−バリン１５０ｍｇ グルコース２０ｇ 寒天３０ｇ ソルビトール１８２ｇ 成分を蒸留水中に混合する。蒸留水で最終容量１１にする。１２０℃で１５分間 高圧滅菌する。高圧滅菌後、Ｌ−トレオニン２００ｍｇおよびＬ−アスノくラギ ン酸１００ｍｇを加える。

セクション１０ 二−レンマイヤーフラスコ中、形質転換株によるタンパク質ＮＣ５０の発現およ びＳＤＳの存在中ポリアクリルアミドゲル上で培養培地中タンパク質の検出１） ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ６７３の培養ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ６７３株（セクシ ョン９で得られた）のコロニーをウラシル−無含有液体培地５０ｍ１中培養した 。この培地は１１当たり以下のものを含む。

一アミノ酸を含まない酵母窒素ベース６．７ｇ（ディフコ社製）−カゼイン加水 分解物５０ｇ（ディフコ社製カザミノ酸）グルコース１０ｇ ３０℃で１夜撹拌後、培養株を１０分間遠心分離し、ベレットを無菌水１０ｍ１ に取り、再び１０分間遠心分離した。タンパク質ＮＣ５０の発現を以下の組成の 培地５０ｍ１中に細胞を取って誘発した。

アミノ酸無含有の酵母窒素ベース素地６．７ｇ／ｌ（ディフコ社製）カゼイン加 水分解物５．０ｇ／］　（ディフコ社製カザミノ酸）グリセリン３０．０　ｇ／ 　］ ガラクトース３０．０ｇ／ｌ エタノール１０ｍ１／１ 培養物を撹拌しつつ３０℃２４時間再インキュベートした。

２）発現タンパク質の解析 ａ）ＳＤＳ存在存在リポリアクリルアミドゲルサンプル製 組成を第２表に示すグルコースを含むウラシル−無含有液体培地と称する培地中 −夜培養された細胞の一部を遠心分離し、非誘発サンプルを得た。エタノール、 グリセリンおよびガラクトースを有するウラシル−無含有液体培地（下記第２表 ）と称する培地中−夜培養した細胞を遠心分離し、誘発されたサンプルを得た。

上清を集めた。デオキコラート２ｍｇ／ｍｌを含む５０％トリクロロ酢酸５Ｑｍ ｌを上清１０ｍ１に加えた。

混合物を３０分間温度４℃で放１し、ついで３０分間遠心分離した。残渣を冷ア セトン（＋４℃）約１ｍｌに取り、再び３０分間遠心分離した。乾燥後、ベレッ トを、当技術の熟練者に周知の１９７０年にラエミリにより開示されたプロトコ ールにより、トリス−ＨＣｌ　ｐＨ６，８０，１２５Ｍ、ＳＤＳ　４％、ブロモ フェノールブルー０．　ＯＯ２％、グリセリン２０％およびβ−メルカプトエタ ノール１０％を含むいわゆる充填緩衝液２０μｌに取る。ベレットを１５分煮沸 して可溶化し、ついでブロモフェノールブルーが青に変わるまで中和する。

サンプルをＳＤＳ存在下ポリアクリルアミドゲル上に置き、電気泳動にかける。

結果 ゲルの解析（クーマシーブルーで発色させる）は、見掛は分子量９±２（主形態 ）および１１±２ｋＤａに相当する２種の主要なバンド、非誘発サンプルと比較 して誘発サンプルの数個の付属バンドの存在を示す。観察された他の付属バンド は、糖鎖形成の様々な程度に相当してかなり多数であり、広がっている。

酵母によるタンパク質のＮ−糖鎖形成は、小胞体中単一糖鎖形成（コア糖鎖形成 ）およびゴルジ装置中Ｎ−高度糖鎖形成（外鎖糖鎖形成）を含む（Ｒ，Ａ、ヒラ マン等、１９９０年、メソード・イン・エンザイモロジー、第１８５巻、アカデ ミツク・プレス、４２１〜４４０頁）。一般に、単−Ｎ−糖鎮形成は均一なの見 掛は分子量（１個のバンド）の糖タンパク質を産生じ、外糖鎖形成は不均一な見 掛は分子量の糖タンパク質（数個の異なるバンド）を産生ずる。

ｂ）潜在的なエンドグリコシダーゼＨ処理でのイムノブロッティング（ウェスタ ンプロット） サンプルの調製 グルコースを有するウラシル−無含有液体培地中で一夜培養された細胞（第２表 ）を遠心分離し、非誘発サンプルを得た。エタノール、グリセリンおよびガラク トースを有するウラシル不在液体培地中−夜培養された細胞（第２表）を遠心分 離し、誘発サンプルを得た。上清を集めた。デオキシコラート２ｍｇ／ｍｌを含 む５０％トリクロロ酢酸５ｍｌを上清１０ｍ１に加えた。

混合物を３０分間温度４℃で放置し、ついで３０分間遠心分離した。ペレツトを 冷アセトン（＋４℃）約１ｍｌに取り、再び３０分間遠心分離した。ペレツトを 可溶化緩衝液（組成ニドリス−ＨＣｌ　ｐＨ６，８１０ｍＭ　β−メルカプトエ タノール２％、ＳＤＳ１％）２０μｌ中に取る。ベレットを１００℃５分間加熱 する。

サンプルをついで２部分に分ける・ −５ＱｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液１０μｍ　ｐＨ５，５およびエンドグリコ シダーゼＨ（５ｍＩｔＪ−ベーリンガー商品番号１０８８７２６）１０μｌを第 １画分１０μｍに加える。サンプルを約−夜３７°Ｃで放置する。充填緩衝液２ ０μｍをついで加える。

一充填緩衝液１０μｌを、第２の１０μｍ部に加える。試料を１０分間煮沸する 。

試料をＳＤＳ存在存在リポリアクリルアミドゲル用し、ラエミリのプロトコール に従って電気泳動法を行う（上記の引用、参照）。

ゲル中得られたタンパク質をついでニトロセルロース膜に移す（Ｈ，トウービイ エンス、アメリカ合衆国、第７６巻、４３５０〜４３５４頁に記載の技術による ）。バイオ−ラッド（商品番号１７０〜６４５０）社製免疫−プロット検定キ・ ソトに記載のプロトコールにより行われる免疫検出は、下記の工程を含むニーゼ ラチン３ｇ／１００ｍ１を含むＴＢＳ　（トリス緩衝化食塩水）とともに３０分 間のニトロセルロース膜の飽和ニ ーＴ、ＴＢＳ　（０，０５％トウィーン２０を含むＴＢＳ）と称する緩衝液で５ 分間２回膜をすすぐ； 一部をセクション１３で製造された免疫血清を１時間室温で接触させる；−キッ トの結合抗体と膜を接触する 一Ｔ、ＴＢＳ緩衝液で５分間２回、ＴＢＳ緩衝液で５分間１回膜をすすぐ一抗原 一抗体複合物を、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスファ−ト（Ｂ ＣＩＰ）およびニトロブルー・テトラゾリウム（ＮＢＴ）を含む発色緩衝液と接 触させて視覚化するニ 一部を水をすすぐ。

結果 イムノブロッティングの解析は、非誘発サンプルと比較するとエンドグルコシダ ーゼＨで未処理の誘発サンプルについて、別の数個の付属ノくンドの存在を示し 、そのうち、２つの主要な付属バンドは見掛は分子量９±２および１１±２ｋＤ ａに相当する。より高い分子量である他の多数の広いノくンドもまた明らかにな る。

すべてのこれらのバンドは、セクション１３で製造した免疫血清により認識され る。

誘発された試料において、見掛は分子量１６±２ｋＤａに対応するノくンドは、 エンドグリコシダーゼＨ処理後消失すると思われ、一方、９±２ｋＤａｚ＜ンド は、同じ条件下強度を増強する。これらの結果は、見掛は分子量１６±２ｋＤａ のタンパク質がＮ−グリコジル化されるということを示す。

高分子量の広いバンドもまた消失し、見掛は分子量約２８±２および２０±２ｋ Ｄａに対応する２種のバンドの出現が、注目される。エンドグリコシダーゼＨ処 理に耐性であるＮＣ５０タンパク質の形態は、フェロモンのプロ配列を残す前駆 物質、またはＮＣ５０タンパク質の○−グリコジル化形態に対応し得る。

第２表 サンプル製造に使用される培地の組成および製造−グルコースを有するウラシル −無含有液体培地−アミノ酸−無含有酵母窒素ベース６．７ｇ（ディフコ）−カ ゼイン加水分解物５．０ｇ（ディフコ社製カザミノ酸）−グルコース１０．０　 ｇ 全成分を蒸留水中混合し、蒸留水で最終体積１１にする。１２０℃１０分間高圧 滅菌する。

一エタノール、グリセリンおよびガラクトースを有するウラシル−無含有液体培 地： 上記のウラシル−無含有液体培地の処方を使用するがグルコースは含まない。

高圧滅菌後、１００％エタノール１０　ｍ　ｌ　’−グリセリン３０ｇおよびガ ラクトース３０ｇを加える。

セクション１１　：ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ６７３株を使用する発酵槽中ＮＣ５０ タンパク質の製造 ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ６７３の培養は以下の方法で発酵槽中行われる：ａ）　じ ゃま板付円錐状フラスコ中での前培養相高圧滅菌相半合成成長培地（Ａ　Ｐ　Ｓ 　ＧＭ）を含む５００ｍ１のじゃま板付円錐状フラスコに、ＭＥＳ　−２（Ｎ− モルホリ）エタンスルホン酸（シグマ社製　Ｍ８２５０）　−緩衝液１．　２８ ｇ、および濾過相半合成成長培地（ＦＰＳＧＭ）のｌＱｍｌを補足し、２０％の グリセリンを含み、λ６００ｎｍで０Ｄ＝３（フントロン分光計による）に対応 する細胞数を有する上記の株の培養懸濁液１ｍｌで接種する。化学的組成および ＡＳＰＳＧＭおよびＦＰＳＧＭ培地の製法を以下に詳細に記載する。３０℃で撹 拌しつつインキュベーン３２２４時間後、λ６００ｎｍで培養の光学密度（ＯＤ ）は、約７である。

ｂ）　発酵槽における成長相 上記の培養は、先に、 ＡＰＳＧＭ培地８００ｍ１゜ ＦＰＳＧＭ培地１００ｍ１充填した２、５１発酵槽を接種するために用いる。

培養ｐｔ−ｔを、発酵槽により固定値５．５に調節する。同様に、酸素圧は、撹 拌を調節して約４０００Ｐａ　（３０ｍｍＨｇ）を維持する。初めに、約ＩＶＶ Ｍに等しい空気流速を１１／分に固定し、ついで必要に応じて徐々に増大する。

３０℃で６〜７時間培養後、総量グルコース３６ｇと等しい５００ｇ／ｌを含む グルコース溶液７２ｍ１を９時間かけて直線的に加える。

Ｃ）　発酵槽における発現相 高圧滅菌相の半合成発現培地（ＡＰＳＥＭ）１００ｍｌおよび濾過相半合成発現 培地（ＦＰＳＥＭ）１００ｍｌを上記の混合物に加える。その化学組成および製 造法は以下に詳細に記載する。ついで、他の物質を加えないで約５時間培養を続 ける。３種の炭素源（グリセリン、ガラクトース、エタノール）をＨＰＬＣで監 視し、以下の値に近づけるために無菌注射により補う：グリセリン１５ｇ／ｌ、 エタノール１５ｇ／］、ガラクトース７．５ｇ／１０２３〜２４時間後および誘 発後および誘発中、λ＝６００ｎｍでのＯＤは、約９０となり、培養を中止する 。

培養懸濁物は、ついで１１５００ｇで３０分間遠心分離する。酵母細胞ベレット を除去し、上清を一８０℃で凍結保管する。

成長および発現培地の化学組成 −高圧滅菌相半合成成長培地ｒＡ　Ｐ　Ｓ　ＧＭＪ最終８００ｍ１につき （超精製水を使用） ＮＴＡ　にトリロトリ酢酸）１ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１，Ｏｇ ＣａＣ１２・７Ｈｚ０　７００ｍｇ グルタミン酸　３．７ｇ ＨＹ−ＣＡＳＥ　ＳＦ（シェルフイールドプロダクト）２５ｇロイシン　１・８ ｇ 濃Ｈ，Ｓ０４または濃ＫＯＨでｐＨ５，５に調整する。

２０分間１２０℃で高圧滅菌する。

−Ｉ−３型微量成分一覧表 最終１１につき （超精製水を使用） 硫酸ｔｉ４　Ｃｕ　Ｓ　Ｏ４・５　Ｈ２０７８０ｍ　ｇホウ酸　Ｈ３ＢＯ３”ｇ ｉ酸亜鉛Ｚ　ｕ　Ｓ　０４　’　７　Ｈｚ○　３ｇヨウ化カリウム　ＫＩ　Ｉｇ 硫Ｍマ’：Ｉ＊シウム　Ｍｎ　Ｓ０４　・２ＨｚＯ３，５ｇモリブデン酸ナトリ ウム　Ｎａ、ＭｏＯ２・２８２０　２ｇ溶液に濃塩酸１００ｍ１を加える。

１０００ｍ１１．：する。

−濾過相半合成成長培地ｒＦＰｓＧＭＪ最終１００ｍ１につき （超精製水を使用） ＫＨｚＰＯ４４ｇ トリプトファン　３５０ｍｇ ｌ−５型ビタミン（以下参照）　１ｍｌグルコース　１５ｇ 加熱溶解し、微温まで冷却し、Ｉ−３型ビタミンを加えて、０，２μｍ膜を通し て濾過により無菌化する。

−Ｉ−Ｓ型ビタミン一覧表 最終１００ｍ１につき （超精製水を使用） ビオチン　５ｍｇ 葉酸　４　ｍ　ｇ ナイアシン　６ｍｇ にコチン酸　−塩酸ピリドキシン）　２５０ｍｇ塩酸チアミン　１ｇ パントテン酸カルシウム　５ｇ ｍ−イノシトール　１０ｇ 溶解後１００ｍ１にする。

０．２μｍ膜を通して冷却状態で無菌条件下濾過する。

＋４℃の温度で保管する。

−高圧滅菌相半合成発現培地ｒＡＰＳＥＭＪ最終４００ｍ１につき （超精製水を使用） ＨＹ−ＣＡＳＥ　ＳＦ（ノエフィールドプロダクト）　２０ｇロイシン　１・　 ８ｇ ヒスチジン　５００ｍｇ メチオニン　１ｇ トリプトファン　３５０ｍｇ ＭｇＳＯ４’２Ｈｚ０　６００ｍｇ ｌ−３型微量成分（上記参照）　５ｍｌ濃Ｈ２Ｓ　Ｏ４またはＫＯＨでｐＨ５， ５ｉ：Ｆｌ整ｔ６゜温度１２０℃で１２０分間高圧滅菌する。

−濾過相半合成発現培地ｒＦＰｓＥＭＪ最終１００ｍ１における （超精製水を使用する） １−Ｓ型ビタミン（上記参照）　１ｍｌ加熱溶解し、微温まで冷却し、ビタミン 類を加えて、０．２μｍ膜を通して濾過により滅菌する。

ｄ）　製造されたタンパク質の分析 試料をセクション１０に記載と同様の方法で製造し、ＳＤＳの存在下ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動を行った。バンドの分布は、誘発された試料のセクション １０で観察したゲルと同じゲル上で観察する。

セクション１２・酵母中産生されるプロティンＮＣ５０の精製およびそのアミノ 末端配列およびペプチドマツプの決定１）プロティンＮＣ５０の２種の主要成分 の精製組換酵母タンパク質の主要成分（それらのバンドは、ＳＤＳ存在下ポリア クリルアミドゲル電気泳動後、見掛は分子量９±２ｋＤａおよび１６±２ｋＤａ に対応する）を分離し、以下の方法によりセクション１１で得られた上清５００ ｍ１から精製する 各二種を連続して行った。

一５０ｍＭｐＨ４，０酢酸ナトリウム液で前もって平衡化されたＱファーストフ ローカラム（５Ｘ５ｃｍ）（ファルマシア）上でのイオン交換クロマトグラフィ ー。流速：１ｍｌ／分。上清のｐＨは、前以て４．０に調整する。これらの反応 条件下、タンパク質はゲルに結合しない。

５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４，０）で前以て平衡化したＳファーストフ ローカラム（ファルマシア社製）（５Ｘ４ｃｍ）で溶出液として５０ｍＭ酢酸ナ トリウム緩衝液（ｐＨ４，０）中１ＭＮａＣ１溶液で、イオン交換クロマトグラ フィーにかける。流速：１ｍｌ／分。

−溶出物をＹＭ５膜（アミコン社製）で濃縮し、容量２ｍｌにし、ついで０゜１ ４ＭＮａＣ１を含むＯ，１Ｍリン酸緩衝液中平衡化したＡＣＡ５４　（ＩＢＦ） ゲル濾過カラム（１００Ｘ１．５ｃｍ）に適用する：流速・０．２ｍｌ／分。組 換タンパク質を含む両分（ＳＤＳ存在下ポリアクリルアミドゲル上電気泳動によ り決定された）を集める。

得られた溶液をＳＤＳ存在下ポリアクリルアミドゲル上電気泳動にかけ、硝酸銀 で視覚化した。見掛は分子量９±２ｋＤａおよび１６±２に、Ｄａｌ：ｉ応する 純度７０％以上のＮＣ５０タンパク質の２種の主要成分が見られた。この溶液を 、下記の生物活性の試験に用いる。

もう１つの実験において、溶出液として直線勾配３０％〜７０％アセトニトリル １０．　１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を用いてＣ４カラム（ブラウンリー社 製）上道相ＨＰＬＣ工程を精製プロトコールへ導入した。純度が９０％以上であ る化合物（ＳＤＳ存在存在リポリアクリルアミドゲル上電気泳動び硝酸銀で視覚 化における評価）を得ることが可能である。

２）　ＮＣ５０タンパク質の２種の主要成分のアミノ末端配列の決定精製された タンパク質をＳＤＳ存在下１６％ポリアクリルアミドゲル上電気泳動にかけた。

ゲル中タンパク質を２５ｍＭ）リス−ホウ酸塩（ｐＨ９，０）　、１０％エタノ ールの組成の緩衝液中１時間０．８ｍＡ／ｃｍ”でイモピロン膜（ミリポア社製 ）へ移す。

見掛は分子量９±２ｋＤａおよび１６±２ｋＤａに対応する２種のバンドを切り 取り、アプライドバイオシステム１２０Ａ型フエニルチオヒダントイン誘導体分 析器を備えるアプライドバイオシステム４７０Ａ型に入れた。

それらのバンドは、同一アミノ末端配列（ｔｒ＋）を有する：Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕｌ 　５　１０ 上記の配列は、所望されるアミノ−末端配列である。セクション５に記載の１１ ４個のアミノ酸（Ｆｉｇ、２、参照）の成熟タンパク質のそれである。そのコー ド配列をセクション９のベクターｐＥＭＲ６７３中に導入する。

３）　見掛は分子量９±２ｋＤａのＮＣ５０タンパク質の形態のペプチドマツプ の決定 見掛は分子量９±２ｋＤａのタンパク質をブタトリプシンでゲル中消化し、下記 の条件下逆相ＨＰＬＣにより分離した。

セクション１１で得た酵母上清をトリクロロ酢酸で沈澱させ、ＳＤＳを含む緩衝 液中１００℃で可溶化後、沈澱物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。

ゲル中タンパク質をクマシンプルーを用いて視覚化した。見掛は分子量９±２ｋ Ｄａのバンドをゲルから切り取り、Ｊ、ローゼンフェルド等による論文「ゲル中 −次元および二次元ゲル電気泳動後向部配列解析のためのタンパク質の消化」に 記載された開示の方法に従ってゲル中ブタトリプシンで消化した。

ついで、トリプシン消化ペプチドを６０分間かけて０．１％ＴＦＡ溶液中１〜７ ０％アセトニトリル勾配でベックマンアルテックスＣ１８カラム（０，２１Ｘ２ ５ｃｍ）上逆相）（ＰＬＣクロマトグラフィーにより分離した。ピークを２１８ ｎｍで光学密度の測定により検知する。

ピークに対応する各画分（以後第１画分および箪２両分と称する）を上記のアプ ライドバイオシステム４７０型シークエンサーを使用して分析する。

得られたアミノ末端配列は以下のようであるニー　第１画分において： Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　 Ｈｉｓ　Ｖａｌ上記の配列は、翻訳されたＮＣ５０タンパク質のアミノ酸１０８ 〜１１８個に対応する（　Ｆ　ｉｇ、参照） −第２画分において： Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　 Ａｌａ　ＬｅｕおよびＬｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ 上記の配列は、各々翻訳されたＮＣ５０タンパク質のアミノ酸３３〜４３種およ び１３８〜１４０種に対応する（Ｆｉｇ、２参照）。

セクション１３：エシェリキア・コリにおけるＮＣ５０タンパク質の細胞質の発 現および免疫血清の製造 １）　エシェリキア・コリ中ＮＣ５０タンパク質の細胞質の発現エシェリキア・ コリにおける１１２個アミノ酸のメチオニル化成熟ＮＣ５０タンパク質の発現ベ クター（ｐｓＥ７１４．１２と称する）をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位で開裂 したベクターｐＥＴ３ａへＮＣ３０ｃＤＮＡの部分を担持するＤＮＡ断片を挿入 して構築した。この発現ベクターは、以下の５゛〜３°　を含む−ローゼンベル グ等、ジーン、５６巻、１２５〜１３５頁に記載されたプラスミドｐＥＴ３ａ中 に含まねる、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼプロモーター−ＡＴＧ翻訳イニ シエーターにより続＜、１１２個のアミノ酸の成熟タンパク質をコード化するＮ Ｃ３０ｃＤＮＡの部分（セクション５、参照）−ファージエフ遺伝子１０のター ミネータ−（ストラブイニル等、ジャーナル・オン・モレキュラー・バイオロジ ー・１９８６年、１８９巻、１１３〜１３０頁）この発現カセットは、ファージ Ｔ７に特異的なＲＮＡポリメラーゼの存在下だけで機能する。従って、宿主エシ ェリキア・コリ株で合成されるこのＲＡＮポリメラーゼを合成することは適切で ある。λＰＲプロモーターの制御下このＲＮＡポリメラーゼの発現カセットを、 この酵素（スチュディエル等、１９８６年、ジャーナル・オン・モレキユラー・ バイオロジー、１８９巻、１１３〜１３０頁によりファージλＣＥ６ＤＮＡへク ローン化された）のためのコード化配列を挿入することにより構築した。この発 現カセットは、このＰＲプロモーターのリプレッサーの温度感受性形態をコード 化する］　（ＣＩ８７５）の対立遺伝子を含む（Ｐ、レエプレトロイス等、１９ ８３年、バイオケミ、６５巻、３１７〜３２４頁）。

従って、低温でＤＮＡポリメラーゼの発現のカセットを抑制し、高温で発現を抑 制しない。この発現カセットを、Ｎ、ケルフナ−（１９８４年、ジーン、３２環 、３６９〜３７９頁）のプラスミド由来の組込みベクターｐＥＪＬ４０７へクロ ーン化した。得られたベクターは、プラスミドｐＥＭＲ６４８である。このベク ターを細胞のエビソーム状態で維持し、転移がＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チ オガラクトシド）で誘発されるとき、ポリメラーゼ（ＣＩリプレッサーを含む） の発現カセットの１またはそれ以上の複写の組込みをもたらす。この組込みを招 （トランスボザーゼは、１ａｃＩ遺伝子の制御下にあるが、それ自身を１移しな い。

従って、プラスミドが消失後、安定な組込みを得ることが可能である。ｐＥＭＲ ６４８でエシェリキア・コリ株に１２１（ＢＩＯＩ　（ギフコＢＲＬ　−商品番 号８２６０ＳＡ）を形質転換、およびついで形質転換体に対して組込みをもたら すことにより、温度感受性ＰＬ−ＣＩ機構の制御下ファージ７ポリメラーゼの発 現の２種のカセットを含み、染色体に組み込まれるＨＢＩＯＩ誘導体（ＶＧ１１ ２と称する）を得た。のエシェリキア・コリ株ＶＧ１１２からプラスミドｐＥＭ Ｒ６４８をクリアし、低温（３０℃）でプラスミドｐＥＭＲ７１４で形質転換す る。

選択され、１９９１年１２月２０日に寄託番号ｌ−１１６２下ＣＮＣＭに寄託さ れた軽質転換体（株ＶＧ１１２ｐＳＥ７１４．１２と称する）を、３０℃６０Ｑ ｎｍでＯＤ　１まで濃度１００μｇ／ｍｌでアンピシリンを含むＬＢ培地で培養 した。ポリメラーゼ遺伝子の発現を４１℃で２時間ＩＰＩＧを用いて誘発した。

クリアされ、形質転換されないＶＧ１１２（対照株）と比較して余分のバンドに 対応する変性ポリアクリルアミドゲル上絵細胞抽出物の分析は、９ｋＤａタンパ ク質を証明し得た。音波処理、ついで遠心分離による細胞溶解は細胞抽出物を以 下の２種の両分に分離し得る：可溶性画分（上清）および不溶性画分（ペレット ）。ＮＣ５０タンパク質は不溶性画分のタンパク質で発見され、この画分のタン パク質の約５０％（質量）を示す。

２）　ＮＣタンパク質を認識する免疫血清の製造この不溶性画分をウサギ（体重 的２ｋｇのニューシーラント雄）の免疫化に利用した。免疫化は、パイツカイテ イス、１９８１年、メリーズ・イン・エンザイモロジー、７３巻、４６頁に記載 のプロトコールに従って１５日毎に行った。最初の注射において、抗原溶液の１ 容量をフロイント完全アジュバント（シグマ社製　−商品番号４２５８）の１容 量で乳化する。６種のブースターをフロイント非完全アジュバント（シグマ社製 　−商品番号５５０６）中投与した。

得られた免疫血清は、ＳＤＳ存在中ポリアクリルアミドゲル電気泳動後免疫検３ ）　ペプチド地図作製によるＮＣ５０タンパク質の特徴１）で得られた不溶性画 分をＳＤＳ存在存在リポリアクリルアミドゲル電気泳動ける。ゲル中タンパク質 をクマンンブルーで染色して視覚化する。見掛は分子量９±２ｋＤａに対応する バンドをゲルから切り取り、ゲル中ブタトリプシンで消化し、トリプシンペプチ ドをセクション１２−３）の記載と同様に分離した。

ピークに対応する画分をアブライドバイオシステムダ４フ０Ａ型シークエンサー を用いて分析した。

得られたアミノ末端配列は以下のとおりである：Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌ ｙ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｎ　Ｖａｌ　Ａｒｇ配列中、Ｎ は、未決定のアミノ酸を示す。

この配列は、翻訳されたＮＣ３タンパク質（Ｆｉｇ、２、参照）のアミノ酸１０ ８〜１０９個およびセクション１２で分析された第１画分のペプチドに対応する 。

セクション１４：ＬＰＳ−刺激末梢血単球によりＩＬ−１βおよびＩＬ−６ｍＲ ＮＡの製造に関する阻害活性のＮＣ５０タンパク質の証明１）　使用された方法 ａ）　細胞製造 末梢血（輸血センターの健常な志願者から採取した）から、赤血球の大部分を０ ．６％デキストラン、０．０９％ＮａＣ１を含む培地中３７℃３０分間沈降して 除去する。細胞をついでフィコルーバク（ファルマシア社製）の層の最上部に置 き、３０分間４００ｇで遠心分離する。フィニルと上清の界面に存在する末梢血 単核細胞（ＰＢＭＮＣ）を取り出す。ＰＢＭＣを１〜５Ｘ１０７細胞／皿を基準 として直径１５ｃｍ培養皿で１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含むＲＰＭＩ培地 （ＲＰＭ１１６４０培地　−ギブコＢＲＬ）中に置（。３０分間後、培地を吸引 し、皿に付着した細胞（主に単核細胞からなる）を以下のようにインキュベート する。

ｂ）　ＬＰＳおよびＮＣ５０タンパク質ど細胞のインキュベーション付着性のＰ ＢＭＮＣを５％ＣＯ２を含む雰囲気下４時間３７℃でＲＰＭＩ／１０％ＦＣ３の ２０ｍ１中、リポ多糖類ＬＰＳ　（シグマ社製　−商品番号Ｌ４３９１）の５μ ｇ／ｍｌと精製酵母（０，１〜１０ｎｇ／ｍｌ）由来の濃度を順次高くしたＮＣ ５０タンパク質、またはプラスミドｐｓＥＩ　ＮＣ５０でトランスフェクトし、 セクション７に記載と同様に培養されたか、または同様の条件下プラスミドｐｓ Ｅ１でトランスフェクトした（対照）かのいずれかのＯ８細胞の上清とともイン キュベートする。

ｃ）　ＲＮＡ製造および分析 細胞をＰＢＳで洗浄し、ついで緩衝液Ｄ（組成、４Ｍグアニジウムチオシアネー ト、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．５％サルコシル、０．１Ｍβ−メルカプ トエタノール：クロモクジンスキー　Ｐ、およびサツキ、Ｎ、（１９８７年）、 アナリティカル・オン・バイオケミストリー）１ｍｌ中かき集めて直接入れる。

ＲＮＡをそれらの著者により記載された酸性ｐＨでのフェノール抽出法により製 造する。ＲＮＡ１〜５μｇをホルムアルデヒドの存在下１％アガロースゲルに適 用する（サンプルツク等、止揚）。移動後、ＲＮＡを強化セルロース膜（シュラ イバーおよびシュエル）上に移し、セクション４の放射標識化ｃＤＮＡプローブ でハイブリダイズする。種々のプローブと各々ＲＮＡのハイブリダイゼーション の強度を、ホスホリメゲル装！でりん光分析（モレキュラー・ダイナミックス、 ８００　Ｅ、　アークニス・アベニュー、サニーバレー、カリフォルニア、９４ ０８６−　ニーニスニー）により定量する。

２）−結果 ４回の実験における精製ＮＣ５０タンパク質で得られた結果の平均および標準偏 差を第３表に示す。リン光分析により測定されるメンセンジャーＲＮＡのＩをＬ ＰＳのみで処理された細胞から産生ずる試料で測定されたメツセンジャーＲＮＡ の量に対するパーセントとして表す。

第３表 ＮＣ５０タンパク質の種々の濃度におけるＩＬ−１βおよびＩＬ−６メツセンジ ヤ上記の表を読み取れば、ＬＰＳ処理単球中ＩＬ−１βおよびＩＬ−６メツセン ジヤーＲＮＡの蓄積は、ＮＣ５０タンパク質のより阻害されるということが判明 する。最大阻害は、ＮＣ５０タンパク質の１０ｎｇ／ｍｌ濃度で観察され、５０ ％阻害を得た濃度（ＩＣ，。）は、約１ｎｇ／ｍｌである。

更に、生成物ＩＬ−１βおよびＩＬ−６メツセンジヤーＲＮＡの阻害は、プラス ミドｐｓＥ１−ＮＣ３０でトランスフェクトされたＣＯ８細胞の上清の存在下同 様に見られ、対照ＣＯ８細胞の上清の存在下では、阻害は見られない。

ＮＣ５０タンパク質の存在下ＬＰＳで処理した単球の培養培地中ＩＬ−１βおよ びＩＬ−６タンパク質の製造の阻害は、また他の実験でも見られた。ＩＬ−６を り、　Ａ、アーチン、１９８７年、ヨーロピアン・ジャーナル・オン・イムノロ ジー、１７巻、１４１１〜１４１６頁により記載された方法に従って、Ｂ９ハイ ブリドーマ系の増殖に対する影響により分析した。（試料中ＮＣ５０タンパク質 の存在する量は単球により製造されるＩＬ−６量のＢ６系による分析に影響しな い。）ＩＬ−１βの分析をＥＷ、パラシジンスキー、１９８７年、バイオケミカ ル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション、１４７巻、２ ０４〜２１１頁により記載される方法に従ってＥＬ４細胞で行い、これは放射標 識化ＩＬ−１βとの結合の競合を測定することにある。

セクション１５：ＮＣ５０タンパク質について扁桃腺Ｂ細胞によるＣＤ２３表面 抗原の量の調節の証明 １）　使用された方法 ａ）　細胞製造 外科手術後６才女子からヒト扁桃腺を除去した。扁桃腺を４℃に冷却したＲＰＭ Ｉ培地中メスで切裂した。この操作後培地に放出された細胞をガーゼを通して濾 過し、均一な細胞懸濁液を得た。２回の洗浄後、細胞を数え、１０％ＤＭＳＯ（ メルク社製）を含むウシ胎児血清中に取る。１ｍｌ容積中７．５ｘｌＯ’セルを 各凍結管に分配する。細胞を一８０℃２４時間真空フラスコ中に置き、ついで液 体窒素中に保管する。

ｂ）　ＮＣ５０タンパク質と細胞のインキュベーション実験当日、細胞のアリコ ートを３７℃で溶解し、ついで１０％ウシ胎児血清を含むＰＲＭＩ培地５Ｑｍｌ 中ゆっくり希釈する。細胞を遠心分離し、ＤＭＳＯを除く。細胞を計数後、４Ｘ １０’セル／ｍＩに再調整された細胞懸濁液１０μｌを９６ウエルのマイクロタ イトレージョンプレート（ＮＵＮＣ）中に分配する。

精製ＮＣ５０タンパク質を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地中培地中種皮 で加える。種々の濃度の１００μｌを微小培養ウェル中の細胞に加える。インキ ュベーションを５％ＣＯ２を含む雰囲気下３７℃４８時間続ける。

Ｃ）　免疫蛍光法のための細胞標識化 インキュベーション後、細胞をミクロニック管（ラボシステム社製）に移す。

シグナル免疫蛍光法において、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート） （イムノチック社製）に結合した抗−ＣＯ２３抗体１０μｍを細胞懸濁液に加え る。二重免疫蛍光法において、フイコエリトリンを結合した抗−ＣＤ２３抗体１ ０μｌおよびＦＩＴＣ（ビクトンデキンソン社製）に結合した抗−ＣＤ２０抗体 １０μｌを細胞懸濁液に同時に加える。

インキュベーションを３０分間４０℃で続け、ついで細胞を遠心分離し、ペレッ トを冷ＰＢ８２５０μｍに取る。２０μｇ／ｍｌを含むヨウ化プロピジウム（シ グマ社製）溶液５０μｍを分析での死滅細胞を区別するために加える。

ｄ）　フロー血球計算分析 試料を、４８０ｎｍの蛍光励起のレーザー波長でファクスターブラス細胞選別機 （ビクトンデキンソン社製）上で蛍光分析により分析する。単一免疫蛍光分析で 、ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム発光を５３０ｎｍおよび６３０ｎｍ干渉フ ィルター各々を使用して集める。二重免疫蛍光分析において、フイコエリトリン による追加の蛍光を５７５ｎｍ干渉フィルターを通して集める。後者の分析にお いて、電子補償作用系を、フィコエリトリンチャネル中ＦＩＴＣ蛍光、ヨウ化ブ ロジウムチャネル中フィコエリトリンおよびフィコエリトリンチャネル中ヨウ化 ブロジウム蛍光の混入を避けるために使用する。結果を集計し、ライシスＩＩソ フトウェア（ビクトンデキンソン社製）を使用して処理する。

得られた結果の平均および標準偏差を、４８時間扁桃腺細胞のインキュベーショ ンおよび１０−３〜１１０２ｎ／ｍｌのＮＣ５０タンパク質の濃度について以下 の第４表に示す。

第４表 ＮＣ５０タンパク質の種々の濃度の存在下ＣＤ２３抗原を発現する扁桃腺細胞の パーセントの変化 トは、ＮＣ５０タンパク質濃度１０−’ｎｇ／ｍ１以上で、ＮＣ５０タンパク質 の不在下得られたパーセントより高い。このタンパク質最大の効果は、濃度１０ ｎｇ／ｍｌで見られる。

ｂ）　ＮＣ５０タンパク質がＣＤ２３抗原の発現を調節する細胞の特徴づけＣＤ ２３抗原を発現する細胞の特徴づけを、フェリコニリドリンに結合する抗ＣＤ２ ３抗体およびＦＩＴＣに結合する抗ＣＤ２０抗体を使用して二重免疫蛍光法によ り行った。後者の抗原は、Ｂ細胞上だけに存在する受容体い対するものである。

フロー血球計算法はＢ細胞の画分だけは、ＮＣ５０タンパク質の作用下ＣＤ２２ ３抗原を発現することを示している。

セクション１６：ハイブリドーマ系Ｂ９の増殖に対するＮＣ５０タンノくり質の 作用の証明 ハイブリドーマ系Ｂ９の増殖の刺激活性を、プラスミドｐｓＥ１−ＮＣ３０でト ランスフェクトされたＣＯ８細胞の培養上清（セクション７参照）および酵母か ら得られた精製ＮＣ５０タンパク質（セクション１２参照）で証明した。この系 を慣例的に使用し、Ｉ　Ｌ−６の生物学的分析を行う（Ｌ、　Ａ、アールチン、 １９８７年、ヨーロピアン・ジャーナル・オン・イムノロジー、１７巻、１４１ １〜１４１６頁）。

１）使用された方法 １）　分析の原理 分析の原理は、Ｔ、モスマン、１９８３年、ジャーナル・オン・イムノロジカル ・メリーズ、６５巻、５５〜６３頁に記載され、および以下の要約される：ミト コンドリアは、テトラゾリウム環をホルマザンに還元し得る多数のデヒドロゲナ ーゼを含む。この方法で還元されたこのタイプの塩、ＭＴＴ　（３−（４゜５− ジメチルチアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムプロミド）は、５６ ５ｎｍでの強い吸収で青色を与える。ここに記載された蛍光分析は、ミトコンド リアの数、とりわけ細胞の数を定量し得る。

ｂ）　細胞培養 使用された細胞は、Ｌ、　Ａ、アーチン、１９８７年、ヨーロピアン・ジャーナ ル・オン・イムノロジー、１７巻、１４１１〜１４１６頁により記載された系Ｂ ９系、マウス／マウスハイブリドーマ系に属する。それらは、マウスＩＬ−６ま たはヒトＩＬ−５の存在下増殖する非付着細胞である。

培養培地 グルタミン酸を含まないＲＰＭ１１６４０培地５００ｍ１商品番号０４１−０１ ８７０Ｍ　（ギブコ社製）＋　ウシ胎児血清５０ｍ１ （脱補足する、即ち５５℃３０分間加熱し、血清補足画分を不活性にする）（シ グマ社製　Ｆ４１３５） ＋　１００ｍＭピルビン酸ナトリウム１２．５ｍｌ商品番号０４３−０１３６０ Ｈ（ギブコ社製）＋　ＩＭＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，３２，５ｍｌ商品番号０４３− ０５６３０Ｄ　（ギブコ社製）＋　２００ｍＭグルタミン１０ｍ１ 商品番号０４３−０５０３０Ｄ　（ギブコ社製）使用する直前に、以下のものを 加えるニー　β−メルカプトエタノール（シグマ社製　商品番号Ｍ−６２５０） 、最終濃度５Ｘ１０−’Ｍニ ー　５００ｐｇ／ｍｌ最終濃度でＩＬ−６Ｃ）　試料の調製 一方を、ＣＯ８細胞上清から得、プラスミドｐｓＥ１−ＮＣ３０でトランスフェ クトし、セクション７に記載、と同様に培養するか、またはプラスミドｐｓＥ１ でトランスフェクトし、同じ条件下培養した（対照）試料、他方は、セクション １２で酵母から得、精製されたＮＣ５０タンパク質溶液から得た試料の２タイプ の試料を濃度５０ｎｇ／ｍｌで使用した。

ｄ）　検定プロトコール 検定を、９６平底ウエル培養板中で行い、各試料を様々な濃度で１２ウエルの列 上で検定する。

Ｂ９系細胞を培養、ＩＬ−６を含まない培養培地で２回洗浄し、培養培地（ＩＬ −６を含まない）中毒懸濁し、２時間で３７℃インキュベートする。インキュベ ーションは、検定でバックグランドとして招き、ＩＬ−６を完全に除去する。

最後に、細胞を再度遠心分離にかけ、濃度２Ｘ１０’セル／ｍｌで上記の培養培 地（ＩＬ−６を含まない）中毒懸濁する。

以下を９６ウエルプレート中に連続して分配する；　〜−各ウェル中培養培地（ ＩＬ−６を含まない）５０μｌ　（各列の第１の試料を除く） −各列の第１のウェル中試験試料１００μｌ　（ウェルからウェルへ２倍希釈フ ァクターで） −各ウェル中細胞懸濁５０μ＋　（１００００セル／ウエル）ついで、プレート を５％Ｃ○２を含む雰囲気下３７℃でインキュベーター中１こ入れる。

インキュベーション３日後、ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ濃度でＭＴＴ　（シグマ社製 −商品番号２１２８）溶液１０μｌを無菌条件下各々ウェルに加える。プレート をインキュベーター中に再び入れる。顕微鏡下、細胞の生存により青みがかった 結晶の形態で産生じたホルマザンの発現を観察することが可能である。４時間後 、細胞は死滅し、各々ウェルの上清を、注意して除去し、結晶を１０％ＳＤＳお よび領　０４ＮＨＣ１を含む６６％ｎ−プロパツール溶液の１００ｍ１で溶解す る。色を均一にするためにプレート振盪機にしばらく入れる。５６５ｎｍの波長 でプレートリーダーを使用して読み取りを行う。

上記のＭＴＴを使用する分析の代りに、顕微鏡下細胞を計数することもまた可ａ ）　ＮＣ５０タンパク質を含むＣｏＳ細胞上清６系列の測定を行った：各系列の ＣＯ８上清の様々な希釈ファクターで、３回は、Ｎ３０タンパク質を含む種々の ＣｏＳ細胞で、３回は種々の対照ＣＯ８細胞で行った。

得られた結果をＦｉｇ、５に示し、ＣＯ８上清溶液の希釈ファクターで換算して 光学な密度での種々の変形を詳細に記す（各点は、３回系列実験における同じ希 釈ファクターで測定された光学密度の平均である）。

ＮＣ５０タンパク質を含むＣＯ８上清溶液は、対照ＣＯ８上清溶液に比べて、８ ９株の増殖において４〜６倍の活性であるということがこの図の検討により判明 する。

対照ＣＯ８上清溶液で見られるＢ９系の増殖の刺激活性は、ＲＩＡ検定（放射線 免疫検定）、特にアメルシャムキット　−　商品番号：ＰＲＡ５３７を使用して ＲＩＡ検定により定量し得る。ＣＯ８細胞によるＩＬ−６の内在性製造のためで ある。このＲＩＡ検定は、Ｂ９形株の増殖（ＮＣ３０タンパク質を含むＣＯ８上 清による）の刺激の過剰な活性が、ＣＯ８細胞によるＩＬ−６の過産生に連結し なかったことを確認し得る。

ｂ）　酵母から得られた精製ＮＣ５０タンパク質：２鬼頭の測定を、１つは、Ｍ ＴＴで染色後光学密度、顕微鏡下細胞の計数による細胞密度を、各系列のＮＣ５ ０タンパク質の様々な濃度で行う。

得られた結果を、ｎｇ／ｍ１で表されたＮＣ５０タンパク質の濃度に換算して光 学密度および細胞密度について変化を詳細に記す、Ｆｆｇ、７で示す。

精製ＮＣ５０タンパク質は、Ｂ９系の増殖を刺激することが判明する。ＥＤ５゜ （得られた最大活性の０．５に等しい活性を示す濃度）は、約１１００ｎ／ｍｌ である。

Ｂ９細胞は、マウス細胞であり、ヒト細胞に対する作用に使用される濃度と比較 べて高い濃度のＮＣ５０タンパク質が必要であるを示すことに注目すべきである （セクション１４．１５および１７）。

セクション１７：０ＭＣ３Ｆの存在下ヒト巨核球株Ｍ○７ｅの増殖へのＮＣ５０ タンパク質の作用の証明 ヒト巨核球株ＭＯ７ｅに対する０ＭＣ３Ｆの増殖活性の増加を酵母中製造したＮ Ｃ５０タンパク質で証明する（セクション１２）。Ｍ、Ｆ、ブリッジ等、１９９ ０年、ブリティッシュ・ジャーナル・オン・ヘマトロジー、７６巻、２０３〜２ ０９頁に記載のこの細胞株の成長は、サイトカインＩＬ−３またはＧＭＣＳＦに 全く依存する。

１）　使用された方法 ａ）　目的 目的は、最大増殖の０．５を必要とする量のＧＭＣ３Ｆ存在下、またはＮＣタン パク質を様々な濃度で加えたＧＭＳＣＦの同量の存在下のいずれかで培養された ＭＯ７ｅ細胞株の増殖を比較することである。

ｂ）　検定の原理 細胞増殖は、培養中細胞によりトリチウム標識チミジンの取込みの放射活性を測 定することにより証明される。

細胞の増殖は、それらのＤＮＡ合成のチミジンを利用する。培地に導入したトリ チウム標識チミジンは、培地中「コールド」チミジンと競合し、細胞中に取り込 まれる。

所定時間後、細胞をフィルター上に集め、洗浄し、細胞中に取り込まれない過剰 のトリチウム標識チミジンを除去する。ついで、各フィルターをガンマカウンタ ーを使用して測定した。増殖活性を、取り込まれたトリチウム標識チミジンのｄ ｐｍの数として表す。

Ｃ）　細胞培養 使用された細胞は、Ｍ、Ｚ、　ブリッジ等、（上記、参照）により確立されたヒ ト巨核球株である株Ｍ○７ｅに属する。それらは、ヒトＩＬ−３、またはヒト０ ＭＣ３Ｆ存在中増殖する非付着細胞である。得られた最大活性の半分（ＥＤ、。

）は、以下のとおりである： ０ＭＣ３Ｆ　３５Ｔ）ｇ／ｍｌ　（ゲン＋＃ム社製　ＲＭ−Ｃ３Ｆ−Ｃ）ＩＬ− ３０，７ｐｇ／ｍｌ　（ゲンザイム社製　ＨＩＬ３Ｃ）。

培養培地 −イコブ修飾ダルベツコ培地５００ｍ１　（ＩＭＤＭ培地　−ギブコ社製　〜商 品番号０４１０１９８０） −　ウシ胎児血清５０ｍ１　（脱補足、即ち５５℃３０分間加熱し、血清補足性 画分を不活化する）（シグマ　商品番号Ｆ４１３５）＋　ゲンタマイシン１０ｍ ｇ／ｍｌ　（ギブコ溶液　−商品番号０４３．０５７１０Ｄ） 使用直前、組み換え型ヒトＩＬ−３（ゲンザイム社製　−ＨＩＬ３．Ｃ）を最終 濃度４ｎｇ／ｍｌで加える。

ｄ）　試料の製造 試験試料を、セクション１２で酵母から得、精製したＮＣ５０タンパク質の溶液 の培養培地（ＩＬ−３を含まない）中希釈して濃度５００　ｎ　ｇ／ｍ　ｌで製 造する。

ｅ）　検定プロトコール 検定を９６平底ウェル培養プレート中行い、各試料を様々な濃度で１２ウエルの 列において分析する。培養されたＭＯ７ｅ株細胞は指数増殖期になければならな い。

検定のために、細胞をＩＬ−３を含まない培養培地で２回洗浄し、３時間３７℃ でインキュベートする。このインキュベーションは、検定のバックグランドの原 因である、ＩＬ−３を完全に除去する。最後に、細胞を再び遠心分離にかけ、２ Ｘ１０’セル／ｍｌ濃度上記の培地（ＩＬ−３を含まない）中に再懸濁する。

以下のものを、９６ウエルプレート中に続けて分配する：・　各ウェル中培養培 地（ＩＬ−３含まない）５０μｍ、または・　濃度２００ｐｇ／ｍｌで培養培地 （ＩＬ−３を含まない）とＧＭＣ３Ｆ溶液］０μｍ、または ・　種々の濃度で試験試料５０μｍと濃度２００　ｐ　ｇ／ｍ　１で０ＭＣ３Ｆ の溶液１０μｍ： ついで各ウェル中細胞懸濁液５０μｍ（１００００セル／ウエル）。

ついで、プレートを５％ＣＯ□を含む雰囲気下３７℃でインキュベーターに入れ る。

インキュベーション３日後、ＩＬ−３を含まない培養培地中トリチウム標識チミ ジン（１０μＣｉ／ｍ１）（アメルシャム社製　商品番号ＴＲＡ６＝１ｍＣｉ／ ｍ１．１０μＣｉ／ｍｌ）の溶液５０μｍを無菌条件下凸ウェルに加える。プレ ートをインキュベーター中に再び入れる。４時間後、各ウェルの内容物をウェル から吸引および蒸留水で洗浄し、フィルター上に集め、フィルターの放射活性を 測定する。

２）　結果 得られた主な結果を、以下の第５表に示す。０ＭＣ３ＦおよびＮＣ５０タンパク 質を含まない培地のｄｐｍ中で発現した放射活性値およびＧＭＣ３Ｆ１８ｐｇ／ ｍｌを含む培地の放射活性値は、ＮＣ５０タンパク質の濃度に換算して表す。

ここで示される放射活性値は、ＧＭＣＦＳを含まない培地、またＧＭＣＳＦだけ を含む培地の１１試験、およびＧＭＳＣＦとＮＣ５０タンパク質を含む培地の７ 試験の平均である。それらの平均の値を９９．９５％以上の有意の程度でスチュ ーチンドを検定を使用して比較した。

第５表 ＮＣ５０タンパク質の濃度に換算された放射活性ＮＣ５０タンパク質は、０ＭＣ ３Ｆの存在下法Ｍ０７ｅの増殖を顕著に増大するということが上記の表の検討に より判明する。

セクション１８：ＮＣ５０タンパク質の走化性活性の証明１）　使用された方法 ａ）　好中球の単離 大部分の赤血球を０．　６％デキストラン（ファルマシア　−　商品番号、１７ −０３２（）−０１）および０．０９％ＮａＣｌを含む溶液中３７℃３０分間沈 降して末梢血から除去する。ついで、細胞をフィコリーパク（ファルマシア社製 ）の層の最上部に置き、４００ｇ３０分間遠心分離する。末梢血単核細胞（ＰＢ ＭＮＣ）は、フィニルと上清の界面に存在するが、残余赤血球および多核細胞（ 主に、好中球）は、細胞ペレットに存在する。このペレットを０．８％ＮＨ４Ｃ Ｌ１０ｍＭヘペス溶液中再懸濁し、３７℃７分間インキュベートし、赤血球を破 裂させる。残余細胞（主に好中球）を遠心分離にかけ、ＨＢＳＳ緩衡液で洗浄す る：ヘンクス平衡食塩溶液（Ｈａｎｋｓ　Ｂａ１ａｎｃｅｄ　５ａｌｉｎｅ　５ ｏｌｕｔｉｏｎ、ギブコ　ＢＲＬ−商品番号０４１−０４０２５Ｈ）　、以後Ｈ ＢＳＳ溶液と称する。

ｂ）　単球の単離 単球の単離の原理は、Ａ、ボユ、１９８３年１．１７巻、４２６〜４３６頁に記 載されている。以下に要約する。方法は、ニコチンズ（Ｎ、　Ｎ’　−ビス（２ ゜３−ジヒドロキプロピル）−５−［Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）ア セタミド］　−２，４，６−ドリヨードイソフタルアミド）と称するヨウ化勾配 培地を使用して血液から単球を分離することを含む。単球とリンパ球の密度差を 増大するために、溶液の容量モル濃度を増大させ、リンパ球が水を排除し、より 密度が大になるようにする。単球分離の最適濃度で二ロチンッ、塩化ナトリウム およびトリシン／ＮａＯＨを含む「ニコブレップ１．０６８Ｊ培地の使用が可能 であるにコムドファルマＡＳ、ノルウェー　−商品番号２２３５１０）。

使用されたプロトコールは、以下のとおりである。

赤血球の大部分を、０．６％デキストランおよび０．０９％ＮａＣｌを含む溶液 中３７℃３０分間沈降して末梢血から除去する。単球、リンパ球および好中球を 含む血漿の上層を取る。他の細胞から単球を分離するために、管を以下の方法で 製造する：血漿６ｍｌを直径１３〜１４ｍｍの管中ニコブレップ１．０６８　＜ ニコムドファルマＡＳ、ノルウェー、商品番号２２３５１０）の３ｍ１層上に置 （。

１５分間６００ｇで遠心分離後、清澄になった血漿を界面から３〜４ｍｍを取り 、残余血漿およびニコブレップ溶液を細胞ペレット上層１ｃｍまで補集する。こ の方法は、リンパ球の引き出しを避は得る。補集された単球懸濁液を５組成０． 　９％ＮａＣＬ　０．１３％ＥＤＴＡの溶液で６〜７ｍｌの溶液し、ついで７分 間６００ｇ遠心分離する。

単球は血小板と混合している。後者を除去するために、懸濁液を遠心分離し、上 清をついで除去し、ペレットを同じ溶液で再懸濁し、それらの操作を３回繰り返 す。

細胞を０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＲＰＭ１１６４０培地（ギ ブコ社製）中懸濁する。

Ｃ）　走化性証明のためのプロトコール使用された試験は、Ｗ、フォーク等、１ ９８０年、ジャーナル・オン・イムノロジカル・メリーズ、３３巻、２３９〜２ ４７頁により記載されたものである。

ニューロプローブ社から市販される変形ボイチン箱を走化性の測定に使用する。

好中球試験のためにＨＢＳＳ溶液および単球試験のための０．５％ＢＳＡを念む ＲＰＭＩ培地で希釈した試験試料を下方プレートのウェル中に入れる。ポリカル ボネート膜（ポアサイズ：５ｍｍ　−ヌクレオポア社製造　商品番号１５５８４ ５）を光沢のある面を下に向けて下方プレートの上に置く。上方プレートを腹の 上に置く。細胞（５００００１５０ｍμｍ緩衝液）を上方プレートのウェル中に 入れる。箱を、好中球に対する試験では１時間および単球に対する試験では３時 間湿ったインキュベーターまたは湿った脱脂綿を含む筒中３７℃でインキュベー トする。膜を取り去り、光沢のない面にある細胞を、膜を拭きとり、ゴム製のス クラバーでそれを掻きとることにより除去し、後者の２種の操作を１回繰り返す 。移した細胞を染色し、「ディラフ−クイック」キット（ディト社製　−商品番 号１３０８３２）で固定する。顕微鏡の観察により、膜の光沢のある面の細胞（ 移入した細胞）の数を数える。ついで、問題の細胞（単球または好中球）に関す る試料の走化性値を計算する。走化性値は、対照実験において培地または希釈緩 衝液に移動した細胞数に対する試料に移動した細胞数の比で定義する。

３）　試料の製造 ａ）　組換ＮＣ５０タンパク質の試料：濃度０．１．１．１０および１１００ｎ ／ｍｌにてセクション１２に記載と同様に酵母から得、精製したＮＣ５０タンパ ク質。

ｂ）　対照＝ 濃度１μＭ（走化性の陽性対照として使用される慣例的な濃度）で、一般にｆＭ ＬＰ　（シグマ社製　−商品番号Ｆ３５０６）と称するペプチド、ホルミル−Ｍ ｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ ４）　結果。

得られた主な結果を下記第６表に示す。単球に関する走化性値および種々の濃度 でＮＣ５０タンパク質の好中球に関する走化性値およびｆＭＬＰ対照を記載する 。この値は４種の独立した実験の平均を取ることにより計算される。

第６表 試験された濃度で、ＮＣ５０タンパク質は、好中球に体する有意な効果を有しな いが、１．１０および１１００ｎ／ｍ１濃度で、ｆＭＬＰのそれより著しく高い 単球に関する走化性値を有する。

従って、ＮＣ５０タンパクは、単球の強力および特異的化学誘引剤である。

セクション１９：マウスにおけるインビボでの免疫調節酵母から得られた精製Ｎ Ｃ５０タンパク質をマウスにおける全身性感染の２モデルでその免疫活性を試験 した。

１）　材料および方法 ａ）　動物 Ｃ，リバー（フランス）により供給された平均体重２５ｇ雌１マウスをこの研究 で使用した。使用した群は、８または１０匹マウスを含む。

ｂ）　細菌株 寄託番号ＣＩＰ５７３４のパスツール研究所コレクションから得たリステリア・ モノサイトジーン株および一７０℃で保管されていた臨床的分離物であるエシェ リキア・コリ株が感染株であった。

Ｃ）　試料 セクション１２で酵母から得、精製したＮＣ３Ｑタンパク質をマウス血漿容量対 １％を含む０．１５ＭＮａＣ１溶液中希釈したものを使用した。この希釈液を対 照として扱う。

ｄ）　マウスの処置 数群にランダムにマウスを分配後、ＮＣ５０タンパク質を容量２および２０μｇ ／ｋｇで感染前２４時間または４時間の間隔で復腔内投与する。対照群は希釈液 で処理する。

ｅ）　感染モデル エシェリキア・コリおよびり、モノサイトジーン株を使用して敗血症感染の２種 のモデルを使用した。それらのモデルは、コン−チク・フン、１９８７年、イン フェクションおよびイムニティ、１９８７年、５５．３．６６８〜６７３頁およ びＭ、ハクフレジデウスコ等、インフエクション・アンド・イムニティ、１９８ ９年、５７．１０．３０１４〜３０２１頁に記載されている。

エシェリキア・コリおよびり、モノサイトジーン株を１８時間３７℃で普通ブイ ヨン（オキソイド普通ブイヨン）で培養した。５Ｘ１０’ＣＦＵに対応する培養 ブイヨンの適当な希釈液０．５ｍｌをマウスに復腔内投与した。各群の死亡率を 毎日、１０日まで記録した。

ｆ）　統計学的処理 処理した群で観察した生存マウスの数をカイ二乗検定により対照群のそれと比較 した。確率が９５％より大きいとき、有意差があるとみなした。

２）　結果 ａ）　Ｌ、モノサイトジーン感染 ＮＣ５０タンパク質２または２０μｇ／ｋｇで感染前２４時間または４時間の間 隔で復腔内で処理された群マウスは、対照群と同様に行動した。生存率について の改善は見られなかった。

ｂ）エシェリキア・コリ感染 下記の第７表に示す。結果を試験群におけるマウスの生存率を示す。

第７表 ＮＣ５０タンパク質の投与量および処理と感染の間の時間Ｔによる、生存マウス 数／エシェリキア・フリ感染マウス数 ＊確率９５％より以上の対照と比較した有意差。

知見は以下の通りである： 感染前２４時間ＮＣ５０タンパク質の２０μｇ／ｋｇで腹腔自処理したマウスは 、対照群のマウスより有意に微生物感染に耐える。

感染前４時間腹腔内投与した予防処置は、行った３回の実験のうち２回に有効で あり、対照動物の生存率と比較して処理動物の生存率において有意な増大を得る ことを可能にした。第１の実験において、試験された２μｇ／ｋｇの用量のみが 活性であった。第２の実験において、２０μｇ／ｋｇの用量のみが、エシェリキ ア・コリ感染に対してマウスを防御した。

２０匹のマウスの群に対して行った他の一連の実験において、以下のことが判明 した：セクション１２記載と同様に酵母から得、精製されたＮＣ５０タンパク質 の３２μｇ／ｋｇ用量は、対照動物の生存率（２０匹のうち２匹）と比較してマ ウスのより高い生存率を得ることを可能にする。観察された差は、スチューチン トを検定を用いて確率９９％有意である。

従って、ＮＣ３Ｑタンパク質は、インビボで免疫調節活性もまた有する。

従って、ＮＣ５０タンパク質は、インビトロ（細胞増殖、細胞活性、走化性およ び他のサイトカイン合成の調整）およびインビボでサイトカイン型免疫調節活性 を有する新規リンホカインである。免疫系の少なくとも２種のキー細胞：単球お よびリンパ球に対して作用する。したがって、新規のインターロイキンである。

その性質の幾つかを、インターロイキン−４と共通する：　ＬＰＳ−活性ヒト末 梢血単球によるインターロイキン−１−βおよびインターロイキン−６の合成の 阻害、および扁桃腺８９２２球に対するＣＤ２３抗原の発現の調節（Ｗ、　ボー ル、１９９１年、ブラッド、７７巻、１９５６頁、ウオール　メルフイツト等、 １９９１年、ジャーナル・オン・エクスペリメンタル・メディスンズ、１７４巻 、１１９９〜１２２０頁）である。

旺祖璽４委＝よさ さ〉口 Ｃへ　ぐｈ　■　６ｓ　Φ Ｏω　−〉Ｆ）　（ｈ　ｙ ■　唖　ロ　Ｑ　−−へ ロ　■　−−一一一 ロ　０　ψ　ψ　ψ　１　罰 Ｎ　ψ　臂　Ｎ　膿　！　−ψ 〜〜ｐ２ミ苔云：＝： の　Ｃ″５　−　へ 品目ま８ヨ艮蓄呈 ；　記　＝　出　；　鑓　＝　シ　；　霊Ｃ％Ｊ　へ　ｍ　の　ｍ　リ　！　ψ 　！　ぐゴミ七　誉士務　２↑５ 光学密度（５７０ｎｍ） １１　光学密ａ−（５７０ｎｍ） ×１０５セル／ｍ１ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／１９ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｋ　８２１４−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｎ　１／１９ Ｃ１２Ｒ１：８６５） （Ｃ１，２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：８６５） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） Ｉ フロントページの続き （７２）発明者　ギュモ、ジャンークロードフランス３１４００　トウールーズ 、レジダーンス・し・パルコン・ドウ・ペシュダビ、シュマン・ドウ・う・サラ ド・ボンサン １５番 （７２）発明者　カガ、ムラ フランス３１５２０ラモンビル・サンタニュ、リュ・ロラン・ロラン　５０番 （７２）発明者　ラピール・ブチイエ、クリステイースフランス３１１００トウ ールーズ、ツユ。ドウ・ラマンディエ　２３番 （７２）発明者　ルプラトワ、パスカルフランス８１４７０キユーク・トウール ザ、カンボン・し・ラヴオール、アン・サン−ビニール　（番地の表示なし） （７２）発明者　マガジン、マリリン フランス３１３２０カスタネートローザン、シュマン・ドウ・う・クラボット　 ２番 （７２）発明者　ミンティ、アドリアンフランス３１３２０メルビラ、シュマン ・ドウ・ペシュミロール　（番地の表示なし）

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の配列（ａ１）： 【配列があります】 （配列中、Ｘａａは、ＡｓｐまたはＧｌｙを表す）、または配列（ａ１）と高い 相同性を有する配列を含むことを特徴とするサイトカイン型活性を有するタンパ ク質。
2. ２．配列（ａ１）のすぐ上流に、配列：Ｓｅｒ　Ｐｒｏを含むことを特徴とする 、請求項１記載のタンパク質。
3. ３．見掛け分子量９．０±２ｋＤａを有することを特徴とする、請求項１および ２のいずれか１項記載のタンパク質。
4. ４．見掛け分子量１６．０±２ｋＤａを有することを特徴とする、請求項１およ び２のいずれか１項記載のタンパク質。
5. ５．Ｎ−グリコシル化されることを特徴とする、請求項１および２のいずれか１ 項記載のタンパク質。
6. ６．ＳＤＳ存在下中ポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀での発色により測 定された純度が、７０％より高いことを特徴とする、請求項１および２のいずれ か１項記載のタンパク質。
7. ７．ＳＤＳ存在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀での発色により測定 された純度が、９０％より高いことを特徴とする、請求項１および２のいずれか １項記載のタンパク質。
8. ８．請求項１および２のいずれか１項記載のタンパク質、または請求項１および ２のいずれか１項記載のタンパク質の前駆体をコード化することを特徴とする組 換ＤＮＡ。
9. ９．シグナル配列を含む請求項１および２のいずれか１項記載のタンパク質の前 駆体をコードすることを特徴とする組換ＤＮＡ。
10. １０．成熟タンパク質コード化配列が以下の配列（Ｎａ１）：【配列があります 】 を含むことを特徴とする、請求項９記載の組換ＤＮＡ。
11. １１．成熟タンパク質のコード化配列が以下の配列（Ｎａ１′）：【配列があり ます】 を含むことを特徴とする、請求項９記載の組換ＤＮＡ。
12. １２．シグナル配列が、以下の配列（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）および（ｂ４ ）：（ｂ１）【配列があります】 （ｂ２）【配列があります】 （ｂ３）【配列があります】 （ｂ４）【配列があります】 から選ばれる配列であることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項記載 の組換ＤＮＡ。
13. １３．シグナルペプチドのヌクレオチドコード化ヌクレオチド配列が、以下の配 列（Ｎｂ１）、（Ｎｂ２）、（Ｎｂ３）および（Ｎｂ４）：（Ｎｂ１）【配列が あります】 （Ｎｂ２）【配列があります】 （Ｎｂ３）【配列があります】 （Ｎｂ４）【配列があります】 から選ばれることを特徴とする、請求項１３記載の組換ＤＮＡ。
14. １４．ベクターの発現に必要な手段を有する請求項８〜１３のいずれか１項記載 の組換ＤＮＡを含むことを特徴とする発現ベクター。
15. １５．巨核球の発現に必要な手段を有する請求項８〜１３のいずれか１項記載の 組換ＤＮＡを含むことを特徴とする巨核球。
16. １６．動物細胞であることを特徴とする、請求項１５記載の巨核球。
17. １７．請求項１４記載の発現ベクターを含むことを特徴とする、請求項１６記載 の動物細胞。
18. １８．ＣＨＯ細胞であることを特徴とする、請求項１７記載の動物細胞。
19. １９．ＣＯＳ細胞であることを特徴とする、請求項１７記載の動物細胞。
20. ２０．酵母細胞であるこを特徴とする、請求項１５記載の巨核球。
21. ２１．請求項１４記載の発現ベクターにより形質転換されることを特徴とする、 原核微生物。
22. ２２．エシエリキア・コリ種に属することを特徴とする原核微生物。
23. ２３．請求項１６〜１９のいずれか１項記載の動物細胞の培養、ついで組換タン パク質の分離および精製の工程を含むことを特徴とする請求項１〜７記載のいず れか１項記載のタンパク質を製造する方法。
24. ２４．請求項２０記載の酵母細胞を培養、ついで組換タンパク質の分離および精 製の工程を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載のタンパク 質の製造方法。
25. ２５．請求項１〜７のいずれか１項記載のタンパク質を含むことを特徴とする医 薬。