JPH06500690A - ヒト卵透明帯タンパク質ｚｐ３ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト　タンパク　ＺＰ３ 本発明は、ヒトＺＰ３活性又は少なくとも部分的にヒトＺＰ３抗原性を有するポ リペプチド又はその機能的誘導体に係る。

受精過程中に、哺乳動物配偶子間の最初の相互作用は、雌性配偶子を包囲する卵 透明帯（ＺＰ）上の種特異的受容体に精子細胞を結合することにより仲介される 。ＺＰは３種の糖タンパク質ＺＰＩ、ＺＰ２及びＺＰ３を含む細胞外マトリック スであり、そのうちＺＰ３は精子受容体として同定されている（Ｗａｓｓａｒｍ ａｎ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０８．　１−１７；　１９９０）。

ブタ及びマウス両方のＺＰタンパク質を使用する多数のｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉ ｎ　ｖｉｖｏ研究報告は、ＺＰ３が免疫避妊の開発を目的とする実験的戦略にお ける重要な標的抗原候補であることを示している（Ｈｅｎｄｅｒｓ。

ｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、Ｆｅｒｔ、８３゜３２５−３４３；　１ ９８８及びその引用文献）、最近ではマウス卵巣ｃＤＮＡ発現ライブラリーを抗 マウスＺＰ３抗体でスクリーニングすることによりマウスＺＰ３　ｃＤＮＡがク ローニング及び特徴付けされ、この目的に重要な進展を示している（Ｒｉｎｇｕ ｅｔｔｅ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１２７゜２８７−２９５；　１ ９８８）、その後、対応するゲノムＺＰ３　ＤＮＡを単層するためにＺＰ３　ｃ ＤＮＡプローブが使用された（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ　ａｎｄ　Ｄｅａｎ、Ｄｅ ｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｏｇｙ　１３１、　２０７−２１４．　１９８ ８；　Ｋ１ｎ１ｏｃｈｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ　８５．　６４０９−６４１３．　１９８９）。

ＺＰ３の避妊能は、マウスＺＰ３アミノ酸配列から誘導されるオリゴペプチドを 雌マウスにワクチン接種後に長期間不妊であることを立証した研究により裏付け られた（Ｍｔｌｌａｒ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６゜９３５−９３ ８．　１９８９）。

ＺＰ３精子受容体は種特異的であるため、マウスポリペプチドは人体での免疫避 妊には不適切である。更に、非ヒト起源のポリペプチドは人体に望ましくない免 疫応答を生じ得る。従って、ヒト精子受容体（の一部）に基づく安全且つ有効な 避妊ワクチンを開発するためには、ヒトＺＰ３ポリペプチドに関する情報及び該 ポリペプチドを入手し得ることが必要である。

雌性配偶子から十分な量のヒトＺＰ３ポリペプチドを単離することは当然不可能 である。しかしながら、本発明者らはヒト遺伝子を同定し、その配列を解明する ことに成功した。こうして、組換えＤＮＡ技術又は面相ポリペプチド合成により ＺＰ３ポリペプチド及び／又はＺＰ３ポリペプチドフラグメントを製造する可能 性が広がった。

従って、本発明はヒトＺＰ３ポリペプチドの少なくとも一部をコードする新規Ｄ ＮＡ分子に係る。該ＤＮＡ分子は図２に示す配列の少なくとも一部を含む。

本発明は更に、上記ＤＮＡ分子の少なくとも一部によりコードされるポリペプチ ドにも係る。該ポリペプチドは図２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を含む 。

当然のことながら、本発明のポリペプチドの機能的誘導体及びフラグメントも本 発明に含まれる０機能的誘導体とは、アミノ酸の１個以上が化学的に同等のアミ ノ酸で置換されたポリペプチドを意味する。

最も重要な点は当然、ヒトＺＰ３抗原性を示すという点である。

これは、（場合によりアジュバントと共に）投与後にヒトＺＰ３を認識する抗体 を産生ずることを意味する。

本発明のポリペプチドは合成により製造することもできるし、組換えＤＮＡ技術 により製造することもできる１合成ポリペプチドの製造方法は当業者に周知であ るので、詳述する必要はない。

組換えＤＮＡ技術によるポリペプチドの製造は、多少異なる結果を生じる多数の 可能性を有する公知の一般方法である０発現すべきポリペプチドはＤＮＡ配列、 又はより正確には核酸配列によりコードされる。

この核酸配列は所望のポリペプチドに（場合により）転写及び翻訳されなければ ならない、この目的に達するためには、通常核酸配列をベクターにクローニング して宿主細胞を形質転換させる。ベクターは自己複製型でもよいし、宿主のＤＮ Ａに組み込んでもよい。

宿主細胞が異なると、得られるポリペプチドも異なる。

原核細胞はグリコジル化に必要なオルガネラをもたない。

原核細胞により産生されるポリペプチドは炭水化物側鎖をもたない、真核細胞は グリコジル化機構を有するが、酵母細胞は哺乳動物細胞と異なるグリコジル化パ ターンを与える。

最も「天然」に近いグルコシル化パターンを与える発現系が本発明のポリペプチ ドに好適である。この目的のためには哺乳動物細胞が最適である。

本発明者らは避妊能を有し得るヒトＺＰ３ポリペプチド上のエピトープも同定し た。これらのエピトープは以下の配列の少なくとも一部分かむ。

一５ｅｒＡｒｇＡｒｇＧｌｎＰｒｏＨｉｓＶａ１ＭａｔＳａｒにｌｎ−。

−ＧｌｕＶａＩＧ１ｙＬａｕＨｉｓＧｌｕｃｙ！ｉＧｌｙＡｓｎｓａｒＭ＠ｔＧ ｌｎＶａｌＴｈｒＡｓｐＡｓｐＡｌａＬｅｕ−。

−ＰｈａＳｅｒＬａｕＡｒｇＬａｕＭｅｔｃｌｕｃｌｕＡｓｎ’ｒｒｐＡｓｎＡ ｌａＧｌｕｌ、ｙｓＡｒｇｓｅｌ：ＰｒｏＴｈｒＰｈｅ−。

−ＣｙｓＧｌｙＴｈｒＰｒｏｓａｒＨｉｓｓｅｒＡｒｇＡｒｇＧｌｎＰｒｏＨｉ ｓＶａｌＭａｔｓｅｒＧｌｎＴｒｐｓａｒ−。

７弓 これらのエピトープのような小さいポリペプチドは合成により容易に製造される 。このようなポリペプチドは同−又は異なる「エピトープ」に結合してより大き くより抗原性の高いポリペプチドを形成してもよい。

本発明の全ポリペプチドの目的は、これらのポリペプチドを使用して避妊ワクチ ンを製造することである。ワクチン接種は受動免疫でも能動免疫でもよい。

能動免疫の場合には、本発明のポリペプチドを（場合によりアジュバントと共に ）女性に投与する。投与の結果、女性は免疫応答を生じる。卵細胞上のヒトＺＰ ３を認識する抗体が産生される。これらの抗体は精子が結合できないように精子 受容体結合部位に特異的に結合するか、又は抗体は立体障害によりこの結合を阻 止する。受動免疫も基本的には同様に行われる。抗原又はその類似体の代わりに 、抗原に対する抗体を直接投与する。従って、抗体は本発明のポリペプチドに対 する抗体でなければならない。

これは適切な哺乳動物の能動免疫手順により達せられる。

哺乳動物のＢリンパ球を適切な時間後に採取し、融合又は形質転換により不死化 させる。これらの方法は当業者に周知である。不死化したリンパ球の培養物から 抗体を単離することができる。

しかしながら、動物起源の抗体には問題がある。繰り返し投与すると、免疫した 女性が抗抗体応答を生じることがある。従って、免疫応答を生じないような人体 適応抗体又は抗体の小部分を使用することが好適である。ＣＤＲ移植のように抗 体を人体に適応させる方法は公知である（Ｊ。

ｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３２１，５２２−５２５．　１９８６ ）、元の抗体の抗原に特異的な抗体のフラグメントの製造方法も知られている（ Ｕｄａｋａｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、２７．２５−３５．　 １９９０）、本発明のポリペプチドに対する抗体への抗原応答を生じさせないた めには、ヒト抗体又はそのフラグメントもしくは誘導体を使用することもできる 。

ヒト抗体は単離したＢリンパ球のｉｎ　ｖｉｔｒｏ刺激により産生させることも できるし、本発明の少なくとも１種のポリペプチドで免疫した女性から採取した （不死化）Ｂリンパ球から単離することもできる０本発明の別の目的は、診断用 テストキットにおけるＺＰ３ボリベアチド及び該ポリペプチドに対する抗体の使 用である。

現在ヒトＺＰ３に対する数種の抗体が獲得されている。

抗体の抗原結合部位を認識し、従って抗原の「内部像」である抗イデイオタイプ 抗体を製造することは当業者の知識の範囲内である。

これらの抗イデイオタイプ抗体もワクチン及び診断目的に非常に有用である。

以下の実験の部では、ヒトＺＰ３　ＤＮＡ配列及びヒトＺＰ３アミノ酸配列の単 離、ＺＰ３抗原性を示す組換えポリペプチドの発現方法、並びにこのような抗原 性を示す合成ポリペプチドの製造手順を示す、これらの実施例は単なる説明を目 的とし、発明の範囲を制限するものではない。

及１１ 社１ｊｕＬ立韮一 本質的にそれ自体既知の手順に従って全組換えＤＮＡ手順を実施した（Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍ。

１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、 第２版、Ｃ３Ｈ−１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｒｅｓｓ、１９８９＞。

制限酵素及びＤＮＡ改変酵素を製造業者により推奨されているように使用した。

ヒト卵巣ｇｔｌｏ　ｃＤＮＡライブラリーはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから購入した 。

１ゴヌ　し　トム オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８１Ａ　ＤＮ Ａ合成装置で製造し、クローニングの目的に直接使用した。

各１−九」」「戒− Ｆｉｅｌｄｓ及びＮｏｂ　ｌｅ　（ｒｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔ。

Ｐｒｏｔ、Ｒｅｓ、３５．　１６０−２１４；　１９９０）により記載されてい る手順を使用して固相ペプチド合成によりオリゴペプチドを製造した。以下のＺ Ｐ３ペプチドを合成した（アミノ酸は３文字コードで示す）。

１良１【 種々の抗原を用いてポリクローナル抗血清を産生させた。

−ｈｈａ、塩類で保存しておいたヒト卵透明帯を熱可溶化し、ウサギの免疫のた めにフロインドアジュバントと混きした。ブタＺＰタンパク質をコートしたＥＬ ＩＳＡアレートで抗血清力価をアッセイした。

−Ｇａ１−ＺＰ３　ム　ンバク　、融合タンパク質はその不溶性に基づき音波処 理した細菌から部分的に精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥ）により分離した。電気プロッティングによりタンパク質をニトロ セルロース膜に移した。ハイブリッドタンノ（り質を含む領域を切り出し、ＤＭ ＳＯに溶解させた。これをフロインドアジュバントと１＝１の比で混合し、ウサ ギの免疫に使用した。

−ＣＨ０ＺＰ３．チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生された ＺＰ３タンパク質に同様の手順を実施した。濃縮した培養培地を５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅにより分離した。４０〜６０キロダルトン領域を切り出し、マウスの免疫に使 用した。

一オ巳しフｌ（ｚ上巳上−０合成したペプチドをキーホールリンペ・７トヘモシ アニン（ＫＬＨ）に物理的に結合し、ウサギに注射した。対照としてウサギにＫ ＬＨ単独を免疫した。血清をペプチドでコートしたＥＬＩＳＡマイクロタイター プレート上でスクリーニングした。

ヒト　゛アッセイ。

塩類で保存しておいた未受精ヒト卵子（ＩＶＦプログラムで精子と共に４８時間 インキュベーション後）を抗血清＜ｗｉｇ液Ａ　［ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ］　でｌ 　：　５０に希釈）　と共にインキュベートした。３回洗浄後、卵子を第２の抗 体（ＦＩＴＣに結合し、Ｍ街液Ａ７：ｌ：１００に希釈したブタ抗ウサギ又はマ ウス抗体）と共に１時間３７℃でインキュベートした。更に３回洗浄後、Ｎ　ｉ 　ｋ　ｏ　ｎｊｉｌｔｉｉ及び照射分析装置で蛍光を測定した。非染色（陰性） 対照卵子は長時間照射しても暗く、陽性染色卵透明帯は短い照射時間で応答した 。

ヒト　−　Ｂ　Δアッセイ ヒト卵子（上記）をウサギ血清中でインキュベートし、緩衝液（ＢＷＷ＋３％Ｂ ＳＡ）で３回洗い、緩衝液（対照）又は抗体く未希釈、３７℃、１時間）中でイ ンキュベートし、３回洗い、受精能を獲得させたヒト精子（１０７個／ｍｌ、３ ７℃、１６時間）を滴下した。繰り返しピペッティングすることにより５自由に 付着する精子を卵子から除去した。結合した精子を固定し、１％グルタルアルデ ヒド及びＨｏｅｃｈｓｔ（Ｈ３３２５８，２０ｇ／ｍｌ）を含有するＢＷＷで染 色し、結合した精子の数を蛍光ま微鏡で計数した。

１」 マウスＺＰ３プローブのム　び ８個の合成オリゴヌクレオチド（２７〜５ｏマー）を結合することにより、１３ ５ｂＰマウスＺＰ３プローブと楕１　築した。マウス遺伝子のエキソン５及び６ の部分を含むこのフラグメント（Ｒｉｎｇｕｅｔｔｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１２７゜２８７−２９５；　１ ９８８に記載の７７１〜９０９位）に単一の５’　ＢａｍＨＩ及び３’　Ｈｉｎ ｄｌ　Ｉ　Ｉ制限部位を形成し、ｐＧＥＭ３　（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクロー ニングした。その後、ヌクレオチド配列を確認した。

ヒトＺＰ３遺　のクローニング　び、番ヒトゲノムＥＭＢＬ３ライブラリーをＩ Ｐ凛識ＺＰ３プローブ（上記１３５ｂｐフラグメント）でスクリーニングした。

３つのオーバラップするＥＭＢＬクローンが強いハイブリダイゼーションを示し たので、更に詳細に特徴付けを行った。これらのクローンの物理的制限地図を図 １に示す、クローン１１及びＤｌからの制限フラグメントをｐＧＥＭベクター及 びＭ　Ｉ　３　ｍ　ｐ　ｌ　８　／　１９にサブクローニングし、ヒト遺伝子の ゲノムの特徴付けに使用した。この特徴付けでは、マウスＺＰ３配列がらの”Ｐ Ｉ［識オリゴヌクレオチドを用いてサザンプロット分析によりエキソンの位置を 決定した後、配列解析した１図１に示すように、ヒト遺伝子はゲノムＤＮＡの約 ２０ｋｂに広がる８個のエキソンから構成される。同定された全エキソンは両側 にコンセンサススプライスドナー及びスプライスアクセプターシグナル（図示せ ず）を有する。全エキソンの配列解析がら、ＺＰ３遺伝子の完全なコーディング 配列を予想することができた（図２）、ヒトＺＰ３遺伝子は４１４３７ダルトン の分子量計算値を有する３７２個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードする 。

ヒトＺＰ３　ｃＤＮＡのクローニング ヒトＺＰ３エキソン１．５及び７からの３２ｐ標識フラグメントでヒト卵巣ｃＤ ＮＡライブラリー（ｇｔｌｏ）をス側の半分のみを含む微傷の部分的ｃＤＮＡ（ エキソン５〜８）を得た。

３個の独立したｃＤＮＡクローンの配列解析の結果、エキソシフ中の１個の残基 以外は先に決定されたゲノムＺＰ３配列と同一であることが確認された（図２） 、ヌクレオチド位２１０６４にはゲノム及びｃＤＮＡに夫々Ｇ及びＣ残基が検出 された。従って、コード化アミノ酸配列中では、３４５位に夫々アルギニン又は スレオニン残基が検出されるだろう、この配列の相違は恐らくヒトＺＰ３遺伝子 とポリペプチドにおける多望性を示すものである。

ＣＨＯこお４　’ＺＰ３の ＣＨＯ細胞中で発現させるために、哺乳動物発現ベクターに挿入できるようにＺ Ｐ３遺伝子のサイズを縮小しな。

種々のＺＰ３　ＤＮＡフラグメントを結合して図３に示すような「ミニ遺伝子」 を形成した。エキソン１及び２をＰＣＲ技術（Ｈｏｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇ ｅｎｅ　７７、　６１−６８，１９８９；　Ｙｏｎ　ａｎｄ　Ｆｒ１ｅｄ、Ｎｕ ｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１７，４８９５．１９８９＞により結合し、夫々 ５’　ＥｃｏＲＩ及び３’ＸｂａＩ部位を形成した。その後、このＤＮＡフラグ メントをエキソン３．４及びエキソン５の一部を含むゲノムＸｂａＩ−９ａｌ　 Ｉフラグメントに連結し、エキソン５〜８を含む部分的ｃＤＮＡをＳａｌ　ｌ− ＨｌｎｄＩ　Ｉ　ｒフラグメントに連結した。形成された２、７ｋｂ　ｒミニ遺 伝子」はエキソン２及び３間に截頭型イントロンを含み、ＺＰ３エキソン３及び ４間とエキソン４及び５間とに天然イントロンを含む、このＺＰ３構築物のヌク レオチド情報をコードするポリペプチドの完全性は配列解析により完全に確認さ れた。

ＺＰ３　ｒミニ遺伝子」を次にｒ＠乳動物発現ベクターに挿入し、ＺＰ３遺伝子 を強力なＳＶ４０初期プロモーターにより転写を開始した。更にこのベクターは 、Ｇ４１８耐性について選択することにより安定な形質転換細胞を単離できるよ うな選択可能なマーカー遺伝子アミノグリコジルホスホトランスフェラーゼ（Ｃ ｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１５０ ．１−１４．　１９８１）、発現遺伝子の適正なＲＮＡプロセシングのためのβ −Ｇｌｏｂｉｎスプライシング及びＳ■４０ポリアデニル化シグナルを含んでい た。リン酸カルシウム沈殿法（Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２，４５６−４６７．１９７３；　Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　 ａｔ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７６、１３７３−１３７６゜１９７９）を使用して ＣＨＯ細胞にＺＰ３発現構築物をトランスフェクトした。Ｇ４１８耐性形質転換 細胞の集団（３００〜５００個の独立したクローンを表す）を組換えＺＰ３遺伝 子の発現について分析した。

図４に示すように、プールした形質転換細胞からの全ＲＮＡを３２ｐ標識ＺＰ３ プローブでノーザンプロット分析すると、（図示しない高発現アクチン遺伝子に 比較して）トランスフェクトしたＺＰ３遺伝子の発現レベルは比較的高いことが 判明した。更に、ミニ遺伝子ＲＮＡはヒト卵巣ＲＮＡ中に存在する天然の転写産 物よりもやや大きいｍＲＮＡに適正にプロセシングされることが立証された（ｒ ｆ！ｉ４９照）、このサイズの相違は、発現ベクター中に存在するフランキング ５゛及び３゛配列に主に起因すると思われる。

更に、Ｇ４１８耐性ＣＨＯ形質転換細胞からエキソン１〜５を含む部分的ｃＤＮ Ａを単離することにより、組換え遺伝子の適正なスプライシング及びプロセシン グが確認された。このｃＤＮＡの配列データはトランスフェクトしたＤＮＡに類 似しており、イントロンがＺＰ３ミニ遺伝子転写産物から適正にスプライスされ ているという結論を裏付ける。

増殖するクローン集団の培地中に組換えＺＰ３ポリペプチドが存在するか否かを ウェスタンプロット分析により試験した。脱グリコジル化ブタＺＰ３に対するボ リクローナｅｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１８．　２５１−２６５゜１９８７＞を 使用して、組換えＺＰ３ポリペプチドを培地中に検出することができた。このシ グナルは非トランスフェクトＣＨＯ細胞からの培地中には不在であった。

にお！　’　ＺＰ３の 大腸菌中で発現させるために、Ｃ）（Ｏ形質転換細胞からＰＣＲにより単離され たエキソン１〜５をカバーするｃＤＮＡフラグメント及びヒト卵巣ｃＤＨＡライ ブラリーから単離された部分的ｃＤＮＡクローン（エキソン５〜８を含む）を使 用してまず全長ＺＰ３　ｃＤＮＡを構築した。４個のＺＰ３　ｃＤＮＡフラグメ ントをｐＥＸプラスミド（Ｂｉｏｒｅｓ）中の大腸菌ＬａｃＺ遺伝子にクローニ ングし、５ｔａｎｌｅｙ及びＬｕｚｉｏ、ＥＭＢＯＪ、３．　１４２９−１４３ ４．　１９８４により報告されているようにβガラクトシダーゼ−ＺＰＢ！を合 ポリペプチドを産生させた。大腸菌における融合ポリペプチドの発現をＳＤＳポ リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びウェスタンプロット分 析により試験した。これらの実験の結果を図５に示す、熱シヨツク誘導後、４個 のＬａｃＺ−ＺＰ３楕築物の全てが融合ポリペプチドを生成したが、その程度は ＬａｃＺ遺伝子よりも著しく低かった。ハイブリッドポリペプチドの分子量は、 クーマシー染色ゲル（図５Ａ）上で観察されるように、発現されたＺＰ３部分に 一致していた。このことは、抗βガラクトシダーゼ抗体（図示せず）及びＫＬＨ に結合したＺＰ３アミ７Ｍ３４１〜３６０に対するウサギ抗血清を用いるウェス タンプロット分析（図５Ｂ）により更に確認された。この領域を含む融合ポリペ プチド（即ちＺＰ３−Ａ及びＺＰ３−Ｄ）のみが抗血清により認識された。ＫＬ Ｈに対する抗血清は図５Ｂのバックグラウンド染色に類似の結果を生じた（図示 せず）、更に、βＧａ　］−ＺＰ３融合ポリペプチドは全ヒト類透明帯に対する 抗血清により認識された（図示せず）。

ｚｐ　ヒト　の　Δ 種々のＺＰ抗体とヒト卵透明帯との結合を特徴付けるためにヒト卵子蛍光アッセ イを行った。３回の異なる実験の結果を図６に示す、ＫＬＨに対する血清及び正 常マウス血清は蛍光染色することができなかったが、ＺＰ酸成分対する全抗血清 では強レベルから中レベルの蛍光が観察された。

図示データから明らかなように、ＺＰ３　（９３〜１１０）。

ＺＰ３　（１７２〜１９０）、ＺＰ３　（３２７〜３４４）。

ＺＰ３（３４１〜３６０）及びＺＰ３　（３６２〜３７２）に対する抗血清はヒ ト卵母細胞を認識する。

１子二ｎ象Ａ玉」１づコ乞巳区１１１Ｌ１ＺＰ３抗体の避妊能分ヒＩ・精子−卵 透明帯結合アツセイで分析した。このアッセイの結果を図７に示す。

全ヒト卵透明帯に対する抗体は７５％の精子−卵透明帯結合阻害率を示した。Ｋ ＬＨに対する抗血清は精子−卵子結合を妨げない、他方、ＺＰ３−ペプチド抗体 （ペプチド：ＺＰ３（９３〜１１０）、ＺＰ３　（１７２〜１９０）。

ＺＰ３　（３４１〜３６０）及びＺＰ３　（３６２〜３７２））の混合物は３５ ％の精子結合相対阻害率を示した。ＣＨＯ細胞からの組換えＺＰ３に対する抗体 は精子結合が低く５５％であった。

！ｊぴＬＮ１５」斐１ 図１ ＥＭＢＬりＯ−７Ｉ　１、Ｄ１２１１”Ｅｌ（Ａ）及びｈ　）　ＺＰＳｉ　伝子 ＜７）されている。制限部位＋　Ｓ、　Ｓａｌ　Ｉ　；　Ｂ、　Ｂａｍ１ｌｌ。

図２ ヒトＺＰ３のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す０位置１０６４では、Ｇまた はＣ残基がゲノム及びｃＤＮＡ中に各々知見ン番号は、円の中に示されている。

ポリアデニル化シグナルは、下線を引いである。

図３ 哺乳類発現ベクター中に挿入するためのｌＰ３遺伝子のサイズ縮小を示す、２． ７ｋｂ　ＺＰ３　ｒミニ遺伝子１を以下の３種類のフラグメント： Ａ　、　ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントをつくるＰＣＲ方法により、フレー ム中互いに結合したエキソン１及びエキラン２；Ｂ、エキソン３．４及びエキソ ン５の一部を有するゲノムＸｂａＩ−ＳａｌＩフラグメント： Ｃ，エキソン５〜８を有する５ａｌｒ−ＨｉｎｄｌＩＩ　ＺＰ３　ｃＤＮ＾ＤＮ Ａメント（人工的な３’　ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄｌＩＩサイトを有する）から 組み立てた。３種のフラグメントをＥｃｏＲＩ及び［ｌ１ｎｄｌＩＩ明乳頚の発 現ベクター中のＳＶ４０プロモーターの後ろに２．７ｋｂ　ＥｃｏＲｉＢａｍＨ Ｉフラグメントとして配置した。

図４ ヒト卵巣由来のＺＰ３　ＤＮＡ及びポリ（Ａ　）”ＲＮＡ（５ｇ）でトランの検 出を示す。

レーン３．ヒト卵巣。

ｐＧＥＭ３中の全ＺＰ３　ｃＤＮＡをプローブとして使用した。

呈上 ヒトＺＰ３　ｃＤＮ＾ＤＮＡを有するＱＥＸプラスミドを保持するＥ、ｅｏｌｉ 株ＰＯＰ２１３６中のβ（ａ　１−ＺＰ３１１合ポリペプチドの産生をタンプロ ット分析な示す。左から右に以下のサンプルをゲルに充填したく一１誘導前；＋ 、誘誘導２問対照ｐＥＸ　：　ｐＥＸ−ＺＰ３＾（ＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグ メント；全ｃＤＮ＾）。

ｐＥＸ−ＺＰ３Ｂ（Ｋｏｎｌ−Ｓａｌｌフラグメン１〜二アミノ酸１−２４１を コードするエキソン５で切断したｃＤＮＡ）　；ｐＥＸ−ＺＰ３Ｃ（Ｋｐｎｌ− Ｓｐｈ１７　ラグメン’ｔ−　ニア　ミ／酸１−１０２をコートするエキソン１ の端で切断したｃＤＮＡ）。

ｐＥＸ−ＺＰ３Ｄ（Ｓａｍｌ−ＢａＩｌ旧フラグメント、アミノ酸２５７−３７ ２ｆ！：コードするエキソン５の３′半分士エキソン６，７及び８）分子量（Ｍ ）マーカーは、一番左端にある（キロダルトンで表されている）。バクテリアは 、３０℃でＯＤ．、。＝０．５−１になるまで生長させ、次いで４２°Ｃで２時 間誘導した．アリコートを取り、遠心分離し、全細胞溶解物を分析した。

図６ ヒトの卵子に対する種々の抗体の結合を表す（材料及びで測定し、対照に対する 割合として表した（　１００ｇ＝暗い。

Ｏｚ＝蛍光卵）。

３　：　ＫＬＨに対する抗−血清； ４　−　８　：　ＺＰ３（９３−１１０＞、　ＺＰ３（１７２−１９０＞、　Ｚ Ｐ３（３２７−３４４＞’；ＺＰ３（３４１−３６０）及びＺＰ３　（３６２− ３７２）に対する抗−血清；９：βＧａ１−ＺＰ３に対する抗−血清；１０、組 換体ＣＨＯ産生ＺＰ３で免疫感作した３匹のマウスの血清の混合物； １１：３匹の対照のマウスの血清の混合物。

照射 対照に対する割合と平均の標準偏差として少雪時間が示されている。

図７ 抗−ＺＰ３抗体による精子−卵子結合の阻害を示している（４料及び方法参照） 。

１：対照； ２　：　ＫＬＦＩに対する抗−血清； ４　：　Ｚｒ２（９３−１１０）、Ｚｒ２（１７２−１９０）、Ｚｒ２（３４１ −３６０）及ヒＺＰ３（３６：−３７２）に対する抗−血清の混合物；５：組換 体ＣＨＯ産生ＺＰ３で免疫感作した３匹のマウスの血清の混合物。

す。

材 寿 ９月−Ｅ」 ＦｉＧ、２ ｏ２０ ゴｈ　ｖｑ！ｆｆ） ａヂレ六ｒｈＬ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１３４条の８）平成５年２月２６日 囚

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒトＺＰ３活性または少なくとも部分的にヒトＺＰ３免疫原性を有すること を特徴とする純粋なポリペプチドまたはその機能的誘導体。 ２）組換体的に産生されることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。 ３）以下の配列： 【配列があります】 の少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のポリペプチ ド。 ４）少なくとも一部がグリコシル化されていることを特徴とする請求項１〜３の いずれか１項に記載のポリペプチド。 ５）以下の配列： 【配列があります】， 【配列があります】， 【配列があります】， 【配列があります】， 【配列があります】， または 【配列があります】 の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項３または４に記載のポリペプチ ド。 ６）以下の配列： 【配列があります】 の少なくとも一部を含むことを特徴とする、ヒトＺＰ３活性または少なくとも部 分的にヒトＺＰ３免疫原性を有するポリペプチド。 ７）請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドの少なくとも一部をコー ドする核酸配列。 ８）以下の配列： 【配列があります】 の少なくとも一部またはその機能的誘導体を含むことを特徴とする請求項７に記 載の核酸配列。 ９）請求項７または８に記載の核酸配列を含むベクター。 １０）請求項９に記載の核酸配列または請求項７または８に記載の配列を含む宿 主細胞。 １１）請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。 １２）請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド及びアジュバントを含 む免疫避妊ワクチン。 １３）請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドを認識する抗体を含む 免疫避妊ワクチン。 １４）請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列 を含むベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を好適な培地中で培養し 、次いで培養物からポリペチドを単離することを特徴とする請求項１〜４のいず れか１項に記載のポリペプチドを製造する方法。 １５）好適な動物に請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチド及びアジュバ ントを注射し、前記動物の−Ｂ−リンパ球を好適な時間後に収穫し、抗体産生細 胞を選択して不死化し、その後、これらを培養し、抗体を培養物から単離するこ とを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載の抗体を製造する方法。