JPH11502116A - トランスフェクションしたｍｅｌ細胞により宿主中で分泌された抗原に対する抗体のインビボ形成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 関心のある生化学的薬剤に対する抗体を哺乳動物宿主において形成させる方法であって、関心のある生化学的薬剤をコードするＤＮＡを含むネズミ赤白血病（ＭＥＬ）細胞を哺乳動物宿主に取り込ませ、関心のある生化学的薬剤をＭＥＬ細胞に発現および分泌させ、それに対する抗体を宿主に形成させ、そして該抗体を宿主から単離することを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】 トランスフェクションしたＭＥＬ細胞により 宿主中で分泌された抗原に対する抗体のインビボ形成 本発明は抗体の形成法に関する。特に本発明は、分泌性生細胞をその方法に使 用することに関する。 関心のある生化学的薬剤に対する抗体を産生させるのに利用しうる方法はある が、一定の欠点をもつ。特にそれらは動物の免疫化を行うのに十分なほど精製さ れた材料の調製を必要とする。これには、細胞培養物または組織の使用、発酵ブ ロス、タンパク質の単離およびゲルからの抽出、アフィニティクロマトグラフィ ーその他の方法が含まれる。 本発明者らは、トランスフェクションしたネズミ赤白血病（ＭＥＬ）細胞を注 入したマウスにおいて抗体を効果的に形成しうることを見出した。組換えタンパ ク質を発現する細胞または発現したタンパク質自体が有意の免疫応答が起こるの に十分な時間、組織内に留まるか否かが不明であったので、これは満足すべきこ とであった。組換え細胞を注入された動物に腫瘍の形成が見られなかったことは 、その細胞は少なくとも急速に動物組織から除去されたことを示した。 したがって本発明の第１態様においては、本発明者らは、関心のある生化学的 薬剤に対する抗体を哺乳動物宿主において形成させる方法であって、関心のある 生化学的薬剤をコードするＤＮＡを含むネズミ赤白血病（ＭＥＬ）細胞を哺乳動 物宿主に取り込ませ、関心のある生化学的薬剤をＭＥＬ細胞に発現および分泌さ せ、それに対する抗体を宿主に形成させ、そして該抗体を宿主から単離すること を含む方法を提供する。 哺乳動物宿主はヒトでない動物、たとえばラットまたはマウス、好ましくはマ ウスであることが好都合である。 関心のある生化学的薬剤（biological of interest）には、それに対する抗体 を形成しうる好都合なタンパク質がいずれも含まれる。特にそれは現在用いられ ている技術で抗体を形成または精製するのが困難なタンパク質でもよい。そのよ うな困難は、由来する組織または種（たとえばヒト由来のタンパク質）によって も生じる可能性がある。それをネズミ赤白血病（ＭＥＬ）細胞にベクターによる トランスフェクションにより導入するのが好都合である。 好都合なベクターにはｐＥＶ発現ベクターが含まれる。ｐＥＶ発現ベクターは 先に報告されたＭＥＬ発現ベクターｐＧＳＥ１４１７／ＥＣ３の修飾形である（ Needham et al.,Nucleic Acids Research,1992,20(5),997-1003）。ｐＥＶは以 下に従って調製された： チミジンキナーゼプロモーターのＥｃｏＲＩ部位、ネオマイシン耐性遺伝子の ＢｇＩＩＩ部位、およびｐＧＳＥ１４１７（２０）のＬＣＲ中のＮｏｔＩ部位を 順に制限酵素消化により欠失させ、次いでＴ４ポリメラーゼ処理し、再連結反応 させて、ｐＤＧＳＥ１４１７を形成した。ｐＥＣ３（１）由来のＣｌａＩ−Ａｓ ｐ７１８フラグメントをｐＤＧＳＥ１４１７のＣｌａＩ部位とＡｓｐ７１８部位 の間に連結反応させて、ｐＥＶを形成した。 関心のある生化学的薬剤をコードするＤＮＡを、たとえばManiatis et al.,Mo lecular Cloning,A Laboratory Manualに示された好都合な分子生物学的技術を 用いてベクターに導入する。 トランスフェクションしたＭＥＬ細胞を、たとえば皮下または腹腔に導入する ボーラスの形での注入により哺乳動物宿主に取り込ませるのが好都合である。 哺乳動物より採取した血清からポリクローナル抗体を回収するのが好都合であ る。この方法で免疫化した動物から得た脾リンパ球を用いて、細胞融合によりモ ノクローナル抗体産生細胞系を生じさせることができる。このようなポリクロー ナル抗体およびモノクローナル抗体は本発明の別の独立した態様である。 以下の実施例を参照して本発明を説明するが、本発明はこれらによって限定さ れない。実施例１ 組換えＭＥＬ細胞免疫化を用いる抗−ＶＣＡＭ抗体の形成ＶＣＡＭ−１ ｃＤＮＡの修飾： ＶＣＡＭ−１ ｃＤＮＡ（Lobb et al.,Biochem.and Biophys.Res.Comms.,199 1,178(3),p1498-1504）をブリティッシュ・バイオテクノロジーから入手し、ポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により以下のとおり修飾した： １）目的外の５′側非コード配列を除去する。 ２）コンセンサス翻訳開始（Ｃ.Ｔ.Ｉ.）配列を翻訳開始部位（５′メチオニン ）のすぐ上流に挿入する。 （注意：さらに、バキュロウイルス発現のためにはこの配列を除外した）。 ３）膜貫通領域開始前のアミノ酸において翻訳を終止する（アミノ酸７２の位置 に翻訳終止コドンを導入することによる）。 ４）発現ベクターの一定範囲にサブクーニングしうるように、ＶＣＡＭ−１ｃＤ ＮＡの各末端に制限酵素部位を挿入する。ｓＶＣＡＭ−１のＭＥＬ細胞発現： 上記の修飾したｓＶＣＡＭ−１ ｃＤＮＡをＭＥＬ細胞発現ベクターｐＥＶに 挿入した（Needham et al.,1995,Protein Expression and Purification,6(2),1 995）。ＭＥＬ Ｃ８８細胞（Deisseroth et al.,Cell,1978,15,55-63）をｐＥ Ｖ／ｓＶＣＡＭ−１発現構築体でトランスフェクションした。６種類の単一細胞 クローンおよび２００種類以上のクローンを含む集団を単離し、誘導し、ＶＣＡ Ｍ−１酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりｓＶＣＡＭ−１の発現 を調べた。最初のＥＬＩＳＡの結果は、ｓＶＣＡＭ−１タンパク質が１〜５ｍｇ ／ｍｌ発現したことを示した。ｓＶＣＡＭ−１を５ｍｇ／ｍｌ発現した１クロー ン（＊１２）を以後の試験用に選択した。抗体形成： 発現しているＭＥＬ／ｓＶＣＡＭ−１クローン＊１２細胞を、残存培地を含ま なくなるまでリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）を用いて洗浄し、次いで卓上遠心機 を用いて遠心分離して柔軟なペレットを得た。得られたスラリーを新たなＰＢＳ で希釈して、１００ｕｌ当たり５×１０⁷細胞の最終濃度を得た。細胞懸濁液１ ００ｕｌを皮下ボーラスとして、１２週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス群のそれぞれ の後側腹部に注入した。この投与を２１日後、そして再びさらに１４日後に繰り 返した。血液試料を３５および６５日目に採取した。 抗原としての精製組換えＶＣＡＭタンパク質を用いたプール血液試料の固相酵 素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、以下の５０％結合力価を示した： − ３５日目に１：１４００および ６５日目に１：６０００＋ これは、被験動物において抗ＶＣＡＭポリクローナル抗体が形成されたことを示 す。 第３回の投与後１２週目に、マウスにそれぞれＰＢＳ１００ｕｌ中に含有され る精製組換えＶＣＡＭタンパク質２０ｕｇを追加免疫注入した。４日後に、マウ スを人により選択し、脾摘出し、それらの脾臓のうち４個から得た脾細胞をＮＳ ０骨髄腫細胞系との融合実験に用いた（Methods in Enzymology,1981,73B:3）。 融合処理後に２３１６の培養ウェルを設定し、ＨＡＴ培地を用いて生化学的に選 択し（Littlefield,Experimental Cell Research,1966,411,190）、培養により 増殖させたのち、これらのうち９５が増殖性単クローン細胞コロニーを生じた。 ＥＬＩＳＡにより判定して抗−ＶＣＡＭ活性が陽性である培地上清は９５中１６ により生成した。この１６中１２を限界希釈法により再クローニングし、１２中 ５が抗−ＶＣＡＭ活性が陽性のクローンを形成した。 陽性クローンの例を増殖させて細胞系の凍結株を調製し、これらの細胞系から 採取した上清をＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット分析により試験して、モノ クローナル抗体活性の持続を確認した。実施例２ 組換えＭＥＬ細胞免疫化によるモノクローナル抗単球化学走性（chemoattract ant）タンパク質−１（ＭＣＰ−１）抗体の形成ＭＣＰ−１ ｃＤＮＡの修飾 ： ＭＣＰ−１ ｃＤＮＡを単離し、Needham et al.,Protein Expression and Pu rification,1996,7,173-182の報告に従って発現のために修飾した。ＭＣＰ−１ ｃＤＮＡのＭＥＬ細胞発現： 上記の修飾したＭＣＰ−１ ｃＤＮＡをＭＥＬ細胞発現ベクターｐＥＶに挿入 した(Needham et al.,1995,Protein Expression and Purification,6(2),1995) 。ＭＥＬ Ｃ８８細胞（Deisseroth et al.,Cell,1978,15,55-63）をｐＥＶ／Ｍ ＣＰ−１発現構築体でトランスフェクションした。６種類の単一細胞クローンお よび２００種類以上のクローンを含む集団を単離し、誘導し、ノーザンブロット 法、 カルシウム流出、および化学走性（chemotaxis）アッセイ法によりＭＣＰ−１の 発現を調べた（Needham et al.,Protein Expression and Purification,1996,7, 173-182）。結果は、ＭＣＰ−１タンパク質が１〜５ｍｇ／ｍｌ発現したことを 示した。ＭＣＰ−１を＞５ｍｇ／ｍｌ発現した１クローン(＊５)を以後の試験用 に選択した。抗体形成： これは、抗体形成に関して最後のＭＥＬ細胞注入と融合前追加免疫との間の休 止期間を６週間に短縮した点以外は、実施例１のＶＣＡＭの場合と全く同じに実 施された。融合処理後に同様に４８０の培養ウェルを設定し、これらのうち３５ が増殖性単クローン細胞コロニーを生じた。これらは最終的に３つのモノクロー ナル抗体産生系を生じた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．関心のある生化学的薬剤に対する抗体を哺乳動物宿主において形成させる 方法であって、関心のある生化学的薬剤をコードするＤＮＡを含むネズミ赤白血 病（ＭＥＬ）細胞を哺乳動物宿主に取り込ませ、関心のある生化学的薬剤をＭＥ Ｌ細胞に発現および分泌させ、それに対する抗体を宿主に形成させ、そして該抗 体を宿主から単離することを含む方法。 ２．哺乳動物宿主がヒトでない動物である、請求項１記載の方法。 ３．関心のある生化学的薬剤をコードするＤＮＡを、ＭＥＬ細胞にベクターに よるトランスフェクションにより導入する、請求項１記載の方法。 ４．ベクターがｐＥＶ発現ベクターである、請求項３記載の方法。 ５．ＭＥＬ細胞を哺乳動物宿主に注入する、請求項１〜４のいずれか１項記載 の方法。 ６．ＭＥＬ細胞を皮下または腹腔に導入するボーラスの形で注入する、請求項 ５記載の方法。 ７．請求項１〜６のいずれか１項記載の方法を用いて調製したポリクローナル 抗体。 ８．請求項１〜６のいずれか１項記載の方法を用いて調製したモノクローナル 抗体。