JPH06500702A - 遺伝子クローニングにおける試料外ヌクレオチドの使用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子クローニングにおける試料外ヌクレオチドの使用発明の分野 本発明は、遺伝子のクローニング及び発現において組み替えＤＮＡを操作するた めの改良法に関するものである。より詳細には、本発明は、試料外ヌクレオチド を使用して標的配列の核酸配列の３′または５゛末端のいずれかを変える方法を 提供するものである。

発明の背景： 精製された核酸フラグメントを増幅することのできる組み換えＤＮＡ法は以前か ら知られている。典型的には、係る方法論は、所望の核酸フラグメントのＤＮＡ またはＲＮＡベクター中への導入、該ベクターのクローニングによる増幅、及び 増幅された核酸フラグメントの回収を含む。このような方法論の例は、コーエン 等（米国特許第４２３７２２４号）、Ｔ、マニアティス等、モレキュラー・クロ ーニング・ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ：Ａ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト リ−１１９８２、等により供されている。

幾つかの例においては、所望の核酸分子は供給材料から容易に取得することがで きる。次いでこの分子を、「リンカ−分子」を添加［シェラ−等、サイエンス（ Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１９６巻１７７−１８０頁（１９７７）］することにより、 または所望分子を制限エンドヌクレアーゼで処理することにより、適当なベクタ ー中に挿入することができる。

しかしながら別の例においては、所望の核酸分子は、遺伝子のクローニングをさ せるに充分な濃度または量を供給材料から得ることができない。このような状況 においては、その核酸分子を適当なベクター中に導入する前に、例えば鋳型支配 伸長によって増幅する必要がある。プライマーの伸長は「ポリメラーゼ連鎖反応 Ｊ　（ｒＰＣＪ）または他の手段によって仲介され得る。

「ポリメラーゼ連鎖反応」すなわちｒＰＣＲＪにおいて、特定の核酸配列の増幅 は、増幅されるべき配列の領域に対し相補的な二つのオリゴヌクレオチドプライ マーを用いて達成される（図１）。

ポリメラーゼ連鎖反応は、その分子が前もって精製されていなくとも、そして特 定の試料中にただ一個のコピーしか存在しなくとも、特定の配列を有する核酸分 子の濃度を選択的に増加させる方法を提供する。この方法は一本鎖または二本鎖 いずれのＤＮＡの増幅にも使用することができる。

ポリメラーゼ連鎖反応の縁膜は、Ｋ、Ｂミュリス［コールド・スプリング・ハー バ−・シンポシア・オン・クラオンティタテイブ・バイオロジー（ＣｏｌｄＳｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　）　、）１ 巻２６３−２７３頁（１９８６）コ　、Ｒ，に、サイキ等「バイオ／テクノロジ ー（Ｂ　ｉｏ／　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　３巻１００８−１０１２頁（１９８ ，５）］　；に、　Ｂ、ミュリス等（メソッズ・イン・エンザイモロ）−（Ｍｅ ｔ、ＥｎｚｙＩＩｌｏｌ、　）　１５５巻３３５−３５０頁（１９８７）：Ｈア ーリノヒ等（ＥＰ５０４２４　：　ＥＰ８４７９６、ＥＰ２５８０１７、ＥＰ２ ３７３６２）：に、ミュリス（ＥＰ２０１１８４）：Ｋ　ミュリス等（ＵＳ４６ ８３２０２）；Ｈアーリノヒ（ＵＳ４５８２７８８）；及びＲ，サイキ等（ＵＳ ４６８３１９４）によって提供されており、これらの記載は全て引用して本明細 書の一部とする。

遺伝子配列を適当なベクター中に組み込む能力は典型的には制限エンドヌクレア ーゼを用いて実施する。即ち、ベクター及び所望の遺伝子配列を、適合性の末端 を生成することのできる制限ヌクレアーゼで処理し、次いでこれをライケーンヨ ンして、共有結合によって閉じたベクター分子を形成させる。好ましくは、この 制限酵素は、その認識サイトが所望の遺伝子配列中に存在しないものを選択する 。

オリゴヌクレオチドリンカー／アダプターを使用せずに、そして制限サイトの利 用可能性または適合性に拘らず、適当なベクター中に所望の標的配列をクローニ ングさせるためには、所望の標的配列のヌクレオチド配列を普遍的に変えること ができるということが望ましい。本発明はこの目的を達成するために好適な方法 を提供する。

発明の要約 本発明は、遺伝子のクローニング及び発現において組み替えＤＮＡを操作するた めの改良法を提供するものである。より詳細には、本発明は、標的配列の末端に 存在する核酸配列を変えることのできる方法を提供する。

詳細には本発明は、 （Ａ）　東−の鎖の少なくとも一方の末端に前もって選択された配列の第一領域 を有することを特徴とする、修飾された所望核酸分子を形成させ［ここで、この 配列は少なくとも１個のｄＵ残基を含んでいる］　：（Ｂ）前もって選択された 配列の第一領域を、ｄＵ残基のうち少なくとも１個のウラシル塩基の除去をもた らすに充分な条件下で処理し、それにより、修飾された所望分子の少なくとも１ 個の鎖に、その鎖の相補的配列と水素結合することのできる突出した末端を形成 させ： ＜Ｃ＞修飾された分子（Ｂ）を、少なくとも１個の突出した一本鎖末端を有し、 且つ修飾された所望ＤＮＡ分子の突出末端のうち少なくとも１個と水素結合する ことのできる修飾されたベクターの存在下でインキュベートし、それによりこの 二本鎖線状所望核酸分子を二本鎖ベクター中に組み込む、ことからなる、二本鎖 線状所望核酸分子を二本鎖ベクター中に組み込む方法を提供する。

さらに本発明は、修飾された所望分子の一方の末端のみがｄＵ含有配列を含んで いる、上記方法の態様を提供する。

さらに本発明は、該末端が、修飾された所望分子の３゛末端または５゛末端であ る、上記方法の態様を提供する。

さらに本発明は、修飾された所望分子の二つの末端がｄＵ含有配列を含んでいる 、上記方法の態様を提供する。さらに本発明は、末端の両方が３゛末端である、 または末端の両方が修飾された所望分子の５°末端である、上記方法の態様を提 供する。

さらに本発明は、所望Ｄ　Ｎ　Ａ分子の第一の及び第二の鎖の末端が複数のｄＵ 残基を含んでいる、上記方法の態様を提供する。

さらに本発明は、工程（Ｂ）において、ｄＵ残基を、少なくとも１個のｄＵ残基 のウラシル塩基を除去するに充分な条件下においてＵＤＧで処理し、それにより 無塩基性サイトを形成させ、または工程（Ｂ）において、修飾された所望分子を 無塩基性サイトで開裂させるに充分な条件下で、この無塩基性サイトをエンドヌ クレアーゼＩＶにより処理することをさらに含む、上記方法の態様を提供する。

さらに本発明は、修飾された所望ＤＮＡ分子の前もって選択された配列の領域が 同一である、上記方法の態様を提供する。

さらに本発明は、工程（Ｃ）において、制限エンドヌクレアーゼの作用により、 または、該ベクターへのオリゴヌクレオチドのライゲーションにより、または、 （Ｉ）該ベクターに、 （ｉ）第一の鎖の５゛末端における、前もって選択された配列の第一の領域（こ こで該配列は少なくとも１個のｄＵ残基を含む）：（１１）第二の鎖の５°末端 における前もって選択された配列の第二の領域（ここで該配列は少なくともＩｌ ｌのｄＵ残基を含む）：を添加し、そして、 （ＩＩ）前もって選択された配列の第−及び第二の領域を、少なくとも１個のｄ Ｕ残基におけるウラシル塩基の除去をもたらすに充分な条件の下で処理し、それ により、突出する３′末端を有する修飾されたベクターを形成させる、ことによ り、二つの突出する一本鎖末端を生成させる、上記方法の態様を提供する。

さらに本発明は、 （Ａ）前もって選択された配列の領域をそれぞれ有する二つの末端Ａ及びＢを有 する二本鎖線状または線状化されたベクター分子、及び、（Ｂ）前もって選択さ れた配列の領域をそれぞれ有する二つの末端Ｉ及びＩＩを有する二本鎖の所望核 酸分子、 にこで、末端Ａにおけるベクター分子の第一の鎖の前もって選択された配列の領 域、及び、末端■における所望核酸分子の第二の鎖の前もって選択された配列の 領域は、互いにハイブリダイズし：そして、末端Ｂにおけるベクター分子の第二 の鎖の前もって選択された配列の領域、及び、末端ＩＩにおける所望核酸分子の 第一の鎖の前もって選択された配列の領域は、互いにハイブリダイズする］ からなる環状核酸分子を提供する。

さらに本発明は、一方の鎖の末端に少なくとも１個のｄＵヌクレオチドを有する 二本鎖オリゴヌクレオチドの入った第一の容器、及び、該ｄＵ残基のウラシル塩 基を除去することのできる酵素の入った第二の容器を、近接した区分化の下に含 むよう特に適合させたキットを提供する。

さらに本発明は、少なくとも１個の突出した末端［ここでこの末端は、該オリゴ ヌクレオチドのｄＵ含有鎖のヌクレオチド配列と実質的に同様の配列を有するコ を有する線状化された二本鎖ベクターの入った第三の容器をさらに含む、上記キ ットの態様を提供する。

さらに本発明は、該末端が３°または５′末端である、または修飾された所望分 子の二つの末端がｄＵ含有配列を含む、上記キットの態様を提供する。

図面の簡単な説明 図１は、ＰＣＲ増幅法で増幅されるべき配列の領域に対し相補的な二つのオリゴ ヌクレオチドの使用を示す。

図２は、試料外ヌクレオチドを二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖に組み込む 態様を示す。標的分子は図２Ａに示す。図２Ｂは、結果として分子の末端の変更 をもたらす所望分子の修飾を例示している。図２０は、突出した３゛末端の生成 を示す。

図３は、エキソヌクレオチドが二本鎖分子の両路中に組み込まれ、二つの修飾さ れた末端を有する分子の生成に使用される態様を示す。

図４Ａは、試料外ヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖に組み込 まれ、分子の５′末端を修飾する態様を示す。標的分子は図２Ａに示す。図４Ｂ は、ｄＵ含有配列の除去を例示している。

図５は、エキソヌクレオチドが二本鎖分子の側鎖に組み込まれ、二つの修飾され た末端を有する分子を生成する態様を示す。

図６はプライマーの描写を示す。

図７は、３′ハイブリダイズ領域と標的分子との間のホモロジーの故にプライマ ーと標的配列との間のハイブリダイゼーションにより形成される構造を示す。

図８Ａは、ｄＵ含有プライマーの描写を示す。図８Ｂは、プライマー全体がエキ ソヌクレオチドを含む態様の描写を示す。図８０は、標的分子とプライマーとの 間に形成されるハイブリダイズされた構造の描写を示す。

図９は、プラスミドまたは池のベクター中に容易に挿入され得る形のエキソヌク レオチド含有分子の描写を示す。

図１０は、突出した３°末端を有する線状化されたベクターを生成するためのリ ンカ−の使用を示す。

図１１は、突出した３゛末端を有する線状化されたベクターを生成するためのＰ ＣＲ及び試料外ヌクレオチドの使用を示す。

図１２は、修飾された分子からｄＵ残基を除去した結果得られる構造を示す。

図１３は、環状ベクター分子を形成させるための、開示される方法の使用を示す 。図１３Ａは、試料外ヌクレオチドの破壊後の修飾された分子を示す。図１３Ｂ は、試料外ヌクレオチドの破壊後の、前もって選択された配列の領域の塩基対形 成能の損失を例示している。図１３Ｃは、修飾された所望配列を含む環状ベクタ ー分子の形成を例示している。図１３Ａ及び１３Ｂにおいて、上の図は修飾され た所望分子の構造を例示しており、下の図は修飾されたベクター分子の構造を例 示している。

好ましい態様の説明 ■　分子生物学で使用される用語 続く記載において、分子生物学及び核酸増幅技術で使用される幾つかの用語が広 範に利用される。このような用語に与えられる範囲を含む本明細書及び請求項の 明確且つ首尾一貫した理解を提供するため、以下の定義を与える。

本明細書中使用される「増幅」とは、ヌクレオチド配列のコピー数を増加させる ための任意のインビトロの過程を意味する。核酸の増幅は、ヌクレオチドのＤＮ ＡまたはＲＮＡ中への組み込みをもたらす。ＰＣＲはＤＮＡ増幅のための好適な 方法の一例である。本明細書中使用される一つの増幅反応は、ＤＮＡ複製の多く の循環より成り立ち得る。例えば、一つのＰＣＲ反応は１Ｏ−５Ｏｒサイクル２ ｊの変性及び複製から成り立ち得る。

本明細書中使用される「ヌクレオチド」は、塩基−糖一燐酸塩の組合せを意味す る学術用語である。ヌクレオチドは核酸重合体、即ちＤＮＡ及びＲＮＡの単量体 単位である。この語はｒＡＴＰＳｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、またはｒＵＴＰのような りポヌクレオシド三燐酸、及びｄＡＴＰ、ｄＣＴＰＳｄＧＴＰ、またはｄＴＴＰ のようなデオキシリボヌクレオシド三燐酸を包含する。「ヌクレオシド」は塩基 −糖の組合せ、即ち燐酸を欠くヌクレオチドである。

本明細書中使用される「試料外ヌクレオシドヨとは、一般にＤＮＡの配列中に見 いだされないヌクレオチドを意味する。殆どのＤＮＡ試料について、デオキシウ リジンが試料外ヌクレオチドの例である。デオキシウリジンの三燐酸塩型ｄＵＴ Ｐは代謝中間体として生体中に存在するものの、これがＤＮＡ中に取り込まれる ことは稀である。ｄＵＴＰがＤＮＡ中に取り込まれると、得られるデオキシウリ ジンは正常の過程、例えば酵素ウラシルＤＮＡグリコンラーゼ（ＵＤＧ）を含む 過程によってインビボで速やかに除去される［クンケル、Ｕ、Ｓ、４８７３１９ ２：Ｂ、に、ダンカン、ジーエンザイムズ（Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ）　ＸＩＶ 、５６５−５８６頁（１９８１）、どちらの記載もその全体を引用して本明細書 の一部とする］。したがってデオキシウリジンは天然のＤＮＡ中には殆どまたは 決して存在しない。幾つかの生物はデオキシウリジンをＤＮＡ中に自然に取り込 み得るということが認められている。これらの生物の核酸試料については、デオ キシウリジンは試料外ヌクレオチドであるとは考えられない。その他の試料外ヌ クレオチドの例は、プロモチオキシウリジン、７−メチルグアニン、５．６−ン ヒロー５゜６７ヒドロデオキシチミジン、３−メチルデオキシアデノシン等を包 含する［Ｂ、に、ダンカン、ン・エンザイムズ（Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ）　Ｘ ＩＶ、５６３−５８６頁（１９８］、）を参照されたい］。その他の試料外ヌク レオチドは当業者には明らかである。例えば、ＤＮＡ増幅のために用いられるＲ ＮＡプライマーは、アルカリまたは適当なりボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）によ って容易に破壊され得る。

ＲＮＮアーゼはＲＮＡ：ＤＮＡハイプリントのＲＮＡを減成し、変性工程後の一 本ＭＲＮＡの消化に有用な多数の−＊ｆＪＩＲＮアーセが知られている。

デオキシウリジンまたは他の任意の試料外ヌクレオチドの存在は、当分野で良く 知られる方法を用いて容易に決定することができる。このような任意の試料外ヌ クレオチドを含む核酸分子は、これがグリコンラーゼ消化といったような成る種 の処理を特に受け易いことを除けば、ｄＡ、ｄＣＳｄＧまたはｄＴ　（ｄＴは本 明細書中Ｔと称する）のみを含むＤＮ、Ａと全ての面で機能的に等価である。数 多くのＤＮＡグリコノラーゼが当分野で知られている。化学的にまたは酵素的に オリゴヌクレオチド中に取り込まれ得る試料外ヌクレオチド、及びそれに働（Ｄ ＮＡグリコシラーゼを、この発明に使用することができる。試料外ヌクレオチド としてプロモチオキシウリジンを含むＤＮＡは、既知の条件の下で光に暴露され ることにより減成され得る。

ＰＣＲ増幅を受けている試料から存在するかも知れない汚染物質を除くための試 料外ヌクレオチドの使用は、ＭＣ，コンゴ等［ジーン（Ｇｅｎｅ）　９３巻１２ ５−１２８頁（１９９０）、ハートレイ、米国特許第５０３５９６６号コにより 開示されており、これらの全体は引用して本明細書の一部とする。この文献は、 標的配列のＰＣＲ支配増幅におけるｄＵ含有オリゴヌクレオチドまたはｄＵＴＰ のいずれかの使用を開示している。

「所望の」または「標的」遺伝子配列または核酸分子とは、本発明の目的を達成 するために増幅されるべき、またはベクター（これは環状または線状であってよ い）中に取り込まれるべき配列を指定するために用いられる用語である。この配 列はいかなる大きさまたは複雑さであってもよい。一般に、その末端の配列が確 かめられるといったように、所望配列について幾らかの情報が知られている。

ＰＣＲによって増幅され得る任意の分子、またはその末端に制限サイトを有する 任意の分子を、本発明の所望または標的配列として使用することができる。「キ メラ分子とは、所望遺伝子配列を持つまたは含むよう修飾されたベクター（プラ スミド、コスミド、ウィルスの核酸等）である。

二つの配列は、もしそれらが共に同じオリゴヌクレオチドにハイブリダイズでき るならば「配列において実質的に類似である」という。

核酸分子の「末端」とは、その分子の端の領域を示す。この語は本明細書中では 線状分子の最後のヌクレオチドを表わす訳ではなく、線状または環状分子の末端 またはその付近にある大体の領域を表わすものである。

二つの核酸分子の二つの末端は、もしその両方の末端がそれぞれの分子の３゛末 端、または両方の末端がそれぞれの分子のそれぞれの５°末端であるならば、「 同じ名称の末端」であると言われる。本明細書中使用される「同じ名称の末端」 という語は、比較される末端のヌクレオチド配列を指すことを意図している訳で はない。

本明細書中、ＤＮＡ分子は、共有結合によって閉じた環、または水素結合により 結合した環のいずれかとして描写できるならば、「環状コであると言う。したが って、環状分子は、共有結合または水素結合を介して互いに結合している１また はそれ以上のポリヌクレオチドから成ることができる。各ポリヌクレオチドの末 端ヌクレオチドは、−末鎖、または共有結合もしくは水素結合を介してもう一つ のポリヌクレオチドに結合していてもよい。

学術用語「ウラノルＤＮＡグリコシラーゼＪ　（ＵＤＧ）は、単量体ヌクレオチ ドｄＵＴＰがＤＮＡ分子中に組み込まれている時にのみ、塩基ウラシルと糖デオ キシリポースとの間のグリコシド結合を開裂させてデオキシウリジン基の取り込 みをもたらす活性を意味する［Ｂ、　ダンカン、シ・エンザイムズ（Ｔ　ｈｅ　 Ｅ　ｎｚｙ＋Ｉｅｓ）１４巻５６５頁（１９８１）、Ｐ、ポイヤー編コ。この活 性を有する酵素は遊離のｄＵＴＰ、遊離のデオキシウリジン、またはＲＮＡには 作用しない（ダンカン、上記）。ＵＤＧの作用の結果「無塩基性」サイトが生成 される。しかしながらこの酵素は、核酸分子のホスホジエステルバックボーンは 開裂させない。最も好ましくは、無塩基性サイトにおけるホスホジエステルバッ クボーンは、このような基質に特異的なエンドヌクレアーゼの作用によって開裂 させることができる。この目的のために好ましい酵素は大腸菌の酵素エンドヌク レアーゼＩＶである。最も好ましくは、エンドヌクレアーゼＩＶをＵＤＧと組み 合わせて使用して、核酸分子からｄＵ残基を除去する。

本明細書中使用される「組み込み」とは、核酸重合体の一部となることを意味す る。

本明細書中使用される「停止」とは、ある処理の停止を導（ことを意味する。

この語は永久的及び条件的停止のいずれについての意味をも包含する。例えば、 その処理が酵素によるものである場合、永久的停止は熱変性であり：条件的停止 は、例えばその酵素の活性範囲外の温度の使用である。いずれの型の停止もこの 語の範囲に含まれることが意図されている。

本明細書中使用される「オリゴヌクレオチド」は、二つの学術用語「オリゴヌク レオチド」及び「ポリヌクレオチド」を集合的に且つ互換的に意味している。

オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは別個の学術用語であるが、これらの 間に正確な分割する線はなく、本明細書中ではこれらは互換的に使用されること に留意されたい。オリゴヌクレオチドは、もしこれが所望の配列を前もって定め られたオリゴヌクレオチド上に据え付けることができるならば、アダプター、ア ダプター／リンカ−またはインスタレーションオリゴヌクレオチド（これらの語 は同義語である）のいずれかであると言われる。オリゴヌクレオチドはこれが「 ブロックされて」いない限りプライマーとして働（ことができる。オリゴヌクレ オチドは、その３゛末端がプライマーとして働き得ないならば、「ブロックされ て」いると言う。

本明細書中使用される「オリゴヌクレオチド依存増幅」は、核酸配列を増幅する ためにオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを使用する増幅を意味する。

オリゴヌクレオチド依存増幅は、長さが２またはそれ以上のモノヌクレオチドサ ブユニットであって、新たに形成された増幅された核酸分子の一部で終わる１ま たはそれ以上のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの存在を必要とする 任意の増幅である。

本明細書中使用される「プライマー」は、増幅の間に共有結合によるヌクレオチ ド単量体の付加によって伸長する一重鎖オリゴヌクレオチドまたは一重鎖ポリヌ クレオチドを意味する。核酸の増幅はしばしば核酸ポリメラーゼによる核酸の合 成を基礎としている。これらポリメラーゼの多くは、伸長してこのような核酸合 成を開始することのできるプライマーの存在を必要とする。プライマーは典型的 には１１またはそれ以上の塩基であり、最も好ましくはプライマーは１７または それ以上の塩基である。しかしながら最低３個の塩基で充分である。

「反応容量」とは、所望の反応（例えば増幅、ハイブリダイゼーション、ｃＤＮ Ａ合成等）の実施に適当な液体を指す。

「リガーゼ」とは、成る核酸分子の３゛ヒドロキシ末端を第二の核酸分子の５゜ 燐酸末端に結合させて一つの分子を形成させることのできる酵素である。リガー ゼ酵素は、Ｊ、　Ｄ、ワトスン、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジー ン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ）３版、Ｗ 、　Ａ、ベンジャミン、Ｉ　ｎｃ、、メン口・パーク、ＣＡ（１９７７）、及び 類似の教科書に記載されている。

ライゲーションまたは重合反応のような酵素反応が行なわれる場合、このような 反応に必要な成分を反応容器に「過剰に」供するのが好ましい。増幅反応の構成 成分について言及する場合の「過剰に」とは、所望の増幅を達成する能力がその 成分の濃度によって限定されないような各成分の量を意味する。ライゲーション の後にリンカ−／アダプター分子を使用する場合は、反応中に存在する過剰のリ ンカ−／アダプターは好ましくは反応生成物から分離、または反応混合物から除 去し、その結果これらが所望配列のクローニングと競合しないようにする。ｄＵ 残基を含むリンカ−／アダプターオリゴヌクレオチドの使用は、酵素的減成また は他の手段による過剰のリンカ−／アダプター分子の破壊を可能にする。

本発明の方法を、一部例示によって説明する。これらの例示において、例えばＡ 及びＡｏ、Ｂ及びＢ゛、Ｃ及びＣｏ、Ｘ及びＸ゛、並びにＹ及びＹ゛等といった ような配列の対はそれぞれ互いに相補的である。相補性は正確である必要はな（ 、適正な機能、例えばアニーリング及びブライミングに充分なホモロジーで充分 である。

１１　本発明の方法および分子 本発明は、試料外ヌクレオチド、最も好ましくは、標的核酸分子における突出す る３゛または５°の伸長を作り出すためのヌクレオチドｄＵＴＰ　（ヌクレオチ ド配列中に組み込まれた場合、これはｄＵと呼称される）を使用する。この核酸 分子はＰＣＲもしくは他の方法から誘導されるか、または適当な供給材料から直 接分離することができる。

Ａ、リンカ−／アダプター分子を用いる所望核酸分子の３゛または５′いずれか の末端の修飾 本発明は、所望の核酸分子の３゛または５゛末端のいずれかを修飾して５゛また は３゛−末鎖突出領域を作り出すことを可能にする。本発明はこの目的を試料外 ヌクレオチド、好ましくはｄＵの使用により達成する。第一の態様において、こ の試料外ヌクレオチドは二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖に組み込まれる。

次いでこのオリゴヌクレオチドを所望分子の一つの末端または両末端にライゲー ションする。即ち、標的分子が図２Ａのように示されるならば、突出する３°末 端を生成させるように所望分子を修飾するためには、試料外ヌクレオチドをその 末端にライゲージコンする（図２Ｂ）。ＵＤＧによる処理はｄＵ残基のウラシル 塩基の除去をもたらし、それにより無塩基性サイトが生成される。この無塩基性 サイトをエンドヌクレアーゼ■Ｖまたは類似の酵素活性をもって開裂させ、所望 の修飾された分子を生成させることができる（図２Ｃ）。

容易に認識されるように、ｄＵ含有オリゴヌクレオチドを分子の両端にライゲー ションすることにより、所望分子の両末端を修飾することが可能である（図３） 。

突出する５゛末端を生成させるよう所望分子を修飾するために、試料外ヌクレオ チドをその末端にライゲーションする（図４Ａ）。上の態様のように、ＵＤＧに よる処理の結果ＣｔＵ残基のウラシル塩基が除去され、それにより無塩基性サイ トが生成し、これをエンドヌクレアーゼＩＶまたは類似の酵素活性によって開裂 させて所望の修飾された分子を生成させることができる（図４Ｂ）。さらに、上 の態様のように、ｄＵ含有オリゴヌクレオチドを分子の両端にライゲーションす ることにより、所望分子の両末端を修飾することが可能である（図５）。

しかしながら最も好ましい態様において、本発明は所望分子の５′末端を修飾す るためにＰＣＲを使用する。

Ｂ、ＰＣＲ増幅を使用する所望核酸分子の５°末端の修飾所望分子の５゛末端を 修飾して、突出する３′末端を有する分子の生成をさせるための第二の態様にお いて、ＰＣＲ増幅の変法を使用することができる。この態様においては、本発明 に係る所望または標的配列をＰＣＲを用いて修飾し、これらが少な（とも１個、 好ましくは数個のエキソヌクレオチド分子を含む５°末端を有するようにする。

この態様のためには特別なプライマーを使用する。この特別なプライマーは、Ｐ ＣＲ反応の最初に、または増幅の任意のサイクルの後に、いかなる段階で添加し てもよい。ＰＣＲの１またはそれ以降のサイクルの後に添加される場合、増幅の 最初のサイクルは常套のプライマーを用いて実施する。

Ｃ１本発明に係る特別なプライマー 所望分子の末端の修飾は、好ましくは二つの特別なプライマーを用いるＰＣＲを 使用して実施する。

即ち、各々のプライマーは、それが所望のＤＮＡ分子の一方の鎖の５゛領域に対 し相補的な３°ハイブリダイズ領域を含むよう組み立てられるであろう。プライ マーはさらに前もって決定され前もって選択された配列の領域（その長さは一般 に該分子の３°ハイブリダイズ領域とほぼ同じ大きさである）を含む。最も好ま しくは、前もって選択される配列の領域の長さはおよそ１０−２０塩基、最も好 ましくはおよそ１２塩基である。プライマー分子の前もって選択される領域のヌ クレオチド配列に関する制約はない。この配列は反復性、／（リントローム性、 または特異なもののいずれであってもよい。したがって各々のプライマーは図６ に示すように描写することができる。

指摘のようにプライマーは、３゛ハイブリダイズ領域及び標的分子の配列の間の ホモロジーの故に、標的配列の一方の鎖とハイブリダイズすることができる（図 ７）。

プライマー分子の３′ハイブリダイズ領域は、標的分子の正確な末端に対し相補 的である必要はない。事実、標的分子は線状分子である必要はない。プライマー 分子の３゛ハイブリダイズ領域が、クローニングされるべき配列を含むかまたは これに隣接する領域とハイブリダイズすることができるならば、本発明の目的は 達せられるであろう。

前もって選択される配列の特徴は、これが幾つかの試料外ヌクレオチドを含み、 好ましくはこれらが全体に散在していることである。好ましい態様において、前 もって選択される配列は１２塩基の長さであり、且つ塩基３個毎にｄＵがある。

したがってプライマーは図８Ａに示されるように描写することができる。

プライマーの３′ハイブリダイズ領域はさらに１またはそれ以上の試料外ヌクレ オチドを含む。事実、本発明の一態様においては、プライマー全体が、全体に散 在する試料外ヌクレオチドを含んでいる（図８Ｂ）。したがって、標的分子とプ ライマーとの間に形成されるハイブリダイズされた構造は、図８Ｃに示されるよ うに描写することができる。

したがって、プライマーは所望核酸分子を含むまたは含むと思われる試料の存在 下でインキュベートする。次いでＰＣＲ，またはこれに代わる方法を上記のやり 方で実施する。少なくとも１増幅サイクルの後、プライマー−伸長分子を自己ハ イブリダイズさせることにより、所望分子が生成される。理解されるように、得 られた分子は二つの面で最初の所望分子とは異なっている。第一に、これは、そ の両末端に、前もって選択された配列領域に対応するさらなる配列を含んでいる 。第二に、増幅された鎖の両方の５゛末端にある前もって選択された配列は、プ ライマー分子の試料外ヌクレオチドを含んでいるであろう。この分子は本発明方 法にしたがってプラスミドまたは他のベクター中に容易に挿入できる形である。

この分子は以下の図９に示されるように描写することができる。

Ｄ、ベクター 任意の前核生物または真核生物のプラスミドまたはウィルスのベクターを本発明 方法に従って使用できるよう修飾することができる。ベクターが環状分子である 場合は、まずこれを、例えば制限エンドヌクレアーゼを用いて線状化する。次い で線状化された分子の二つの末端を、増幅された所望分子中に存在する前もって 選択された配列の一方または両方に対し相補的な配列を含むよう変える。上に述 べたプライマーの場合、線状化されたベクター分子の末端は、様々な方法のうち いずれによっても変えることができる。

好ましい態様において、リンカ−を使用して線状化された分子の末端にライゲー ションし、所望の突出した３゛末端を生成させることができる（図１０）。

別法として、ＰＣＲを用いて適当な末端を有する線状化されたベクター分子を生 成させることもできる。ベクターの末端は、修飾された所望分子の試料外ヌクレ オチド含有配列に対し相補的な試料外ヌクレオチド含有配列を含むよう修飾する ことができる。即ち、修飾された所望分子の試料外ヌクレオチド含有配列が配列 ｒＸＪを有するとき、修飾されたベクターの試料外ヌクレオチド含有配列は配列 「Ｘｏ」を有するであろう（図１１）。

理解されるように、これらの操作の効果は、修飾された所望配列のどちらかまた は両方の末端に含まれる前もって選択された配列に対し相補的な前もって選択さ れた配列を含む末端を有する線状化された分子を生成させることである。

Ｅ、修飾されたベクター中への修飾された所望配列のクローニング上記の手法で 修飾されたベクター分子及び所望分子を、試料外ヌクレオチドの破壌をもたらす 条件下でインキュベートする。即ち、例えば試料外ヌクレオチドがｄＵである場 合は、この分子を酵素ＵＤＧによる処理に付す。得られた構造を下に示す（図１ ２）。例示の通り、ＵＤＧによる処理は核酸分子のホスホジエステルバックポー ンの切断をもたらさない。むしろこれは、無塩基性サイトの生成を導き、したが って相補的配列との塩基対形成ができない。これらの無塩基性サイト含有配列の 存在または不存在は、続く本発明方法の適用には無関係である。

修飾されたベクター及び所望分子配列の相補性の故に、試料外ヌクレオチドの破 壊後の修飾されたベクターと修飾された所望配列とのインキュベーションの継続 は、キメラ分子を形成させる（図１３）。

理解されるように、修飾された所望分子の一方の端とのみ相補的な配列の使用は 、この配列の一方向性の挿入を可能にする。即ち、例えばもし修飾された所望分 子の一端が前もって選択された配列の領域Ｘ及びＸｏを有し、該分子の他端が前 もって選択された配列の領域Ｙ及びＹ′を有するならば、前もって選択された配 列の領域Ｘ゛及びＸ並びにＹ゛及びＹをそれぞれ存するベクターを使用すること により、修飾されたベクターへの挿入の方向性を管理することが可能であろう。

重要なことに、適当な微生物宿主への形質転換の前に環状分子から無塩基性サイ トを除去する必要はない。同様に、二本鎖の共有結合により閉じた環状分子を生 成させるために、この環状分子をＤＮＡリガーゼまたは他の試薬で処理する必要 はない。上記の環状分子は、受容細胞の形質転換に直接使用することができる。

本発明方法は特に、特定の核酸配列を増幅する酵素を利用するインビトロの方法 、特にＰＣＲにおける使用に従う。

本発明は、「キット」のような製造品を包含する。このようなキットは、典型的 には、使用説明書と、５°末端が、少なくとも１個の試料外ヌクレオチドを含む 前もって選択された配列の領域を含む、環状、またはより好ましくは線状化され たベクター分子とを、近接した区分化の下に含むよう特に適合させたものである 。第二の態様においてこのキットは、試料外ヌクレオチドが破壊されて突出する （即ち突き出ている）３゛末端、またはこれと同義であるが、相補的配列と塩基 対形成することのできない非陥凹５゛末端が生成された修飾されたベクター分子 を含んでいる。

上の態様の副態様において、このキットはさらに、所望核酸分子の末端を修飾す るためのプライマーとしての使用に好適な試料外ヌクレオチド含有オリゴヌクレ オチドを入れた容器、及び／または試料外ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチ ドを減成することのできる酵素を入れた容器を含む。さらにこのキットは緩衝剤 、酵素等を含むことができる。

ここに本発明を一般的に説明してきたが、本発明は以下の実施例を参照すること により、より容易に理解されるであろう。これらの実施例は例示のために供され るものであって、特記されない限り本発明を限定する意図はない。

実施例１ 酵素及び試薬 ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはパーキン・エルマー−シークスから購入した：ｄＮ ＴＰはベーリンガー・マンハイム由来のものである。コンピテントな細菌（ＤＨ ＩＯＢ）、プロテイナーゼＫ及び制限酵素はＢＲＬ由来のものである。オリゴヌ クレオチドはＡＢＩ−３８０Ａ　ＤＮＡ合成機及びベクターの増幅及びヒトコス ミドＤＮＡを用いて合成された。

全てのＰＣＲ反応液は、以下の最終緩衝液濃度：５０ｍＭ　ＫＣＩ、ｌＱｍＭト リスＨＣ１（ｐＨ８，４）　、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、及び０．２ｍＭの各ｄ ＮＴＰ、を用い、鉱油で被覆した５０μｌとした。、ＡＩｕ−ＰＣＲ産物の生成 及びサブクローンからの挿入物の分析にはパーキン・エルマー−７一タス温度循 環器を使用した。最初５分間９３°とした後、６０°で１分間、７２°で１分間 及び９３°で１分間の循環３５回採用した。最後の循環のためにさらに５分間７ ２°とした。四つのＮｏｔＩ−線状化コスミドをそれぞれ２２０−３０ｎ増幅し た。Ｘｂａｒ−線状化ｐＵｃ１１９　（，５）ｌｎｇを上記のように増幅した。

ＰＣＲ反応からの生成物は、エチジウムプロミドを入れたＴＡＥ緩衝液中１％ア カロースゲル電気泳動によって分析した。

ＵＤＧ処理 ベクター及びＡｌｕ−ＰＣＲ産物をエタノールで沈澱させ、以下の緩衝液［２５ ｍＭトリスＨＣ１（ｐＨ７，８）　、１０ｍＭ　ＭｇＣＩ　２．４ｍＭ　β−メ ルカプトエタノール、０．４ｍＭ　ＡＴＰコに溶解した。ベクター（２２５ｎｇ ）及びＡｌｕ−ＰＣＲ産物（１１０ｎｇないし２１２ｎｇ）を各々別々に最終容 量１０μｍ中３７°で１０分間ＵＤＧ　（ＢＲＬ）で処理することによって、ベ クターにおいては１０ヌクレオチド、Ａｌｕ−ＰＣＲ産物においては１１ヌクレ オチドからなる一本鎖３゛突出部を作る。当初の実験は１６単位のＵＤＧを使用 したが、わずか１単位でも充分であることがわかった。このＵＤＧ処理の後、６ ５″で１０分間の処理を行なった。

クローニング及び形質転換 上のトリス、ＭｇＣ１□、β−メルカプトエタノール、ＡＴＰ緩衝液の最終容量 ２０μｍ中で、ＵＤＧ処理ベクター（４５ｎ　ｇ）をＵＤＧ処理Ａｌｕ−ＰＣＲ 産物（４５ｎｇないし１０１０６ｎと室温で１時間合した。製造者の指示に従っ て各混合物の５μｍをＤＨＩＯＢコンピテント細胞（ＢＲＬ）５０ｔｌＩに導入 し、アンピシリン、Ｘ−ｇａｌ及びＩＰＴＧを含有するＬＢ平板上に蒔いた。

形質転換体のＰＣＲ分析 Ａｌｕプライマーを用いるＰＣＲによりサブクローンを分析した。単一の白色コ ｏニーを、１２μｌのｌＱｍＭトリスＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ、５０μｇ／ｍｌプロ子イナーゼＫに分散させ、５５°で１５分間、８０°て １５分間インキュベートし、そして氷上で冷却した。Ａｌｕプライマーを含むＰ ＣＲ構成成分を添加し、上記方法を用いて３０サイクル増幅した。各分析のうち ５μｍを、サイズ分けのためアガロースゲルで分析した。

得られた形質転換体のこの方法を用いた分析は、試料外ヌクレオチドクローニン グ法を用いたＰＣＲ産物が有効にクローニングされたことを示した。挿入ＤＮＡ １またはベクターＤＮＡまたはＵＤＧ処理を割愛した対照反応がらは形質転換体 が得られず、この事は、クローニング法が本出願に概説され具体化されている方 法に依存することを示すものである。

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Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．（Ａ）第一の鎖の少なくとも一方の末端に前もって選択された配列の第一領 域を有することを特徴とする、修飾された所望核酸分子を形成させ［ここで、こ の配列は少なくとも１個のｄＵ残基を含んでいる］；（Ｂ）前もって選択された 配列の第一領域を、該ｄＵ残基のうち少なくとも１個のウラシル塩基の除去をも たらすに充分な条件下で処理し、それにより、修飾された所望分子の少なくとも １個の鎖に、その鎖の相補的配列と水素結合することのできる突出した末端を形 成させ； （Ｃ）この修飾された分子（Ｂ）を、少なくとも１個の突出した一本鎖末端を有 し、且つ修飾された所望ＤＮＡ分子の該突出末端のうち少なくとも１個と水素結 合することのできる修飾されたベクターの存在下でインキュベートし、それによ りこの二本鎖線状所望核酸分子を該二本鎖ベクター中に組み込む、ことからなる 、二本鎖線状所望核酸分子を二本鎮ベクター中に組み込む方法。
2. ２．修飾された所望分子の１個の末端のみが該ｄＵ含有配列を含む、請求項１の 方法。
3. ３．該末端が、修飾された所望分子の３′末端である、請求項２の方法。
4. ４．該末端が、修飾された所望分子の５′末端である、請求項２の方法。
5. ５．修飾された所望分子の二つの末端が該ｄＵ含有配列を含む、請求項１の方法 。
6. ６．該末端の両者が、修飾された所望分子の３′末端である、請求項５の方法。
7. ７．該末端の両者が、修飾された所望分子の５′末端である、請求項５の方法。
8. ８．該所望ＤＮＡ分子の第一の及び第二の鎖の該末端が複数のｄＵ残基を含む、 請求項１の方法。
9. ９．工程（Ｂ）において、該ｄＵ残基を、該ｄＵ残基のうち少なくとも１個のウ ラシル塩基を除去するに充分な条件下でＵＤＧにより処理し、それにより無塩基 性サイトを形成させる、請求項１の方法。
10. １０．工程（Ｂ）において、該無塩基性サイトを、修飾された所望分子を該無塩 基性サイトにおいて開裂させるに充分な条件下でエンドヌクレアーゼＩＶにより 処理することをさらに含む、請求項９の方法。
11. １１．修飾された所望ＤＮＡ分子の前もって選択された配列の領域が同一である 、請求項１の方法。
12. １２．工程（Ｃ）において、二つの突出する一本鎖末端が制限エンドヌクレアー ゼの作用により生成される、請求項１の方法。
13. １３．工程（Ｃ）において、二つの突出する一本鎖末端が、該ベクターへのオリ ゴヌクレオチドのライゲーションによって生成される、請求項１の方法。
14. １４．工程（Ｃ）において、二つの突出する一本鎖末端が、（Ｉ）該ベクターに 、 （ｉ）第一の鎖の５′末端における、前もって選択された配列の第一の領域（こ こで該配列は少なくとも１個のｄＵ残基を含む）；（ｉｉ）第二の鎖の５′末端 における前もって選択された配列の第二の領域（ここで該配列は少なくとも１個 のｄＵ残基を含む）；を添加し、そして、 （ＩＩ）前もって選択された配列の第一及び第二の領域を、該ｄＵ残基のうち少 なくとも１個のウラシル塩基の除去をもたらすに充分な条件の下で処理し、それ により、突出する３′末端を有する修飾されたベクターを形成させる、ことによ り生成される、請求項１の方法。
15. １５．（Ａ）前もって選択された配列の領域をそれぞれ有する二つの末端Ａ及び Ｂを有する二本鎖線状または線状化されたベクター分子、及び、（Ｂ）前もって 選択された配列の領域をそれぞれ有する二つの末端Ｉ及びＩＩを有する二本鎖の 所望核酸分子 ［ここで、末端Ａにおける該ベクター分子の第一の鎖の前もって選択された配列 の領域、及び、末端Ｉにおける該所望核酸分子の第二の鎖の前もって選択された 配列の領域は、互いにハイブリダイズし；そして、末端Ｂにおける該ベクター分 子の第二の鎖の前もって選択された配列の領域、及び、末端ＩＩにおける該所望 核酸分子の第一の鎖の前もって選択された配列の領域は、互いにハイプリダイズ する］ からなる環状核酸分子。
16. １６．一方の鎖の末端に少なくとも１個のｄＵヌクレオチドを有する二本鎖オリ ゴヌクレオチドを入れた第一の容器、及び、該ｄＵ残基のウラシル塩基を除去す ることのできる酵素を入れた第二の容器を、近接した区分化の下に含むよう特に 適合させたキット。
17. １７．少なくとも１個の突出した末端〔ここで、この末端は、該オリゴヌクレオ チドの該ｄＵ含有鎖のヌクレオチド配列と実質的に同様の配列を有する］を有す る線状化された二本鎖ベクターを入れた第三の容器をさらに含む、請求項１６の キット。
18. １８．該末端が３′末端である、請求項１６のキット。
19. １９．該末端が５′末端である、請求項１６のキット。